CN117323427A - 脂质体佐剂及其制造方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种脂质体佐剂及其制造方法和应用。采用的皂苷类似物供应量比其他皂苷佐剂更为充足，且不具有溶血活性。使得制备的脂质体佐剂更稳定，毒性更低。联合抗原后能够激发更强的CD4+T细胞免疫应答。成本低、佐剂效力高、稳定性及安全性好，可作为多种疫苗的候选佐剂。

Description

脂质体佐剂及其制造方法和应用
技术领域
本申请属于生物医药工程领域，涉及生产具有特殊结构的含有三萜皂苷类似物的脂质体佐剂，特别是这种脂质体佐剂中的三萜皂苷类似物制剂方式的改进。
背景技术
AS01是一种包含免疫刺激剂单磷酰脂质A(MPL)和皂树皂苷QS-21的脂质体佐剂。TLR4激动剂MPL是来自明尼苏达沙门氏菌的脂多糖的无毒衍生物，QS-21是从南美树皂树Molina的树皮提取的天然皂苷分子，能激活被膜下淋巴窦巨噬细胞中的半胱天冬酶1(Caspase1)，两者同时协同激活免疫系统。GSK公司开发的疟疾疫苗RTS,S和带状疱疹疫苗Shingrix中，以及针对病原体诸如人免疫缺陷病毒和结核分枝杆菌开发的多种候选疫苗中都包括AS01。GSK公司公开的AS01佐剂常规制造工艺为MPL存在于有机相中，QS-21存在于水相中，辅以辅助脂质制备成脂质体佐剂。
尽管QS-21具有显著的佐剂效力和广泛的临床研究，但它仍存在许多局限性，其中最主要是在于它的获取极其困难，首先是皂树的粗提物的异质性和它极低的分离效率。其次，QS-21酰基侧链结构极不稳定，酰基容易自发水解导致佐剂失活和具有显著溶血活性的副产物。QS-21还具有一定临床毒性，包括注射部位的肿胀和红斑以及全身性类流感症状。
TQL-1055是一种合理设计的半合成皂苷佐剂QS-21类似物，提供与QS-21相同的强免疫应答。其高效合成工艺采用来自皂树树叶和树枝的原料，原料供应量比其他皂苷佐剂更为充足，且不具有溶血活性。虽然目前Adjuvance正以TQL-1055为基础设计新的联合佐剂，但常规方法均是以TQL-1055的游离酸或胆碱盐水溶液的形式参与联合佐剂的开发，例如该公司的百日咳疫苗中使用的TQL-1055佐剂就是TQL-1055的水溶液形式。但利用TQL-1055的水溶液制备的脂质体佐剂联合病毒抗原发挥的佐剂效力却并不高，这与溶解TQL-1055的溶剂类型、溶解程度以及TQL-1055在脂质体佐剂中分散的位置等都有很大关系。
因此，仍然需要新的佐剂和制造方法，安全、方便和成本有效地生产脂质体佐剂，同时提供比由常规制造方法产生的免疫学性能更高的佐剂效力。
发明内容
根据本发明所述方法，可以制成将MPL和TQL-1055共同包裹于磷脂双分子层间的单室或多室脂质体佐剂，能够提供比由常规制造方法产生的免疫学性能更高的佐剂效力。在本发明中，DOPC或DOPC/DOTAP混合脂质做为脂质的骨架结构成分，而胆固醇作为助脂质嵌入脂质双分子层之间，调节膜的结构和性质。
本发明的技术方案如下：
本发明一方面提供一种脂质体佐剂，包含水相和悬浮在所述水相中的单层囊泡或多层囊泡，所述单层囊泡包含一个球形的双层脂质膜和位于所述双层脂质膜中心的含水小室，所述多层囊泡包含多个球形且同心分布的双层脂质膜，最内层的双层脂质膜的中心为含水小室，不同的双层脂质膜之间被水相隔开，所述双层脂质膜中含有TLR4激动剂以及皂苷或其类似物。本发明的脂质体佐剂将TLR4激动剂以及皂苷或其类似物共包裹于磷脂双分子层间，而非黏附/部分嵌入脂质体上、包封于含水小室或游离在体系中，从根本上稳定脂质体结构和佐剂的协同作用机制。
在一些实施方式中，其中，TLR4激动剂选自革兰阴性菌脂多糖LPS、3D-单磷酰脂质A(MPL)、吡喃葡萄糖基脂质A(GLA)、热休克蛋白、纤维蛋白和盘尾丝虫的活化相关蛋白(Ov-ASP-1)中的一种或多种，优选为MPL。
在一些实施方式中，其中，皂苷选自QS-21、QS-18、QS-7或其混合物，优选为QS-21。
在一些实施方式中，其中，皂苷类似物是TQL-1055。
在一些实施方式中，所述TLR4激动剂和皂苷或其类似物的质量比为1:4～4:1；例如，所述TLR4激动剂和皂苷或其类似物的质量比为1:4、1:2、1:1.25、1:1、2:1、3:1或4:1，优选为1:2、1:1.25、1:1或2:1。在一些具体的实施例中，以1/10人用剂量(1/10HD)计，本发明包含5μg的MPL和2.5μg、5μg、6.25μg或10μg的TQL-1055的脂质体佐剂，或包含2.5μg的MPL和2.5μg的TQL-1055的脂质体佐剂均能有效诱导细胞免疫应答。
在一些实施方式中，其中，形成双层脂质膜的物质包含中性脂质。其中，中性脂质选自蛋黄磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)和二月桂酰磷脂酰胆碱的磷脂酰胆碱，优选为DOPC。
在一些实施方式中，其中，形成双层脂质膜的物质进一步包含阳离子脂质，其与中性脂质形成脂质混合物。其中，阳离子脂质选自二油酰丙基氯化三甲铵DOTMA、(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基氯化铵DOTAP、DDA、DOP-DEDA、DODMA、DMG-PEG2000和DLin-MC3-DMA，在一个具体的实施例中，本发明选用的阳离子脂质为DOTAP。
DOTAP与中性脂质(例如DOPC)的组合主要优点是二者的组合更稳定，制成的脂质混合物保持无沉淀状态时间可超过2个月，相比于仅使用中性脂质的稳定性增加3-5倍。另外，DOPC与DDA的脂质组合获得的脂质体粒径远大于200nm，对工艺后期的过滤除菌等会有不利影响，而本发明的脂质体佐剂可以获得粒径在70-230nm之间的脂质体颗粒，有利于后期工艺及免疫增效。
在一些实施方式中，所述中性脂质与阳离子脂质的质量比为4:1～9:1，例如4:1、5:1、6:1、7:1、8:1或9:1。
在一些实施方式中，所述中性脂质与阳离子脂质的质量比优选为4:1或9:1，其中更加优选地为9:1。少量阳离子脂质的添加有利于在保证免疫效力的前提下提升脂质体的结构稳定性。在本发明中，每人用剂量包含中性脂质与阳离子脂质的总质量为500～2000μg，优选500～1000μg。
在一些实施方式中，其中，形成双层脂质膜的物质进一步包含固醇，其中，所述固醇为胆固醇。本发明中，在每人用剂量脂质体佐剂中中性脂质的质量或中性脂质与阳离子脂质的总质量是胆固醇的4倍。
本发明另一方面提供一种脂质体佐剂的制备方法，包括如下步骤：
1)称取脂质、固醇和TLR4激动剂，按质量比90～100:20～30:4～5的比例制成混合物，并溶解于有机溶剂1中，得到类脂的有机溶液备用；
2)称取皂苷或其类似物溶解于有机溶剂2，并用1～2倍体积的有机溶剂1稀释得到皂苷或其类似物的浓缩液，其中所述皂苷或其类似物与TLR4激动剂初始投料的质量比为1.9:7～2.1:7；
3)将所述类脂的有机溶液、皂苷或其类似物的浓缩液以及有机溶剂1按2.6～41:0.5～1.5:2～8的体积比充分混合为有机相，缓冲溶液为水相，经微流控装置得到脂质体样品，所述有机相和水相的体积比为1:3～6；
4)将制备的脂质体样品去除有机溶剂后经1～2次过滤得到最终的脂质体佐剂，
其中，所述有机溶剂1和有机溶剂2选自乙腈、二甲基甲酰胺(DMF)、甲醇、丙酮、二甲基亚砜(DMSO)、乙醇、正丙醇、异丙醇或其中两者的混合物。
在一些实施方式中，其中有机溶剂1和有机溶剂2的体积比为1:1～1:2。
在一些实施方式中，例如，有机溶剂1和有机溶剂2的体积比为1:1、1:1.25、1:1.5、1:1.75或1:2等。在一些优选的实施方式中，其中有机溶剂1和有机溶剂2的体积比为1:1。
在一些实施方式中，例如有机溶剂1为DMF，有机溶剂2为乙醇；例如有机溶剂1为乙醇，有机溶剂2为异丙醇；例如有机溶剂1为DMSO，有机溶剂2为乙醇；例如有机溶剂1为DMF，有机溶剂2为乙腈；例如有机溶剂1为乙腈，有机溶剂2为乙醇/异丙醇的混合物等。
在一些实施方式中，其中有机溶剂1和有机溶剂2均为乙醇/异丙醇混合溶剂。
在一些优选的实施方式中，其中有机溶剂1为乙醇/异丙醇混合溶剂，有机溶剂2为DMSO。
在一些优选的实施方式中，乙醇/异丙醇混合溶剂中乙醇和异丙醇的体积比为1:1。
在一个实施方式中，所述脂质、固醇和TLR4激动剂，按质量比约94:24:4.57的比例制成混合物。例如混合物包含282mg DOPC、72mg胆固醇和13.71mg MPL；或282mg的DOPC/DOTAP脂质混合物、72mg胆固醇和13.71mg MPL。
在一些实施方式中，步骤2)中所述皂苷或其类似物与TLR4激动剂初始投料的质量比为1.9:7～2.1:7，例如，在一个实施例中，TQL-1055与MPL初始投料的质量比为2.04:7。
在一些实施方式中，步骤3)中将所述类脂的有机溶液、皂苷或其类似物的浓缩液以及有机溶剂1按2.6:1:5的体积比充分混合为有机相。
在一些优选的实施方式中，步骤3)中将所述类脂的有机溶液、皂苷或其类似物的浓缩液以及有机溶剂1按5:1:5的体积比充分混合为有机相。
在一些优选的实施方式中，步骤3)中将所述类脂的有机溶液、皂苷或其类似物的浓缩液以及有机溶剂1按8:1:5的体积比充分混合为有机相。
在一些优选的实施方式中，步骤3)中将所述类脂的有机溶液、皂苷或其类似物的浓缩液以及有机溶剂1按10:1:5的体积比充分混合为有机相。
在一些优选的实施方式中，步骤3)中将所述类脂的有机溶液、皂苷或其类似物的浓缩液以及有机溶剂1按20:1:5的体积比充分混合为有机相。
在一些优选的实施方式中，步骤3)中将所述类脂的有机溶液、皂苷或其类似物的浓缩液以及有机溶剂1按41:1:5的体积比充分混合为有机相。在一些实施方式中，步骤3)中微流控过程在20～25℃温度下以4～6ml/min的总流速和有机相:水相＝1:3～1:6的流速比运行。例如在20℃温度下以4ml/min的总流速和有机相:水相＝1:3的流速比运行。例如在23℃温度下以5ml/min的总流速和有机相:水相＝1:4的流速比运行。例如在25℃温度下以6ml/min的总流速和有机相:水相＝1:5的流速比运行等。
在一些优选的实施方式中，步骤3)中微流控过程在25℃温度下以4ml/min的总流速和有机相:水相＝1:3的流速比运行。
在一些实施方式中，步骤3)中所述将制备的脂质体样品去除有机溶剂后经1～2次过滤得到最终的脂质体佐剂。
在一些实施方式中，例如，经1次过滤得到最终的脂质体佐剂。在一些优选的实施方式中，所述过滤是通过0.22μm聚醚砜膜(PES)无菌过滤器完成的。
常用的过滤器为聚醚砜(PES)材质，其中的PES膜由聚醚砜超细纤维热熔连在一起制成，其物理、化学性能稳定，具有很好的相容性。
在一些实施方式中，例如，经2次过滤得到最终的脂质体佐剂。在一些优选的实施方式中，其中还包括通过30kD超滤管浓缩过滤。
在一些实施方式中，其中过滤后的脂质体佐剂的粒径为70～230nm，多分散性指数(PDI)低于0.250。
在一些实施方式中，其中所述TLR4激动剂选自革兰阴性菌脂多糖LPS、3D-单磷酰脂质A(MPL)、吡喃葡萄糖基脂质A(GLA)、热休克蛋白、纤维蛋白和盘尾丝虫的活化相关蛋白(Ov-ASP-1)中的一种。
在一些优选的实施方式中，其中所述TLR4激动剂是MPL。
在一些实施方式中，其中所述皂苷选自QS-21、QS-18、QS-7或其混合物。
在一些优选的实施方式中，其中所述皂苷类似物是TQL-1055。
在一些实施方式中，所述脂质是阳离子型脂质。
在一些实施方式中，阳离子型脂质选自二油酰丙基氯化三甲铵DOTMA、(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基氯化铵DOTAP、DDA、DOP-DEDA、DODMA、DMG-PEG2000和DLin-MC3-DMA，优选为DOTAP。
在一些实施方式中，所述脂质是阴离子型脂质。
在一些实施方式中，所述脂质是两性离子。
在一些实施方式中，所述脂质是中性脂质。
在一些实施方式中，所述中性脂质是选自蛋黄磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)或二月桂酰磷脂酰胆碱的磷脂酰胆碱，优选为DOPC。
在一些实施方式中，所述脂质是脂质混合物，例如，脂质混合物是中性脂质和阳离子型脂质的混合物，尤其是DOPC和DOTAP的脂质混合物。
在一些实施方式中，所述中性脂质与阳离子脂质的质量比为4:1～9:1，例如4:1、5:1、6:1、7:1、8:1或9:1。
在一些实施方式中，所述中性脂质与阳离子脂质的质量比优选为4:1或9:1，其中更加优选地为9:1。
在一些优选的实施方式中，其中所述固醇是胆固醇。
在一些实施方式中，缓冲溶液选自乙酸盐、柠檬酸盐、组氨酸、马来酸盐、磷酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐和Tris的缓冲剂。
在一些优选的实施方式中，缓冲溶液是10mM，含150mM NaCl的磷酸盐水溶液。
本发明另一方面还提供一种利用两步或多步乳化制备脂质体佐剂的方法，该方法制备出的脂质体具有多层囊泡(多室)结构，可减少脂质体包裹物的泄露。
例如，采用两步乳化法制备W/O/W型脂质体。以45ml无水乙醇或异丙醇溶解50mgMPL、50mg TQL1055、1250mg脂质和固醇，为有机相。将5ml磷酸盐缓冲液缓慢滴入45ml有机相中，10000rpm高速乳化10min，充分混匀水相和有机相，获得第一次乳化的W/O型脂质体。混匀后的W/O型脂质体(50ml)滴入450ml水相(可与第一次水相相同，也可不同)中，10000rpm高速乳化10min，进行二次乳化，充分混匀，获得W/O/W型脂质体。多种多层囊泡的脂质体佐剂的制备可以通过调整乳化次数和工艺参数实现。
在一些实施方式中，其中，多层囊泡包含多个球形且同心分布的双层脂质膜，最内层的双层脂质膜的中心为水相，不同的双层脂质膜之间被水相隔开，所述双层脂质膜中含有TLR4激动剂以及皂苷或其类似物。
本发明另一方面提供一种利用所述方法制备的脂质体佐剂。
本发明另一方面提供一种含有TQL-1055水溶液的脂质体佐剂，该脂质体佐剂成分包括：a)DOPC、胆固醇和MPL组成的类脂；b)TQL-1055和增溶剂；c)缓冲液；其中DOPC与胆固醇的重量比为3-5:1，胆固醇与MPL的重量比为4-6:1，TQL-1055与MPL的重量比为0.8-2:2，TQL-1055与增溶剂的重量比为1:40-100。
在一个实施例中，本发明的脂质体佐剂成分包括：a)DOPC、胆固醇和MPL组成的类脂；b)TQL-1055和增溶剂；c)缓冲液；其中DOPC与胆固醇的重量比为4:1，胆固醇与MPL的重量比为5:1，TQL-1055与MPL的重量比为1:1或1:2，TQL-1055与增溶剂的重量比为1:50。
在一个实施例中，本发明的脂质体佐剂每人份是30-80μg，成分包括：
a)DOPC、胆固醇和MPL组成的类脂；
b)TQL-1055和羟丙基β环糊精；
c)缓冲液；
其中DOPC浓度为2mg/ml，胆固醇浓度为0.5mg/ml，MPL浓度为0.05-0.1mg/ml，TQL-1055浓度为0.05-0.1mg/ml，羟丙基β环糊精浓度为2.5-5mg/ml。
在一个实施例中，本发明的含有TQL-1055水溶液的脂质体佐剂的制备方法，包括如下步骤：
步骤1)制备有机相：将DOPC、胆固醇和MPL按质量比90-110:20-30:3-6的比例溶解于有机溶剂中，得到有机相备用；步骤2)制备水相：取与MPL的重量比为0.8-2:2的TQL-1055，取与TQL-1055重量比为1:50的增溶剂与注射用水、生理盐水或缓冲盐溶液混合，制得水相备用；步骤3)制备脂质体溶液：用微流控装置混合有机相和水相，去除有机溶剂、过滤得到脂质体溶液。
在一个实施例中，所述步骤3)可以用如下步骤替代：制备脂质体溶液：将有机相在水浴下减压、旋蒸后得脂质薄膜；在脂质薄膜中加入注射用水、生理盐水或缓冲盐溶液混合进行水化，经过微射流均质获得浓缩脂质体；浓缩脂质体与水相混合、加缓冲液稀释成所需要浓度的脂质体溶液。
本发明中所述的增溶剂选自α环糊精、β环糊精、γ环糊精、羟丙基β环糊精、磺丁基醚β环糊精等的天然型环糊精；羟乙基-β-环糊精(HE-β-CD)、羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)、甲基-β-环糊精(M-β-CD)、磺丁基醚-β-环糊精(SBE-β-CD)等的环糊精衍生物；乙二胺、三乙醇胺、二乙醇胺等胺；天冬氨酸、甘氨酸、磷酸、酒石酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸、L-精氨酸去氧胆酸钠、熊去氧胆酸等酸；脲、乙基脲、葡甲胺、乙醇、丙二醇、聚乙二醇、水杨酸钠和烟酰胺。
在一个实施例中，所述增溶剂选自β环糊精、羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)、酒石酸和琥珀酸。
本发明另一方面提供一种含有TQL-1055分散在类脂中的脂质体佐剂，脂质体佐剂成分包括：a)DOPC、胆固醇和MPL组成的类脂；b)TQL-1055；c)缓冲液；其中TQL-1055分散在类脂中，DOPC与胆固醇的重量比为3-5:1，胆固醇与MPL的重量比为4-6:1，TQL-1055与MPL的重量比为0.8-2:2。
在一个实施例中，本发明的脂质体佐剂成分包括：a)DOPC、胆固醇和MPL组成的类脂；b)TQL-1055；c)缓冲液；其中TQL-1055分散在类脂中，DOPC与胆固醇的重量比为4:1，胆固醇与MPL的重量比为5:1，TQL-1055与MPL的重量比为1:1或1:2。
在一个实施例中，本发明的脂质体佐剂的每人份是30-80μg，成分包括：
a)DOPC、胆固醇和MPL组成的类脂；
b)TQL-1055；
c)缓冲液；
其中TQL-1055分散在类脂中，DOPC浓度为2mg/ml，胆固醇浓度为0.5mg/ml，MPL浓度为0.05-0.1mg/ml，TQL-1055浓度为0.05-0.1mg/ml，羟丙基β环糊精浓度为2.5-5mg/ml。
在一个实施例中，本发明的脂质体佐剂成分还包括免疫刺激剂CpG，其中CpG与MPL的重量比为1-5:1。
在一个实施例中，本发明的脂质体佐剂成分中所述DOPC用同等质量的脂质混合物替换，其中脂质混合物由4:1或9:1的DOPC和DOTAP组成。例如，在一个实施例中，本发明的脂质体佐剂成分中脂质混合物的浓度为2mg/ml。
在一个实施例中，本发明的TQL-1055分散在类脂中的脂质体佐剂的制备方法，包括如下步骤：步骤1)制备有机相：将DOPC、胆固醇和MPL按质量比90-110:20-30:3-6的比例溶解于有机溶剂中，得到有机溶液备用；制备TQL-1055母液：取与MPL的重量比为0.8-2:2的TQL-1055溶解在有机溶剂中，制得TQL-1055母液；混合备用的有机溶液和TQL-1055母液得有机相；步骤2)制备水相：取注射用水、生理盐水或缓冲盐溶液，制得水相；步骤3)制备脂质体溶液：用微流控装置混合有机相和水相，去除有机溶剂、过滤得到脂质体溶液。
在一个实施例中，所述步骤3)可以用如下步骤替代：制备脂质体溶液：将有机相在水浴下减压、旋蒸后得脂质薄膜；在脂质薄膜中加入注射用水、生理盐水或缓冲盐溶液混合进行水化，经过微射流均质获得浓缩脂质体；浓缩脂质体与水相混合、加缓冲液稀释成所需要浓度的脂质体溶液。
本发明另一方面提供一种疫苗组合物，包含所述脂质体佐剂和抗原类成分。
本发明另一方面提供一种制备疫苗组合物的方法，所述方法包括前述方法和将过滤的脂质体佐剂与抗原类成分组合。
在一些实施方式中，所述疫苗组合物用于预防HIV、HPV、带状疱疹、HSV、结核病(TB)、HBV、HFMD、RSV、CMV、流感或冠状病毒感染。
在一些实施方式中，所述疫苗用于预防、减轻或治疗带状疱疹感染。
在一些实施方式中，所述抗原来源于水痘带状疱疹病毒。
在一些优选的实施方式中，所述抗原类成分为病毒来源的重组蛋白抗原和/或多肽或表位抗原，优选为水痘带状疱疹病毒gE重组蛋白。
水痘带状疱疹病毒(VZV)是八种人类疱疹病毒之一，即3型人疱疹病毒。VZV糖蛋白E(glycoprotein E，gE)亚单位疫苗是目前的水痘疫苗的主流研究方向，gE由病毒的ORF68基因编码，1872个碱基组成的该基因位于VZV基因组短片段区。在利用现代生物分子学技术制备重组VZV gE蛋白时，一般将截短gE蛋白，使其缺少羧基端疏水锚区。葛兰素史克开发的Shingrix是一种基于重组gE蛋白辅以新型佐剂AS01B的亚单位疫苗，三期临床试验数据显示该亚单位疫苗在老年人中有着优于Zostavax的免疫原性和有效性，并于2017年获FDA批准上市。VZV gE蛋白的制造通常是通过在培养细胞中表达或通过化学合成来实现。常常使用并且适合用于产生蛋白质的宿主细胞包括大肠杆菌、酵母、昆虫以及哺乳动物。如本文中所使用的，抗原为gE蛋白的1-546aa，gE蛋白是本领域技术人员公知的(参见，例如NCBIGenbank数据库登录号：Q9J3M8)。
利用现代分子生物的常规技术手段可轻易地获得上述抗原，典型的方法包括：
(1)将本发明的gE蛋白基因(经密码子优化)克隆入表达载体中；
(2)将步骤(1)所得的表达载体转染至宿主细胞(例如CHO)中；
(3)通过细胞群筛选和单克隆筛选，获得稳定表达gE蛋白的细胞株；
(4)使用步骤(3)所得的细胞株进行表达，获得VZV gE蛋白。
将上述获得的蛋白，经常规的处理方式，例如疏水层析、阴离子交换层析、羟基磷灰石层析等可获得较纯的抗原蛋白。
在一些实施方式中，所述抗原来源于冠状病毒，例如中东呼吸综合征冠状病毒(MERS CoV)、严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS CoV)，尤其是新型冠状病毒SARS-CoV-2。
SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)的受体结合结构域(RBD)被认为是诱导机体产生中和抗体的最主要的抗原靶区域。RBD作为疫苗能够将机体刺激产生的中和抗体更加聚焦在针对病毒的受体结合，可以提高疫苗的免疫原性和免疫效率。SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)N端结构域(NTD)为病毒S蛋白N端的一段序列，其可与宿主细胞的蛋白或糖蛋白结合，介导病毒入侵宿主细胞，故该段区域可能包含诱导中和抗体产生的表位。为了开发本发明的目的，在本发明的实施例中，发明人采用了一种包含SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)的受体结合结构域(RBD)或其功能活性片段和/或SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)N端结构域(NTD)或其功能活性片段的融合蛋白作为抗原。所述融合蛋白进一步包含foldon结构域或其功能活性片段。
在一些实施方式中，所述抗原选自HPV6、11、18、31、33、45、52、58、68型中的至少一种。
HPV的衣壳是由主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2组成。已上市疫苗都是基于HPVL1病毒样颗粒(Virus-like particle，VLP)为抗原的疫苗，通过基因重组表达的L1蛋白可在一定条件下形成类似病毒的颗粒，有着较好的免疫原性。在NCBI数据库中，已有许多现有的HPV各型L1 VLP蛋白(HPV 16L1、18L1、6L1、11L1、31L1、33L1、45L1、52L1、58L1)序列可供本领域技术人员进行选择，这些序列均可以作为抗原蛋白的理想选择基础。为了开发本发明的目的，在本发明的实施例中，发明人大部分采用了从现有技术中具有高度的保守性的序列，具体情况如下：HPV 6L1的氨基酸序列已于1995年在NCBI数据库中收录，登录号为AAA74218；HPV 11L1的氨基酸序列已于1994年在NCBI数据库中收录，登录号为AAA46935；HPV 16L1的氨基酸序列已于1998年在NCBI数据库中收录，登录号为AAC09292.1；HPV 18L1蛋白的氨基酸序列已于2003年在NCBI数据库中收录，登录号为AAQ92369.1；HPV 31L1蛋白的氨基酸序列已于1994年在NCBI数据库中收录，登录号为AAA46956；HPV 33L1蛋白的氨基酸序列已于2009年在NCBI数据库中收录，登录号为ACL12333.1；HPV 45L1蛋白的氨基酸序列已于2009年在NCBI数据库中收录，登录号为ABP99831.1(截短了N端26个氨基酸，上述26个氨基酸为疏水区，疏水区可能影响L1蛋白形成VLP，故而截短)；HPV52 L1蛋白的氨基酸序列已于2005年在NCBI数据库中收录，登录号为CAA52590.1(截短了N端27个氨基酸，上述27个氨基酸为疏水区，疏水区可能影响L1蛋白形成VLP，故而截短)；HPV 58L1蛋白的氨基酸序列已于2009年在NCBI数据库中收录，登录号为CAX48979.1。
利用现代分子生物的常规技术手段可轻易地获得上述抗原，典型的方法包括：在毕赤酵母中表达上述HPV各型L1 VLP蛋白的方法，包括下述步骤：
(1)将本发明的HPV各型L1蛋白基因(经密码子优化)克隆入表达载体中；
(2)将步骤(1)所得的表达载体转化至宿主菌(例如毕赤酵母)中；
(3)通过菌株筛选，获得稳定表达HPV各型L1蛋白的菌株；
(4)使用步骤(3)所得的菌株进行表达，获得HPV各型L1蛋白。
将上述获得的蛋白，经常规的处理方式，例如疏水层析、阴离子交换层析、羟基磷灰石层析等可获得较纯的抗原蛋白。
需要说明的是，使用毕赤酵母表达系统稳定表达HPV各型L1蛋白的方法是本领域众所周知的方法，具体可参照《分子克隆试验指南》及其他一些文献。本领域技术人员也可以选择例如大肠杆菌、酿酒酵母、汉逊酵母、CHO细胞、昆虫细胞等在内的其他表达方式获得HPV各型L1蛋白。
本发明最后一方面提供一种制备疫苗试剂盒的方法，所述方法包括根据前述方法制备脂质体佐剂和将脂质体佐剂包装进试剂盒中作为抗原试剂盒组分之外的试剂盒组分。
本发明的实施例中使用的主要试剂信息如下表。
相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
首先，本发明采用原料供应量比其他皂苷佐剂更为充足，且不具有溶血活性的TQL-1055为原料，一方面保证了佐剂生产的成本效益，另一方面使得制备的脂质体佐剂具有低毒性，高安全性的优点。
其次，常规方法通常将皂苷类物质溶于水相，再配合MPL和脂质通过薄膜分散法或微流控等方法制备成脂质体佐剂。由此获得的佐剂，其中的皂苷类物质通常黏附于或部分嵌入脂质体上，或者包封于含水小室中。结构的不稳定导致佐剂作用机制存在不同程度的差异，而且会存在皂苷类物质游离在体系中，从而造成批内和批间佐剂效果的不稳定以及严重的副反应。而本发明将TQL-1055溶解于有机溶剂，制备获得的脂质体佐剂具有将MPL和TQL-1055共同包裹于磷脂双分子层间或内外膜上的稳定结构。一方面保证了佐剂作用机制的稳定性，另一方面使得处于磷脂双分子层中或内外MPL和TQL-1055能够更好的发挥协同作用，制备的脂质体佐剂比常规方法获得的脂质体佐剂更加有效，联合抗原后能够激发更强的CD4+T细胞免疫应答。更特别的，在本发明的一些实施例中使用了脂质混合物作为磷脂双分子层的主要成分，其主要优点是阳离子脂质DOTAP与中性脂质DOPC的组合更稳定，制成的脂质混合物保持无沉淀状态时间可超过2个月，相比于仅使用中性脂质的稳定性增加3-5倍，由此制成的脂质体佐剂在提供相当佐剂效力的同时，具有更优异的稳定性。
本发明提供的含有TQL-1055水溶液的脂质体佐剂，其中增溶剂的添加有效改善了TQL-1055的溶解程度，在此基础上得到的含有TQL-1055水溶液的脂质体佐剂同样可以使MPL和TQL-1055更好的发挥协同作用，联合抗原后能够激发更强的CD4+T细胞免疫应答，具有佐剂优势；另外，添加额外的免疫刺激剂CpG，进一步达到了将这种佐剂优势翻倍的效果。
附图说明
以下附图仅旨在于对本发明做示意性说明和解释，并不限定本发明的范围。
其中：
图1-2为本发明实施例7中小鼠免疫检测结果。
图3为本发明实施例中TQL-1055水溶液制备的单室脂质体佐剂体系示意图。
图4为本发明中TQL-1055水溶液制备的多室脂质体佐剂体系示意图。
图5为本发明实施例中TQL-1055醇溶液制备的单室脂质体佐剂体系示意图。
图6为本发明中TQL-1055醇溶液制备的多室脂质体佐剂体系示意图。
图7(A)和(B)为本发明实施例11中免疫样品对大鼠一免和二免后各时段体温的影响结果图。
具体实施方式
下面将通过非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围，因为实施方案必然是多样的。本说明书中使用的用语仅是为了阐述特定的实施方案，而非作为限制，本发明的范围已界定在所附的权利要求中。
除非特别说明，本说明书中所使用的所有技术和科学用语均和本案所属技术领域的技术人员所普遍明了的意义相同。下面就本发明的优选方法和材料加以叙述，但是与本说明书中所述方法和材料类似或等效的任何方法和材料均可用以实施或测试本发明。下述实验方法如无特别说明，均为常规方法或产品说明书所描述的方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。
术语定义
在本申请中，提及“一个实施例”时均意指在该实施例中描述的具体参数、步骤等至少包含在根据本发明的一个实施例中。因而，在本申请中，若采用了诸如“根据本发明的一个实施例”、“在一个实施例中”等用语并不用于特指在同一个实施例中，若采用了诸如“在另外的实施例中”、“根据本发明的不同实施例”、“根据本发明另外的实施例”等用语，也并不用于特指提及的特征只能包含在特定的不同的实施例中。本领域的技术人员应该理解，在本发明说明书的一个或者多个实施例中公开的各具体参数、步骤等可以以任何合适的方式组合。
在本申请中，术语“佐剂”是指在临床上可应用于人体或具有人体应用前景的具有增强免疫反应功能的物质，包括当前已获批准的和将来可能获得批准的各种佐剂，例如但不限于铝佐剂、MF59及各种形式的佐剂组合物。
在本申请中，术语“脂质体”是本领域中是众所周知的，并且定义一般类别的囊泡，其包含围绕水性空间的一个或多个脂质双层。因此，脂质体由一个或多个脂质和/或磷脂双层组成，并且可以在其结构中含有其他分子，诸如蛋白或碳水化合物。因为存在脂质相和水相两者，脂质体可以包封或捕获水溶性材料、脂溶性材料和/或两亲性化合物。
脂质体大小可以从30nm至几μm变化，这取决于磷脂组成和用于其制备的方法。本发明的脂质体含有磷脂酰胆碱脂质，或基本上由磷脂酰胆碱脂质和固醇组成。
合适地，本发明的脂质体含有DOPC，或基本上由DOPC和固醇组成。
在本发明中，脂质体大小将在70nm至230nm的范围内，特别是在75nm至200nm的范围内，特别是75nm至180nm，诸如75-165nm。最佳地，脂质体应当是稳定的并且具有75-95nm的直径以允许通过过滤方便地灭菌。
脂质体的结构完整性可以通过方法诸如测量脂质体的大小(Z-平均直径，Zav)和多分散性的动态光散射(DLS)，或通过用于分析脂质体结构的电子显微镜来评价。合适地，平均粒径在70和230nm之间，和/或，多分散性(PDI)指数不大于0.35，尤其是不大于0.3，诸如不大于0.25。在一个实施方案中，平均粒径在75和95nm之间，和/或，多分散性(PDI)指数不大于0.2。
在一些情况下，溶剂和某些额外组分的存在可以影响脂质体大小。因此，在除去溶剂和并入任何额外组分之后，合适地测量脂质体大小。
在本申请中，术语“皂苷”、“三萜皂苷类似物”合适的是QS-21及其类似物，TQL-1055是一种合理设计的半合成皂苷佐剂QS-21类似物，旨在提高疫苗耐受性并提供与QS-21相同的强免疫应答。TQL-1055是一种半合成分子，其高效合成工艺采用来自皂树(Quillajasaponaria)树叶和树枝的原料，原料供应量比其他皂苷佐剂更为充足。一项临床试验显示，TQL-1055耐受良好、免疫应答强。通常，三萜皂苷类似物，尤其是TQL-1055，是至少90％纯的，诸如至少95％纯的，特别是至少98％纯的，尤其是99％纯的。
在本申请中，术语“TLR4激动剂”合适实例是脂多糖，合适地脂质A的无毒衍生物，特别是单磷酰脂质A，且更特别是3-脱-O-酰化的单磷酰脂质A(3D-MPL)。MLA(MPL)和3D-MLA(3D-MPL)已知并且不需要在本文中进行详细描述。参见例如1984年3月13日发布并转让给Ribi免疫化学制剂研究公司(Ribi ImmunoChem Research,Inc.)的美国专利号4,436,727，所述专利公开单磷酰脂质A及其制造。Myers等人的也转让给Ribi免疫化学制剂研究公司的美国专利号4,912,094体现3-脱酰单磷酰脂质A及其制造方法。还参见例如GB2220211和WO92/16556。从GB2220211(Ribi)处已知3-脱氧酰化单磷酰脂质A。在化学方面，其是3-脱氧酰化单磷酰脂质A与4、5或6个酰化链的混合物并且Ribi Immunochem Montana制造。国际专利申请WO92/16556中公开了3-脱氧酰化单磷酰脂质A的某种形式。关于MLA和3D-MLA的这些专利中的每一个的公开内容通过引用并入本文。
可以使用的其他TLR4激动剂是烷基氨基葡糖苷磷酸酯(AGP)，诸如WO98/50399或美国专利号6,303,347中描述的那些(还描述了用于制备AGP的方法)。一些AGP是TLR4激动剂，且一些是TLR4拮抗剂。
可用于本发明中的其他TLR4激动剂包括吡喃葡糖基脂质佐剂(GLA)，诸如描述于WO2008/153541或WO2009/143457。
通常，TLR4激动剂，诸如脂多糖且尤其是MPL，是至少90％纯的，诸如至少95％纯的，特别是至少98％纯的，尤其是99％纯的。
当佐剂中存在TLR4激动剂和三萜皂苷类似物两者时，则TLR4激动剂与三萜皂苷类似物的重量比合适地为1:5至5:1，更加合适地为1:4至4:1，在一些实施例中，优选为1:2、1:1.25、1:1或2:1。例如，在每人用剂量中MPL以50μg的量存在的情况下，则合适地TQL-1055可以以25μg、50μg、62.5μg或100μg的量存在。
三萜皂苷类似物：DOPC的比率将通常为约1:50至1:10(w/w)，合适地1:25至1:12(w/w)，且优选地1:20至1:14(w/w)，诸如1:16(w/w)。
在本申请中，术语“缓冲溶液”、“缓冲剂”包括但不限于磷酸盐缓冲溶液、柠檬酸盐缓冲液、Tris缓冲液、醋酸盐缓冲液或柠檬酸-磷酸缓冲液等缓冲系统。
在本申请中，术语“除去溶剂”回收的混合材料将在水和有机溶剂中包含脂质体。此类材料是用于制备脂质体佐剂的脂质体浓缩物，所述脂质体浓缩物包含水、有机溶剂、磷脂酰胆碱脂质、三萜皂苷类似物和胆固醇，诸如包含水、有机溶剂、DOPC、TQL-1055和胆固醇。回收的材料可以储存用于后来使用，或者可以进一步处理以除去所述溶剂的一些或全部。
为了促进脂质体在佐剂中的使用，期望除去基本上所有的有机溶剂(例如，留下至少98％w/w水，诸如至少99％水，特别是至少99.5％水，尤其是至少99.9％水，诸如至少99.99％)。合适地，残余有机溶剂的水平等于每人剂量小于150μg，诸如每人剂量小于100μg，诸如每人剂量小于50μg，且特别是每人剂量小于20μg(例如每人剂量10μg或更少)。期望地，所述残余有机溶剂的水平符合国际协调委员会关于人用药物的技术要求的残余溶剂指南Q3C(R6)。
可以通过多种方法来进行溶剂除去，所述方法可以单独或组合使用。合适的方法包括超滤和透析，特别是渗滤。
可以通过透析进行所述溶剂的至少一部分、诸如所述溶剂的基本上全部的除去。透析是使用半渗透性密闭容器，所述半渗透性密闭容器是选择性渗透的，使得当将回收的材料引入半渗透性密闭容器时，所述溶剂将穿过容器的半渗透性部分，并且将保留脂质体(还有皂苷或其类似物和TLR4激动剂，如果存在的话)。例如，所使用的半渗透性密闭容器可以包括单个半渗透膜，并且可以通过将包含回收的材料的半渗透性密闭容器浸入交换介质中并允许通过膜分离的液体通过扩散达到平衡而实现溶剂除去。透析可以以分批或连续操作模式进行。例如，透析可以用分批替换交换介质来重复多次，以达到期望水平的溶剂除去。透析也可以在连续过程中，其中回收的材料和/或交换介质连续地经历替换。
可以通过超滤进行所述溶剂的至少一部分、诸如所述溶剂的基本上全部的除去。超滤是使用包括通过半渗透性膜隔开的第一隔室和第二隔室的密闭容器。可以将回收的材料置于密闭容器的第一隔室中，然后可以对其施加相对于第二隔室的正压，使得迫使液体穿过密闭容器的半渗透性部分。渗滤是超滤的一种形式，其中通过将交换介质添加至容器的第一隔室，可以将剩余液体的至少一部分替换为交换介质。因此，随着超滤进行，剩余的液体将趋向于交换介质的组成。渗滤可以以各种方式进行-连续的(也称为恒定体积)，其中交换介质以与膜上的液体过滤相当的速率添加；不连续的，其中剩余液体的体积变化，并且交换介质以不连续的方式(例如，通过初始稀释和随后浓缩至原始体积，或通过初始浓缩并随后稀释至原始体积等)添加。最佳操作模式可以取决于许多因素，包括：1)初始样品体积、浓度和粘度，2)所需的最终样品浓度，3)样品在各种浓度下的稳定性，4)渗滤所需的缓冲液的体积，5)总处理时间，6)可用的储库大小，7)经济性。示例性渗滤膜包括Hydrosart 30kD。
在溶剂除去期间使用的交换介质不必对应于最终脂质体佐剂的介质，为了方便起见，交换介质合适地是期望的最终脂质体佐剂介质或其浓缩物，例如，磷酸盐缓冲盐水或所期望的另一种缓冲组合物。
“无菌级过滤器”意指在大于或等于1×107/cm2的有效过滤面积的攻击水平下被微生物攻击后产生无菌流出物的过滤器。为了本发明的目的，无菌级过滤器对于本发明领域的技术人员是众所周知的，无菌级过滤器具有0.15至0.25μm、合适地0.18-0.22μm、诸如0.2或0.22μm的孔径。
无菌级过滤器的膜可以由技术人员已知的任何合适的材料(例如但不限于乙酸纤维素、聚醚砜(PES)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚四氟乙烯(PTFE))制成。在本发明的一个具体实施方案中，本发明的滤膜中的一个或多个或全部包含聚醚砜(PES)，尤其是亲水性聚醚砜。
在本申请中，术语“抗原”、“抗原类成分”或“免疫原”是指能够激发免疫应答的多肽。合适地，所述免疫原是包含至少一个B或T细胞表位的抗原。激发的免疫应答可以是抗原特异性B细胞应答，其产生中和抗体。激发的免疫应答可以是抗原特异性T细胞应答，其可以是全身性应答和/或局部应答。抗原特异性T细胞应答可以包含CD4+T细胞应答，诸如涉及表达多种细胞因子(例如IFNγ、TNFα和/或IL2)的CD4+T细胞的应答。可替代地或额外地，所述抗原特异性T细胞应答包含CD8+T细胞应答，诸如涉及表达多种细胞因子(例如IFNγ、TNFα和/或IL2)的CD8+T细胞的应答。
所述抗原可以源自(诸如获得自)感染人和非人脊椎动物的人或非人病原体，包括例如细菌、真菌、寄生微生物或多细胞寄生虫，或癌细胞或肿瘤细胞。
在一个实施方案中，所述抗原是重组蛋白，诸如重组原核蛋白。
根据本发明的方法制备的脂质体佐剂可以与免疫原或抗原结合使用，脂质体佐剂也可以与抗原分开施用。抗原可以以每个人剂量0.1至100μg的量提供。
在本申请中，术语“疫苗组合物”是指一种组合物，其包含在个体，如人中，能够刺激免疫反应的免疫原性组分。疫苗组合物可以给予个体以提高抗相应病毒的免疫反应，其能够预防或治疗个体的相应病毒感染。所述病毒选自人免疫缺陷型病毒HIV-1、人乳头瘤病毒、水痘带状疱疹病毒、人单纯疱疹病毒、呼吸道合胞病毒、乙肝病毒、手足口病毒、柯萨奇病毒、人巨细胞病毒、流感病毒、冠状病毒和新型冠状病毒SARS-CoV-2。在本发明的一些实施方式中，优选地，所述病毒为水痘带状疱疹病毒。相应地，本文所用的术语“疫苗”是指治疗性疫苗(用于疾病的治疗)和预防性疫苗(用于疾病的预防)。
在本申请中，术语“包括”通常是指包含、总括、含有或包涵的含义。在某些情况下，也表示“为”、“由……组成”的含义。
实施例1.BFA-T-S佐剂的制备
本实施例以磷酸盐水溶液为TQL-1055的溶剂，制备了含有不同含量(25μg、50μg、100μg、200μg)TQL-1055的脂质体佐剂，以25μg为例，具体方法为：
(1)将4g DOPC、1g胆固醇和200mg MPL溶于20ml异丙醇，通过梯度减压旋蒸获得脂质薄膜。
(2)在脂质薄膜中加入50ml磷酸盐水溶液(50mM PB，包含100mM的NaCl)，在25℃水浴中旋转水化得到悬浮液。
(3)获得的悬浮液稀释至特定浓度后进行均质，均质后获得的脂质体以0.22μm聚醚砜膜(PES)过滤器过滤，最终获得适当特定的浓缩脂质体。
(4)取2mg TQL-1055，加391μl磷酸盐水溶液(50mM PB，包含100mM的NaCl)，涡旋，加176μl 100mM KOH，混匀后超声，获得3mg/ml TQL-1055溶液。
(5)取67μl 3mg/ml TQL-1055溶液，加653μl磷酸盐水溶液(50mM PB，包含100mM的NaCl)，调节pH至7，加80μl浓缩脂质体，使终浓度为DOPC 2mg/ml，胆固醇0.5mg/ml，MPL0.1mg/ml，TQL-1055 0.25mg/ml，标识为BFA-T0.25-S。
BFA-T0.5-S、BFA-T1-S、BFA-T2-S佐剂参照上述方法制备。
对该实施例制备的脂质体佐剂进行分析发现，脂质体包含水相和悬浮在水相中的单层囊泡，每个囊泡包含一个球形的双层脂质膜，MPL基本分布在磷脂双分子层内，而TQL-1055则基本分布在水相中，TQL-1055水溶液制备的单室脂质体佐剂体系示意图见图3。
实施例2.BFA-TH0.25-S佐剂的制备
本实施例以加入了增溶剂的磷酸盐水溶液为TQL-1055的溶剂，制备了含有25μgTQL-1055的脂质体佐剂，其中，增溶剂使用的是羟丙基β环糊精(HPβCD)，具体方法为：
(1)将4g DOPC、1g胆固醇和200mg MPL溶于20ml异丙醇，通过梯度减压旋蒸获得脂质薄膜。
(2)在脂质薄膜中加入50ml磷酸盐水溶液(50mM PB，包含100mM的NaCl)，在25℃水浴中旋转水化得到悬浮液。
(3)获得的悬浮液稀释至特定浓度后进行均质，均质后获得的脂质体以0.22μm聚醚砜膜(PES)过滤器过滤，最终获得适当特定的浓缩脂质体。
(4)取2mg TQL-1055，加662μl磷酸盐水溶液(50mM PB，包含100mM的NaCl)，涡旋，加88μl 100mM KOH，加250μl 40％w/v羟丙基β环糊精，混匀后超声，获得2mg/ml TQL-1055溶液。
(5)取100μl 2mg/ml TQL-1055溶液，加620μl磷酸盐水溶液(50mM PB，包含100mM的NaCl)，调节pH至7，加80μl浓缩脂质体，使终浓度为DOPC2mg/ml，胆固醇0.5mg/ml，MPL0.1mg/ml，TQL-1055 0.25mg/ml，标识为BFA-TH0.25-S。
该实施例制备的脂质体佐剂进行分析发现，与实施例1类似，MPL基本分布在磷脂双分子层内，而TQL-1055则基本分布在水相中。
实施例3.BFA-TH0.25/CpG-S佐剂的制备
本实施例以加入了增溶剂的磷酸盐水溶液为TQL-1055的溶剂，制备了含有25μgTQL-1055和50CpG的脂质体佐剂，具体方法为：
(1)将4g DOPC、1g胆固醇和200mg MPL溶于20ml异丙醇，通过梯度减压旋蒸获得脂质薄膜。
(2)在脂质薄膜中加入50ml磷酸盐水溶液(50mM PB，包含100mM的NaCl)，在25℃水浴中旋转水化得到悬浮液。
(3)获得的悬浮液稀释至特定浓度后进行均质，均质后获得的脂质体以0.22μm聚醚砜膜(PES)过滤器过滤，最终获得适当特定的浓缩脂质体。
(4)取2mg TQL-1055，加662μl磷酸盐水溶液(50mM PB，包含100mM的NaCl)，涡旋，加88μl 100mM KOH，加250μl 40％w/v羟丙基β环糊精，混匀后超声，获得2mg/ml TQL-1055溶液。
(5)1621μg CpG加100μl生理盐水溶解，为16mg/ml CpG。
(6)取100μl 2mg/ml TQL-1055溶液，加595μl磷酸盐水溶液(50mM PB，包含100mM的NaCl)，调节pH至7，加80μl浓缩脂质体，加16mg/ml CpG25μl，使终浓度为DOPC 2mg/ml，胆固醇0.5mg/ml，MPL 0.1mg/ml，TQL-10550.25mg/ml，CpG 0.5mg/ml，标识为BFA-TH0.25/CpG-S。
该实施例制备的脂质体佐剂进行分析发现，与实施例1类似，MPL基本分布在磷脂双分子层内，而TQL-1055则基本分布在水相中。
实施例4.TH0.25-S佐剂的制备
本实施例以加入了增溶剂的磷酸盐水溶液为TQL-1055的溶剂，制备了含有25μgTQL-1055的非脂质体佐剂，具体方法为：
(1)取2mg TQL-1055，加662μl磷酸盐水溶液(50mM PB，包含100mM的NaCl)，涡旋，加88μl 100mM KOH，加250μl 40％w/v羟丙基β环糊精，混匀后超声，获得2mg/ml TQL-1055溶液。
(2)取100μl 2mg/ml TQL-1055溶液，加700μl磷酸盐水溶液(50mM PB，包含100mM的NaCl)，调节pH至7，使终浓度为TQL-1055 0.25mg/ml，标识为TH0.25-S。
实施例5.BFA-T0.0625-C佐剂的制备
本实施例区别于常规方法，根据本发明的方法制备了含有6.25μg TQL-1055的脂质体佐剂，其中，最主要的，在制备过程中将TQL-1055先溶于DMSO再溶于乙醇/异丙醇混合有机溶剂中，或直接溶于乙醇/异丙醇混合有机溶剂中，具体方法为：
(1)称取282mg DOPC、72mg胆固醇和13.71mg MPL，溶解于7ml乙醇/异丙醇混合有机溶剂(乙醇异丙醇体积比1:1)。4mg TQL-1055溶解于100μl DMSO中，加100μl乙醇/异丙醇混合有机溶剂(乙醇异丙醇体积比1:1)，稀释至20mg/ml，为TQL-1055母液。
(2)取0.8ml溶解有DOPC、胆固醇和MPL的有机溶液，加0.1ml TQL-1055母液，加0.5ml乙醇/异丙醇混合有机溶剂(乙醇异丙醇体积比1:1)，混合后为有机相，磷酸盐水溶液(10mM PB，含150mM NaCl)为水相，微流体过程在25℃温度下以4ml/min的总流速和有机相:水相＝1:3的流速比运行。去除有机溶剂后0.22μm聚醚砜膜(PES)过滤器过滤，检测过滤后的样品粒径为128.6nm，PDI为0.171。
(3)30kD超滤管浓缩过滤后的样品至一定体积，至各组分含量为DOPC 1mg/ml，胆固醇0.25mg/ml，MPL 0.05mg/ml，TQL-1055 0.0625mg/ml，为免疫佐剂，标识BFA-T0.0625-C。
对该实施例制备的脂质体佐剂进行分析发现，脂质体包含水相和悬浮在水相中的单层囊泡，每个囊泡包含一个球形的双层脂质膜，MPL和TQL-1055均基本分布在磷脂双分子层内，TQL-1055醇溶液制备的单室脂质体佐剂体系示意图见图5。
实施例6.含有重组VZV gE抗原的疫苗组合物的制备
为了研究本发明所提供的脂质体佐剂的技术效果。本发明的发明人制成了含有免疫原和佐剂的疫苗组合物，免疫原使用的是水痘带状疱疹病毒gE重组蛋白，佐剂使用的是根据实施例1-5制备的佐剂。各组佐剂的设计方案如表1所示。
按制备过程中TQL-1055的溶剂划分，分组1～4为不同含量TQL-1055的水溶液组，其中水溶液仅为磷酸缓冲液，没有添加任何增溶剂成分。作为对比，分组5为TQL-1055的水溶液+增溶剂组，佐剂未制成脂质体形式。分组6为TQL-1055的水溶液+增溶剂组，其中TQL-1055的含量为25μg。分组7为在分组6的基础上加入了TLR9激动剂CpG。分组8为TQL-1055的醇溶液组，其中TQL-1055的含量为6.25μg。分组9为空白对照组。
通过大量的试验筛选发现，当佐剂中TQL-1055含量相同时，在相同免疫剂量下，TQL-1055的水溶液制备的脂质体佐剂或非脂质体佐剂无法达到与TQL-1055醇溶液制备的脂质体佐剂相当的免疫效果。出于节省原料并突出效果对比的考虑，分组8使用的佐剂中TQL-1055的含量仅为6.25μg。而分组5～7使用的佐剂中TQL-1055的含量均为25μg。
表1佐剂设计方案
疫苗组合物的具体配制方法为将gE重组蛋白以5μg的量与各组佐剂充分混合。
实施例7.重组水痘-带状疱疹病毒疫苗的佐剂效果评价
针对实施例6中获得的含有水痘带状疱疹病毒gE重组蛋白的疫苗组合物，发明人以C57BL/6小鼠为动物模型开展了免疫原性研究，利用实施例6制备的疫苗组合物考察本申请的脂质体佐剂联合gE抗原的免疫原性，从而评价本发明脂质体佐剂的效果。采用C57BL/6小鼠，每组10只，0天初免，两针间隔14天的免疫程序，于0天进行水痘苗接种，35天和49天进行重组带状疱疹疫苗免疫(分组1～5的小鼠免疫剂量为1/5HD；分组6～8的小鼠免疫剂量为1/10HD，HD代表的是0.5ml/剂)，并于第63天评价不同佐剂的细胞免疫效果。重组带状疱疹疫苗第二次免疫后14天(63d)，取小鼠脾脏分离小鼠脾淋巴细胞，以VZV gE(1-546aa)肽库为刺激物，通过流式细胞术检测细胞内细胞因子IFN-γ、IL-2的水平。小鼠免疫检测结果如表2和图1-2所示。
表2小鼠免疫检测结果
注：“—”存在等于0的数值，无法计算几何均值
分组1～4的结果显示，在不加入任何增溶剂的情况下，TQL-1055水溶液制备的脂质体佐剂联合gE抗原，其激发的CD4+T细胞免疫应答水平虽然与TQL-1055的含量有一些剂量依赖的关系，但统计学无显著差异。25μg的TQL-1055用量足以支撑本发明后续进行的各影响因素的研究。
分组5的结果显示，在TQL-1055含量均为25μg的情况下，若不将其制备为脂质体形式的佐剂，其佐剂效力甚至比未使用增溶剂的分组1还要低。而且，其联合gE抗原激发的细胞免疫应答水平远低于免疫剂量仅为其一半的分组6，结果是显著的。分组6与其差异仅在于制备的佐剂形式是脂质体佐剂，且免疫剂量是分组5的一半。此处本领域技术人员应该理解的是，理论上，在合适范围内，免疫剂量对免疫结果是有影响的。可见根据本发明所述的方法将佐剂制备形成脂质体是很有必要的。
免疫剂量同为1/10HD时，分组6的BFA-TH0.25-S佐剂虽然具备一定程度的佐剂优势，但添加了TLR9激动剂(CpG)的分组7所述的BFA-TH0.25/CpG-S佐剂进一步达到了将这种佐剂优势翻倍的效果。
更进一步的，根据本发明所述方法制备的BFA-T0.0625-C佐剂联合gE抗原免疫小鼠激发的细胞免疫应答水平远高于其他任意各组，甚至包括上述佐剂优势已经实现翻倍的BFA-TH0.25/CpG-S佐剂。说明根据本发明所述的制备方法，其中有机溶剂有助于使TQL-1055被脂质体包裹，均匀地分散于脂质体的磷脂双分子层间或内外膜上，被磷脂双分子层共同包裹或内外膜上的MPL和TQL-1055能够更好的发挥协同作用，有助于提高整体的佐剂效力，极显著的激发了高水平的CD4+T细胞免疫应答。
基于以上结果，按照本发明所述的方法，保证了新型脂质体佐剂的成功制备，使MPL和TQL-1055共同包裹于磷脂双分子层间或内外膜上，使得制备的脂质体佐剂比常规方法获得的脂质体佐剂作用机制更稳定，更加有效，联合抗原后能够激发更强的CD4+T细胞免疫应答。而且，本发明采用原料供应量比其他皂苷佐剂更为充足，且不具有溶血活性的TQL-1055为原料，不仅保证了佐剂生产的成本效益，而且制备的脂质体佐剂毒性更低。
实施例8.TQL-1055剂量优化
本实施例进一步探索关于TQL-1055的剂量。本研究采用C57BL/6小鼠，0天初免，两针间隔14天的免疫程序，于0天进行水痘苗接种，35天和49天进行重组带状疱疹疫苗免疫(1/10HD)。重组带状疱疹疫苗第二次免疫后14天(63d)，取小鼠脾脏分离小鼠脾淋巴细胞，以VZV gE(1-546aa)肽库为刺激物，通过流式细胞术检测细胞内细胞因子IFN-γ、IL-2的水平。结果显示，低剂量组(2.5μg)的TQL1055相对于中剂量组和高剂量组的免疫效果具有统计学差异。
表3不同剂量TQL-1055的小鼠免疫检测结果
佐剂 剂量 IL-2+ IL-2+IFN-γ+ IFN-γ+ 合计
BFA-TQL1055-2.5 MPL 5μg，TQL-1055 2.5μg 0.77 0.85 1.24** 2.86
BFA-TQL1055-5 MPL 5μg，TQL-1055 5μg 0.69 0.73 0.38 1.80
BFA-TQL1055-10 MPL 5μg，TQL-1055 10μg 0.74 0.30 0.22 1.26
注：显著差异中p＜0.05标示为*，p＜0.01标示为**
实施例9.MPL剂量优化
本实施例进一步探索优化MPL的剂量，本研究采用C57BL/6小鼠，随机分组，每组5只，0天初免，两针间隔21天的免疫程序，于0天和21天进行重组带状疱疹疫苗免疫(1/10HD)，并于第35天进行细胞内细胞因子检测评价疫苗细胞免疫效果。结果显示，MPL低剂量组(2.5μg)相对于MPL正常剂量组(5μg)表现出更佳的诱导细胞免疫应答的能力，二者无统计学差异。因此，在使用剂量优化的TQL-1055的情况下，使用减量的MPL即可获得相当的免疫效力，在保证免疫效力的前提下大大节省佐剂原料投入，降低成本。
表4不同剂量MPL的小鼠免疫检测结果
佐剂 剂量 IL-2+ IL-2+IFN-γ+ IFN-γ+ 合计
BFA08-5-2.5 MPL 5μg，TQL-1055 2.5μg 0.36 0.09 0.03 0.47
BFA08-2.5-2.5 MPL 2.5μg，TQL-1055 2.5μg 0.41 0.18 0.08 0.66
NaCl N/A 0.06 — — 0.06
注：“—”存在等于0的数值，无法计算几何均值
实施例10.脂质组成对佐剂免疫效果影响的研究
为了研究不同脂质组成对脂质体产生的影响，以不同的阳离子脂质与中性脂质比率制备脂质体溶液。将DOPC用不同比例DOPC/DOTAP配制的脂质混合物替换，参照实施例5、实施例6制备不同佐剂成分及不同DOPC/DOTAP比率的疫苗组合物进行制剂研究和免疫效果影响的研究。
不同佐剂成分及不同DOPC/DOTAP比率对脂质体大小的影响结果如表5所示。
表5不同佐剂成分及不同DOPC/DOTAP比率对脂质体大小的影响
本实施例的疫苗组合物的抗原类成分使用的是水痘带状疱疹病毒gE重组蛋白，考察脂质体佐剂中不同DOPC/DOTAP比率组成对免疫效果的影响，以C57BL/6小鼠为动物模型开展了免疫原性研究。
Gr1：小鼠随机分组，每组5只，0天初免，两针间隔14天的免疫程序，于0天进行水痘苗接种，35天和49天进行重组带状疱疹疫苗免疫(1/10HD)。重组带状疱疹疫苗第二次免疫后14天(63d)，进行细胞内细胞因子检测评价疫苗细胞免疫效果。
Gr2：小鼠随机分组，每组5只，采用0天初免，两针间隔21天的免疫程序，于0天和21天进行重组带状疱疹疫苗免疫(1/10HD)，并于第35天进行细胞内细胞因子检测评价疫苗细胞免疫效果。
表6佐剂中不同DOPC/DOTAP比率对细胞免疫的影响
注：“—”存在等于0的数值，无法计算几何均值
从免疫原性考虑，不同重量比的DOPC/DOTAP制备的脂质体佐剂都可以获得细胞免疫的保护效果。综合对脂质体粒径(nm)和PDI的考量，DOPC/DOTAP比例为1:1时佐剂粒径过大，因此当脂质体中使用混合脂质时，优选9:1和4:1比例关系的DOPC/DOTAP脂质混合物，尤其优选9:1比例关系的DOPC/DOTAP脂质混合物。
实施例11.脂质体佐剂对大鼠体温的影响
在以1/10HD施用各免疫样品对大鼠进行一免和二免的给药日，在给药后各时段检查各免疫样品对大鼠体温的影响，以生理盐水作为空白对照组，AS01佐剂(每人用剂量0.5mL含50μg的MPL，50μg的QS-21，4.385mg氯化钠，1mg的DOPC，0.54mg磷酸二氢钾，0.25mg胆固醇和0.15mg无水磷酸二钠)作为阳性对照组。使用直肠数字温度计监测各组大鼠的体温并记录(测温探头进入直肠内约10s，等待数值稳定后读数)，分组见下表。相对于生理盐水对照组，经历Gr1、Gr2和Gr3首次免疫和二次免疫后各时段的大鼠体温变化幅度轻微，而Gr5在一免和二免后普遍显著地引起大鼠体温升高，产生不良副反应。对体温的评估表明，BFA08-5-2.5、BFA08-2.5-2.5和BFA34-1-5-2.5都被动物很好地耐受，安全性高。
表7大鼠一免测温结果
表8大鼠二免测温结果
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (13)

1.一种含有TQL-1055水溶液的脂质体佐剂，其特征在于脂质体佐剂成分包括：
a)DOPC、胆固醇和MPL组成的类脂；
b)TQL-1055和增溶剂；
c)缓冲液；
其中DOPC与胆固醇的重量比为3-5:1，胆固醇与MPL的重量比为4-6:1，TQL-1055与MPL的重量比为0.8-2:2，TQL-1055与增溶剂的重量比为1:40-100。
2.如权利要求1所述的脂质体佐剂，其特征在于脂质体佐剂成分包括：
a)DOPC、胆固醇和MPL组成的类脂；
b)TQL-1055和增溶剂；
c)缓冲液；
其中DOPC与胆固醇的重量比为4:1，胆固醇与MPL的重量比为5:1，TQL-1055与MPL的重量比为1:1或1:2，TQL-1055与增溶剂的重量比为1:50。
3.如权利要求1所述的脂质体佐剂，其特征在于每人份脂质体佐剂30-80μg，成分包括：
a)DOPC、胆固醇和MPL组成的类脂；
b)TQL-1055和羟丙基β环糊精；
c)缓冲液；
其中DOPC浓度为2mg/ml，胆固醇浓度为0.5mg/ml，MPL浓度为0.05-0.1mg/ml，TQL-1055浓度为0.05-0.1mg/ml，羟丙基β环糊精浓度为2.5-5mg/ml。
4.一种含有TQL-1055的脂质体佐剂，其特征在于脂质体佐剂成分包括：
a)DOPC、胆固醇和MPL组成的类脂；
b)TQL-1055；
c)缓冲液；
其中TQL-1055分散在类脂中，DOPC与胆固醇的重量比为3-5:1，胆固醇与MPL的重量比为4-6:1，TQL-1055与MPL的重量比为0.8-2:2。
5.如权利要求4所述的脂质体佐剂，其特征在于脂质体佐剂成分包括：
a)DOPC、胆固醇和MPL组成的类脂；
b)TQL-1055；
c)缓冲液；
其中TQL-1055分散在类脂中，DOPC与胆固醇的重量比为4:1，胆固醇与MPL的重量比为5:1，TQL-1055与MPL的重量比为1:1或1:2。
6.如权利要求4所述的脂质体佐剂，其特征在于每人份脂质体佐剂30-80μg，成分包括：
a)DOPC、胆固醇和MPL组成的类脂；
b)TQL-1055；
c)缓冲液；
其中TQL-1055分散在类脂中，DOPC浓度为2mg/ml，胆固醇浓度为0.5mg/ml，MPL浓度为0.05-0.1mg/ml，TQL-1055浓度为0.05-0.1mg/ml，羟丙基β环糊精浓度为2.5-5mg/ml。
7.如权利要求1-6所述的脂质体佐剂，其特征在于脂质混合物中还包括免疫刺激剂CpG，其中CpG与MPL重量比为1-5:1。
8.如权利要求1-6所述的脂质体佐剂，其特征在于所述DOPC用同等质量的脂质混合物替换，其中脂质混合物由4:1或9:1的DOPC和DOTAP组成。
9.如权利要求8所述的脂质体佐剂，其特征在于脂质混合物的浓度为2mg/ml。
10.权利要求1-3中任一项所述的脂质体佐剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
步骤1)制备有机相：将DOPC、胆固醇和MPL按质量比90-110:20-30:3-6的比例溶解于有机溶剂中，得到有机相备用；
步骤2)制备水相：取与MPL的重量比为0.8-2:2的TQL-1055，取与TQL-1055重量比为1:50的增溶剂与注射用水、生理盐水或缓冲盐溶液混合，制得水相备用；
步骤3)制备脂质体溶液：用微流控装置混合有机相和水相，去除有机溶剂、过滤得到脂质体溶液。
11.权利要求4-6中任一项所述的脂质体佐剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
步骤1)制备有机相：将DOPC、胆固醇和MPL按质量比90-110:20-30:3-6的比例溶解于有机溶剂中，得到有机溶液备用；制备TQL-1055母液：取与MPL的重量比为0.8-2:2的TQL-1055溶解在有机溶剂中，制得TQL-1055母液；混合备用的有机溶液和TQL-1055母液得有机相；
步骤2)制备水相：取注射用水、生理盐水或缓冲盐溶液，制得水相；
步骤3)制备脂质体溶液：用微流控装置混合有机相和水相，去除有机溶剂、过滤得到脂质体溶液。
12.如权利要求10或11所述的制备方法，其特征在于所述步骤3)可以用如下步骤替代：
制备脂质体溶液：将有机相在水浴下减压、旋蒸后得脂质薄膜；在脂质薄膜中加入注射用水、生理盐水或缓冲盐溶液混合进行水化，经过微射流均质获得浓缩脂质体；浓缩脂质体与水相混合、加缓冲液稀释成所需要浓度的脂质体溶液。
13.如权利要求10或11所述的脂质体佐剂的制备方法，其特征在于所述有机溶剂是乙腈、二甲基甲酰胺(DMF)、甲醇、丙酮、二甲基亚砜(DMSO)、乙醇、正丙醇、异丙醇或其中两者的混合物，优选乙醇、异丙醇或两者的混合。
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