JP2001501640A

JP2001501640A - ワクチン

Info

Publication number: JP2001501640A
Application number: JP10517196A
Authority: JP
Inventors: ガルコン，ナタリー; フリード，マルタン
Original assignee: スミスクラインビーチャムバイオロジカルズソシエテアノニム
Priority date: 1996-10-05
Filing date: 1997-09-30
Publication date: 2001-02-06
Also published as: CA2267191A1; AU4781297A; IL128985A0; BR9711853A; KR20000048866A; TR199900729T2; HUP9904549A3; AU714930B2; NO991524L; EP0939650A1; AR009958A1; CZ116799A3; PL332633A1; CN1238696A; HU9904549A; GB9620795D0; CO4910170A1; ZA978868B; WO1998015287A1; NO991524D0

Abstract

(57)【要約】本発明はみょうばん、抗原、免疫活性サポニン画分及びステロールを含んで成るワクチン組成物に関する。

Description

【発明の詳細な説明】ワクチン本発明は新規のワクチン製剤、その製造方法及び医薬品におけるその用途に関する。詳しくは、本発明はみょうばん、抗原、キラジャ・サポナリア・モリナ(Q uillaja Saponaria Molina)の樹皮に由来する免疫活性画分、例えばQS21、及びステロールを含むワクチンに関する。南米の樹木キラジャ・サポナリア・モリナの樹皮に由来するアジュバント活性を有する免疫活性サポニンが当業界において公知である。例えば、QA21としても知られるQS21、即ち、キラジャ・サポナリア・モリナ樹木に由来のHplc精製画分が米国特許第5,057,540号に開示されている（QA21として）。キラジャ・サポニンはScottら、Int．Archs．Allergy Appl．Immun.，1985，77，409によってもアジュバントとして開示されている。しかしながら、アジュバントとしてのQS21の利用は一定の欠点が伴う。例えば、QS21を哺乳動物に遊離分子として注射すると、壊死、即ち局所的な組織死がその注射部位において観察されている。 WO96／33739は抗原、キラジャ・サポナリア・モリナの樹皮に由来する免疫活性画分、例えばQS21及びステロールを含んで成るワクチン製剤を開示する。驚くべきことに、MPL，QS21及びSUVを含むワクチン製剤におけるみょうばんの組込みは体液性及び細胞性応答を高め、そしてMPL,QS21，SUV及びみょうばんを含むワクチン製剤は良好な反応原性プロフィールを伴いながら無毒であり、且つ高いアジュバント活性を有することがこの度見い出された。更に、かかる併合アジュバントはTH１応答を優先することが示された。第一の観点において、本発明はみょうばん、免疫活性サポニン画分及びステロールを含んで成るワクチンアジュバントを提供する。「みようばん」とは水酸化アルミニウム又はリン酸アルミニウムを意味する。好ましくは、本発明のアジュバント組成物は実質的に純粋な形態で免疫活性サポニン画分を含む。好ましくは、本発明の組成物はQS21を実質的に純粋な形態で含み、即ちQS21は純度90％以上、好ましくは純度95％以上、そして最も好ましくは純度98％以上である。本発明の組成物において有用なその他の免疫活性サポニン画分にはQA17／QS17 が含まれる。QS21及びコレステロールを含んで成る本発明の組成物は、コレステロールのない組成物と比べて低い反応原性を示し、しかもそのアジュバント効果はそのままである。更に、QS21はpHが約７以上の場合の塩基性条件下で分解することが公知である。本組成物の更なる利点は、塩基媒介加水分解に対するQS21の安定性がコレステロール含有製剤において高まっていることにある。好適なステロールにはβ−シトステロール、スチグマステロール、エルゴステロール、エルゴカルシフェロール及びコレステロールが含まれる。これらのステロールは当業界において周知であり、例えばコレステロールはMerck Index 第11 版p341において、動物脂肪の中で見い出せる天然ステロールとして開示されている。最も好ましくは、ステロールはコレステロールである。本発明の好適な組成物はリポソーム構造、即ち、小単層小胞(SUV）を形成するものである。ステロール／免疫活性サポニン画分がISCOM構造を形成する組成物も本発明の態様を構成する。 QS21：ステロールの比は典型的には１：100〜１：１程度の重量比であろう。好ましくは過剰のステロールが存在し、QS21：ステロールの比は少なくとも１：１ｗ／ｗとなる。ヒト投与のためには典型的にはQS21及びステロールはワクチンの中に約１μｇ〜約100μｇの範囲、好ましくは約10μｇ〜約50μ ｇの範囲においてQS21の１回の投与当りに存在するであろう。リポソームは好ましくは中性脂質、例えばホスファチジルコリンを含み、それは好ましくは室温で非結晶であり、例えば卵黄ホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン又はジラウリルホスファチジルコリンである。当該リポソームは帯電脂質も含み、それは飽和脂質より成るリポソームについてのリポソーム−QS21構造の安定性を高める。このような場合においては、帯電脂質の量は好ましくは１〜20重量％、最も好ましくは５〜10重量％とする。ステロール、対、リン脂質の比は１〜50モル％、最も好ましくは20〜25モル％とする。本発明の特に好適、且つ好都合な組成物はMPL（３−デアシル化モノ−ホスホリル脂質Ａ，３Ｄ−MPLとしても知られる）を含む。３Ｄ−MPLはGB2220211(Ribi )からの４，５又は６本のアシル化鎖をもつ３タイプのデ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａの混合物として知られ、そしてRibi Immunochem．Montanaにより製造されている。好適な形態が国際特許出願94／21292に開示されている。本発明の適当な組成物は、リポソームがまずMPL抜きで調製され、次いでMPLが 100nmの粒子として添加されたものである。従って、MPLは小胞膜内に含まれていない（「MPLは外」として知られる）。MPLが小胞膜内に含まれている組成物（「 MPLは中」として知られる）も本発明の態様を構成する。抗原は小胞膜内に含まれるか、又は小胞膜の外部に含まれていてよい。好ましくは、可溶性抗原は外部にあり、そして疎水性又は脂質付加抗原は膜の内側又は外側のいづれかに含まれている。本発明の好適な観点において、リポソーム／SUVをまずQS21に加え、次いでみょうばんと混合し、みょうばんに大量のQS21を結合させる（リポソームを介する相互作用を通じて）。かかる製剤は、注射すると、みょうばんの貯蔵効果により、QS21が遊離である場合又はリポソームに固定されていない場合よりもゆっくりとした身体へのQS21の放出をもたらすものと期待される。MPL，QS21，SUV及びみょうばんを含む製剤が極めて有利であり、なぜならそれらは無毒且つ高度に免疫原性であるからである。好ましくは、当該ワクチン製剤はヒト又は動物病原体に対する免疫応答を誘導することのできる抗原又は抗原性組成物を含むであろう。かくして第一の観点において、本発明はみょうばん、抗原、免疫活性サポニン画分及びステロールを含んで成るワクチン組成物を提供する。当業界において公知の抗原又は抗原性組成物、例えば多糖抗原、HIV−１に由来する抗原もしくは抗原性組成物(例えばgp120又はgp160)、任意のネコ免疫不全ウィルス、ヒト又は動物ヘルペスウィルス、例えばgDもしくはその誘導体、又は即時早期タンパク質、例えばHSV１もしくはHSV２由来のICP27、サイトメガロウィルス（特にヒト)(例えばgB又はその誘導体）、バリセラ・ゾスター・ウィルス（例えばgpＩ，II又はIII）、又は肝炎ウィルス、例えばＢ型肝炎ウィルス、例えばＢ型肝炎表層抗原もしくはその誘導体、Ａ型肝炎ウィルス、Ｃ型肝炎ウィルス及びＥ型肝炎ウィルス、又はその他のウィルス性病原体、及び呼吸性シンシチウムウィルス（例えばHSRV Ｆ及びＧタンパク質又は米国特許第5,149,650号に開示のその免疫原性フラグメント、又はHSRVタンパク質Ｆ及びＧ由来の免疫原性フラグメントを含むキメラポリペプチド、例えば米国特許第5,1 94,595号に開示のFG糖タンパク質）、髄膜炎株、例えばＡ，Ｂ及びＣ型髄膜炎、ストレプトコッカス・ニューモニア(Streptococcus Pneumonia)、ヒトパピロマウィルス、インフレンザウィルス、ヘモフィルス(Haemophilus)インフレンザＢ( Hib)、アプスタイン・バー・ウィルス(EBV)に由来する抗原、又は細菌病原体、例えばサルモネラ（Salmonella）、ナイゼリア(Neisseria)、ボレッリア(Borrel ia)(例えばOspAもしくはOspB又はその誘導体）、又はクラミジア(Chlamydia)、又はボルデッテラ（Bordetella）由来の抗原、例えば、Ｐ．69，PT及びFHA、又は寄生虫、例えばプラスモジウム（Plasmodium）もしくはトキソプラスマ（toxo plasma）由来の抗原が本組成物において利用できうる。 HSV糖タンパク質Ｄ（gD）又はその誘導体が好適なワクチン抗原である。それはウィルス膜上に位置し、そして感染細胞の細胞質の中にも見い出せる（Eisenb erg Rら、Ｊ．ofVirol．1980 35 428-435）。それはシグナルペプチドを含む393 個のアミノ酸を含んで成り、そして約60kDの分子量を有する。全てのHSVエンベロープ糖タンパク質のうち、おそらくはこれが最もよく特性決定されている(Coh enら、J．Virology 60 157-166)。in vivoで、それは細胞膜に対するウィルス付着の中心的な役割を果たすことで知られる。更に、糖タンパク質Ｄはin vivoで中和抗体を誘導し、そして動物を致死的な負荷から守ることが示されている。gD 分子のトランケーション形態はＣ末端アンカー領域を含まず、そして哺乳動物細胞の中で可溶性タンパク質として生成され得、細胞培養上清液の中へと輸送される。かかるgDの可溶性形態が好ましい。gDのトランケーション形態の製造はEP 0 139417に記載されている。好ましくは、gDはHSV−２に由来する。本発明の態様は308個のアミノ酸のトランケーション化HSV−２糖タンパク質Ｄであり、それはアミノ酸番号１〜30 6にわたる天然糖タンパク質と、その膜アンカー領域を欠くトランケーション化タンパク質のＣ末端に付加されたアスパラギン及びグルタミンとを含んで成る。このタンパク質の形態はシグナルペプチドを含み、それが切断されて成熟可溶性の283アミノ酸タンパク質が宿主細胞から分泌されるようになる。本発明の別の観点において、Ｂ型肝炎表層抗原が好適なワクチン抗原である。本明細書における「Ｂ型肝炎表層抗原」又は「HBsAg」なる表現はHBV表層抗原を表示する任意のHBsAg又はそのフラグメントを含む。HBsAg抗原の226アミノ酸配列に加えて、本明細書において言及するHBsAgは、所望するなら、上記参考文献及びEP−Ａ−0278940に記載のプレ−Ｓ配列の全て又は一部を含みうる。特に、HBsAgはad血清型のＢ型肝炎ウィルス上のオープンリーディングフレームに対してHBsAgのＬ−タンパク質の残基１２−５２、それに続く残基133−145、それに続く残基175−400を含んで成るアミノ酸配列を含んで成る（このポリペプチドはＬ^★と称する；EP 0414374参照）。本発明の範囲内のHBsAgはEP 0198474(Endo tronics)に記載のプレ−Ｓ１−プレＳ２−Ｓポリペプチド又はその近似体、例えばEP 0304578（McCormic and Jones）に記載のものも含みうる。本明細書に記載のHBsAgは突然変異体、例えばWO91／14703又はヨーロッパ特許出願番号0511855A 1に記載の「エスケープ突然変異体」、特に145位でのアミノ酸置換がグリシンからアルギニンに至っているHBsAgにも及ぶ。通常、HBsAgは粒状であろう。これらの粒子は例えばＳタンパク質と単独で含んで成るか、又は複合粒子、例えば（Ｌ^★，Ｓ）であってよく、ここでＬ^★は前述の通りであり、そしてＳはHBsAgのＳ−タンパク質を意味する。この粒子は酵母の中で発現される形態において有利である。Ｂ型肝炎表層抗原Ｓ−タンパク質の調製はかなり発表されている。例えば、Ha rfordら(1983)Develop．Biol．Standard 54，p125，Greggら(1987)Biotechnolog y，5，p479，EP 0226846，EP 0299108及びその中の引用文献を参照のこと。別の態様において、当該ワクチン抗原はRSV抗原である。特に、Ｆ／Ｇ抗原である。米国特許第5,194,595号（Upjohn）には、RSVのＦ及びＧ糖タンパク質の免疫原セグメントを含むキメラ糖タンパク質が記載され、そしてかかるタンパク質が様々な系、例えば細菌、酵母、哺乳動物（例えばCHO細胞）及び昆虫細胞（例えばバキュロウィルスを利用して）から発現されうる。 Wathenら（J．Gen．Virol．1989，70，2625-2635）には、Ｇタンパク質のアミノ酸97−279に連結されたＦタンパク質のアミノ酸１−489より成る、バキュロウィルスベクターを利用して発現される特殊なRSV FGキメラ糖タンパク質が記載されている。本発明の範囲に属する製剤は抗腫瘍抗原も含んでよく、そして癌を免疫療法処置するために有用でありうる。ワクチン製剤は一般にNew Trends and Developments in Vaccines，Vollerら編、University Park Press，Baltimore，Maryland．USA，1978に記載されている。リポソーム内への封入は例えばFullertonの米国特許第4,235,877号に記載されている。巨大分子へのタンパク質の接合は例えばLikhiteの米国特許第4,372,9 45号及びArmorらの米国特許第4,474,757号に記載されている。各ワクチン投与におけるタンパク質の量は、免疫防御応答を誘導し、しかも典型的なワクチンの著しい有害副作用を及ぼさない量として選定される。かかる量はどの特異的な免疫原を採用するか、及びどのようにして提供されるかに依存して変わるであろう。一般に、各用量は１〜1000mcg、好ましくは２〜100mcg、最も好ましくは４〜40mcgのタンパク質を含んで成るであろう。特定のワクチンに関する最適用量は被検体における適切な免疫応答の観察を包含する標準試験により確認されうる。一次ワクチン接種の後、被検体に適当な間隔をあけて１又は数回のブースター免疫を与えてよい。本発明の製剤は予防及び治療の双方の目的のために利用されうる。従って、更なる観点において、本発明はヒト患者の処置のために本発明のワクチン製剤の利用を提供する。本発明は患者に本発明のワクチンを有効量で投与することを含んで成る処置の方法を提供する。詳しくは、本発明はウィルス、細菌、寄生虫、感染症又は癌を処置するための方法であって、患者に本発明のワクチンを有効量で投与することを含んで成る方法を提供する。以下の実施例及びデーターは本発明を具体化する。実施例１みょうばん、SUV MPL及びQS21を含むワクチンの調製 1.1 SUVの調製方法有機溶媒中の脂質（例えば卵黄又は合成ホスファチジルコリン）及びコレステロールの混合物を真空（又は不活性気流のもとで）乾燥させる。水性溶液（例えばリン酸緩衝食塩水）を加え、そしてこの槽を全ての脂質が懸濁されるまで撹拌する。次いでこの懸濁物をリポソームサイズが100nmへと縮小されるまでマイクロ流動化し、次いで0.2μｍのフィルターで除菌濾過する。押出又は音波処理がこの工程に代わることができる。典型的にはコレステロール：ホスファチジルコリンの比を１：４（ｗ／ｗ）とし、そして水性溶液を加えて最終コレステロール濃度を５〜50mg／mlにする。 1.2 抗原（１〜500μｇ、好ましくは10〜100μｇ）をみょうばん（例えば水酸化アルミニウム又はリン酸アルミニウム）（100〜500 μｇ）水に加える。水の容量は最終製剤の容量が500μｌとなるように選定する。15〜30分インキュベーション後、50μｇのMPLを小粒子MPLの形態(WO94／21292 )で加える。MPLを室温で15〜30分かけてみょうばんに収着させる。10倍濃度のリン酸緩衝食塩水(1.5Ｍの塩化ナトリウム、0.5Ｍのリン酸ナトリウム、pH 7.5)を最終製剤が等張となる容量で加える。この製剤を室温で15〜30分インキュベーションする。Ｑ21（50μｇ）をSUV(50〜250μｇのコレステロールを含む)に加える。この混合物を上記みょうばん／抗原／MPL／バッファー混合物に加える。必要なら、静菌剤、例えばチオメルサールを加える（50μｇ）。実施例２表１は25重量％のジオレオイルホスファチジルコリンを含むリポソームの有無で、且つQS21と比べ５倍過剰量のコレステロールを利用してのみょうばんに対するQS21の結合量を示す。みょうばんに対するＱ21の結合量を増大させるためにはリポソームの量を減らすことができる。これはコレステロール：QS21の比を下げるが、QS21は１：１以上のコレステロール：QS21の比で無毒なままであることが示されている。表２はみょうばんの量を減らすと（500μｇから100μｇ）結合するQS21の量が有意に下がり、そして結合するMPLの量も減ることを示す。リポソームの添加を減らし、しかしながらコレステロール：QS21の比を１：１又はそれより大に維持することで、増大する量のQS21及びMPLがみょうばんに結合できる。実施例３リポソームと組合せた抗原（単純ヘルペスウィルス２由来のgD2t−CHO細胞において発現し、そして成熟糖タンパク質の成熟Ｎ末端（由来の283アミノ酸を含んで成る）とMPL及びQS21の併合のアジュバント効果をみょうばんの有無で試験した。製剤はアフリカグリーンモンキーで試験した。アフリカグリーンモンキーは20μｇのgDt2t+50μｇのMPL+50μｇのQS21で、リポソーム(250μｇのコレステロール＋１mgのDOPC)の有無で、及び500μｇのみょうばんの有無で、２回（０，28日目）免疫した。42日目に免疫応答を分析した。その結果を図１〜４に概略する。体液性応答はgDタンパク質に対するIgGとして測定した。図１はMPL＋QS21＋SU V＋みょうばんの組合せが、みょうばん抜きのものと比べ高い力価を誘導したことを示す。図２は本発明の製剤が優れ抗原特異性増殖を供することを示す。このデーターは、MPL及びQS21及びSUVを含むワクチン製剤への水酸化アルミニウムの組込みが、体液性及び細胞性応答の双方を高めることを示す。これは予期しない発見であり、なぜならアジュバントとしてのアルミニウムはTH２型応答を優先する傾向にあることが一般に認識されているにもかかわらず、ここで示す結果はその応答がみょうばんの添加により抑制されない有意なTh１成分を含むことを実証したからである。 MPL及びQS21及びSUV及びみょうばんを含む製剤は無毒であり、且つ高度に免疫原性である。実施例４ RSV FG CHO細胞誘導タンパク質の製造プラスミド pEE14−FGはＦ（１−525）及びＧ（69−298）のアミノ酸配列間での融合を含んで成るキメラ構築体を含み、そしてA．BOLLEN（ULB/CRI，Belgium) の協力により入手できた。このFG融合タンパク質は全部で755個のアミノ酸を含む。これはＦのＮ−末端シグナル配列から出発し、そしてＦ糖タンパク質のＣ末端トランスメンブランドメイン(525−574)−アンカードメインを欠く。それにＧ糖タンパク質の細胞外領域が続き、典型的なクラスII糖タンパク質であるＧのシグナル／アンカードメインを含むアミノ末端領域はない。 pEE14−FG発現プラスミドは、Asp 7181（ブラント）5’−HindIII（ブラント）３’制限フラグメント（2188bp）としてのpNIV2857(A．Bollen，ULB/CRI，Bel gium)由来のFGコード配列の、pEE14(Celltech)のSmaＩ部位への挿入により作製した。FG開始ATGの代わりにKozak配列を／pNIV2857構築体の中に下記の通りに作製した： pEE14−FGにおけるＦ配列はSS2 RSV株に由来し、そしてPringle博士の好意によりワクシニアベクターの中でcDNA構築体として利用できた（Baybutt and Prin gle，J．Gen．Virol.，1987，2789-2796）。Ｇ配列はA2 RSV株に由来し、そして G．Wertz博士（Alabama，USA）より入手した組換Ｇワクシニアウィルスから作製した。 CHO K1トランスフェクション及び安定FGタンパク質発現 MCB 024M（Celltech）由来のCHO K1細胞をCa−リン酸−グリセロールトランスフェクション手順を利用し、２回CsCl精製した20μｇのpEE14−FGプラスミドDNA でトランスフェクションした。細胞クローンをGS（グルタミンシンセターゼ）発現系(Ｃｒｏｃｅｔｔら、Bio Techn.，1990，Vol 8，662)の手順に従って選定し、そして２５マイクロモルのメチオニンスルホキシミン(MSX)の存在下で、グルタミンを含まず、且つ10％の透析FBS(胎児牛血清)の添加されたG MEMの中で増幅された。トランスフェクション後、39個のMSX耐性クローンを24穴プレートでスクリーニングし、そしてその上清液をFG融合タンパク質の分泌について試験した。トランスフェクタントは全て特異的「サンドイッチ」ＥＬＩＳＡアッセイ(即ち、ウサギポリクローナル抗FG血清／抗原／mAB19)を利用してＦ抗原発現について陽性であると証明された。モノクローナル抗体19はコンホメーションＦ１−エピトープを認識し、そして中和性である。３つの最良FG産生クローン（ｎ°７，13及び37）を96穴プレート中でウェル当り0.07個の細胞を利用する限界希釈アッセイで単細胞継代培養した。全部で59個の陽性サブクローンが得られ、そして16の最良FG産生体をウェスタンブロット及びELISAにより更に特性決定した。再度８個のFG−サブクローンを更に増幅させ、そしてそのFG発現を酪酸ナトリウム（２mM）又はDMSO（１又は２％）の有無で評価した。６つのサブクローンを増幅させ、そして細胞バイアルを作り、そして−80℃及び液体Ｎ₂で保存した。最後に、３つの最良FGサブクローンを選別した。これらはCHOK1 FG°7.18、°13.1及び°37.2である。モノクローナルmAB19によるウェスタンブロット分析（非還元条件）は約135kD aで主要FGバンドを示した。組換バキュロウィルスFG感染細胞（UpJohn）由来の精製FGタンパク質は±100kDaでの主要ブロードバンド、及び類似のブロット条件下で±70kDaでのその他のバンドとして出現した。 CHO−FG細胞培養培地への酪酸ナトリウムの添加はサブクローン及び細胞培養増殖条件に依存してFGの発現レベルを３〜12倍高めた。特に、サブクローンCHO −FG 13.1は酪酸塩の存在下でFGタンパク質を８〜10倍高く発現した(WB／ELISA) 。発現レベルの決定は標準品としての精製FGバキュロタンパク質を用いるELISA( mAB19又はMoAb AK13)により、及び系列希釈を利用するウェスタンブロット分析により実施した。 ELISAアッセイ及び細胞培養条件に依存して、CHO−FGの発現レベルは酪酸塩による処理を経て５〜12μｇのFG／mlとなる。蓄積条件下及び培地変換（３〜５日）により、16〜28μｇの分泌FGタンパク質／mlの収量が得られた。 CHO K1 FG 13.1細胞系を専用増殖培地を利用する懸濁及び無血清（ｓ／SF）条件に順応させた。酪酸塩抜きの培地中での細胞系CHO−FG 13.1 ｓ／SF増殖は、酪酸塩を含む培地中での親付着細胞系増殖と似た収量を示した。CHO−FG 13.1 ｓ／SF培地への酪酸塩の添加はFGの生産に対してほとんど影響を及ぼさなかった（1.5〜２倍の上昇）。長期発現評価及び予備遺伝子特性決定はCHO−FG 13.1及びｓ／SF順応13.1細胞系が安定であり、インタクトFG発現カセットを含み、長さ約3000ヌクレオチドの一本のmRNAバンドを生起することを示した（サザン及びノーザン分析）。CHO−FGクローン13.1ｓ／SFをFG抗原の生産のために更に用いた。 RSV(呼吸性シンシチウムウィルス）由来のFGタンパク質に対するアフリカグリーンモンキーにおける免疫応答の増強のためのみょうばん／MPL／QS21／SUVの利用 FGタンパク質(RSV由来のＦ−及びＧ−タンパク質を含む融合タンパク質)をCHO 細胞の中で発現させ、そして精製した。20μｇの精製タンパク質をみょうばん(5 00μｇ)の上に収着させ、それにモノホスホリル脂質Ａ(MPL：50μｇ)を添加した。室温で30分インキュベーション後、リン酸緩衝食塩水を添加した。次いでSUV 単独又はSUVとQS21との混合物(50μｇのQS21、250μｇのコレステロールと１mg のDOPCとを含むSUV)を加えた。アフリカングリーンモンキーにこれらの製剤、又はみょうばんのみの上のFG、又はみょうばん抜きにMPL，SUV及びQS21と混合した FGを３回注射した。図５は各製剤から得られたRSV中和力価及びFG−ELISA力価を示す。グループみょうばん／MPL／QS21／SUVが最高の力価を誘導することが明らかである。実施例５ QS21／SUV含有製剤とSL^★抗原含有Ｂ型肝炎ワクチンのみょうばん製剤との対比序論 SL^★はヨーロッパ特許出願第414374号に記載の手順に従って製造した。免疫原性研究をBalb/cマウスで実施し、Al(OH)₃の有無でのQS21−SUV含有製剤により誘導される体液性応答を比較した。MPL用量は５μｇとし、QS21は５μｇとし、SUVは25μｇのコレステロール及び100μｇのDOPCを含んだ。実験プロトコールは材料と方法の章に記載してある。簡単に述べると、マウスをビヒクル、免疫剌激因子又は両者の組合せを含むSL^★ワクチンで４週間の間隔をあけて２回足に筋肉内免疫を施した。抗HBs体液性応答(IgG及びアイソタイプ) を分析した。以下のグループをこの研究に含ませた：１． SL^★(２μｇ） Al(OH)3 （50μｇ）２． SL^★(２μｇ） Al(OH)3 （50μｇ）／ MPL／QS21−SUV ３． SL^★(２μｇ） Al(OH)3 （50μｇ）／QS21−SUV ４． SL^★(２μｇ） MPL／QS21−SUV 結果体液性応答を材料と方法の章に記載の通りにしてELISAにより測定した。２つの時点を分析した：第一回目の注射の２８日後（28postＩ）及びブースター注射の１４日後（14postII）。プール血清に対して分析したｐｏｓｔＩ及びpostII抗−HBs応答を図６に示す。これらのデータは、第一応答において同等の抗体力価がQS21−SUVを含む製剤全てにより誘導され、Al(OH)₃のみを利用すると弱い応答が観察されることを示した。第二応答において、最低の抗体応答もAl(OH)₃含有ワクチンにより誘導された。しかしながら、QS21−SUVを含む製剤は全て同じように挙動しなかった。 Al(OH)₃ QS21−SUV(±MPL)を含む２種類の製剤は最強の抗体応答を誘導した(M PL／QS21−SUVより２倍高い)。統計学的分析は実施しなかったが、個々の血清に基づく結果はこの観察を確証せしめた。 Al(OH)₃とQS21−SUV(±MPL)の組合せも、体液性応答のアイソタイププロフィールにより示される通り、免疫応答に定量的な影響を及ぼした（図７）。 Al(OH)₃は明確なTH２型の免疫応答（３％のIgG2aのみ）を誘導し、一方Al(OH)₃ ／QS21−SUV(±MPL)製剤は46％までのIgG2aを誘導した。結論みょうばんとQS21−SUV(±MPL)との組合せはビヒクル又は免疫刺激因子のみを含む製剤よりも高い抗体力価を誘導した。材料と方法免疫５匹の雌Balb/cマウス（生後６〜８週）10グループに、Al(OH)₃（50μｇ当量のAL₃ ⁺）、Al(OH)₃／QS21−SUV，Al(OH)₃／MPL／QS21−SUV，MPL／QS21−SUVに配合された２μｇのSL^★を含む50μｌのワクチンで４週間置きに２回足（腓腹筋）に筋肉内免疫を施した。５μｇの免疫刺激因子の用量を利用した。動物をELISAによる抗体測定のために２８日目（28postＩ）及び42日目（14pos tII）に採血した。製剤成分のバッチを使用した。処方工程 SL^★(２μｇ)を50μｇの水希釈Al(OH)₃の上に１５分かけて収着するかしない。必要なら、５μｇのMPLをこの調製品に100nmの粒子(MPL外)として１５分間添加する。必要なら、10倍濃度のバッファーを、QS21／コレステロールの重量比がｌ／５であるリポソームと混合した５μｇのQS21の添加前に加える。チオメルサールをQS21／SUVの添加の15分後に製剤に加える。 QS21−SUVを含む製剤をPBS pH7.4で緩衝にし、そしてその他は PBS pH6.8の中で調製する。血清学抗HBs抗体の定量をコーティング抗原としてHBs(Hep286)を用いるELISAにより実施した。抗原及び抗体溶液をウェル当り50μｌで使用した。抗原をPBSの中で１μｇ／mlの最終濃度で希釈し、そして96穴マイクロタイタープレート（Maxiso rb Immuno-plate，Nunc，Denmark）のウェルに４℃で一夜収着させた。これらのプレートを37℃で１hr、１％の牛血清アルブミン及び0.1％のTween 20（飽和バッファー）を含むPBSとインキュベーションした。飽和バッファー中の血清の２倍希釈品（１／100の希釈率で出発）をこのHBs−コート化プレートに加え、そして37℃で１時間30分インキュベーションした。これらのプレートをPBS 0.1％Twe en 20で４回洗い、そして飽和バッファーに１／1000希釈したビオチン接合抗マウスIgGＩ，IgG2a，IgG2b又はこの３種の抗体の混合物（Amersham，UK）を各ウェルに加え、そして37℃で１時間30分インキュベーションした。洗浄工程の後、飽和バッファーに１／5000希釈したストレプトアビジン−ビオチニル化ペルオキシダーゼ複合体（Amersham，UK）を37℃で更に30分加えておいた。プレートを前述の通りに洗浄し、そして0.1％のTween 20 0.05Ｍのクエン酸バッファーpH4.5 中の0.04％のＯ−フェニレンジアミン(Sigma)、0.03％のH₂O₂の溶液のと20分インキュベーションした。反応を２ＮのH₂SO₄で止め、そして492／620nmで測定した。ELISA力価はSoftmaxPro（４通りのパラメーター式を利用）から計算し、そしてEV／mlで示す。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１０年１０月１６日（１９９８．１０．１６）【補正内容】請求の範囲 1. みょうばん、QS21及びステロールを含んで成り、ここで当該のみょうばんは当該QS21に結合していることを特徴とするアジュバント組成物。 2. 前記サポニンがリン脂質及びステロールを含んで成るリポソーム又はISCO Mと一体化している、請求項１記載のアジュバント組成物。 3. 前記ステロールがコレステロールである、請求項１又は２記載のアジュバント組成物。 4. QS21：ステロールの比が１：100〜１：１である、請求項１〜３のいづれか１項記載のアジュバント組成物。 5. ３−デ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａを更に含む、請求項１〜４のいづれか１項記載のアジュバント組成物。 6. 請求項１〜５のいづれか１項記載のアジュバント組成物と抗原とを含んで成るワクチン。 7. 請求項１〜６のいづれか１項記載の組成物で増強された、ヒト免疫不全ウィルス、ネコ免疫不全ウィルス、バリセラ・ゾスター・ウィルス、１型単純ヘルペスウィルス、２型単純ヘルペスウィルス、ヒトサイトメガロウィルス、Ａ，Ｂ，Ｃ又はＥ型肝炎、呼吸性シンシチウムウィルス、ヒトパピロマウィルス、インフレンザウィルス、Hib、髄膜炎ウィルス、サルモネラ、ナイセッリア、ボレッリア、クラミジア、ボルデッテラ、ブラスモジウム又はトキソプラスマのいづれかに由来する抗原又は抗原組成物を含んで成る、請求項６記載のワクチン組成物。 8. 前記抗原が腫瘍抗原である、請求項６記載のワクチン。 9. 前記抗原がＢ型肝炎に由来するSL^★、HSV gD₂t又はRSV FGキメラタンパク質群から選ばれる、請求項６記載のワクチン。 10．ウィルス、細菌又は寄生虫感染症の予防処置のためのワクチンの製造のための請求項１〜５のいづれか１項記載の組成物の利用。 11．ウィルス、細菌、寄生虫感染症又は癌の免疫療法処置のためのワクチンの製造のための請求項１〜５のいづれか１項記載の組成物の利用。 12．病原性感染症を患う又はそれにかかり易い哺乳動物を処置するための方法であって、安全、且つ有効な量の請求項１〜４のいづれか１項記載の組成物を投与することを含んで成る方法。 13．癌を患う哺乳動物を処置するための方法であって、安全、且つ有効な量の請求項１〜４のいづれか１項記載の組成物を投与することを含んで成る方法。 14．QS21画分及びコレステロールを混合し、そして当該QS21をみょうばんに結合させることを含んで成る、請求項１記載のアジュバント組成物を製造するための方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 39/10 Ａ６１Ｋ 39/10 39/112 39/112 39/118 39/118 39/125 39/125 39/145 39/145 39/21 39/21 39/245 39/245 39/29 39/29 Ａ６１Ｐ 31/04 Ａ６１Ｐ 31/04 31/14 31/14 31/16 31/16 31/18 31/18 31/20 31/20 31/22 31/22 33/02 33/02 33/06 33/06 35/00 35/00 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者フリード，マルタンベルギー国，ベー―1330 リクサンサール，リュドゥランスティテュ 89，スミスクラインビーチャムバイオロジカルズソシエテアノニム

Claims

【特許請求の範囲】 1. みょうばん、免疫活性サポニン画分及びステロールを含んで成るアジュバント組成物。 2. 前記免疫活性サポニン画分がQS21である、請求項１記載のアジュバント組成物。 3. 前記サポニンがリン脂質及びステロールを含んで成るリポソームと一体化している、請求項１又は２記載のアジュバント組成物。 4. 前記ステロールがコレステロールである、請求項１〜３のいづれか１項記載のアジュバント組成物。 5. QS21：ステロールの比が１：100〜１：１である、請求項２，３又は４記載のアジュバント組成物。 6. ３−デ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａを更に含む、請求項１〜５のいづれか１項記載のアジュバント組成物。 7. 請求項１〜６のいづれか１項記載のアジュバント組成物と抗原とを含んで成るワクチン。 8. 請求項１〜６のいづれか１項記載の組成物で増強された、ヒト免疫不全ウィルス、ネコ免疫不全ウィルス、バリセラ・ゾスター・ウィルス、１型単純ヘルペスウィルス、２型単純ヘルペスウィルス、ヒトサイトメガロウィルス、Ａ，Ｂ，Ｃ又はＥ型肝炎、呼吸性シンシチウムウィルス、ヒトパピロマウィルス、インフレンザウィルス、Hib、髄膜炎ウィルス、サルモネラ、ナイセッリア、ボレッリア、クラミジア、ボルデッテラ、ブラスモジウム又はトキソプラスマのいづれかに由来する抗原又は抗原組成物を含んで成る、本明書に記載のワクチン組成物。 9. 前記抗原が腫瘍抗原である、任意の請求項記載のワクチン。 10．前記抗原がＢ型肝炎に由来するSL^★、HSV gD₂t又はRSV FGキメラタンパク質群から選ばれる、請求項８記載のワクチン。 11．ウィルス、細菌又は寄生虫感染症の予防処置のためのワクチンの製造のための請求項１〜６のいづれか１項記載の組成物の利用。 12．ウィルス、細菌、寄生虫感染症又は癌の免疫療法処置のためのワクチンの製造のための請求項１〜６のいづれか１項記載の組成物の利用。 13．病原性感染症を患う又はそれにかかり易い哺乳動物を処置するための方法であって、安全、且つ有効な量の請求項１〜５のいづれか１項記載の組成物を投与することを含んで成る方法。 14．癌を患う哺乳動物を処置するための方法であって、安全、且つ有効な量の請求項１〜５のいづれか１項記載の組成物を投与することを含んで成る方法。 15．みょうばん、免疫活性サポニン画分及びコレステロールを抗原又は抗原性組成物と混合することを含んで成る、請求項１記載のワクチン組成物を製造するための方法。