KR20000048866A - 백신 - Google Patents

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나탈리 가르콘
마르틴 프리에데
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장 스테판느
스미스클라인 비이참 바이오로지칼즈 에스.에이.
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Abstract

본 발명은 명반, 항원, 면역학적 활성 사포닌 분획 및 스테롤을 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다.

Description

백신 {VACCINES}
본 발명은 신규한 백신 제형, 이들의 제조 방법 및 이들을 의약에 사용하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 명반, 항원, QS21과 같은 퀼라자 사포나리아 몰리나(Quillaja Saponaria Molina)의 수피로부터 유도된 면역학적 활성 분획 및 스테롤을 함유하는 백신에 관한 것이다.
남아메리카 나무인 퀼라자 사포나리아 몰리나의 수피로부터 유도된 보조 활성을 갖는 면역학적 활성 사포닌 분획은 당 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, QA21로도 공지된 QS21은 퀼라자 사포나리아 몰리나 나무로부터의 Hplc 정제된 분획이며, 이것의 제조 방법은 미국 특허 제 5,057,540호에 기재되어 있다 (QA21로서). 퀼라자 사포닌은 스코트(Scott) 등의 문헌[Int. Archs. Allergy Appl. Immun., 1985, 77, 409]에 또한 기재되어 있다. 그러나, QS21을 보조제로서 사용하는 것은 약간의 결점과 관련이 있다. 예를 들어, QS21이 포유동물에게 주사되는 경우에 괴사, 즉 국소적 조직 치사가 주사 부위에서 발생함이 관찰되어 왔다.
WO 96/33739호에는 항원, QS21과 같은 퀼라자 사포나리아 몰리나의 수피로부터 유도된 면역학적 활성 분획 및 스테롤을 포함하는 백신 제형이 기재되어 있다.
MPL, QS21 및 SUV를 함유하는 백신 제형에 명반을 혼입시키면 체액성 및 세포성 반응 둘 모두가 증강되고, MPL, QS21, SUV 및 명반을 함유하는 백신 제형은 리액토제네시티(reactogenecity) 프로파일이 양호하면서도 무독성이며 증강된 보조 활성을 갖는 것으로 놀랍게도 밝혀져 왔다. 또한, 조합된 보조제는 TH1 반응에 유리한 것으로 여겨진다.
제 1 일면에 있어서, 본 발명은 명반, 면역학적 활성 사포닌 분획 및 스테롤을 포함하는 백신 보조제를 제공한다. '명반'이란 용어는 알루미늄 하이드록사이드 또는 알루미늄 포스페이트를 의미한다.
본 발명의 보조제 조성물은 면역학적 활성 사포닌을 실질적으로 순수한 형태로 함유하는 것이 바람직하다. 본 발명의 조성물은 QS21을 실질적으로 순수한 형태로 함유하는 것이 바람직하며, 즉, QS21은 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상이 순수하다.
본 발명의 조성물에 유용한 기타 면역학적 활성 사포닌 분획으로는 QA17/QS17이 있다. QS21 및 콜레스테롤을 포함하는 본 발명의 조성물은 콜레스테롤이 없는 조성물과 비교하여 감소된 리액토제네시티를 나타내지만, 보조 효과는 유지한다. 또한, QS21은 pH가 약 7 이상인 조건하에 분해되는 것으로 공지되어 있다. 본 발명의 조성물의 또 다른 잇점은 염기 매개성 가수분해에 대한 QS21의 안정성이 콜레스테롤을 함유하는 제형에서 증강된다는 데에 있다.
바람직한 스테롤로는 β-시토스테롤, 스티그마스테롤, 에르고스테롤, 에르고칼시페롤 및 콜레스테롤이 있다. 이들 스테롤은 당 분야에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 콜레스테롤은 머크 인덱스(Merck Index) 11판의 341쪽에 동물 지방에서 발견되는 천연 스테롤로서 기재되어 있다. 스테롤은 콜레스테롤인 것이 가장 바람직하다.
본 발명의 바람직한 조성물은 리포솜 구조, 즉, 작은 유니라멜라(unilamella) 소낭(SUV)을 형성하는 조성물이다. 스테롤/면역학적 활성 사포닌 분획이 ISCOM 구조를 형성하고 있는 조성물은 또한 본 발명의 일면을 구성한다.
QS21:스테롤의 비는 중량 대 중량이 1:100 내지 1:1 정도인 것이 전형적일 것이다. 과량의 스테롤이 존재하는 것이 바람직하며, QS21:스테롤의 비는 1:1 w/w 이상이다. 인체 투여의 경우에, QS21 및 스테롤은 백신 중에 QS21의 용량 당 약 1㎍ 내지 약 100㎍, 바람직하게는 약 10㎍ 내지 약 50㎍으로 존재하는 것이 전형적일 것이다.
리포솜은 중성 리피드, 예를 들어 바람직하게는 실온에서 비결정성인 포스파티딜, 예를 들어 난황 포스파티딜콜린, 디올레일 포스파티딜콜린 또는 디라우릴 포스파티딜콜린을 함유하는 것이 바람직하다. 리포솜은 포화 리피드로 구성된 리포솜에 대해 리포솜-QS21 구조의 안정성을 증가시키는 하전된 리피드를 또한 함유할 수 있다. 이들 경우에, 하전된 리피드의 양은 바람직하게는 1 내지 20% w/w, 가장 바람직하게는 5 내지 10% 이다. 스테롤 대 포스포리피드의 비는 1 내지 50%(몰/몰), 가장 바람직하게는 20 내지 25% 이다.
본 발명의 특히 바람직하고 유리한 조성물은 MPL(3D-MPL로도 공지된 3-디아실화된 모노-포스포릴 리피드 A)을 함유한다. 3D-MPL은 GB 2 220 211호(Ribi)에 4, 5 또는 6번 사슬이 아실화된 3종류의 De-O-아실화된 모노포스포릴 리피드 A의 혼합물로서 공지되어 있으며, 리비 이뮤노켐(Ribi Immunochem, Montana)에 의해 제조되고 있다. 바람직한 형태는 국제 특허 출원 제 94/21292호에 기재되어 있다.
본 발명의 적당한 조성물은 먼저 리포솜이 MPL 없이 제조된 후, MPL이 바람직하게는 100 nm 입자로서 첨가된 조성물이다. 따라서, MPL은 소낭 막 내에 함유되지 않는다 (MPL 아웃(out)으로서 공지되어 있음). MPL이 소낭 막 내에 함유된 조성물(MPL 인(in)으로서 공지되어 있음)은 또한 본 발명의 일면을 구성한다. 항원은 소낭 막 내에 함유되거나 소낭 막 외부에 함유될 수 있다. 가용성 항원은 외부에 존재하며, 소수성 또는 리피드화된 항원은 막 내부 또는 외부에 함유되는 것이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 일면에 있어서, 먼저 리포솜/SUV가 QS21에 첨가된 후, 명반과 혼합되어, QS21의 상당 부분이 명반에 결합된다 (리포솜을 통한 상호작용에 의해). 이러한 제형은 명반의 데포우 효과로 인해 QS21이 없거나 비고정된 리포솜에 존재하는 경우 보다 QS21의 체내 방출을 느리게 할 것으로 예상된다. MPL, QS21, SUV 및 명반을 함유하는 제형은 이들이 무독성이고 고도로 면역원성인 경우에 특히 유리하다.
백신 제형은 사람 또는 동물 병원체에 대해 면역 반응을 유도시킬 수 있는 항원 또는 항원 조성물을 함유하는 것이 바람직할 것이다. 따라서, 제 1 일면에 있어서, 본 발명은 명반, 항원, 면역학적 활성 사포닌 분획 및 스테롤을 포함하는 백신 조성물을 제공한다.
당 분야에 공지된 항원 또는 항원 조성물은 본 발명의 조성물에 사용될 수 있으며, 폴리사카라이드 항원, HIV-1(예를 들어, gp120 또는 gp160), 고양이과 동물 면역결핍 바이러스, 사람 또는 동물 포진 바이러스, 예를 들어 gD 또는 이것의 유도체 또는 HSV1 또는 HSV2로부터의 ICP27과 같은 이미디어트 어얼리 (Immediate Early) 단백질, 사이토메갈로바이러스(특히, 사람)(예를 들어, gB 또는 이것의 유도체), 바리셀라 조스터 (Varicella Zoster) 바이러스(예를 들어, gpI, II 또는 III), 간염 바이러스, 예를 들어 B형 간염 바이러스 표면 항원 또는 이것의 유도체, A형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스 및 E형 간염 바이러스, 또는 기타 바이러스 병원체, 예를 들어 레스피레토리 신시셜 (Respiratory Syncytial) 바이러스(예를 들어, 미국 특허 제 5,149,650호에 기재된 HSRV F 및 G 단백질 또는 이것의 면역원성 단편 또는 미국 특허 제 5,194,595호에 기재된 FG 당단백질과 같은 HSRV 단백질 F 및 G로부터의 면역원성 단편을 함유하는 키메라 폴리펩티드), 뇌막염 스트레인, 예를 들어 A형, B형 및 C형 뇌막염, 스트렙토코커스 폐렴, 사람 파필로마(papilloma) 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 헤모필러스(Haemophilus) 인플루엔자 B(Hib), 엡스타인 바르 (Epstein Barr) 바이러스(EBV), 박테리아 병원체, 예를 들어 살모넬라, 네이세리아(Neisseria), 보렐리아(Borrelia)(예를 들어, OspA, OspB 또는 이것의 유도체), 클라미디아(Chlamydia), 보르데텔라(Bordetella), 예를 들어 P.69, PT 및 FHA, 또는 기생체, 예를 들어 플라스모듐(plasmodium) 또는 톡소플라스마(toxoplasma)로부터 유도된 항원 또는 항원 조성물이 있다.
HSV 당단백질 D(gD) 또는 이것의 유도체는 바람직한 백신 항원이다. 이것은 바이러스 막에 위치하며, 또한 감염된 세포의 세포질에서 발견된다 [참조: Eisenberg R.J. et al; J of Virol 1980 35 428-435]. 이것은 신호 펩티드를 포함하여 393개 아미노산을 포함하며, 분자량은 약 60kD이다. 모든 HSV 외피 당단백질 중에서, 이것은 아마도 가장 잘 특징화되어 있을 것이다 [참조: Cohen et al J. Virology 60 157-166]. 생체내에서, 이것은 세포막에 대한 바이러스 부착에서 중추적인 역할을 하는 것으로 공지되어 있다. 더욱이, 당단백질 D는 생체내에서 항체의 중화를 유도하며, 동물을 치명적인 공격으로부터 방어하는 것으로 밝혀져 왔다. 절단된 형태의 gD 분자는 C 말단 앵커 영역이 결여되어 있고, 포유동물 세포에서 세포 배양물 상층액으로 배출되는 가용성 단백질로서 생성될 수 있다. 이러한 가용 형태의 gD가 바람직하다. 절단된 형태의 gD의 생성은 EP 0 139 417호에 기재되어 있다. gD는 HSV-2로부터 유도되는 것이 바람직하다. 본 발명의 한 구체예는 막 앵커 영역이 결여된 절단된 단백질의 C 말단 단부에 아스파라긴 및 글루타민이 첨가된 천연 당단백질의 1 내지 306 아미노산을 포함하는 308개 아미노산의 절단된 HSV-2 당단백질 D이다. 이러한 형태의 단백질은 성숙한 가용성 283 아미노산 단백질이 숙주 세포로부터 분비되도록 분해되는 신호 펩티드를 포함한다.
본 발명의 또 다른 일면에 있어서, B형 간염 표면 항원은 바람직한 백신 항원이다.
본원에 사용되는 'B형 간염 표면 항원' 또는 'HBsAg'란 표현은 HBV 표면 항원의 항원성을 나타내는 임의의 HBsAg 항원 또는 이것의 단편을 포함한다. HBsAg 항원의 226 아미노산 서열[참조: Tiollais et al, Nature, 317, 489 (1985) 및 여기에 인용된 참고문헌] 이외에, 본원에 기재된 HBsAg는 바람직한 경우에 상기 참고문헌 및 EP-A- 0 278 940호에 기재된 pre-S 서열의 전부 또는 일부를 함유할 수 있다. 특히, HBsAg는 as 혈청형의 B형 간염 바이러스 상의 오픈 리딩 프레임에 관해 HBsAg의 L-단백질의 잔기 12 내지 52, 잔기 133 내지 145, 잔기 175 내지 400을 차례로 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함할 수 있다 (이 폴리펩티드는 L*로서 언급된다; EP 0 414 374호 참조). 본 발명의 범위에 있는 HBsAg로는 EP 0 198 474호(Endotronics)에 기재된 pre-S1-S 폴리펩티드 또는 이것의 밀접한 유사체, 예를 들어 EP 0 304 578호(Mc Cormick 및 Jones)에 기재된 유사체가 또한 있을 수 있다. 본원에 기재된 HBsAg는 돌연변이체, 예를 들어 WO 91/14703호 또는 유럽 특허 출원 제 0 511 855호에 기재된 '이스케입(escape) 돌연변이체', 특히 위치 145에서 글리신이 아르기닌으로 아미노산 치환된 HBsAg을 또한 의미할 수 있다.
HBsAg는 입자 형태인 것이 정상적일 것 이다. 입자는 예를 들어, S 단백질만을 포함할 수 있거나 복합 입자, 예를 들어 (L*, S)(여기에서, L*은 상기 규정된 바와 같고, S는 HBsAg의 S-단백질을 의미함)일 수 있다. 상기 입자는 효모에서 발현되는 형태로 존재하는 것이 유리하다.
B형 간염 표면 항원 S-단백질의 제조 방법은 문헌에 상세히 기재되어 있다 [참조: Harford et al (1983) in Develop. Biol. Standard 54, page 125, Gregg et al (1987) in Biotechnology, 5, page 479, EP 0 226 846호, EP 0 299 108호 및 여기에 인용된 참고문헌].
또 다른 구체예에 있어서, 백신 항원은 RSV 항원, 특히 F/G 항원이다. 미국 특히 제 5194595호(Upjohn)에는 RSV의 F 및 G 당단백질의 면역원성 절편을 함유하는 키메라 당단백질이 기재되어 있으며, 이러한 단백질이 박테리아, 효모, 포유동물(예를 들어, CHO 세포) 및 곤충 세포(예를 들어 바쿨로바이러스를 사용함)를 포함하는 다양한 시스템으로부터 발현될 수 있음이 제시되어 있다.
워텐(Wathen) 등의 문헌[J. Gen. Virol. 1989, 70, 2625-2635]에는 G 단백질의 아미노산 97 내지 279에 결합된 F 단백질의 아미노산 1 내지 489로 구성된 바쿨로바이러스 벡터를 사용하여 발현되는 특정 RSV FG 키메라 당단백질이 기재되어 있다.
본 발명의 범위에 있는 제형은 항종양 항원을 또한 함유할 수 있으며, 암을 면역치료적으로 치료하기에 유용할 수 있다.
백신 제형은 문헌[New Trends and Developments in Vaccines, edited by Voller et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A. 1978]에 일반적으로 기재되어 있다. 리포솜 내의 캡슐화는 예를 들어, 풀러톤(Fullerton)의 미국 특허 제 4,235,877호에 기재되어 있다. 거대분자에 대한 단백질의 컨쥬게이션은 예를 들어, 릭히트(Likhite)의 미국 특허 제 4,372,945호 및 아모르(Armor) 등의 미국 특허 제 4,474,757호에 기재되어 있다.
각각의 백신 용량 중의 단백질의 양은 전형적인 백신에서 현저한 부작용 없이 면역보호 반응을 유도하는 양으로서 선택된다. 이러한 양은 사용되는 특이적 면역원의 종류 및 이것이 제공되는 방식에 따라 변할 것이다. 일반적으로, 각각의 용량은 1 내지 1000mcg, 바람직하게는 2 내지 100mcg, 가장 바람직하게는 4 내지 40mcg의 단백질을 포함할 것이다. 특정 백신의 최적량은 피검체에서의 적당한 면역 반응의 관찰을 포함하는 표준 실험에 의해 확인될 수 있다. 초기 백신접종 후, 피검체에게 적당한 간격을 두고 1회 이상의 부스터 면역화를 제공할 수 있다.
본 발명의 제형은 예방 및 치료 둘 모두의 목적으로 사용될 수 있다.
따라서, 또 다른 일면에 있어서, 본 발명은 사람 환자를 치료하기 위해 본 발명의 백신 조성물을 사용하는 방법을 제공한다. 본 발명은 유효량의 본 발명의 백신을 환자에게 투여하는 것을 포함하는 치료 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 유효량의 본 발명의 백신을 환자에게 투여하는 것을 포함하여 바이러스, 박테리아, 기생체 감염증을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 하기 실시예 및 데이터에 의해 예시된다.
실시예 1. 명반, SUV MPL 및 QS21을 함유하는 백신의 제조
1.1 SUV의 제조 방법
유기 용매 중의 리피드(예를 들어, 난황 또는 인공 난황으로부터의 포스파티딜콜린)과 콜레스테롤의 혼합물을 진공 하에(또는 대안적으로 비활성 기체의 스트림 하에) 건조시켰다. 그 후, 수용액(예를 들어, 포스페이트 완충 식염)을 첨가하고, 용기를 모든 리피드가 부유될 때까지 교반시켰다. 그 후, 이 현탁액을 리포솜 크기가 100nm이 될 때까지 미세유동화시킨 다음, 0.2㎛ 필터를 통해 멸균 여과시켰다. 이 단계는 익스트루션(extrusion) 또는 초음파처리로 대체할 수 있다. 전형적으로, 콜레스테롤:포스파티딜콜린 비는 1:4(w/w)였으며, 수용액을 첨가하여 최종 콜레스테롤 농도를 5 내지 50 ㎎/㎖로 만들었다.
1.2 항원(1 내지 500㎍, 바람직하게는 10 내지 100㎍)을 물 중의 명반(예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드 또는 알루미늄 포스페이트)(100 내지 500㎍)에 첨가하였다. 물의 부피를 최종 제형이 500㎕가 되도록 선택하였다. 15 내지 30분 동안 인큐베이팅한 후, MPL 50㎍를 소립자 MPL(WO94/21292호)의 형태로 첨가하였다. MPL이 명반 상에 흡착되도록 실온에서 15 내지 30분간 방치시켰다. 그 후, 10배 농축된 포스페이트 완충 식염(1.5M 나트륨 클로라이드, 0.5M 나트륨 포스페이트 pH 7.5)을 최종 농도가 등장이 되도록 하는 부피로 첨가하였다. 이 제형을 실온에서 15 내지 30분간 인큐베이팅시켰다.
그 후, QS21(50㎍)을 SUV(50 내지 250㎍의 콜레스테롤을 함유함)에 첨가하였다. 이 혼합물을 상기 명반/항원/완충 혼합물에 첨가하였다. 필요한 경우에, 티오메르살과 같은 세균발육저지제를 첨가하였다.
실시예 2
표 1은 디올레오일 포스파티딜콜린 중의 25%(w/w)를 함유하는 리포솜의 존재 및 부재하의 명반에 대한 QS21의 결합량, 및 QS21에 대해 5배 과량의 콜레스테롤의 사용시의 명반에 대한 QS21의 결합량을 나타낸다.
제형 SUV 결합된 QS21(㎍)
500㎍ 명반 + 50㎍ QS21 0 < 10
500㎍ 명반 + 50㎍ QS21 250㎍ 콜레스테롤 + 1㎎ DOPC > 40
명반에 대한 QS21의 결합량을 증가시키기 위해, 리포솜의 양을 감소시킬 수 있다. 이는 콜레스테롤:QS21 비를 감소시키지만, QS21은 1:1 이상의 콜레스테롤:QS21 비에 대해 무독성 상태로 남아있음이 밝혀졌다. 표 2는 명반의 양이 감소(500㎍ 내지 100㎍)하는 경우에, 결합되는 Q21의 양이 현저하게 감소하며, 또한 결합되는 MPL의 양이 감소함을 나타낸다. 보다 적은 양의 리포솜을 첨가하지만 콜레스테롤:QS21 비를 1:1 이상으로 유지시킴으로써, 증가된 양의 QS21 및 MPL을 명반에 결합시킬 수 있다.
제형 콜레스테롤/QS21 결합된 QS21(㎍) 결합된 MPL(㎍)
500㎍ 명반 + 50㎍ QS21 + 50㎍ MPL 5/1 42 >48
100㎍ 명반 + 50㎍ QS21 + 50㎍ MPL 5/1 17 >40
100㎍ 명반 + 50㎍ QS21 + 50㎍ MPL 2/1 30 >45
100㎍ 명반 + 50㎍ QS21 + 50㎍ MPL 1/1 40 >45
실시예 3
리포솜과 함께 MPL 및 QS21과 항원(CHO 세포에서 발현되며, 성숙한 당단백질의 성숙한 N 말단으로부터의 283 아미노산을 포함하는, 단순 포진 바이러스-2로부터의 gD2t)과의 조합의 보조 효과를 명반의 존재 및 부재하에 시험하였다. 제형을 아프리카 그린 원숭이에서 시험하였다.
아프리카 그린 원숭이를 리포솜(250㎍ 콜레스테롤 + 1㎎ DOPC)의 존재 또는 부재 및 명반 500㎍의 존재 또는 부재하에 20㎍ gD2t+50㎍ MPL+50㎍ QS21으로 2회(0, 28일째) 면역시켰다. 42일째에, 면역 반응을 분석하였다.
결과를 도 1 내지 4에 약술하였다.
체액성 반응을 gD 단백질에 대한 IgG로서 측정하였다. 도 1은 MPL+QS21+SUV+명반의 조합물이 명반이 없는 경우 보다 높은 역가를 유도하였음을 도시한다. 도 2는 본 발명의 제형이 우수한 항원 특이적 증식을 제공함을 도시한다.
데이터는 MPL 및 QS21 및 SUV를 함유하는 백신 제형에 알루미늄 하이드록사이드를 혼입시키면 체액성 및 세포성 반응 둘 모두가 증강됨을 도시한다. 이것은 보조제로서의 알루미늄은 Th2 타입 반응에 유리한 경향이 있는 것으로 일반적으로 인정되기 때문에 예상치 못한 발견이지만, 본원에 제시된 결과는 반응이 명반의 첨가에 의해 억제되지 않는 현저한 Th1 성분을 함유함을 입증한다.
MPL 및 QS21 및 SUV 및 명반을 함유하는 제형은 무독성이며, 고도로 면역원성이다.
실시예 4 RSV FG CHO 세포 유도된 단백질의 생성
플라스미드 pEE14-FG는 F(1 내지 525)와 G(69 내지 298)의 아미노산 서열 사이의 융합물을 포함하는 키메라 구성물을 함유하며, 에이.볼렌(A. BOLLEN, ULB/CRI, Belgium)과 공동연구하여 입수하였다. 이 GF 융합 단백질은 총 755개 아미노산을 함유하고 있다. 이것은 F의 N 말단 신호 서열에서 출발하며, F 당단백질의 C-말단 트랜스멤브레인 도메인(525-574)-앵커 도메인-이 결여되어 있다. 그 다음에, 전형적인 클래스 II 당단백질인 G의 신호/앵커 도메인을 함유하는 아미노-말단 영역 없이 G 당단백질의 세포외 영역이 이어진다.
pEE14-FG 발현 플라스미드는 Asp7181(평활)5'-HindIII(평활) 3' 제한 단편(2188bp)로서의 pNIV2857(A.Bollen, ULB/CRI, Belgium)으로부터의 FG 코딩 서열을 pEE14(Celltech)의 SmaI 부위에 삽입시킴으로써 생성시켰다. FG 개시 ATG 대신에 코자크(Kozak) 서열을 하기와 같이 pNIV 2857 구성물에 생성시켰다.
pEE14-FG 중의 F 서열은 SS2 RSV 스트레인으로부터 유래하며, 프링글(PRINGLE) 박사에 의해 우두 벡터 중의 cDNA 구성물[참조: Baybutt 및 Pringle, J.Gen.Virol., 1987, 2789-2796]로서 어려움없이 구할 수 있었다. G 서열은 A2 RSV 스트레인으로부터 유래하며, 지. 웨르츠(G. WERTZ) 박사(Alabama, USA)에게서 입수한 재조합 G 우두 바이러스로부터 제조하였다.
CHO K1 트랜스펙션 및 안정한 FG 단백질 발현
MCB O24M(Celltech)로부터 유도된 CHO K1 세포를 Ca-포스페이트-글리세롤 트랜스펙션 과정을 사용하여 2회 CsCl 정제된 pEE14-FG 플라스미드 DNA 20ug로 트랜스펙팅시켰다. 세포 클론을 GS(글루타민 합성효소) 발현 시스템[참조: Crocett et al Bio Techn., 1990, Vol18, 662]의 과정에 따라 선택하고, 글루타민을 함유하지 않고 10% 투석된 FBS(우태아 혈청)이 보충된 G MEM 배지 중에서 25μM 메티오닌 술폭시민(MSX)의 존재하에 증폭시켰다. 트랜스펙션 후에, 39개의 MSX 내성 클론을 24-웰 플레이트 중에서 스크리닝하고, 이들의 상층액을 FG 융합 단백질의 분비에 대해 시험하였다. 모든 트랜스펙턴트는 특이적인 '샌드위치(Sandwich)' ELISA 검정을 사용하는 F 항원 발현(즉, 토끼 다클론성 항 FG 혈청/항원/mAB19)에 대해 포지티브한 것으로 증명되었다. 단클론성 항체 19는 구조적 F1-에피토프를 인식하며, 중화작용을 한다.
3개의 최상의 FG-프로듀서(producer) 클론(n°7, 13 및 37)을 96-웰 플레이트 중에서 웰 당 0.07개 세포를 사용하는 제한 희석 검정에서 단일-세포 서브클로닝시켰다. 총 59개의 포지티브 서브클론을 수득하고, 16개의 최상의 FG-프로듀서를 웨스턴 블롯 및 ELISA에 의해 추가로 특징화하였다. 또 다시, 8개의 최상의 FG-서브클론을 추가로 증폭시키고, 이들의 FG 발현을 나트륨 부티레이트(2mM) 또는 DMSO(1 또는 2%)의 존재 및 부재하에 평가하였다. 6개의 서브클론을 증폭시키고, 세포 바이알을 만들고, -80℃ 및 액체 N2에서 저장하였다. 최종적으로, 3개의 최상의 FG-서브클론을 선택하였다. 이들은 CHOK1 FG˚7.18, ˚13.1 및 ˚37.2였다.
단클론성 mAB19를 사용하는 웨스턴블롯 분석(비환원 조건)은 약 135 kDa에서 FG의 주 밴드를 나타내었다. 재조합 바쿨로바이러스 FG 감염 세포(UPJOHN)으로부터의 정제된 FG 단백질은 +/-100kDa에서 주요 광역 밴드로서 나타났고, 그 밖의 밴드는 유사한 블롯 조건하에 +/-70kDa에서 나타났다.
CHO-FG 세포 배양물 배지 중에 나트륨 부티레이트가 첨가되면 서브클론 및 세포 배양 증식 조건에 따라 FG의 발현 수준이 3 내지 12배 증가되었다. 특히, 서브클론 CHO-FG 13.1은 부티레이트의 존재하에 FG 단백질을 8 내지 10배 더 발현시켰다 (WB/ELISA).
발현 수준 결정을 정제된 FG 바쿨로 단백질을 표준으로서 사용하는 ELISA(mAB19 또는 MoAb AK13) 뿐만 아니라 연속 희석을 사용하는 웨스턴 블롯 분석에 의해 수행하였다.
ELISA 검정 및 세포 배양 조건에 따라, CHO-FG 13.1의 발현 수준은 부티레이트에 의한 처리 후에 ㎖당 5 내지 12 ug의 FG였다. 축적 조건 및 배지 교환(3 내지 5일) 하에, ㎖당 16 내지 28ug의 분비된 FG 단백질의 수율을 수득하였다.
CHOK 1 FG 13.1 세포주를 전매 증식 배지를 사용하는 현탁 및 무혈청(S/SF) 조건에서 증식하도록 적응시켰다. 부티레이트 비함유 배지 중에서 증식시킨 세포주 CHO-FG 13.1 S/SF는 부티레이트 함유 배지 중에서 증식시킨 모세포 유착성(parental adherent) 세포주와 유사한 수율을 나타내었다. CHO-FG 13.1 S/SF 배지에 부티레이트를 첨가한 경우에 FG의 생성에 거의 영향을 미치지 못했다 (1.5 내지 2배 증가).
장기 발현 평가 및 예비 유전 특징화에 의해 CHO-FG 13.1 및 S/SF 적응된 13.1 세포주는 안정하며, 길이가 약 3000개 누클레오티드인 하나의 단일 mRNA 밴드를 생성시키는(서던 및 노던 분석) 온전한 FG 발현 카세트를 함유하는 것으로 나타났다. CHO-FG 클론 13.1 S/SF를 추가로 사용하여 FG 항원을 생성시켰다.
RSV(레스피레토리 신시셜 바이러스)로부터의 FG 단백질에 대한 아프리카 그린 원숭이에서의 면역 반응을 강화시키기 위해 명반/MPL/QS21/SUV를 사용하는 방법.
FG 단백질(RSV로부터의 F 및 G 단백질을 함유하는 융합 단백질)을 CHO 세포에서 발현시키고, 정제시켰다. 정제된 단백질 20㎍을 모노포스포릴 리피드 A(MPL: 50㎍)이 첨가된 명반(500㎍)에 흡착시켰다. 실온에서 30분간 인큐베이팅시킨 후, 포스페이트 완충 식염을 첨가하였다. 그런 다음, SUV만을 첨가하거나 SUV와 QS21의 혼합물(QS21 50㎍, 콜레스테롤 250㎍과 DOPC 1㎎을 함유하는 SUV)를 첨가하였다. 아프리카 그린 원숭이를 이들 제형, 또는 오로지 명반 상의 FG 또는 명반 없이 MPL, SUV 및 QS21과 혼합된 FG로 3회 주사하였다.
도 5는 각각의 제형에 대해 수득된 RSV 중화 역가 및 FG-ELISA 역가를 도시한다. 군 명반/MPL/QS21/SUV는 최대 역가를 유도시킨다.
실시예 5 QS21/SUV 함유 제형과 SL*항원을 함유하는 B형 간염 백신의 명반 제형의 비교
도입
SL*을 유럽 특허 출원 제 414374호에 기재된 과정에 따라 제조하였다.
면역원성 실험을 Balb/c 마우스에서 수행하여, Al(OH)3의 존재또는 부재하에 QS21-SUV 함유 제형에 의해 유도된 체액성 반응을 비교하였다. MPL 용량은 5㎍ 이었고, QS21은 5㎍, SUV는 콜레스테롤 25㎍과 DOPC 100㎍을 함유하였다.
실험 프로토콜은 재료 및 방법에 기술되어 있다. 간단히 요약하면, 마우스를 비히클, 면역자극제 또는 둘의 조합물을 함유하는 SL*백신으로 4주 간격을 두고 2회에 걸쳐 다리에 근내 면역시켰다. 항-HBs 체액성 반응(IgG 및 이소타입)을 분석하였다.
하기 군을 실험에 포함시켰다:
1. SL*(2ug) Al(OH)3(50ug)
2. SL*(2ug) Al(OH)3(50ug)/MPL/QS21-SUV
3. SL*(2ug) Al(OH)3(50ug)/QS21-SUV
4. SL*(2ug) MPL/QS21-SUV
결과
체액성 반응을 재료 및 방법에 기술된 ELISA에 의해 측정하였다. 두 개의 시간 점을 분석하였다: 최초 주사 후 28일째(28 post I) 및 부스터 주사 후 14일째(14 post II). 풀링된 혈청에 대해 분석된 post I 및 post II 항-HBs 반응 분석을 도 6에 도시하였다.
이들 데이터는 1차 반응에서 유사한 항체 역가가 QS21-SUV를 함유하는 모든 제형에 의해 유도된 반면에, 보다 약한 반응이 Al(OH)3만이 사용된 경우에 관찰됨을 나타낸다.
2차 반응에 있어서, 최저 항체 반응은 Al(OH)3함유 백신에 의해 또한 유도되었다. 그러나, QS21-SUV를 함유하는 모든 제형이 동일한 방식으로 거동하지는 않았다.
Al(OH)3QS21-SUV(+/-MPL)를 함유하는 두 제형은 가장 강력한 항체 반응을 유도시켰다 (MPL/QS21-SUV 보다 2배 높음).
통계 분석이 수행되지 않았다고 하더라도, 개개의 혈청에 대한 결과는 이 결과를 확인시켜 준다.
Al(OH)3과 QS21-SUV(+/-MPL)의 조합물은 체액성 반응의 이소타입 프로파일에 의해 도시된 바와 같이 면역 반응에 또한 정량적으로 영향을 미친다 (도 7).
Al(OH)3은 면역 반응의 클리어(clear) TH2 타입(3%만의 IgG2a)을 유도시킨 반면에, Al(OH)3/QS21-SUV(+/-MPL) 제형은 46% 이하의 IgG2a를 유도시켰다.
결론
명반을 QS21-SUV(+/-MPL)과 조합시키면 비히클 또는 면역자극제만을 함유하는 제형 보다 높은 항체 역가가 유도되었다.
재료 및 방법
면역화
10개 군의 5마리 암컷 Balb/c 마우스(6 내지 8주)를 Al(OH)3(등가 Al3+ 50ug), Al(OH)3/QS21-SUV, Al(OH)3/MPL/QS21-SUV, MPL/QS21-SUV 중에서 제형된 SL 2㎍를 함유하는 백신 50㎕로 4주 간격을 두고 2회에 걸쳐 다리에 (비복근) 근내 면역시켰다. 면역자극제 5ug 용량을 사용하였다.
동물을 28일째(28 post I) 및 42일째(14 post II)에 채혈시켜 ELISA에 의해 항체 분석하였다.
제형
사용된 성분 배치(batch)
제형화 방법
SL*(2ug)를 물 희석된 Al(OH)350ug 상에 15분간 흡착시키거나 시키지 않았다.
필요한 경우에, MPL 5ug을 100nm 입자(MPL 아웃)의 현탁액으로 15분간 제형에 첨가하였다. 필요한 경우에, 10배 농축된 완충액을 첨가한 후, 1/5의 QS21/콜레스테롤의 중량비로 리포솜과 혼합된 QS21 5ug을 첨가하였다.
QS21/SUV 첨가한 지 15분 후에 티오메르살을 제형에 첨가하였다.
QS21-SUV를 함유하는 제형을 pH 7.4의 PBS로 완충시키고, 나머지를 pH 6.8의 PBS 중에서 제조하였다.
혈청학
항-HBs 항체의 정량을 HBs(Hep286)을 코팅 항원으로서 사용하는 ELISA에 의해 수행하였다. 항원 및 항체 용액을 웰 당 50ul로 사용하였다. 항원을 PBS 중에서 최종 농도가 1ug/㎖로 희석시키고, 96 웰 미세역가 플레이트(Maxisorb Immuno-plate, Nunc, Denmark)의 웰에 4℃에서 밤새 흡착시켰다. 그 후, 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 1% 우혈청 알부민과 0.1% 트윈 20을 함유하는 PBS(포화 완충액)와 인큐베이팅시켰다. 포화 완충액 중의 혈청의 2배 희석물(1/100 희석에서 출발하여)을 HBs 코팅된 플레이트에 첨가하고, 37℃에서 1시간 30분 동안 인큐베이팅시켰다. 플레이트를 PBS 0.1% 트윈 20으로 4회 세척하고, 포화 완충액 중에서 1/1000 희석된 비오틴 컨쥬게이팅된 항-마우스 IgG1, IgG2a, IgG2b 또는 3가지 항체의 혼합물(Amersham, UK)을 각각의 웰에 첨가하고, 37℃에서 1시간 30분 동안 인큐베이팅시켰다. 세척 단계 후, 포화 완충액 중에서 1/5000 희석된 스트렙타비딘 비오티닐화된 퍼옥시다아제 복합체(Amersham, UK)를 37℃에서 추가 30분 동안 첨가하였다. 플레이트를 상기와 같이 세척하고, pH 4.5의 0.1% 트윈 20 0.05M 시트레이트 완충액 중의 o-페닐렌디아민(Sigma) 0.04% H2O20.03%의 용액과 20분간 인큐베이팅시켰다. 반응을 H2SO42N으로 중지시키고, 492/620nm에서 판독하였다. ELISA 역가를 소프트맥스프로(SoftmaxPro)(4개의 파라미터 방정식을 사용함)에 의해 기준으로부터 계산하고, EU/㎖로 표현하였다.

Claims (15)

  1. 명반, 면역학적 활성 사포닌 분획 및 스테롤을 포함하는 보조제 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 면역학적 활성 사포닌 분획이 QS21임을 특징으로 하는 보조제 조성물.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 사포닌이 포스포리피드 및 스테롤을 포함하는 리포솜과 결합됨을 특징으로 하는 보조제 조성물.
  4. 제 1항 내지 제 3항에 있어서, 스테롤이 콜레스테롤임을 특징으로 하는 보조제 조성물.
  5. 제 2항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, QS21:스테롤의 비가 1:100 내지 1:1임을 특징으로 하는 보조제 조성물.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 3-de-O-아실화된 모노포스포릴 리피드 A를 추가로 함유함을 특징으로 하는 보조제 조성물.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중의 어느 한 항에 따른 보조제 및 항원을 포함하는 백신.
  8. 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 보조제로 사용하는, 사람 면역결핍 바이러스, 고양이과 동물 면역결핍 바이러스, 바리셀라 조스터 바이러스, 단순 포진 바이러스 타입 1, 단순 포진 바이러스 타입 2, 사람 사이토메갈로바이러스, A형, B형, C형 또는 E형 간염 바이러스, 레스피레토리 신시셜 바이러스, 사람 파필로마 바이러스, 인플루엔자 바이러스, Hib, 뇌막염 바이러스, 살모넬라, 네이세리아, 보렐리아, 클라미디아, 보르데텔라, 플라스모듐 및 톡소플라스마로 구성된 군으로부터 선택된 생물체로부터 유도된 항원 또는 항원 조성물을 포함하는 백신 조성물.
  9. 제 7항 또는 제 8항에 있어서, 항원이 종양 항원임을 특징으로 하는 백신.
  10. 제 8항에 있어서, 항원이 B형 간염 바이러스로부터 유도된 SL*, HSV gD2t 및 RSV FG 키메라 단백질로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 백신.
  11. 바이러스, 박테리아 또는 기생체 감염증의 예방 치료용 백신을 제조하기 위한 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 용도.
  12. 바이러스, 박테리아, 기생체 감염증 또는 암의 면역치료적 치료용 백신을 제조하기 위한 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 용도.
  13. 안전하고 유효한 양의 제 1항 내지 제 5항에 따른 조성물을 투여하는 것을 포함하여 병원체 감염증에 걸린 또는 걸리기 쉬운 포유동물을 치료하는 방법.
  14. 안전하고 유효한 양의 제 1항 내지 제 5항에 따른 조성물을 투여하는 것을 포함하여 암에 걸린 포유동물을 치료하는 방법.
  15. 명반, 면역학적 활성 사포닌 분획 및 콜레스테롤을 항원 또는 항원 조성물과 혼합시키는 것을 포함하여 제 1항에 따른 백신 조성물을 제조하는 방법.
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