EA021391B1 - Способ индукции иммунного ответа, вакцинная композиция, ее применение и набор - Google Patents

Способ индукции иммунного ответа, вакцинная композиция, ее применение и набор Download PDF

Info

Publication number
EA021391B1
EA021391B1 EA200901060A EA200901060A EA021391B1 EA 021391 B1 EA021391 B1 EA 021391B1 EA 200901060 A EA200901060 A EA 200901060A EA 200901060 A EA200901060 A EA 200901060A EA 021391 B1 EA021391 B1 EA 021391B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
immunogenic
adjuvant
cells
protein
polypeptide
Prior art date
Application number
EA200901060A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200901060A1 (ru
Inventor
Геральд Герман Фосс
Original Assignee
Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=39415279&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA021391(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А. filed Critical Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А.
Publication of EA200901060A1 publication Critical patent/EA200901060A1/ru
Publication of EA021391B1 publication Critical patent/EA021391B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/002—Protozoa antigens
    • A61K39/015—Hemosporidia antigens, e.g. Plasmodium antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/21—Retroviridae, e.g. equine infectious anemia virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/235—Adenoviridae
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A61P31/06—Antibacterial agents for tuberculosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A61P33/06—Antimalarials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/35—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Mycobacteriaceae (F)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/44—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from protozoa
    • C07K14/445—Plasmodium
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55572—Lipopolysaccharides; Lipid A; Monophosphoryl lipid A
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55577—Saponins; Quil A; QS21; ISCOMS
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16211—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV gagpol
    • C12N2740/16222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16311—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV regulatory proteins
    • C12N2740/16322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение относится, среди прочего, к способу индукции иммунного ответа против патогена, включающему введение (1) одного или более чем одного первого иммуногенного полипептида, происходящего из указанного патогена; (2) одного или более чем одного аденовирусного вектора, содержащего один или более чем один гетерологичный полинуклеотид, кодирующий один или более чем один второй иммуногенный полипептид, происходящий из указанного патогена; и (3) адъюванта; где один или более чем один первый иммуногенный полипептид, один или более чем один аденовирусный вектор и адъювант вводят совместно. Данное изобретение также относится к вакцинам, фармацевтическим композициям, наборам и применениям с использованием указанных полипептидов, аденовирусных векторов и адъювантов.

Description

Данное изобретение относится к новым композициям вакцин и к их применению при стимуляции иммунных ответов у млекопитающих, особенно у людей, и, конкретно, для предупреждения и лечения инфекции патогенами. Конкретно оно относится к композициям, способным индуцировать ответы Тклеток СЭ4+ и СЭ8+, а также гуморальные ответы у субъектов без обращения к сложным схемам с первичной-повторной иммунизацией.
Предшествующий уровень техники
Инактивированные целые организмы используют в успешной вакцинации с конца девятнадцатого столетия. Позднее использовали вакцины, включающие введение экстрактов, субъединиц, анатоксинов и капсульных полисахаридов. С момента, когда стали доступными методики генной инженерии, применение рекомбинантных белков стало предпочтительной стратегией, устраняющей многие риски, связанные с применением очищенных белков из природных источников.
Ранние подходы с использованием вакцин были основаны на введении белков, которые стимулировали некоторый аспект иммунного ответа ίη νίνο. Затем стало понятно, что иммунные ответы также могут быть индуцированы введением ДНК, которая может быть транскрибирована и транслирована хозяином в иммуногенный белок.
Иммунный ответ млекопитающих имеет два ключевых компонента: гуморальный ответ и клеточноопосредованный ответ. Гуморальный ответ включает генерацию циркулирующих в крови антител, которые будут связываться с антигеном, к которому они являются специфичными, посредством этого нейтрализуя данный антиген и способствуя его последующему устранению при помощи процесса, включающего другие клетки, которые являются либо цитотоксическими, либо фагоцитарными. В-клетки ответственны за генерацию антител (плазматические В-клетки), а также за сохранение иммунологической гуморальной памяти (В-клетки памяти), т.е. способности распознавать антиген через несколько лет после его первого воздействия, например, посредством вакцинации. Клеточно-опосредованный ответ включает взаимодействие многих разных типов клеток, среди которых находятся Т-клетки. Т-клетки делят на целый ряд разных подклассов, главным образом, на Т-клетки СЭ4+ и СЭ8+.
Антигенпрезентирующие клетки (АРС), такие как макрофаги и дендритные клетки, действуют как стражи иммунной системы, осуществляя скрининг организма на чужеродные антигены. Когда экстраклеточные чужеродные антигены определяются АРС, эти антигены фагоцитируются (поглощаются) внутрь АРС, где они будут переработаны в меньшие пептиды. Эти пептиды затем презентируются на молекулах главного комплекса гистосовместимости класса II (МНС II) на поверхности АРС, где они могут распознаваться антигенспецифичными Т-лимфоцитами, экспрессирующими поверхностные молекулы СЭ4 (Тклетки СЭ4+). Когда Т-клетки СЭ4+ распознают антиген, к которому они являются специфичными, на молекулах МНС II в присутствии дополнительных адекватных костимулирующих сигналов, они становятся активированными и секретируют ряд цитокинов, которые затем активируют другие ветви иммунной системы. В общем, Т-клетки СЭ4+ классифицируют на субпопуляции Т-хелперов 1 (ТЫ) или Тхелперов 2 (ТЬ2), в зависимости от типа ответа, который они генерируют после распознавания антигена. При распознавании комплекса пептид-МНС II, Т-клетки СЭ4+ ТЫ секретируют интерлейкины и цитокины, такие как интерферон-гамма, активируя, посредством этого, макрофаги к высвобождению токсичных химических веществ, таких как оксид азота и активные формы кислорода/азота. (Ы-2 (интерлейкин2) и ΤΝΡ-альфа (фактор некроза опухолей-альфа) также обычно классифицируются как ТЫ-цитокины. В отличие от этого, Т-клетки СЭ4+ ТЬ2 обычно секретируют такие интерлейкины, как (Ы-4, (Ы-5 или (Ы-13.
Другие функции Т-хелперных Т-клеток СЭ4+ включают обеспечение помощи при активации Вклеток для продукции и высвобождения антител. Они также могут участвовать в активации антигенспецифичных Т-клеток СЭ8+, другой главной субпопуляции Т-клеток, помимо Т-клеток СЭ4+.
Т-клетки СЭ8+ распознают пептид, к которому они являются специфичными, когда он презентируется на поверхности клетки-хозяина молекулами главного комплекса гистосовместимости класса I (МНС I) в присутствии подходящих костимулирующих сигналов. Для того чтобы быть представленным на молекулах МНС I, чужеродный антиген должен непосредственно поступить внутрь клетки (в цитоплазму или в ядро) так, как происходит, когда вирус или внутриклеточные бактерии непосредственно проникают в клетку-хозяина, или после ДНК-вакцинации. Внутри клетки данный антиген перерабатывается на маленькие пептиды, которые будут загружаться на молекулы МНС I, которые перенаправляются на поверхность клетки. При активации Т-клетки СЭ8+ секретируют ряд цитокинов, таких как интерферонгамма, которые активируют макрофаги и другие клетки. Конкретно, субпопуляция этих Т-клеток СЭ8+ секретирует при активации литические и цитотоксические молекулы (например, гранзим, перфорин). Такие Т-клетки СЭ8+ называются цитотоксические Т-клетки.
Совсем недавно был описан альтернативный путь презентации антигена, включающий загрузку экстраклеточных антигенов или их фрагментов на комплексы МНС I и названный перекрестной презентацией (сго88-рге8еп1а1юп).
На природу ответа Т-клеток также влияет композиция адъюванта, использованного в вакцине. Например, было показано, что адъюванты, содержащие МРЬ и Ц821, активируют Т-клетки СЭ4+ ТЫ секретировать ΓΡΝ-гамма (§1е\уаг1 е! а1. Уассше. 2006, 24 (42-43):6483-92).
- 1 021391
В то время как хорошо известно, что адъюванты имеют ценность при усилении иммунных ответов на белковые антигены, их обычно не используют в сочетании с ДНК-вакцинацией или вакцинацией на основе ДНК-векторов. Есть несколько гипотез относительно того, почему адъюванты не используют в сочетании с вакцинами на основе ДНК-векторов. В действительности интерференции между адъювантом и вектором могут иметь влияние на их стабильность. Кроме того, можно ожидать, что добавление адъюванта к ослабленному вектору могло бы повышать реактогенность, индуцированную таким продуктом. Наконец, увеличение иммуногенности вакцины на основе ДНК-вектора может приводить к усиленному нейтрализующему иммунному ответу против самого вектора, предотвращая, посредством этого, любой ревакцинаторный эффект последующих инъекций той же самой вакцины на основе вектора. На самом деле, в протоколе вакцинации, направленной на защиту против инфекции Р. ГаЮрагит, 1опе8 с1 а1. (2001, 1. 1пГес1 О|5еа5С5 183, 303-312), сообщали о вредных последствиях после объединения ДНК, рекомбинантного белка и адъюванта в виде ревакцинаторной композиции после первичной иммунизации ДНК. В самом деле, уровни паразитемии были значительно ниже в группе, в которой ревакцинаторная композиция содержала только белок и адъювант. Заключили, что применение комбинации ДНК, рекомбинантного белка и адъюванта в этом протоколе вредно влияло на результат по паразитемии, а также на гуморальные ответы.
С другой стороны, сообщалось об увеличении эффективности адъювантной вакцины на основе ДНК-вектора (Саппе е1 а1. Уассше (1994), 12(13) 1190-1196). В частности, повышенная эффективность вакцины на основе дефектного по репликации аденовирусного вектора посредством добавления масляных адъювантов коррелировала с более высокими уровнями антител, но о влиянии на ответы Т-клеток СЭ4 и СЭ8 не сообщали.
Применение непатогенного вируса в качестве адъюванта было раскрыто в АО 2007/016715. Не было упомянуто, что указанный вирус может содержать какой-либо гетерологичный полинуклеотид.
Обычно считается, что для оптимального защитного иммунитета нужна стимуляция как клеток ί'Ό4+, так и СЭ8+, особенно при определенных заболеваниях, таких как ВИЧ инфекция/СПИД. Для того чтобы индуцировать оптимальный иммунный ответ либо профилактически, либо терапевтически, желательной является стимуляция и СЭ4+, и СЭ8+ клеток. Это является одной из главных целей стратегий вакцинации с первичной-повторной иммунизацией, при которых поочередное введение вакцин на основе белка (индуцирующих главным образом Т-клетки СЭ4+) с вакцинами на основе ДНК-векторов, т.е. с обнаженной ДНК, с вирусными векторами или с векторами на основе внутриклеточных бактерий, таких как листерия (индуцирующих главным образом Т-клетки СЭ8+) или, наоборот, вероятнее всего активирует как ответы Т-клеток СЭ4+, так и СЭ8+.
Однако, несмотря на то что стратегии вакцинации с первичной-повторной иммунизацией обычно могут приводить к большему или к более сбалансированному ответу, требование вакцинировать более чем один раз и, определенно, более чем два раза может быть обременительным или даже нежизнеспособным, особенно в программах массовой иммунизации для развивающихся стран.
Кроме того, как уже упоминалось выше, часто невозможно осуществлять ревакцинацию компонентом вирусного вектора из-за иммунитета, который был индуцирован против самого вектора.
Таким образом, цели данного изобретения включают одно или более чем одно из следующего: (а) предоставление полного протокола вакцинации и вакцинной композиции, которая стимулирует продукцию СЭ4+ и/или СЭ8+ клеток, и/или антител, и, конкретно, которая устраняет или уменьшает необходимость повторных иммунизаций; (б) предоставление протокола вакцинации и вакцинной композиции, которая лучше стимулирует продукцию СЭ4+ клеток и/или СЭ8+ клеток, и/или антител по отношению к композициям вакцин, содержащим один иммуногенный полипептид, или один полинуклеотид, или по отношению к традиционному протоколу с первичной-повторной иммунизацией, включающему раздельное введение иммуногенного полипептида и полинуклеотида; (в) предоставление вакцинной композиции, которая стимулирует или лучше стимулирует ТЬ1-ответы; (г) предоставление вакцинной композиции и протокола вакцинации, в которых требующиеся дозы компонентов, особенно вирусных векторов, минимизированы; и (д) в общем, предоставление полезной вакцинной композиции и протокола вакцинации для лечения или предупреждения заболеваний, вызванных патогенами. Под фразой лучше стимулирует подразумевается, что интенсивность и/или стойкость ответа увеличивается.
Краткое изложение сущности изобретения
Таким образом, согласно данному изобретению предложен способ индукции иммунного ответа против патогена, включающий введение (1) одного или более чем одного первого иммуногенного полипептида, происходящего из указанного патогена; (2) одного или более чем одного аденовирусного вектора, содержащего один или более чем один гетерологичный полинуклеотид, кодирующий один или более чем один второй иммуногенный полипептид, происходящий из указанного патогена; и (3) адъювант; где один или более чем один первый иммуногенный полипептид, один или более чем один аденовирусный вектор и адъювант вводят совместно.
Согласно конкретному аспекту данного изобретения предложена вакцинная композиция, содержащая (1) один или более чем один первый иммуногенный полипептид, происходящий из патогена; (2) один или более чем один аденовирусный вектор, содержащий один или более чем один гетерологичный
- 2 021391 полинуклеотид, кодирующий один или более чем один второй иммуногенный полипептид, происходящий из указанного патогена; и (3) адъювант.
Также предложена иммуногенная композиция, содержащая (1) один или более чем один первый иммуногенный полипептид, происходящий из патогена; (2) один или более чем один аденовирусный вектор, содержащий один или более чем один гетерологичный полинуклеотид, кодирующий один или более чем один второй иммуногенный полипептид, происходящий из указанного патогена; и (3) адъювант.
Указанные вакцины и иммуногенные композиции соответственно стимулируют продукцию патогенспецифичных Т-клеток СЭ4+. и/или Т-клеток СЭ8+, и/или антител.
Под патогенспецифичными Т-клетками СЭ4+, и/или Т-клетками СЭ8+, и/или антителами подразумеваются Т-клетки СЭ4+, и/или Т-клетки СЭ8+, и/или антитела, которые специфично распознают целый патоген или его часть (например, иммуногенную субъединицу). Под фразой специфично распознают подразумевается, что Т-клетки СЭ4+, и/или Т-клетки СЭ8+, и/или антитела распознают указанный патоген (или его часть) иммуноспецифичным, а не неспецифичным способом.
Также предложен способ стимуляции иммунного ответа у млекопитающего, который включает введение субъекту иммунологически эффективного количества такой композиции.
Также предложено применение такой композиции в изготовлении лекарственного средства для стимуляции иммунного ответа у млекопитающего.
Также предложена такая композиция для применения при стимуляции иммунного ответа у млекопитающего.
Также предложен способ стимуляции продукции патогенспецифичных Т-клеток СЭ4+, и/или Тклеток СЭ8+, и/или антител у млекопитающих, включающий введение указанному млекопитающему (1) одного или более чем одного первого иммуногенного полипептида, происходящего из патогена; (2) одного или более чем одного аденовирусного вектора, содержащего один или более чем один гетерологичный полинуклеотид, кодирующий один или более чем один второй иммуногенный полипептид, происходящий из указанного патогена; и (3) адъюванта; где один или более чем один первый иммуногенный полипептид, один или более чем один аденовирусный вектор и адъювант вводят совместно, например, путем введения иммунологически эффективного количества вышеуказанной композиции.
Также предложено применение вышеуказанных композиций в изготовлении лекарственного средства для стимуляции продукции патогенспецифичных С.П4+ и/или СЭ8+ клеток и/или антител у млекопитающих.
Например, стимулируется продукция Т-клеток СЭ4+, или Т-клеток СЭ8+, или антител.
Соответственно, стимулируется продукция 2 и особенно 3 из Т-клеток СЭ4+, и/или Т-клеток СЭ8+, и/или антител.
Соответственно, стимулируется продукция Т-клеток СЭ8+. Соответственно, стимулируется продукция Т-клеток С.П4+ и СЭ8+. Соответственно, стимулируется продукция Т-клеток СЭ4+ и С.П8+ и антител.
В качестве альтернативы, соответственно, стимулируется продукция Т-клеток СЭ4+. Соответственно, стимулируется продукция СЭ4+ и антител.
В качестве альтернативы, соответственно, стимулируется продукция антител.
Способы по данному изобретению, соответственно, предназначены для обеспечения адекватных стадий для полного способа индукции иммунного ответа (хотя при необходимости данный способ можно повторить). Следовательно, данные способы, соответственно, не включают применение примирующей дозы любого иммуногенного полипептида или полинуклеотида (например, в форме вектора, такого как аденовирусный вектор), кодирующего любой иммуногенный полипептид.
Например, предложен способ индукции иммунного ответа против патогена, который состоит из стадий: (а) введения (1) одного или более чем одного первого иммуногенного полипептида, происходящего из указанного патогена; (2) одного или более чем одного аденовирусного вектора, содержащего один или более чем один гетерологичный полинуклеотид, кодирующий один или более чем один второй иммуногенный полипептид, происходящий из указанного патогена; и (3) адъюванта; где один или более чем один иммуногенный полипептид, один или более чем один аденовирусный вектор и адъювант вводят совместно; и (б) возможно повторения стадий (а).
Стадии данного способа можно повторять (например, повторять один раз), если повтор дает улучшенный иммунный ответ. Адекватный ответ, по меньшей мере, насколько это касается ответа Т-клеток, может быть получен без какой-либо необходимости повторения.
Также предложен способ индукции иммунного ответа против патогена, включающий (а) введение (1) одного или более чем одного первого иммуногенного полипептида, происходящего из указанного патогена; (2) одного или более чем одного аденовирусного вектора, содержащего один или более чем один гетерологичный полинуклеотид, кодирующий один или более чем один второй иммуногенный полипептид, происходящий из указанного патогена; и (3) адъюванта; где один или более чем один первый иммуногенный полипептид, один или более чем один аденовирусный вектор и адъювант вводят совместно; и где данный способ не включает введения какой-либо примирующей дозы иммуногенного полипеп- 3 021391 тида или полинуклеотида, кодирующего иммуногенный полипептид.
Также предложен набор, включающий (1) один или более чем один первый иммуногенный полипептид, происходящий из патогена; (2) один или более чем один аденовирусный вектор, содержащий один или более чем один гетерологичный полинуклеотид, кодирующий один или более чем один второй иммуногенный полипептид, происходящий из указанного патогена; и (3) адъювант; и, конкретно, включающий (1) один или более чем один первый иммуногенный полипептид, происходящий из патогена, и адъювант; и 2) один или более чем один второй аденовирусный вектор, содержащий один или более чем один гетерологичный полинуклеотид, кодирующий один или более чем один иммуногенный полипептид, происходящий из указанного патогена; для применения в способе согласно данному изобретению.
Композиции и способы по изобретению могут быть полезными для предупреждения инфекции патогенами у субъектов, не подвергавшихся воздействию, или для предупреждения повторной инфекции у субъектов, которые ранее были инфицированы патогеном, или для лечения субъектов, которые были инфицированы патогеном.
Краткое описание фигур
На фиг. 1 показано графическое изображение конструкции плазмиды ρ73ί-Τ§τη;
на фиг. 2-8 показаны результаты экспериментов, обсуждаемых в примере 1, в частности:
на фиг. 2а, 2б, 3а, 3б - ответы Т-клеток СЭ4+ и СЭ8+ в ответ на повторную стимуляцию пулами пептидов, происходящих из р24, ΚΤ, №Г и р17, после разных протоколов иммунизации и в разные моменты времени;
на фиг. 4 - гуморальные ответы против Р4;
на фиг. 5-8 - гуморальные ответы против Р4 компонентов р24, ΚΤ, р17 и №Г соответственно; на фиг. 9 показаны результаты экспериментов, обсуждаемых в примере 2, в частности ответы Тклеток СЭ4+ в ответ на повторную стимуляцию пулами пептидов, происходящих из р24 и ΚΤ, после разных протоколов иммунизации;
на фиг. 10-12 показаны результаты экспериментов, обсуждаемых в примере 3, в частности на фиг. 10 показан лимфопролиферативный ответ РВМС (мононуклеары периферической крови) против пептидных пулов, охватывающих последовательность Р4;
на фиг. 11 показана динамика гуморальных ответов против Р4;
на фиг. 12а и 12б показаны гуморальные ответы (в сутки 77) против Р4 компонентов р24 и ΚΤ соответственно;
на фиг. 13 показана количественная оценка ВИЧ-1-специфичных Т-клеток СЭ4;
на фиг. 14 показано распределение частоты Р4-специфичных Т-клеток СЭ4 через 7 суток после двух иммунизаций;
на фиг. 15 показана продукция цитокинов Р4-специфичными Т-клетками СЭ4 через 7 суток после двух иммунизаций;
на фиг. 16 показана количественная оценка ВИЧ-1-специфичных Т-клеток СЭ8;
на фиг. 17 показана продукция цитокинов Р4-специфичными Т-клетками СЭ8 через 7 суток после двух иммунизаций;
на фиг. 18 показана количественная оценка С8Р-специфичных Т-клеток СЭ4; на фиг. 19 показана количественная оценка С8Р-специфичных Т-клеток СЭ8; на фиг. 20 показана количественная оценка С8Р(К-конец)-специфичных Т-клеток СЭ4; на фиг. 21 показана количественная оценка С8Р(С-конец)-специфичных Т-клеток СЭ4; на фиг. 22 показана количественная оценка С8Р(К-конец)-специфичных Т-клеток СЭ8; на фиг. 23 показана количественная оценка С8Р(С-конец)-специфичных Т-клеток СЭ8; на фиг. 24 показана количественная оценка титров С8Р-специфичных антител.
- 4 021391
Обзор перечней последовательностей
Описание аминокислот или полинуклеотидов Идентификатор последовательности (ЗЕО Ю N0:)
Оад-ΗΤ-Νβί (“ΟΗΝ ) ВИЧ (Клад В) (кДНК) 1
Оад-КТ-Ые! (“ΟΡΝ) ВИЧ (Клад В) (аминокислоты) 2
Сад-КТ-интеграза-Ме! (“ΘΚΙΝ”) ВИЧ (Клад А) (КДНК) 3
Оад-НТ-интеграза-Ие! (“ΘΚΙΝ) ВИЧ (Клад А) (аминокислоты) 4
др140 ВИЧ (Клад А) (кДНК) 5
др140 ВИЧ (Клад А) (аминокислоты) 6
др120 ВИЧ (Клад В) (кДНК) 7
др120 ВИЧ (Клад В) (аминокислоты) 8
ТВ антигены слитого белка М72 (кДНК) 9
ТВ антигены слитого белка М72 (аминокислоты) 10
Антиген, происходящий из белка СЗ Р. Ыарагит (кДНК) 11
Антиген, происходящий из белка СЗ Р. (а1с!рагит (аминокислоты) 12
Слитый белок, происходящий из белка СЗ Р. (аЫрагит “КТ5” (кДНК) 13
Слитый белок, происходящий из белка СЗ Р. (а!арагит “КТЗ (аминокислоты) 14
ρ24-ΡΤ-Νθί-ρ17 ВИЧ (кДНК) 15
ρ24-ΗΤ-Νβί-ρ17 ВИЧ (аминокислоты) 16
Перечисленные выше последовательности можно использовать в виде полипептидов или полинуклеотидов, кодирующих полипептиды, полезных в показательных аспектах данного изобретения. Указанные полипептиды могут состоять из или включать вышеупомянутые последовательности. Исходные остатки Ме! являются возможными. Ν-концевые Ηίδ остатки (включая Ηίδ остатки, следующие сразу за исходным Ме!, как в §ЕЦ ГО N0: 9) являются возможными, или можно использовать Ν-концевую Ηίδ метку разной длины (например, для облегчения выделения белка обычно можно использовать вплоть до 6 Ηίδ остатков). Можно использовать белки-аналоги, которые имеют значительную идентичность последовательностей, например большую чем 80%, например большую чем 90%, например большую чем 95%, например большую чем 99% идентичности последовательности по всей длине эталонной последовательности, особенно когда белок-аналог имеет сходную функцию, и, конкретно, когда белок-аналог является аналогично иммуногенным. Например, может быть приемлемым вплоть до 20, например вплоть до 10, например 1-5 замен (например, консервативных замен). Можно использовать нуклеиновые кислоты, которые отличаются от нуклеиновых кислот, перечисленных выше, которые кодируют те же самые белки или вышеупомянутые белки-аналоги. Идентичность последовательности можно определять традиционными способами, например, с использованием ВЬЛ§Т. В одном конкретном варианте 8ЕЦ ГО N0: 16, который можно упомянуть, остаток 398 представляет собой §ег, а не Суδ.
Подробное описание изобретения
При использовании здесь термин совместно означает, когда один или более чем один иммуногенный полипептид, один или более чем один аденовирусный вектор и адъювант вводят в пределах периода не более чем 12 ч, например в пределах периода не более чем 1 ч, типично за один раз, например, во время одного визита к медицинскому работнику, например, один или более чем один иммуногенный полипептид, один или более чем один аденовирусный вектор и адъювант вводят последовательно или одновременно.
Термин эпитоп при использовании здесь относится к иммуногенной аминокислотной последовательности. Эпитоп может относиться к минимальной аминокислотной последовательности типично из 68 аминокислот, причем минимальная последовательность является иммуногенной при удалении из ее природного контекста, например, при трансплантации в гетерологичный полипептид. Эпитоп также может относиться к той части белка, которая является иммуногенной, где полипептид, содержащий эпитоп, именуется антигеном (или иногда полипептидным антигеном). Полипептид или антиген могут содержать один или более чем один (например, 2, или 3, или более) отличный эпитоп. Термин эпитоп охватывает В-клеточные и Т-клеточные эпитопы. Термин Т-клеточный эпитоп охватывает Т-клеточные эпитопы СГО4+ и Т-клеточные эпитопы СГО8+ (иногда также именуемые эпитопы СТЬ).
Термин иммуногенный полипептид относится к полипептиду, который является иммуногенным,
- 5 021391
т.е. он способен вызывать иммунный ответ у млекопитающего и, следовательно, содержит один или более чем один эпитоп (например, Т-клеточные и/или В-клеточные эпитопы). Иммуногенные полипептиды могут содержать один или более чем один полипептидный антиген, например, в неестественном расположении как, например, в слитом белке.
Иммуногенные полипептиды типично будут рекомбинантными белками, продуцируемыми, например, экспрессией в гетерологичном хозяине, таком как бактериальный хозяин, в дрожжах или в культивируемых клетках млекопитающих.
Термин полипептид, происходящий из патогена означает полипептид, который частично или полностью содержит последовательности (т.е. антигены), которые встречаются в природе у патогенов или несут высокую степень идентичности последовательностей с ними (например, более чем 95%-ная идентичность на отрезке из по меньшей мере 10, например из по меньшей мере 20 аминокислот).
Иммуногенные полипептиды могут содержать один или более чем один (например, 1, 2, 3 или 4) полипептидных антигена.
Если не определено иначе, иммунный ответ может быть клеточным и/или гуморальным ответом.
В одном воплощении данного изобретения один или более чем один из указанного одного или более чем одного первого иммуногенного полипептида является, по существу, тем же самым, что и один или более чем один из указанного одного или более чем одного второго иммуногенного полипептида. Например, один из по меньшей мере одного первого иммуногенного полипептида и один из по меньшей мере одного второго иммуногенного полипептида может иметь общую идентичность последовательности 90% или более, например 95% или более, например 98% или 99% или более по длине одного или другого иммуногенного полипептида.
В другом воплощении данного изобретения один или более чем один из указанного одного или более чем одного первого иммуногенного полипептида содержит по меньшей мере один антиген, который, по существу, является тем же самым, что и антиген, содержащийся в одном или более чем одном из указанного одного или более чем одного второго иммуногенного полипептида. Например, один из по меньшей мере одного первого иммуногенного полипептида и один из по меньшей мере одного второго иммуногенного полипептида может иметь общую идентичность последовательности 90% или более, например 95% или более, например 98 или 99% или более по длине отрезка из 20 аминокислот или более, например из 40 аминокислот или более, например из 60 аминокислот или более.
Соответственно, один или более чем один первый иммуногенный полипептид содержит по меньшей мере один Т-клеточный эпитоп.
Соответственно, один или более чем один второй иммуногенный полипептид содержит по меньшей мере один Т-клеточный эпитоп.
Соответственно, один или более чем один первый иммуногенный полипептид содержит по меньшей мере один В-клеточный эпитоп.
Соответственно, один или более чем один второй иммуногенный полипептид содержит по меньшей мере один В-клеточный эпитоп.
В другом воплощении данного изобретения один или более чем один из указанного одного или более чем одного первого иммуногенного полипептида и один или более чем один из указанного одного или более чем одного второго иммуногенного полипептида имеют один или более чем один идентичный В-клеточный и/или Т-клеточный эпитоп. Соответственно, они имеют одну или более чем одну идентичную аминокислотную последовательность длиной 10 аминокислот или более, например 15 аминокислот или более, например 25 аминокислот или более.
В другом воплощении данного изобретения ни один из одного или более чем одного из указанного одного или более чем одного первого иммуногенного полипептида не является, по существу, тем же самым или не содержит какой-либо общий антиген с одним или более чем одним из указанного одного или более чем одного второго иммуногенного полипептида, например, они могут иметь общую идентичность последовательности менее чем 90% на отрезке из 20 аминокислот или более, например из 40 аминокислот или более, например из 60 аминокислот или более.
Таким образом, они могут не иметь каких-либо общих В-клеточных или Т-клеточных эпитопов. Например, они могут не иметь каких-либо общих идентичных аминокислотных последовательностей длиной 10 аминокислот или более, например 15 аминокислот или более, например 25 аминокислот или более.
В одном конкретном воплощении данного изобретения первый иммуногенный полипептид и второй иммуногенный полипептид содержат те же самые антигены в том же самом расположении или в другом расположении (например, в другом расположении). Под другим расположением подразумевается, что они могут располагаться в другом порядке и/или то, что они могут быть разделены. В другом конкретном воплощении данного изобретения первый иммуногенный полипептид и второй иммуногенный полипептид являются одинаковыми.
Композиция согласно данному изобретению может содержать один первый иммуногенный полипептид в качестве единственного иммуногенного полипептида в композиции. В качестве альтернативы, композиция согласно данному изобретению может содержать более чем один первый иммуногенный
- 6 021391 полипептид, например 2, или 3, или 4, или более иммуногенных полипептидов.
Композиция согласно данному изобретению может содержать один аденовирусный вектор. В качестве альтернативы, она может содержать более чем один аденовирусный вектор, например 2 аденовирусных вектора.
В композициях согласно данному изобретению аденовирусный вектор может содержать гетерологичный полинуклеотид, который кодирует один второй иммуногенный полипептид, или он может содержать более чем один гетерологичный полинуклеотид, которые вместе кодируют более чем один второй иммуногенный полипептид под контролем более чем одного промотора.
Так же как и для профилактической вакцинации, композиции по данному изобретению также можно использовать у индивидуумов, которые уже инфицированы патогеном, и они будут приводить к улучшенному иммунологическому контролю установившейся инфекции. Это особенно интересно, когда патогеном является ВИЧ (вирус иммунодефицита человека). В случае ВИЧ считается, что этот контроль достигается СО8-позитивными Т-клетками, которые специфически распознают ВИЧ-инфицированные клетки. Такой ответ СЭ8-позитивных Т-клеток поддерживается присутствием ВИЧ-специфичных СЭ4позитивных клеток Т-хелперов. Следовательно, индукция обоих типов иммунного ответа является особенно полезной и может достигаться путем объединения разных композиций вакцины. Комбинация адъювантного белка и рекомбинантного аденовируса является особенно интересной. ВИЧ-инфицированные пациенты, которые будут получать пользу от вышеописанной вакцинации, находятся во время вакцинации или в состоянии первичной инфекции, в латентной, или конечной фазе ВИЧ-инфекции. Во время вакцинации данные пациенты могут подвергаться или могут не подвергаться другим вмешательствам терапевтического лечения против патогена (в случае ВИЧ - например, высокоактивной антиретровирусной терапии).
Антигены.
Полезные антигены согласно данному изобретению происходят из патогенов.
Патогены включают вирусы, бактерии, простейшие и другие паразитические организмы, вредные для млекопитающих, включая человека.
Подходящие полипептидные антигены, подлежащие введению в виде полипептида или полинуклеотида, кодирующего полипептид согласно данному изобретению, включают антигены, происходящие из ВИЧ (например, Н1У-1), вирусов герпеса человека (такие как дН, дЬ, дМ, дВ, дС, дК, дЕ или дЭ. или их производные, или предранний белок, такой как 1СР27, 1СР47, 1СР4, 1СР36 из Н8У1 или Н8У2), цитомегаловируса, особенно человеческого (такой как дВ или их производные), вируса Эпштейна-Барр (такой как др350 или его производные), вируса ветряной оспы (такой как др1, II, III и 1Е63) или из вируса гепатита, такого как вирус гепатита В (например, антиген поверхности гепатита В, Рге81, Рге82 и поверхностные белки оболочки, коровый антиген гепатита В или ро1), вирус гепатита С (например, кор, Е1, Е2, Р7, N82, N83, Ν84Α, Ν84Β, Ν85Α и В) и антиген вируса гепатита Е, или из других вирусных патогенов, таких как парамиксовирусы: респираторно-синцитиальный вирус (такие как белки Р и С и их производные), или антигены из вируса парагриппа, вируса кори, вируса свинки, вирусов человеческой папилломы (например, НРУ6, 11, 16, 18, например Ь1, Ь2, Е1, Е2, Е3, Е4, Е5, Е6, Е7), флавивирусов (например, вирус желтой лихорадки, вирус денге, вирус клещевого энцефалита, вирус японского энцефалита) или вируса гриппа (такой как гемагглютинин, нуклеопротеин, белки ΝΑ или М, или их комбинации), или антигены, происходящие из бактериальных патогенов, таких как виды рода №188епа, включая Ν. допогтИеа и Ν. тешпд1ИЙ18, например трансферринсвязывающие белки, лактоферринсвязывающие белки, РИС, адгезины); 8. руодепе8 (например, М белки или их фрагменты, протеиназа С5А), 8. ада1асйае, 8. ти1апз; Н. йистеуц виды рода Могахе11а, включая М. са1атгИаН8, также известная как ВгапИате11а са1аттИаН8 (например, адгезины и инвазины с высокой и низкой молекулярной массой); виды рода Вотйе1е11а, включая В. рет1и8818 (например, пертактин, коклюшный токсин или его производные, нитчатый гемагглютинин, аденилатциклаза, фимбрии), В. рагарепи8818 и В. ЪтопсЫзерйса; виды рода МусоЪас1етшт, включая М. 1иЬегси1о818, М. Ъоу18, М. 1ергае, М. аущт, М. рага1иЪегси1о818, М. 8тедтаИ8; виды рода ЬедюпеПа, включая Ь. рпеиторЫ1а; виды рода Е8сИег1сЫа, включая энтеротоксическую Е.соИ (например, факторы колонизации, термолабильный токсин или его производные, термостабильный токсин или его производные), энтерогеморрагическую Е.соИ, энтеропатогенную Е.соИ (например, шигаподобный токсин или его производные); виды рода У&тю, включая У. сИо1ета (например, холерный токсин или его производные); виды рода 8Ыде11а, включая 8. 8оппек 8. Йу8еп1епае, 8. йехпетИ; виды рода Уешша, включая Υ. еШетосоНИса (например, белок Υор), Υ. ре8Й8, Υ. р8енИо1нЬегси1о818; виды рода Сатру1оЪас1ет, включая С. .ίςριπί (например, токсины, адгезины и инвазины) и С.соН; виды рода 8а1топе11а, включая 8. 1урЫ, 8. рага1урИ1, 8. сИо1етае8Ш8, 8. еп1ег1ИЙ18; виды рода Е181ег1а, включая Ь. топосу1одепе8; виды рода НеНсоЪас1ет, включая Н. ру1ой (например, уреаза, каталаза, вакуолизирующий токсин); виды рода Р8еийотопа8, включая Р. аетидто8а; виды рода 81арИу1ососси8, включая 8. аитеи8, 8. ер|Иегт1018; виды рода Еп1етососси8, включая Е. ЕаесаИ8, Е. Еаесшт; виды рода С1о8Итйшт, включая С. 1е1аш (например, столбнячный токсин и его производное), С. ЪоШНпит (например, ботулотоксин и его производное), С. йййсйе (например, токсины А или В клостридий или их производные); виды рода Васй1и8, включая В. ап1Итас18 (например, ботулотоксин и его производные); виды рода СотупеЪас1егшт, включая С. ФрИШейае (например, дифтерийный
- 7 021391 токсин и его производные); виды рода ВотгеЬа, включая В. ЬигдбогГеп (например, ОкрА, ОкрС, ИЬрА, ИЬрВ). В. дагиш (например, ОкрА, ОкрС, ИЬрА. ИЬрВ). В. аГгеШ (например, ОкрА, ОкрС, ИЬрА. ИЬрВ). В. апбеткопи (например, ОкрА, ОкрС, ИЬрА. ИЬрВ). В. Ьетткп; виды рода ЕЬтЬсЫа, включая Е. сера и агент человеческого гранулоцитарного эрлихиоза; виды рода КюкеЬыа, включая К. пскеПт; виды рода СЫатуШа, включая С. 1тасЬотабк, С. риеитотае, С. ркЫасц виды рода ЬерШкрта, включая Ь. 1Шеггодаик; виды рода Тгеропета, включая Т. ра1Ьбит (например, редкие белки наружной мембраны), Т. беиОсо1а. Т. ЬуобукеШепае; или происходящие из паразитов, таких как виды рода Иактошт, включая Р. Га1тратит и Р. у1уах; виды рода Тохор1акта, включая Т. доибп (например, 8АО2, 8АО3, Тд34); виды рода Еи1атоеЬа, включая Е. Ык1о1убса; виды рода ВаЬейа. включая В. тютоб; виды рода Тгураиокота, включая Т. сги/ί; виды рода О1агб1а, включая О. 1атЬба; виды рода ЬетЬтата, включая Ь. та.)ог, виды рода Риеитосукбк, включая Р. сатши; виды рода ТпсЬотоиак, включая Т. уадшабк; виды рода ЗсЫкокЮта. включая 8. таикош, или происходящие из дрожжей, таких как виды рода Саиб1ба, включая С. а1Ысаик; виды рода СгурЮсоссик. включая С. иеоГогтаик.
Дополнительные бактериальные антигены включают антигены, происходящие из видов рода 8берЮсоссик. включая 8. риеитотае (РкаА, РкрА, стрептолизин, холинсвязывающие белки) и белковый антиген пневмолизин (ВюсЬет ВюрЬук Ас!а, 1989, 67, 1007; КиЬшк е! а1., МютоЬШ РаШодеиеык, 25, 337-342) и его мутантные детоксифицированные производные (АО 90/06951; АО 99/03884). Другие бактериальные антигены включают антигены, происходящие из видов рода НаеторЬЛик, включая Н. отЛпеи/ае типа В (например, РКР и его конъюгаты), нетипируемый Н. тПнеи/ае. например, ОМР26, высокомолекулярные адгезины, Р5, Р6, белок И и липопротеин И, фимбрин и пептиды, происходящие из фимбрина (И8 5843464), или их варианты с множественными копиями или слитые белки.
Конкретно способы или композиции по настоящему изобретению можно использовать для защиты против или для лечения вирусных расстройств, таких как расстройства, вызванные вирусом гепатита В, вирусом гепатита С, вирусом папилломы человека, вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), или вирусом герпеса; бактериальных заболеваний, таких как заболевания, вызванные МусоЬасЮгшт 1иЬегси1ок1к (ТВ) или видами рода СЬ1атуб1а; и протозойных инфекций, таких как малярия.
Следует понимать, что на эти конкретные болезненные состояния, патогены и антигены ссылались только в качестве примера, и они не предназначены для того, чтобы ограничивать объем настоящего изобретения.
Антигены ТВ (туберкулез).
Патогеном может быть, например, МусоЬасЮгшт 1иЬегси1ок1к.
Типичными антигенами, происходящими из М. 1иЬегси1ок1к, являются, например, альфа-кристаллин (НкрХ), НВНА, Ку1753, Ку2386, Ку2707, Ку2557, Ку2558, КРР: Ку0837с, Ку1884с, Ку2389с, Κν2450, Ку1009, асеА (Ку0467), Е8АТ6, ТЬ38-1, А§85А, -В или -С, МРТ 44, МРТ59, МРТ45, Н8Р10, Н8Р65, Н8Р70, Н8Р75, Н8Р90, РРИ 19 кДа [Ку3763], РРИ, 38 кДа [Ку0934], Рк!81, (Ку0932), 8обА (Ку3846), Ку2031с, 16 кДа, Ка12, ТЬН9, Ка35, ТЬ38-1, Егб 14, ИРУ, МТ1, М8Ь, ИРРИ, тТСС1, тТСС2, ЬТСС1 (АО 99/51748) и ЬТСС2 и особенно М!Ь32а, Ка35, Ка12, ИРУ, М8Ь, МТ1, ТЬ38-1, тТСС1, ТЬН9 (М!Ь39а), ЬТСС1, тТСС2 и ИРРИ. Антигены, происходящие из М. ЮЬегсЫокб. также включают слитые белки и их варианты, где по меньшей мере два или, например, три полипептида М. 1иЬегси1ок1к слиты в больший белок. Такие слияния могут содержать или состоять из Ка12-ТЬН9-Ка35, Етб14-ИРУ-МТ1, ИРУ-МТ1М8Ь, Егб14-ИРУ-МТ1-М8Ь-тТСС2, Егб14-ИРУ-МТ1-М8Ь, ИРУ-МТ1-М8Ь-тТСС2, ТЬН9-ИРУ-МТ1 (АО 99/51748), Ка12-ТЬЬ9-Ка35-А§85В и Ка12-ТЬЬ9-Ка35-тТСС2. Конкретно последовательность Ка12ТЬЬ9-Ка35, которую можно упомянуть, определена 8ЕЦ 1И ИО: 6 АО 2006/117240, вместе с вариантами, в которых 8ет 704 этой последовательности мутирован до другой аминокислоты, чем серин, например, до А1а, и их производными, включающими Ν-концевую Шк метку подходящей длины (например, 8ЕЦ 1И ИО: 2 или 4 АО 2006/117240). См. также 8ЕЦ 1И ИО: 10, которая представляет собой последовательность, содержащую возможный исходный М и возможную Ν-концевую Шк-Шк метку (положения 2 и 3), и в которой в положении 706 находится мутированный А1а по сравнению с 8ег дикого типа.
Антигены СЬ1атуб1а.
Патогеном могут быть, например, виды рода СЬ1атуб1а, например С. 1тасЬотабк.
Типичные антигены, происходящие из видов рода СЬ1атуб1а, например из С. (гасЬотабк. выбраны из СТ858, СТ089, СТ875, МОМР, СТ622, РтрИ, РтрО и их фрагментов, 8А1В и иммуногенных фрагментов любого из них (таких как РтбИрб и РтбОрб) и из их комбинаций. Предпочтительные комбинации антигенов включают СТ858, СТ089 и СТ875. Конкретные последовательности и комбинации, которые можно использовать, описаны в АО 2006/104890.
Антигены Р1актобшт.
Патогеном может быть, например, паразит, который вызывает малярию, такой как Р1актобшт кр, например Р. ГаШрагит или Р. у1уах.
Например, антигены, происходящие из Р. ГаШрагит. включают белок циркумспорозоита (белок С8), РГЕМР-1, антиген РГк 16, М8Р-1, М8Р-3, Ь8А-1, Ь8А-3, АМА-1 и ТКАР. Конкретным гибридным антигеном, который можно упомянуть, является КТ8. КТ8 представляет собой гибридный белок, содержащий, по существу, всю С-концевую часть белка циркумспорозоита (С8) Р. ГаШратит, связанную через
- 8 021391 четыре аминокислоты части рге82 антигена поверхности (вируса) гепатита В с антигеном поверхности (8) вируса гепатита В. При экспрессии в дрожжах ΚΤδ продуцируется в виде частицы липопротеина, и, когда он коэкспрессируется с антигеном δ НВУ (вирус гепатита В), он продуцирует смешанную частицу, известную как ΚΤδ,δ. Структура ΚΤδ и ΚΤδ,δ раскрыта в АО 93/10152. Антигены ТКЛР описаны в АО 90/01496. Другие антигены Р1а8шобшш включают ЕВА, СЬИКР, КЛР1, КЛР2, секвестрин, Р1332, δΤΛΒΡ, δΛΣδΆ, Р1ЕХР1, РЙ25, РЙ28, РР827/25, РЙ48/45, РЙ230 Р. Га1е1рагит и их аналоги в других видах рода Р1а§тобшт. Одним воплощением настоящего изобретения является композиция, содержащая ΚΤδ,δ или белок Οδ, или его фрагмент, такой как С8 часть ΚΤδ,δ в комбинации с одним или более чем одним другим малярийным антигеном, который может быть выбран, например, из группы, состоящей из М8Р-1, М8Р-3, АМА-1, РГ 16, ΕδΑ-1 или ΕδΑ-3. Возможные антигены из Р. νίνηχ включают белок циркумспорозоита (белок Οδ) и белок, связывающий антиген Даффи (ЭиГГу), и их иммуногенные фрагменты, такие как РуРП (см., например, АО 02/12292).
Таким образом, в одном подходящем воплощении данного изобретения первый и второй иммуногенные полипептиды выбраны из антигенов, происходящих из Р1а8тобшт ГаЮрагит и/или из Р1а§тобшт νίνηχ.
Например, первый и/или второй иммуногенные полипептиды, выбранные из антигенов, происходящих из Р1а8тобшт ГаЮрагит и/или Р1а8тобшт \ауах, выбраны из ΚΤδ (например, в виде ΚΤδ,δ), белка циркумспорозоита (С8), М8Р-1, М8Р-3, АМА-1, ΕδΑ-1, ΕδΑ-3 и из их иммуногенных производных или их иммуногенных фрагментов.
Одним конкретным производным, которое можно упомянуть, является гибридный белок, известный как ΚΤδ, особенно когда он представлен в форме смешанной частицы, известной как ΚΤδ,δ.
Типичная последовательность ΚΤδ показана в δΕΟ ΙΌ N0: 14.
Типичный антиген, происходящий из белка С8 Р. ГаЮратит, показан в δΕΟ ΙΌ N0: 12. Эта конкретная последовательность соответствует последовательности С8Р Р. ГаЮратит (штамм 3Ό7), которая также содержит вставку из 19 аминокислот, происходящую из штамма 708 (81-100).
В одном конкретном воплощении данного изобретения первый иммуногенный полипептид представляет собой ΚΤδ,δ, и второй иммуногенный полипептид представляет собой белок С8 из Р1а8тобшт ГаЮрагит или его иммуногенный фрагмент.
Антигены НРУ (вирус папилломы человека).
Патогеном может быть, например, вирус папилломы человека.
Таким образом, антигены, полезные в настоящем изобретении, например, могут происходить из вируса папилломы человека (НРУ), который, как считается, отвечает за остроконечные бородавки (НРУ 6 или НРУ 11 и другие), и/или из вирусов НРУ, ответственных за рак шейки матки (НРУ16, НРУ18, НРУ33, НРУ51, НРУ56, НРУ31, НРУ45, НРУ58, НРУ52 и другие). В одном воплощении формы профилактических или терапевтических композиций против остроконечных бородавок содержат частицы Ь1 или капсомеры и слитые белки, содержащие один или более чем один антиген, выбранные из белков НРУ Е1, Е2, Е5, Е6, Е7, Ь1 и Ь2. В одном воплощении формами слитого белка являются: Ь2Е7, как раскрыто в АО 96/26277, и белок Ό (1/3)-Е7, раскрытый в РСТ/ЕР98/05285.
Предпочтительные профилактические или терапевтические композиции против инфекции или рака шейки матки, вызванных НРУ, могут содержать антигены НРУ 16 или 18. Например, мономеры антигенов Ь1 или Ь2, или антигены Ь1 или Ь2, присутствующие вместе в виде вирусоподобной частицы (УЪР), или один белок Ь1, присутствующий один в УЪР, или в структуре капсомера. Такие антигены, вирусоподобные частицы и капсомер известны как таковые. См., например, АО 94/00152, АО 94/20137, АО 94/05792 и АО 93/02184. Могут быть включены дополнительные ранние белки, одни или в виде слитых белков, такие как, например, Е7, Е2 или предпочтительно Е5; особенно предпочтительное воплощение этого включает УЪР, содержащую слитые белки Ь1Е7 (АО 96/11272). В одном воплощении антигены НРУ 16 содержат ранние белки Е6 или Е7 в слиянии с белком-носителем Ό с образованием белок Ό-Ε6 или -Е7 слияний из НРУ 16 или их комбинации; или комбинации Е6 или Е7 с Ь2 (АО 96/26277). В качестве альтернативы ранние белки Е6 или Е7 НРУ 16 или 18 могут быть представлены в одной молекуле, предпочтительно в слиянии белок Ό-Ε6/Ε7. Такая композиция возможно может давать один из или оба белка Е6 и Е7 из НРУ 18, предпочтительно в форме слитого белка белок Ό-Ε6 или белок Ό-Ε7 или слитого белка белок Ό Е6/Е7. Дополнительно можно использовать антигены из других штаммов НРУ, предпочтительно из штаммов НРУ 31 или 33.
Антигены ВИЧ.
Патогеном может быть, например, ВИЧ, например ВИЧ-1.
Таким образом, антигены могут быть выбраны из антигенов, происходящих из ВИЧ, конкретно из антигенов, происходящих из ВИЧ-1.
Белки Τаΐ и №Г ВИЧ представляют собой ранние белки, т.е. они экспрессируются рано при инфекции и в отсутствие структурных белков.
Ген №Г кодирует ранний вспомогательный белок ВИЧ, который, как было показано, обладает несколькими активностями. Например, известно, что белок №Г вызывает удаление СЭ4, рецептора ВИЧ, с поверхности клетки, хотя биологическая значимость этой функции обсуждается. Дополнительно №Г
- 9 021391 взаимодействует с сигнальным путем Т-клеток и индуцирует активное состояние, которое, в свою очередь, может стимулировать более эффективную экспрессию генов. Некоторые изоляты ВИЧ имеют мутации или делеции в этой области, которые являются причиной того, что эти изоляты не кодируют функциональный белок и имеют серьезные нарушения в своей репликации и патогенезе ίη νίνο.
Ген Сад транслируется в полноразмерную РНК с образованием полибелка-предшественника, который затем расщепляется на 3-5 капсидных белков; белок матрикса р17, капсидный белок р24 и белок, связывающий нуклеиновые кислоты (Рипбатеп1а1 Уио1оду, Не1бк Β.Ν., Кшре Ό.Μ. апб Но\у1еу М. 1996,
2. Не1бк У1го1оду, νοί. 2, 1996).
Ген Сад приводит к образованию белка-предшественника Сад в 55 килодальтон (кДа), также именуемого р55, который экспрессируется на вирусной мРНК, не подвергавшейся сплайсингу. Во время трансляции Ν-конец р55 миристоилируется, запуская его ассоциацию с цитоплазматической стороной клеточных мембран. Ассоциированный с мембраной полибелок Сад рекрутирует две копии вирусной геномной РНК, наряду с другими вирусными и клеточными белками, которые запускают отпочковывание вирусной частицы от поверхности инфицированной клетки. После отпочковывания, на протяжении процесса созревания вируса, р55 расщепляется протеиназой, кодируемой вирусом (продукт гена Ро1), на четыре меньших белка, обозначенных МА (матриксный [р17]), СА (капсидный [р24]), N0 (нуклеокапсидный [р9]) и р6.(4).
Помимо 3 главных Сад белков (р17, р24 и р9) все предшественники Сад содержат несколько других областей, которые вырезаются и сохраняются в вирионе в виде пептидов разных размеров. Эти белки имеют разные назначения, например, белок р2 имеет предполагаемую роль в регуляции активности протеиназы и способствует правильному временному паттерну протеолитического процессинга.
Полипептид МА происходит из Ν-концевого миристоилированного конца р55. Большинство молекул МА остаются прикрепленными к внутренней поверхности липидного бислоя вириона, стабилизируя частицу. Подгруппа МА рекрутируется внутрь более глубоких слоев вириона, где она становится частью комплекса, который экскортирует вирусную ДНК в ядро. Эти молекулы МА облегчают ядерный транспорт вирусного генома, так как кариофильный сигнал МА распознается клеточным механизмом ядерного импорта. Этот феномен позволяет ВИЧ инфицировать неделящиеся клетки, что является необычным свойством для ретровируса.
Белок р24 (СА) образует конический кор вирусных частиц. Было продемонстрировано, что циклофилин А взаимодействует с областью р24 р55, приводя к его включению в частицы ВИЧ. Взаимодействие между Сад и циклофилином А является существенным, так как нарушение этого взаимодействия циклоспорином ингибирует репликацию вируса.
Область N0 Сад отвечает за специфическое распознавание так называемого упаковочного сигнала ВИЧ. Данный упаковочный сигнал состоит из четырех структур типа стебель-петля, расположенных около 5'-конца вирусной РНК, и является достаточным для опосредования включения гетерологичной РНК в вирионы ВИЧ-1. N0 связывается с упаковочным сигналом посредством взаимодействий, опосредованных двумя мотивами цинковых пальцев. N0 также облегчает обратную транскрипцию.
Полипептидная область р6 опосредует взаимодействия между р55 Сад и вспомогательным белком Ург, приводя к включению Ург в собирающиеся вирионы. Область р6 также содержит так называемый поздний домен, который требуется для эффективного высвобождения отпочковывающихся вирионов из инфицированной клетки.
Ген Ро1 кодирует три белка, имеющих активности, нужные вирусу при ранней инфекции, обратную транскриптазу КТ, протеиназу и интегразный белок, необходимый для интеграции вирусной ДНК в клеточную ДНК. Первичный продукт Ро1 отщепляется протеиназой вириона с образованием аминоконцевого пептида КТ, который содержит активности, необходимые для синтеза ДНК (РНК- и ДНКнаправленная ДНК-полимераза, рибонуклеаза Н), и карбоксиконцевого интегразного белка. КТ ВИЧ представляет собой гетеродимер полноразмерной КТ (р66) и продукта расщепления (р51), не имеющего карбоксиконцевого домена РНКазы Н.
КТ является одним из наиболее высококонсервативных белков, кодируемых ретровирусным геномом. Двумя главными активностями КТ являются (активности) ДНК Ро1 и рибонуклеазы Н. Активность ДНК Ро1 КТ взаимозаменяемо использует РНК и ДНК в качестве матриц и, подобно всем известным ДНК-полимеразам, не способна инициировать синтез ДНК бе ηονο, но требует того, чтобы заранее существующая молекула служила в качестве праймера (РНК).
Активность РНКазы Н, присущая всем белкам КТ, играет существенную роль в ранний момент времени при репликации, удаляя РНК геном по мере продолжения синтеза ДНК. Она селективно деградирует РНК из всех гибридных молекул РНК-ДНК. Структурно полимераза и рибо Н занимают раздельные, неперекрывающиеся домены в Ро1, охватывающие две трети аминоконца Ро1.
Каталитическая субъединица р66 складывается в 5 различных субдоменов. Их 23 аминоконцевые (аминокислоты) имеют часть с активностью КТ. Ближе к карбоксиконцу по отношению к ним находится домен РНКазы Н.
После инфекции клетки-хозяина ретровирусная геномная РНК копируется в линейную двухцепочечную ДНК обратной транскриптазой, которая присутствует в инфекционной частице. Интеграза (рас- 10 021391 смотренная в §ка1ка АМ '99 Αάν ίη νίπΐδ Ке8 52, 271-273) распознает концы вирусной ДНК, подрезает их и сопровождает вирусную ДНК к сайту на хромосоме хозяина для того, чтобы катализировать интеграцию. Многие сайты в ДНК хозяина могут быть мишенями для интеграции. Несмотря на то что интеграза достаточна для катализа интеграции ίη νίίτο, она является не единственным белком, связанным с вирусной ДНК ίη νίνο - большой комплекс белок-вирусная ДНК, выделенный из инфицированных клеток, был обозначен как прединтеграционный комплекс. Он облегчает захват генов клетки-хозяина потомством вирусных геномов.
Интеграза составлена из 3 отличных доменов, Ν-концевого домена, каталитического кора и Сконцевого домена. Каталитический коровый домен содержит все требующееся для химии полинуклеотидильного переноса.
Антигены, происходящие из ВИЧ-1, для применения в данном изобретении, таким образом, могут, например, быть выбраны из Сад (например, полноразмерного Сад), р17 (части Сад). р24 (другой части Сад), р41, р40, Ро1 (например, полноразмерная Ρο1), КТ (часть Ρο1), р51 (часть Ρο1), интегразы (часть Ρο1), протеиназы (часть Ρο1), Εην, др120, др140 или др160, др41, №Г, νίί, νρτ, νρυ, Κν, Таί и их иммуногенных производных и их иммуногенных фрагментов, конкретно Εην, Сад, №Г и Ρο1 и их иммуногенный производных и их иммуногенных фрагментов, включая р17, р24, КТ и интегразу. Вакцины против ВИЧ могут содержать полипептиды и/или полинуклеотиды, кодирующие полипептиды, соответствующие многим разным антигенам ВИЧ, например 2, или 3, или 4, или более антигенам ВИЧ, которые можно выбрать из списка, приведенного выше. Несколько разных антигенов, например, могут содержаться в одном слитом белке. Можно использовать более чем один первый иммуногенный полипептид и/или более чем один второй иммуногенный полипептид, каждый из которых представляет собой антиген ВИЧ или слияние более чем одного антигена.
Например, антиген может содержать Сад или его иммуногенное производное, или иммуногенный фрагмент, слитый с КТ, или его иммуногенное производное, или иммуногенный фрагмент, слитый с №Г, или его иммуногенное производное, или иммуногенный фрагмент, где Сад часть слитого белка присутствует на 5'-конце полипептида.
Последовательность Сад, полезная согласно данному изобретению, может исключать последовательность, кодирующую полипептид р6 Сад.
Конкретный пример последовательности Сад для применения в данном изобретении содержит последовательности, кодирующие р17 и/или р24.
Последовательность КТ может содержать мутацию для того, чтобы, по существу, инактивировать любую активность обратной транскриптазы (см. \УО 03/025003).
Ген КТ является компонентом большего гена ρο1 в геноме ВИЧ. Будет понятно, что последовательность КТ, используемая согласно данному изобретению, может присутствовать в контексте Ρο1 или фрагмента Ρο1, соответствующего, по меньшей мере, КТ. Такие фрагменты Ρο1 сохраняют главные эпитопы Ρο1 для СТЬ (цитолитические Т-лимфоциты). В одном конкретном примере КТ включен в виде только р51 или только р66 фрагментов КТ.
Компонент КТ слитого белка или композиции согласно данному изобретению возможно содержит мутацию для удаления сайта, который служит в качестве внутреннего сайта инициации в прокариотических системах экспрессии.
Возможно последовательность №Г для применения в данном изобретении является усеченной для удаления последовательности, кодирующей Ν-концевую область, т.е. для удаления от 30 до 85 аминокислот, например от 60 до 85 аминокислот, конкретно 65 Ν-концевых аминокислот (последнее усечение именуется здесь ίτ№Γ). Альтернативно или дополнительно №Г может быть модифицирован для удаления сайта миристилирования. Например, сайт миристилирования С1у 2 может быть удален делецией или заменой. Альтернативно или дополнительно №Г может быть модифицирован для изменения дилейцинового мотива Ьеи 174 и Ьеи 175 путем делеции или замены одного или обоих лейцинов. Важность дилейцинового мотива при понижающей регуляции СИ4 описана, например, в Вгещакан Ρ.Α. еί а1. (1998), СиггеШ Вюкду, 8(22): 1235-8.
Антиген Εην может присутствовать полноразмерным, как др160, или усеченным, как др140, или более коротким (возможно с подходящей мутацией для разрушения мотива сайта расщепления между др120 и др41). Антиген Εην также может присутствовать в его встречающейся в природе подвергнувшейся процессингу форме в виде др120 и др41. Эти два производных др160 можно использовать индивидуально или совместно в виде комбинации. Вышеупомянутые антигены Εην могут дополнительно демонстрировать делеции (конкретно вариабельные петли) и усечения. Также можно использовать фрагменты Εην.
Типичная последовательность др120 показана в 8ΕΟ ГО ΝΟ: 8. Типичная последовательность др140 показана в 8ΕΟ ГО ΝΟ: 6.
Иммуногенные полипептиды согласно данному изобретению могут содержать Сад, Ρο1, Εην и №Г, где присутствуют по меньшей мере 75%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 95%, например, 96% эпитопов СТЬ этих нативных антигенов.
В иммуногенных полипептидах согласно данному изобретению, которые содержат р17/р24 Сад, р66
- 11 021391
КТ и усеченный №£, как определено выше, соответственно присутствуют 96% эпитопов СТЬ нативных антигенов Сад. Ро1 и №Г.
Согласно одному воплощению данного изобретения предложен иммуногенный полипептид, содержащий р17, р24 Сад, р66 КТ, усеченный №Г (лишенный нуклеотидов, кодирующих терминальные аминокислоты 1-85 -1г№Г) в порядке Сад, КТ, №Г. В полинуклеотидах, кодирующих иммуногенные полипептиды по изобретению, соответственно, Р24 Сад и Р66 КТ являются оптимизированными по кодонам.
Конкретные полинуклеотидные конструкции и соответствующие полипептидные антигены согласно данному изобретению включают:
1. р17, р24 (с оптимизированными кодонами) Сад - р66 КТ (с оптимизированными кодонами) - усеченный №£;
2. усеченный №Г - р66 КТ (с оптимизированными кодонами) - р17, р24 (с оптимизированными кодонами) Сад;
3. усеченный №Г - р17, р24 (с оптимизированными кодонами) Сад - р66 КТ (с оптимизированными кодонами);
4. р66 КТ (с оптимизированными кодонами) - р17, р24 (с оптимизированными кодонами) Сад - усеченный №£;
5. р66 КТ (с оптимизированными кодонами) - усеченный №Г - р17, р24 (с оптимизированными кодонами) Сад;
6. р17, р24 (с оптимизированными кодонами) Сад - усеченный №Г - р66 КТ (с оптимизированными кодонами).
Типичным слиянием является слияние Сад, КТ и №£, конкретно, в порядке Сад-РТ-№Г (см., например, 8ЕС ГО N0: 2). Другим типичным слиянием является слияние р17, р24, КТ и Νοί, конкретно, в порядке р24-КТ-№Г-р17 (см., например, 8ЕЦ ГО N0: 16, везде здесь именуемую Р4).
В другом воплощении иммуногенные полипептиды содержат Сад, КТ, интегразу и №Г, особенно в порядке Сад-КТ-интеграза-№£ (смотри, например, 8ЕЦ ГО N0: 4).
В других воплощениях антиген ВИЧ может представлять собой слитый полипептид, который содержит №Г или его иммуногенное производное, или его иммуногенный фрагмент и р17 Сад и/или р24 Сад или их иммуногенные производные, или их иммуногенные фрагменты, где при присутствии обоих р17 и р24 Сад, между ними присутствует по меньшей мере один антиген ВИЧ или иммуногенный фрагмент.
Например, №Г соответственно представляет собой полноразмерный №Г.
Например, р17 Сад и р24 Сад соответственно представляют собой полноразмерные р17 и р24 соответственно.
В одном воплощении иммуногенный полипептид содержит и р17, и р24 Сад, или их иммуногенные фрагменты. В таких конструкциях компонент р24 Сад и компонент р17 Сад разделены по меньшей мере одним другим антигеном ВИЧ или иммуногенным фрагментом, таким как №Г и/или КТ или их иммуногенные производные, или их иммуногенные фрагменты. См. Х0 2006/013106 для дополнительных подробностей.
В слитых белках, которые содержат р24 и КТ, может быть предпочтительным, чтобы р24 предшествовал КТ в конструкции, так как, при экспрессии данных антигенов в Е.сой по одному, наблюдается лучшая экспрессия р24, чем КТ.
Некоторые конструкции согласно данному изобретению включают следующие:
1. р24-КТ-Νβί-р17
2. р24- ВТ*- Νβί-р17
3. р24 - р51КТ- Νβί-р17
4. р24 - р51КТ* - Νβί-р17
5. р17 - р51ВТ-Νβί
6. р17-р51ВТ* - Νβί
7. Νβί- р17
8. Νβί-ρ17 с линкером
9. ρ17-Νβί
10. р17 - Νβί с линкером * представляет собой мутацию метионина592 КТ на лизин.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен слитый белок из антигенов ВИЧ, содержащий по меньшей мере четыре антигена ВИЧ или их иммуногенных фрагмента, где четыре антигена или фрагмента представляют собой или происходят из №Г, Ро1 и Сад. Предпочтительно Сад присутствует в виде двух отдельных компонентов, которые разделены в слиянии по меньшей мере одним другим антигеном. Предпочтительно №Г представляет собой полноразмерный №Г. Предпочтительно Ро1 представляет собой р66 или р51КТ. Предпочтительно Сад представляет собой р17 и р24 Сад. Другие предпочтительные характеристики и свойства антигенных компонентов слияния в этом аспекте изобретения являются та- 12 021391 кими, как здесь описано.
Предпочтительными воплощениями этого аспекта данного изобретения являются четырехкомпонентные слияния, уже перечисленные выше:
1. р24 - КТ-Νβί-р17
2. р24- ВТ’- Νβί-р17
3. ρ24-ρ51ΚΤ-Νβί-ρ17
4. ρ24-ρ51ΚΤ*-Νβί-ρ17
Иммуногенные полипептиды по настоящему изобретению могут иметь линкерные последовательности, присутствующие между последовательностями, соответствующими конкретным антигенам, таким как Сад, КТ и Νβί. Такие линкерные последовательности могут иметь длину, например, вплоть до 20 аминокислот. В конкретном примере они могут быть из 1-10 аминокислот или из 1-6 аминокислот, например из 4-6 аминокислот.
Дополнительное описание таких подходящих антигенов ВИЧ можно найти в νθ 03/025003.
Антигены ВИЧ по настоящему изобретению могут происходить из любого клада ВИЧ, например, клада А, клада В или клада С. Например, антигены ВИЧ могут происходить из клада А или В, особенно из В.
В одном конкретном воплощении данного изобретения первый иммуногенный полипептид представляет собой полипептид, содержащий Сад, и/или Ро1, и/или Νβί, или фрагмент, или производное любого из них (например, ρ24-ΚΤ-№ί-ρ17). В одном конкретном воплощении данного изобретения второй иммуногенный полипептид представляет собой полипептид, содержащий Сад, и/или Ро1, и/или Νβί, или фрагмент, или производное любого из них (например, Сад-ΚΤ-Nеί или Сад-КТ-интеграза-№1).
Таким образом, в одном конкретном воплощении полипептид, содержащий Сад, и/или Ро1, и/или Νβί, или фрагмент, или производное любого из них (например, ρ24-ΚΤ-Νβί-ρ17), представляет собой первый иммуногенный полипептид, и полипептид, содержащий Сад, и/или Ро1, и/или Νβί, или фрагмент, или производное любого из них (например, Сад-ΚΤ-Νβί или Сад-КТ-интеграза-ЛеГ), представляет собой второй иммуногенный полипептид.
В другом конкретном воплощении данного изобретения первый иммуногенный полипептид представляет собой Εην или его фрагмент, или производное, например, дρ120, дρ140 или дρ160 (особенно §ρ120). В одном конкретном воплощении данного изобретения второй иммуногенный полипептид представляет собой полипептид, содержащий Сад, и/или Ро1, и/или №ί, или фрагмент, или производное любого из них (например, ρ24-ΚΤ-№ί-ρ17).
Таким образом, в одном конкретном воплощении Εην или его фрагмент, или производное, например, дρ120, дρ140 или дρ160 (особенно §ρ120) представляет собой первый иммуногенный полипептид, и полипептид, содержащий Сад, и/или Ро1, и/или №£, или фрагмент, или производное любого из них (например, ρ24-ΚΤ-№ί-ρ17), представляет собой второй иммуногенный полипептид.
В другом конкретном воплощении данного изобретения первый иммуногенный полипептид представляет собой полипептид, содержащий Сад, и/или Ро1, и/или №ί, или фрагмент, или производное любого из них (например, ρ24-ΚΤ-№ί-ρ17). В одном конкретном воплощении данного изобретения второй иммуногенный полипептид представляет собой Εην или его фрагмент, или производное, например, дρ120, дρ140 или дρ160 (особенно §ρ120).
Таким образом, в одном конкретном воплощении полипептид, содержащий Сад, и/или Ро1, и/или №ί, или фрагмент, или производное любого из них (например, ρ24-ΚΤ-№ί-ρ17), представляет собой первый иммуногенный полипептид, и Εην или его фрагмент, или производное, например дρ120, дρ140 или дρ160 (особенно дρ120), представляет собой второй иммуногенный полипептид.
Иммуногенные производные и иммуногенные фрагменты антигенов.
Вышеупомянутые антигены можно применять в виде их иммуногенных производных или иммуногенных фрагментов, а не в виде целого антигена.
При использовании здесь, термин иммуногенное производное по отношению к антигену нативного происхождения относится к антигену, который был модифицирован ограниченным способом по отношению к его природным эквивалентам. Например, он может включать точечную мутацию, которая может изменять свойства белка, например, путем улучшения экспрессии в прокариотических системах или путем устранения нежелательной активности, например, ферментативной активности. Иммуногенные производные, однако, будут достаточно сходными с нативными антигенами так, что они сохраняют их антигенные свойства и остаются способными к индукции иммунного ответа против нативного антигена. Индуцирует или нет данное производное, такой иммунный ответ можно измерить подходящим иммунологическим анализом, таким как ЕЬ18А (для гуморальных ответов) или проточная цитометрия с использованием подходящего окрашивания для клеточных маркеров (для клеточных ответов).
Иммуногенные фрагменты представляют собой фрагменты, которые кодируют по меньшей мере один эпитоп, например эпитоп СТЬ, типично пептид из по меньшей мере 8 аминокислот. Фрагменты из по меньшей мере 8, например из 8-10 аминокислот или из вплоть до 20, 50, 60, 70, 100, 150 или 200 аминокислот в длину рассматриваются как попадающие в объем данного изобретения, при условии, что дан- 13 021391 ный полипептид демонстрирует антигенность, т.е. главные эпитопы (например, эпитопы СТЬ) сохраняются в полипептиде.
Аденовирус.
Аденовирусные векторы по настоящему изобретению содержат один или более чем один гетерологичный полинуклеотид (ДНК), который кодирует один или более чем один иммуногенный полипептид.
Аденовирусные векторы, полезные в настоящем изобретении, могут происходить из целого ряда хозяев-млекопитающих.
Аденовирусы (здесь именуемые Аб или Α6ν) имеют характерную морфологию с икосаэдрическим капсидом, состоящим из трех главных белков, гексона (II), пентонового основания (III) и шишковатой нити (IV), наряду с целым рядом других минорных белков VI, VIII, IX, Ша и Ша2 (Ки88е1 \У.С. 2000, Сей νίτοί, 81:2573-2604). Вирусный геном представляет собой линейную двухцепочечную ДНК с терминальным белком, ковалентно присоединенным к 5'-концам, которые имеют инвертированные концевые повторы (ГТК). Вирусная ДНК тесно ассоциирована с сильно основным белком VII и с маленьким пептидом, именуемым ти. Другой белок, V, упакован с комплексом ДНК-белок и обеспечивает структурную связь с капсидом через белок VI. Данный вирус также содержит протеиназу, кодируемую вирусом, которая необходима для процессинга некоторых структурных белков для продукции зрелого инфекционного вируса.
Было выделено свыше 100 отличных серотипов аденовируса, которые инфицируют разные виды млекопитающих, 51 из которых имеют человеческое происхождение. Таким образом, один или более чем один из аденовирусных векторов может происходить из человеческого аденовируса. Примерами таких происходящих от человека аденовирусов являются Аб1, Аб2, Аб4, Аб5, Аб6, Аб11, Аб24, Аб34, Аб35, конкретно Аб5, Аб11 и Аб35. Человеческие серотипы были классифицированы на шесть подродов (А-Р), на основе целого ряда биологических, химических, иммунологических и структурных критериев.
Несмотря на то что векторы на основе Аб5 широко используются в целом ряде генотерапевтических испытаний, могут существовать ограничения по использованию Аб5 и других аденовирусных векторов группы С из-за уже существующего иммунитета у всех слоев населения благодаря природной инфекции. Аб5 и другие члены группы С имеют тенденцию находиться среди наиболее серопревалирующих серотипов. Иммунитет на существующие векторы может развиваться в результате воздействия вектора во время лечения. Эти типы уже существующего или развившегося иммунитета на серопревалирующие векторы могут ограничивать эффективность генотерапии или усилий по вакцинации. Альтернативные аденовирусные серотипы, таким образом, представляют собой очень важные мишени в поисках систем доставки генов, способных ускользать от иммунного ответа хозяина.
Одной такой областью альтернативных серотипов являются серотипы, происходящие от приматов, не являющихся человеком, особенно от аденовирусов шимпанзе. См. патент США 6083716, который описывает геном двух аденовирусов шимпанзе.
Было показано, что аденовирусные векторы шимпанзе (Рап или С) индуцируют сильный иммунный ответ на трансгенные продукты также эффективно, как человеческие аденовирусные векторы (РП/дега1б е! а1. I. Iттиηο1. 170:1416).
Аденовирусы приматов, не являющихся человеком, можно выделить из брыжеечных лимфатических узлов шимпанзе. Аденовирусы шимпанзе являются достаточно сходными с подтипом С человеческого аденовируса для обеспечения репликации делетированного вируса Е1 в клетках НЕК 293 (клетки почки эмбриона человека). Тем не менее, аденовирусы шимпанзе филогенетически отличаются от более обычных человеческих серотипов (Аб2 и Аб5). Рап6 является менее близкородственным и серологически отличным от Рап5, 7 и 9.
Таким образом, один или более чем один аденовирусный вектор может происходить из аденовируса приматов, не являющихся человеком, например из аденовируса шимпанзе, такого как вирус, выбранный из серотипов Рап5, Рап6, Рап7 и Рап9.
Аденовирусные векторы также могут происходить из более чем одного аденовирусного серотипа, и каждый серотип может быть из того же самого или из другого источника. Например, они могут происходить из более чем одного человеческого серотипа и/или из более чем одного серотипа приматов, не являющихся человеком. Способы для конструирования химерных аденовирусных векторов раскрыты в νΟ 2005/001103.
Существуют определенные ограничения по размеру, связанные с вставкой гетерологичной ДНК в аденовирусы. Человеческие аденовирусы имеют способность к упаковке вплоть до 105% длины генома дикого типа (Ве!! е! а1. 1993, I. ^го1 67 (10), 5911-21). Для человеческих аденовирусов был показан меньший упаковочный предел, составляющий 75% длины генома дикого типа (Рагкз е! а1. 1995, I. ^го1 71(4), 3293-8).
Одним примером аденовирусов, полезных в настоящем изобретении, являются аденовирусы, которые отличаются от превалирующих встречающихся в природе серотипов в человеческой популяции, таких как Аб2 и Аб5. Это предупреждает индукцию мощного иммунного ответа против вектора, который ограничивает эффективность последующих введений того же самого серотипа блокировкой поглощения вектора посредством нейтрализующего антитела и влияния на токсичность.
- 14 021391
Таким образом, аденовирусом может быть аденовирус, который не является превалирующим встречающимся в природе серотипом человеческого вируса. Аденовирусы, выделенные из животных, имеют иммунологически отличные капсидный, гексоновый, пентоновый и нитчатый компоненты, но филогенетически являются близкородственными. Конкретно, данный вирус может представлять собой аденовирус, отличный от человеческого, например аденовирус обезьяны и, конкретно, аденовирус шимпанзе, такой как Рап5, 6, 7 или 9. Примеры таких штаммов описаны в νθ 03/000283 и доступны из Американской коллекции типовых культур, 10801 ИтуегзЬу Вои1еуагй, Мапаззаз, Упднпа 20110-2209, и из других источников. Желательными штаммами аденовирусов шимпанзе являются Рап5 [АТСС УК-591], Рап6 [АТСС УК-592] и Рап7 [АТСС УК-593].
Считается, что применение аденовирусов шимпанзе является преимущественным по сравнению с применением человеческих серотипов аденовирусов из-за отсутствия уже существующего иммунитета, конкретно из-за отсутствия перекрестно нейтрализующих антител на аденовирусы у целевого населения. Перекрестная реактивность аденовирусов шимпанзе с ответами уже существующих нейтрализующих антител присутствует только у 2% целевого населения по сравнению с 35% в случае определенных человеческих аденовирусных векторов-кандидатов. Аденовирусы шимпанзе отличаются от более обычных человеческих подтипов Αά2 и Αά5, но являются более близкородственными человеческому Αά4 из подгруппы Е, который не является превалирующим подтипом. Рап6 является менее близкородственным Рап5, 7 и 9.
Аденовирус по изобретению может быть дефектным по репликации. Это означает, что он имеет пониженную способность реплицироваться в некомплементирующих клетках по сравнению с вирусом дикого типа. Это можно осуществлять путем мутирования вируса, например, путем удаления гена, участвующего в репликации, например, удаления гена Е1а, Е1Ь, Е3 или Е4.
Аденовирусные векторы согласно настоящему изобретению могут происходить из аденовируса, дефектного по репликации, содержащего функциональную делецию Е1. Таким образом, аденовирусные векторы согласно данному изобретению могут быть дефектными по репликации из-за отсутствия способности экспрессировать аденовирусные Е1а и Е1Ь, т.е. являются функционально делегированными по Е1а и Е1Ь. Рекомбинантные аденовирусы также могут нести функциональные делеции в других генах [см. νθ 03/000283], например, делеции в генах Е3 или Е4. Задержанный ранний ген аденовируса Е3 может быть устранен из последовательности аденовируса, что образует часть рекомбинантного вируса. Функция Е3 не является необходимой для продукции рекомбинантной аденовирусной частицы. Таким образом, нет необходимости замещать функцию этого генного продукта для того, чтобы упаковать рекомбинантный аденовирус, полезный в данном изобретении. В одном конкретном воплощении рекомбинантные аденовирусы имеют функционально делетированные гены Е1 и Е3. Конструкция таких векторов описана в Коу е! а1., Нитап Оепе ТЬегару 15:519-530, 2004.
Также могут быть сконструированы рекомбинантные аденовирусы, имеющие функциональную делецию гена Е4, хотя может быть желательным сохранение функции ОКР6 Е4. Аденовирусные векторы согласно данному изобретению также могут содержать делецию в задержанном раннем гене Е2а. Также можно сделать делеции в любом из поздних генов Ь1-Ь5 аденовирусного генома. Аналогично могут быть полезными делеции в промежуточных генах IX и 1Уа.
Другие делеции могут быть сделаны в других структурных или в неструктурных аденовирусных генах. Приведенные выше делеции можно использовать индивидуально, т.е. последовательность аденовируса для применения в настоящем изобретении может содержать делеции только Е1. В качестве альтернативы, можно использовать делеции целых генов или их частей в любой комбинации для эффективного нарушения их биологической активности. Например, в одном типичном векторе последовательности аденовируса могут иметь делеции генов Е1 и гена Е4, или генов Е1, Е2а и Е3, или генов Е1 и Е3 (такие как функциональные делеции в Е1а и Е1Ь и делеция по меньшей мере части Е3), или генов Е1, Е2а и Е4 с или без делеции Е3 и т.д. Такие делеции могут быть частичными или полными делециями этих генов и могут использоваться в комбинации с другими мутациями, такими как температурочувствительные мутации, для достижениия желательного результата.
Аденовирусные векторы можно продуцировать на любой подходящей клеточной линии, в которой вирус способен к репликации. Конкретно, можно использовать комплементирующие клеточные линии, которые дают факторы, отсутствующие в вирусном векторе, что приводит к ухудшенным характеристикам его репликации (такие как Е1 и/или Е4). Без ограничений такая клеточная линия может представлять собой клетки НеЬа [№ доступа АТСС (Американская коллекция типовых культур) ССЬ 2], А549 [№ доступа АТСС ССЬ 185], НЕК 293, КВ [ССЬ 17], Пе!гоЬ [например Пе!гоЬ 510, ССЬ 72] и νΐ-38 [ССЬ 75], среди прочих. Все эти линии клеток доступны в Американской коллекции типовых культур, 10801 ИтуегзЬу Вои1еуагй, Мапаззаз, Уиднпа 20110-2209. Из других источников можно получить другие подходящие родительские линии клеток, такие как клетки РЕК.С6©, представленные клетками, заложенными под ЕСАСС № 96022940 в Европейскую коллекцию культур животных клеток (ЕСАСС) в Центре прикладной микробиологии и исследований (САМК, ИК), или клетки Нег 96 (Сгисе11).
Полинуклеотидные последовательности, которые кодируют иммуногенные полипептиды, могут быть оптимизированными по кодонам для клеток млекопитающих. Такая оптимизация по кодонам под- 15 021391 робно описана в \УО 05/025614. Оптимизация по кодонам для определенных последовательностей ВИЧ дополнительно описана в \УО 03/025003.
В одном воплощении настоящего изобретения полинуклеотидные конструкции содержат Νконцевую лидерную последовательность. Сигнальная последовательность, трансмембранный домен и цитоплазматический домен каждый индивидуально возможно присутствуют или удалены. В одном воплощении настоящего изобретения все эти области присутствуют, но модифицированы.
Промотором для применения в аденовирусном векторе согласно данному изобретению может быть промотор из гена ΙΕ НСМУ, например, где 5'-нетранслируемая область гена ΙΕ НСМУ, содержащая экзон 1, включена, и интрон А полностью или частично исключен, как описано в \УО 02/36792.
Когда несколько антигенов подвергнуты слиянию в слитый белок, такой белок будет кодироваться полинуклеотидом под контролем одного промотора.
В альтернативном воплощении данного изобретения несколько антигенов могут экспрессироваться раздельно посредством индивидуальных промоторов, причем каждый их указанных промоторов может быть одинаковым или разным. В еще одном другом воплощении данного изобретения некоторые антигены могут образовать слияние, связанное с первым промотором, и другой антиген(ы) может быть связан со вторым промотором, который может быть таким же или другим, чем первый промотор.
Таким образом, аденовирусный вектор может содержать одну или более чем одну кассету экспрессии, каждая из которых кодирует один антиген под контролем одного промотора. Альтернативно или дополнительно он может содержать одну или более чем одну кассету экспрессии, каждая из которых кодирует более чем один антиген под контролем одного промотора, причем данные антигены, посредством этого, экспрессируются в виде слияния. Каждая кассета экспрессии может присутствовать в аденовирусном векторе в более чем одном локусе.
Полинуклеотид или полинуклеотиды, кодирующие иммуногенные полипептиды, подлежащие экспрессии, могут быть вставлены в любую из делегированных областей аденовируса, например в делегированную область Е1.
Несмотря на то что два или более полинуклеотида, кодирующих иммуногенные полипептиды, могут быть связаны в виде слияния, образующийся белок может экспрессироваться в виде слитого белка, или он может экспрессироваться в виде отдельных белковых продуктов, или он может экспрессироваться в виде слитого белка и затем позднее распадаться на меньшие субъединицы.
Адъювант.
Адъюванты в общем описаны в Уассше Όβδί^η - 1Нс §иЪииЛ аиб Л<фиуап1 ЛрргоасЬ, например Ро\\е11 аиб №\утап. Р1епит Рге88, №ν Уогк, 1995.
Подходящие адъюванты включают соль алюминия, такую как гидроксид алюминия или фосфат алюминия, но также могут представлять собой соль кальция, железа или цинка, или могут представлять собой нерастворимую суспензию ацилированного тирозина или ацилированных сахаров, катионные или анионные производные сахаров, или полифосфазены.
В препарате по данному изобретению предпочтительно, что адъювантная композиция предпочтительно индуцирует ТЫ-ответ. Однако будет понятно, что не исключаются другие ответы, включая другие гуморальные ответы.
Хорошо известно, что определенные адъюванты вакцин особенно подходят для стимуляции цитокиновых ответов либо ТЫ-, либо ТЬ2-типа. Традиционно лучшие индикаторы баланса ТЬ1:ТЬ2 иммунного ответа после вакцинации или инфекции включают прямое измерение продукции ТЫ- или ТЬ2цитокинов Т-лимфоцитами ίη νίίΓΟ после повторной стимуляции антигеном и/или измерение отношения 1дО1:1дО2а антигенспецифичных антительных ответов.
Таким образом, адъювантом ТЫ-типа является адъювант, который стимулирует продукцию выделенными популяциями Т-клеток высоких уровней цитокинов ТЫ-типа ίη νίνο (при измерении в сыворотке) или ех νίνο (цитокины, которые измеряют, когда клетки повторно стимулируют антигеном ίη νίίτο), и индуцирует антигенспецифичные ответы иммуноглобулинов, связанные с изотипом ТЫ-типа.
Предпочтительные иммуностимуляторы ТЫ-типа, которые можно готовить в виде препаратов для продукции адъювантов, подходящих для применения в настоящем изобретении, включают и не ограничиваются следующими.
Лиганды То11-подобного рецептора (ТЬК) 4, особенно агонист, такой как производное липида А, конкретно монофосфориллипид А и более конкретно 3-деацилированный монофосфориллипид А (3 ΌМРЬ).
Ό-МРЬ продается О1ахо8тЪЬК1ше под торговой маркой МРЬ® и главным образом стимулирует ответы Т-клеток СИ4+, характеризуемые продукцией ΙΡΝ-д (ТЫ-клетками, т.е. клетками Т-хелперами СИ4 с фенотипом типа-1). Его можно получить согласно способам, раскрытым в ОБ 2220211 А. Химически он представляет собой смесь 3-деацилированного монофосфориллипида А с 3, 4, 5 или 6 ацилированными цепями. Предпочтительно в композициях по настоящему изобретению используется 3 Ό-МРЬ в виде маленьких частиц. 3 Ό-МРЬ в виде маленьких частиц имеет такой размер частиц, что его можно подвергнуть стерилизующей фильтрации через 0,22-мкм фильтр. Такие препараты описаны в международной патентной заявке № \УО 94/21292. Известны синтетические производные липида А, считающиеся
- 16 021391 агонистами ТЬК4, включающие, но не ограничивающиеся:
ОМ 174 (2-дезокси-6-о-[2-дезокси-2-[(К)-3-додеканоилокситетрадеканоиламино]-4-о-фосфоно-в-Иглюкопиранозил]-2-[(К)-3-гидрокситетрадеканоиламино]-а-Э-глюкопиранозилдигидрофосфат) (АО 95/14026);
ОМ 294 ΌΡ (38,9К)-3-[(К)-додеканоилокситетрадеканоиламино]-4-оксо-5-аза-9(К)-[(К)-3гидрокситетрадеканоиламино]декан-1,10-диол,1,10-бис(дигидрофосфат) (АО 99/64301 и АО 00/0462);
ОМ 197 МР-Ас ΌΡ (38-, 9К)-3-[(К)-додеканоилокситетрадеканоиламино]-4-оксо-5-аза-9-[(К)-3гидрокситетрадеканоиламино]декан-1,10-диол,1-дигидрофосфат-10-(6-аминогексаноат) (АО 01/46127).
Другими лигандами ТЬК4, которые можно использовать, являются алкилглюкозаминид фосфаты (ΆΟΡ), такие как ЛОР, раскрытые в АО 9850399 или И8 6303347 (способы получения ЛОР также раскрыты), или фармацевтически приемлемые соли АОР, как раскрыто в И8 6764840. Некоторые АОР являются агонистами ТЬК4, и некоторые являются антагонистами ТЬК4. Считается, что и те, и другие являются полезными в качестве адъювантов.
Согласно данному изобретению сапонины также являются предпочтительными ТЬ1иммуностимуляторами. Сапонины являются хорошо известными адъювантами, и о них сообщается в: ГасаШе-ИиЪоЦ, М. апй Аадисг Н. (1996. А ге\ае\у о£ Ъю1одюа1 аий рЬагтасо1одюа1 αοίίνίΐίοδ о£ карошик. РНуЮтсДстс, νо1. 2, р. 363-386). Например, Ош1 А (происходящий из коры южноамериканского дерева Ош11а]а 8ароиапа МоНиа) и его фракции описаны в И85057540 и в 8арошик ак \'ассте апцп'атк, КеикД С.К., СгП Ре\' ТЬег Игид Сатег 8укр 1996, 12 (1-2):1-55; и в ЕР 0362279 В1. Гемолитические сапонины 0821 и 0817 (очищенные ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография) фракции Цш1 А) были описаны как мощные системные адъюванты, и способ их получения раскрыт в патентах США № 5057540 и в ЕР 0362279 В1. В этих ссылках также раскрыто применение 087 (негемолитическая фракция ОпП-А), который действует как мощный адъювант для системных вакцин. Применение 0821 дополнительно раскрыто в КепкП е1 а1. (1991, ί. 1ттиио1оду, νо1. 146, 431-437). Также известны комбинации 0821 и полисорбата или циклодекстрина (АО 99/10008). Адъювантные системы в виде частиц, содержащие фракции ОпПА, такие как 0821 и 087, описаны в АО 96/33739 и АО 96/11711. Одна такая система известна как 1ксот и может содержать один или более чем один сапонин.
Адъювант по настоящему изобретению конкретно может содержать лиганд То11-подобного рецептора (ТЬК) 4, особенно 3Ό-ΜΡΓ, в комбинации с сапонином.
Другие подходящие адъюванты включают лиганды ТЬК9 (агонисты). Таким образом, другим предпочтительным иммуностимулятором является иммуностимулирующий олигонуклеотид, содержащий неметилированные динуклеотиды СрО (СрО). СрО является сокращением цитозин-гуанозиновых динуклеотидных мотивов, присутствующих в ДНК. СрО известен в данной области как адъювант при введении как системным путем, так и через слизистую (АО 96/02555, ЕР 468520, Эа\ак е1 а1., ί. 1ттиио1, 1998, 160(2):870-876; МсС1иккю аий Оа'^лк, I. 1ттиио1., 1998, 161(9):4463-6). Исторически наблюдали, что фракция ДНК ВСО может оказывать противоопухолевый эффект. В других исследованиях было показано, что синтетические олигонуклеотиды, происходящие из генных последовательностей ВСО, способны индуцировать иммуностимулирующие эффекты (как ш ν^ι^о. так и ш νί\Ό). Авторы этих исследований заключили, что определенные палиндромные последовательности, включающие центральный мотив СО, несли эту активность. Центральная роль мотива СО при иммуностимуляции была позднее прояснена в публикации Кпед, №Циге 374, р546 1995. Подробный анализ показал, что мотив СО должен находиться в контексте определенной последовательности, и что такие последовательности являются обычными в бактериальной ДНК, но редкими в ДНК позвоночных. Иммуностимулирующая последовательность часто представляет собой: пурин, пурин, С, О, пиримидин, пиримидин; где мотив СО является неметилированным, но известно, что другие неметилированные последовательности СрО яляются иммуностимулирующими и могут быть использованы в настоящем изобретении.
В определенных комбинациях из шести нуклеотидов присутствует палиндромная последовательность. Несколько этих мотивов, либо в виде повторов одного мотива, либо комбинации разных мотивов, могут присутствовать в том же самом олигонуклеотиде. Присутствие одной или более чем одной из этих иммуностимулирующих последовательностей, содержащих олигонуклеотиды, может активировать разные иммунные субпопуляции, включая естественные клетки-киллеры (которые продуцируют интерферон γ и имеют цитолитическую активность) и макрофаги (АооИпде е1 а1. Уо1 89 (ио. 8), 1977). Теперь также было показано, что другие неметилированные последовательности, содержащие СрО, не имеющие этой консенсусной последовательности, являются иммуномодулирующими.
СрО, приготовленный в виде препаратов вакцин, обычно вводится в свободном растворе вместе со свободным антигеном (АО 96/02555; МсС1иккю аий Оа\ак, ранее) или ковалентно конъюгированным с антигеном (АО 98/16247), или приготовленным в виде препарата с носителем, таким как гидроксид алюминия (поверхностный антиген вируса гепатита) Эа\ак е1 а1., ранее; Вга/о1о1-МШан е1 а1., Ρ^ос.Nаί1.Асаά.8с^.υ8А, 1998, 95(26), 15553-8).
Другие агонисты ТЬК9, представляющие потенциальный интерес, включают олигонуклеотиды, содержащие иммуностимулирующий мотив СрК, и олигонуклеотиды, содержащие мотив УрО (Шега).
- 17 021391
Такие иммуностимуляторы, в том виде, как они описаны выше, можно приготовить в виде препарата совместно с носителями, такими как, например, липосомы, эмульсии типа масло-в-воде и/или соли металлов, включающие соли алюминия (такие как гидроксид алюминия). Например, 3Ό-ΜΡΕ можно приготовить в виде препарата с гидроксидом алюминия (ЕР 0689454) или с эмульсиями типа масло-вводе (\νϋ 95/17210); 0821 предпочтительно можно готовить в виде препаратов с липосомами, содержащими холестерин (νθ 96/33739), эмульсиями типа масло-в-воде (νθ 95/17210) или с алюминиевыми квасцами (νθ 98/15287); СдС можно приготовить в виде препарата с алюминиевыми квасцами (Эаνΐδ с! а1., ранее; Вга/о1о1-МШап ранее) или с другими катионными носителями.
Комбинации иммуностимуляторов также являются предпочтительными, конкретно комбинация монофосфориллипида А и производного сапонина (νθ 94/00153; νθ 95/17210; νθ 96/33739; νθ 98/56414; νθ 99/12565; νθ 99/11241), более конкретно, комбинация 0821 и 3Ό-ΜΡΕ, как раскрыто в νθ 94/00153. В качестве альтернативы, комбинация СрС плюс сапонин, такой как 0521. также образует мощный адъювант для применения в настоящем изобретении. В качестве альтернативы, сапонин может быть приготовлен в виде препарата в липосоме или в Неоги и объединен с иммуностимулирующим олигонуклеотидом.
Таким образом, подходящие адъювантные системы включают, например, комбинацию монофосфориллипида А, предпочтительно 3Ό-ΜΡΕ, вместе с солью алюминия (например, как описано в νθ 00/23105).
Улучшенная система включает комбинацию монофосфориллипида А и производного сапонина, конкретно комбинацию 0821 и 3Ό-ΜΡΕ, как раскрыто в νθ 94/00153, или менее реактогенную композицию, где 0821 погашен в липосомах, содержащих холестерин (Ό0), как раскрыто в νθ 96/33739. Эта комбинация может дополнительно содержать иммуностимулирующий олигонуклеотид.
Таким образом, пример адъюванта содержит 0821, и/или ΜΡΕ, и/или СрС.
Особенно мощный адъювантный препарат, включающий 0821, 3Ό-ΜΡΕ и токоферол в эмульсии типа масло-в-воде, описан в νθ 95/17210 и представляет собой другой предпочтительный препарат для применения в данном изобретении.
Другой предпочтительный препарат содержит олигонуклеотид СрС, один или вместе с солью алюминия.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ изготовления препарата вакцины, как здесь описано, где данный способ включает смешивание одного или более чем одного первого иммуногенного полипептида согласно изобретению с подходящим адъювантом.
Особенно предпочтительными адъювантами для применения в препаратах согласно данному изобретению являются следующие:
1) 3Ό-ΜΡΕ + 0821 в липосоме (см., например, адъювант Б, описанный ниже),
2) Квасцы + 3Ό-ΜΡΕ,
3) Квасцы + 0821 в липосоме + 3Ό-ΜΡΕ,
4) Квасцы + СрС,
5) 3Ό-ΜΡΕ + 0821 + эмульсия типа масло-в-воде,
6) СрС,
7) 3Ό-ΜΡΕ + 0821 (например, в липосоме) + СрС,
8) 0821 + СрС.
Предпочтительно адъювант представлен в форме липосомы, I8СΟΜ или эмульсии типа масло-вводе. В одном типичном воплощении данного изобретения адъювант включает эмульсию типа масло-вводе. В другом типичном воплощении данного изобретения адъювант содержит липосомы.
Соответственно, адъювантный компонент не собержит какого-либо вируса. Таким образом, соответственно, композиции для применения согласно данному изобретению не содержат какого-либо вируса, отличного от одного или более чем одного аденовирусного вектора, содержащего один или более чем один гетерологичный полинуклеотид, кодирующий один или более чем один второй иммуногенный полипептид, происходящий из патогена.
Композиции, дозировка и введение.
В способах по изобретению иммуногенный полипептид(ы), аденовирусный вектор(ы) и адъювант вводят совместно.
Типично адъювант будет приготовлен в виде комбинированного препарата с иммуногенным полипептидом. Соответственно, адъювант также будет приготовлен в виде комбинированного препарата с любым другим иммуногенным полипептидом, подлежащим введению.
Таким образом, в одном воплощении данного изобретения предложен способ индукции иммунного ответа, который включает введение: (1) одного или более чем одного первого иммуногенного полипептида, приготовленного в виде препарата вместе с адъювантом; и (2) одного или более чем одного аденовирусного вектора, содержащего один или более чем один гетерологичный полинуклеотид, кодирующий один или более чем один второй иммуногенный полипептид; где один или более чем один первый иммуногенный полипептид и адъювант и один или более чем один аденовирусный вектор вводят совместно.
Под фразой приготовленный в виде препарата вместе с подразумевается, что первый иммуноген- 18 021391 ный полипептид и адъювант содержатся в одной и той же композиции, например в фармацевтической композиции.
Типично в композиции, например в фармацевтической композиции, содержится аденовирусный вектор.
В качестве альтернативы, один или более чем один первый иммуногенный полипептид, один или более чем один аденовирусный вектор и адъювант готовят вместе в виде препарата.
Таким образом, предложены композиции согласно изобретению, которые содержат один или более чем один иммуногенный полипептид, один или более чем один аденовирусный вектор и адъювант.
Композиции и способы согласно данному изобретению могут включать применение более чем одного иммуногенного полипептида и/или более чем одного аденовирусного вектора. Применение множественых антигенов является особенно полезным при индукции защитных иммунных ответов на определенные патогены, такие как ВИЧ, М. 1иЬегси1о818 и Р1а§тойшт 8р. Композиции согласно данному изобретению могут содержать более чем один адъювант.
Композиции и способы, применяемые согласно данному изобретению, типично могут содержать носитель, например, в виде водного забуференного носителя. Могут быть включены защитные компоненты, такие как сахара.
Композиции должны вводиться в достаточных количествах для трансдукции клеток-мишеней, для обеспечения достаточных уровней переноса и экспрессии генов и для обеспечения развития патогенспецифичных иммунных ответов с тем, чтобы обеспечить профилактическую или терапевтическую пользу без нежелательных вредных физиологических эффектов или с физиологическими эффектами, приемлемыми с медицинской точки зрения, которые могут определить специалисты в области медицины. Традиционные и фармацевтически приемлемые пути введения включают, но не ограничиваются, прямую доставку в сетчатку и другие внутриглазные способы доставки, прямую доставку в печень, ингаляцию, интраназальный, внутривенный, внутримышечный внутритрахеальный, подкожный, внутрикожный, эпидермальный, ректальный, пероральный и другие парентеральные пути введения. Пути введения можно комбинировать, если это желательно, или адаптировать в зависимости от генного продукта или состояния. Путь введения прежде всего будет зависеть от природы состояния, которое лечат. Самым подходящим путем является внутримышечный, внутрикожный или эпидермальный.
Предпочтительными тканями, служащими мишенями, являются мышцы, кожа и слизистые оболочки. Кожа и слизистые оболочки являются физиологическими сайтами, где обычно встречается большинство инфекционных антигенов.
Когда первый иммуногенный полипептид, адъювант и аденовирусный вектор не приготовлены вместе в виде препарата, разные препараты (например, препараты полипептида/адъюванта и аденовирусного вектора) можно вводить тем же самым путем введения или разными путями введения.
Дозировки композиций в данных способах будут прежде всего зависеть от таких факторов, как состояние, которое лечат, возраст, масса и здоровье субъекта, и, таким образом, могут варьировать у субъектов. Например, терапевтически эффективная взрослая человеческая или ветеринарная дозировка обычно находится в интервале от примерно 100 мкл до примерно 100 мл носителя, содержащего концентрации от примерно 1х 106 до примерно 1х1015 частиц, примерно 1х10п-1х1013 частиц или примерно 1х 1091 χ 1012 частиц вируса вместе с приблизительно 1-1000 мкг, или примерно 2-100 мкг, например, приблизительно 4-40 мкг иммуногенного полипептида. Дозировки будут варьировать в зависимости от размера животного и от пути введения. Например, подходящая человеческая или ветеринарная дозировка (для животного массой приблизительно 80 кг) для внутримышечной инъекции находится в интервале от примерно 1 χ 109 до примерно 5х 1012 вирусных частиц и 4-40 мкг белка на 1 мл для одного сайта. Специалист в данной области может адаптировать эти дозы, в зависимости от пути введения и терапевтического или вакцинационного применения, для которого используется данная композиция.
Количество адъюванта будет зависеть от природы адъюванта и иммуногенного полипептида, состояния, которое лечат, возраста, массы и состояния здоровья субъекта. Типично для введения человеку может быть подходящим количество адъюванта 1-100 мкг, например 10-50 мкг, на дозу.
Соответственно, адекватного иммунного ответа добиваются одиночным совместным введением композиции или композиций по изобретению в способах по изобретению. Однако, если иммунный ответ дополнительно усиливается введением дополнительной дозы первого иммуногенного полипептида, адъюванта и аденовирусного вектора при втором или последующем случаях (например, через месяц или два месяца), тогда такой протокол охвачен данным изобретением.
Авторы данного изобретения обнаружили, что хорошие патогенспецифичные ответы Т-клеток ί'Ό4+ и/или СЭ8+ обычно могут быть индуцированы после одиночного совместного введения композиции или композиций по изобретению в способах по изобретению. Однако авторы данного изобретения обнаружили, что для хороших патогенспецифичных гуморальных ответов может потребоваться второе или дальнейшее совместное введение композиции или композиций по изобретению.
Компоненты данного изобретения можно комбинировать или готовить в виде препаратов с любым фармацевтически приемлемым эксципиентом, таким как вода, буферы и т.п.
- 19 021391
Примеры
Адъювантные препараты.
1) Получение эмульсии типа масло-в-воде, следуя протоколу, изложенному в ШО 95/17210.
Данная эмульсия содержит: 42,72 мг/мл сквалена, 47,44 мг/мл токоферола, 19,4 мг/мл Тетееп 80.
Образующиеся капельки масла имеют размер приблизительно 180 нм.
Т\уееп 80 растворяли в забуференном фосфатом физиологическом растворе (РВ8) с получением 2%ного раствора в РВ8. Для получения 100 мл двухкратного концентрата, эмульсию 5 г ОЬ-альфатокоферола и 5 мл сквалена встряхивали до тщательного перемешивания. Добавляли 90 мл раствора РВ8/Т\уееп и тщательно перемешивали. Образующуюся эмульсию затем пропускали через шприц и, наконец, подвергали псевдоожижению с использованием установки для микропсевдоожижения М1108. Образующиеся капельки масла имеют размер приблизительно 180 нм.
2) Получение эмульсии типа масло в воде с 0821 и МРЬ.
Стерильный основной объем эмульсии добавляли к РВ8 для достижения конечной концентрации 500 мкл эмульсии на 1 мл (об./об.). Затем добавляли 3О-МРЬ. Затем добавляли 0821. Между каждым добавлением компонента промежуточный продукт перемешивали в течение 5 мин. Через 15 мин рН проверяли и подводили, если это необходимо, до 6,8 +/- 0,1 ΝαΟΗ или НС! Конечная концентрация 3О-МРЬ и Ц821 составляла 100 мкг на 1 мл для каждого.
3) Получение липосомного МРЬ.
Смесь липида (такого как фосфатидилхолин, либо из яичного желтка, либо синтетического), холестерина и 3О-МРЬ в органическом растворителе сушили под вакуумом (или, в качестве альтернативы, под струей инертного газа). Затем добавляли водный раствор (такой как забуференный фосфатом физиологический раствор), и сосуд встряхивали, пока весь липид не оказывался в суспензии. Эту суспензию затем подвергали микропсевдоожижению, пока размер липосом не снижался до примерно 100 нм, и затем подвергали стерилизующей фильтрации через 0,2-мкм фильтр. Эту стадию могли заменить экструзия или обработка ультразвуком.
Типично соотношение холестерин:фосфатидилхолин составляло 1:4 (мас./мас.), и добавляли водный раствор с получением конечной концентрации холестерина 10 мг/мл.
Конечная концентрация МРЬ составляет 2 мг/мл.
Липосомы имеют размер приблизительно 100 нм и называются 8ИУ (маленькие однослойные везикулы). Данные липосомы сами по себе стабильны с течением времени и не имеют способности к слиянию.
4) Получение адъюванта В (аб| В).
Стерильный основной объем 8ИУ добавляли к РВ8. Состав РВ8 был следующим: №2НРО4: 9 мМ; КН2РО4: 48 мМ; №С1: 100 мМ, рН 6,1. 0821 в водном растворе добавляли к 8ИУ. Конечная концентрация 3О-МРЬ и 0821 составляла 100 мкг для каждого. Эта смесь называется Адъювант В. Между каждым добавлением компонента промежуточный продукт перемешивали в течение 5 мин. рН проверяли и подводили, если это необходимо, до 6,1 +/-0,ШаОН или НС1.
Получение белка р24-КТ-№Е-Р17 (Р4).
Р4 получали, как описано в ШО 2006/013106, пример 1, способ с оптимизированными кодонами.
Получение аденовируса шимпанзе Рап7, содержащего трансген Сад-КТ-№Е (Рап7СК№).
Конструкция плазмиды Сад, КТ, №ί.
Плазмида р731-Тдгп.
Полная последовательность вставки в плазмиду Тдгп приведена в 8ЕО ГО NΟ: 1, и конструкция данной плазмиды показана графически на фиг. 1. Она содержит р17 р24 (с оптимизированными кодонами) Сад, р66 КТ (с оптимизированными кодонами и инактивированный) и усеченный №ί.
Плазмиду Р731-Тдгп получали, как описано в ШО 03/025003, примеры 1-13.
Конструкция аденовируса Рап7 с делециями Е1/Е3.
Аденовирус Рап7 с делециями Е1/Е3 получали, как описано в ШО 2006/120034, пример 1.
Другие серотипы векторов можно сконструировать аналогичным способом. Полное описание конструкции делеций Е1, Е3 и Е4 в этом и в других серотипах аденовируса Рап приведено в ШО 03/0046124. Дополнительная информация также доступна в Нитап Сепе ТЬегару 15:519-530.
Вставка последовательности Сад, КТ, №ί в аденовирус.
С использованием плазмиды Р731-Тдгп в аденовирус Рап7 с делециями Е1/Е3 вставили кассету экспрессии СКN с получением С7-СКNС, как описано в ШО 2006/120034, пример 3. С7-СКNС представляет собой компонент аденовируса Рап7СКИ использованный в изложенных здесь примерах.
Пример 1.
Исследование иммуногенности у мышей, иммунизированных аденовирусным компонентом (Рап7СКЦ) и белковым компонентом (Р4/адъювант В) раздельно, или вместе как аденовирусным, так и белковым компонентом, приготовленными вместе в виде препарата.
Использовали штамм мышей СВ6Р1, и 3 мышей использовали в каждый момент времени. Для иммунизации Р4/адъювант В (Р) инъецировали 1/10 человеческой дозы, т.е. 9 мкг белка Р4 в 50 мкл адъюванта В. Для иммунизации Ρаη7СКN (А) использовали 10х108 вирусных частиц в 50 мкл физиологиче- 20 021391 ского раствора (0,9%-ный раствор ΝαΟ в воде для инъекции). Аденовирус шимпанзе Ραη7ΟΚΝ несет гены, кодирующие Сад (С), КТ (К) и №£ (Ν).
Схема вакцинации была следующей.
Группа Сутки 0 Сутки 21 Сутки 42 Сутки 33
1 - - Р4Уас1| В Р4/аЗ| В
2 Рап7еКЫ Рап7еРМ
3 Р4/асЦ В Р4/асИ В Рап7СРМ Ρβη7ΘΡΝ
4 ΡθηΣΘΚΝ ΡβηϊΘΚΝ Р4/асЦ В Р4/а0) В
5 - - - Р4УаЗ| В/ Ρ3Π7ΘΡΝ
6 - Р4/асЦ В/ Ρ3π7ΟΚΝ Р4/аф В/ Рап7ОКИ
7 - - аб) В аб] В
3 - - - -
Таким образом, можно видеть, что в группах 1 и 2 мышей иммунизировали 2 инъекциями белка (РР) или аденовируса (АА) соответственно. Мыши из групп 3 и 4 получали традиционную схему с первичной-повторной иммунизацией: белок, затем аденовирус (РРАА), или наоборот (ААРР), тогда как в группах 5 и 6 мыши получали одну или две инъекции комбинации (сотЬо) белка и аденовируса совместно согласно изобретению. Мыши из группы 7 получали только адъювантный контроль, тогда как мыши из группы 6 были наивными.
Получали следующие показатели:
гуморальные ответы (ЕЫ§Л (твердофазный иммуноферментный анализ) проводили на сыворотке из каждого отдельного животного из каждой группы):
гуморальный ответ против Р4 (фиг. 4), гуморальный ответ против компонентов Р4: р24, КТ, №£ и р17 (фиг. 5-8).
Клеточные ответы (фиг. 2-3):
измеренные проточной цитометрией, отслеживающей поверхностное и внутриклеточное окрашивание на цитокины, после повторной стимуляции клеток селезенки пулами пептидов р24, КТ, №£ или р17 в течение ночи. Для анализа объединяли клетки селезенки из 3 мышей на момент времени и на группу.
Для групп 1 и 2 пробы отбирали для измерения через 21 сутки после соответствующей конечной иммунизации. Для остальных групп измерения проводили через 21 сутки, 56 суток и 112 суток после соответствующей конечной иммунизации.
Результаты.
Результаты показаны на фиг. 2-8.
Метки оси X соответствуют следующему:
РР - группа 1 животных после второй иммунизации,
АА - группа 2 животных после второй иммунизации,
РРАА - группа 3 животных после четвертой иммунизации,
ААРР - группа 4 животных после четвертой иммунизации,
СотЬо - группа 5 животных после иммунизации,
СотЬо х 2 - группа 6 животных после второй иммунизации.
Моменты времени измерения (21, 56 или 112 суток после последней иммунизации) показаны в скобках.
Клеточные ответы (фиг. 2, 3).
В проанализированные моменты времени данные показывают, что ответы Т-клеток СЭ4+ наблюдали главным образом против р24, КТ и №£.
Как показано на фиг. 2а и 2б (левые панели), через 21 сутки после последней иммунизации самые сильные ответы Т-клеток СЭ4+ наблюдали с двумя иммунизациями аденовирусом с последующими двумя иммунизациями белком/адъювантом (животные группы 4). Одна инъекция комбинации аденовирус/белок/адъювант индуцирует более высокие уровни Т-клеток СЭ4+. чем две инъекции белка/адъюванта после повторной стимуляции пептидами р24, КТ или №£. Что касается повторной стимуляции КТ и №£, две иммунизации комбинацией аденовирус/белок/адъювант индуцируют ответ Т-клеток СЭ4+, немного более сильный, чем одна иммунизация комбинацией, тогда как для р24 ответы с одной или с двумя иммунизациями были идентичными.
В проанализированные моменты времени ответы Т-клеток СЭ8+ главным образом наблюдали против пептидов р24 и КТ, и не определяли значительного числа Т-клеток СЭ8+, специфичных для №£ или р17. Как показано на фиг. 2а и 2б (правые панели), через 21 сутки после последней иммунизации ответы Т-клеток СЭ8+ были идентичными после одной или двух иммунизаций комбинацией аденовирус/белок/адъювант. Ответ СЭ8 против р24, наблюдавшийся в группах, иммунизированных либо (1) дважды аденовирусом, либо (2) дважды аденовирусом с последующими двумя иммунизациями белком, либо (3) один или два раза комбинацией аденовирус/белок/адъювант, были сравнимыми друг с другом и немного слабее, чем ответ в группе, дважды иммунизированной белком с последующими двумя иммунизациями аденовирусом. Ответ СЭ8 против КТ, наблюдавшийся в группах, иммунизированных один или
- 21 021391 два раза комбинацией аденовирус/белок/адъювант, был сравнимым и слегка слабее ответа в группах, иммунизированных либо (1) дважды аденовирусом, либо (2) дважды аденовирусом с последующими двумя иммунизациями белком, либо (3) дважды белком с последующими двумя иммунизациями аденовирусом.
Ответы Т-клеток СЭ4 и СЭ8 также анализировали в более поздние моменты времени (56 и 112 суток после последней иммунизации), когда можно определить стойкость ответов (фиг. 3а и 3б). Ответы СЭ4 (фиг. 3а и 3б, левые панели) главным образом наблюдаются против р24, КТ и №£. В эти моменты времени самые сильные ответы СЭ4 наблюдаются у животных, иммунизированных два раза аденовирусом с последующими двумя иммунизациями белком. Ответы СЭ4 у мышей, иммунизированных один или два раза комбинацией аденовирус/белок/адъювант, были сравнимыми друг с другом и обычно более сильными, чем ответ, наблюдавшийся в группах, дважды иммунизированных белком с последующими двумя иммунизациями аденовирусом.
В более поздние моменты времени ответ СЭ8 против р24 является самым сильным в группе, иммунизированной один раз комбинацией аденовирус/белок/адъювант (фиг. 3б, правая панель). Он является сравнимым с ответом у животных, дважды иммунизированных белком с последующими двумя иммунизациями аденовирусом, и немного более сильным, чем ответ у животных, иммунизированных либо (1) дважды комбинацией аденовирус/белок/адъювант, либо (2) дважды аденовирусом с последующими двумя иммунизациями белком. Последние два являются сравнимыми друг с другом. Ответ СЭ8 против КТ является самым сильным и аналогичным в группах, иммунизированных (1) дважды комбинацией аденовирус/белок/адъювант или (2) дважды аденовирусом с последующими двумя иммунизациями белком. Ответы СЭ8 против КТ в группах, иммунизированных (1) дважды комбинацией аденовирус/белок/адъювант или (2) дважды белком с последующими двумя иммунизациями аденовирусом были немного слабее, но сравнимыми друг с другом (фиг. 3). Как показано на фиг. 3а (правая панель), не было обнаружено значимого числа Т-клеток СЭ8+, специфичных к №Г или р17.
Гуморальные ответы.
Как показано на фиг. 4-8, обнаруженные гуморальные ответы направлены главным образом против р24 (фиг. 5), КТ (фиг. 6) и №Г (фиг. 8). Ответ против Р4 (фиг. 4) обычно имитирует ответ, наблюдавшийся против каждого из компонентов - р24, КТ или №Г, и может быть охарактеризован следующим образом:
гуморальный ответ от слабого до отсутствующего определен в группах, иммунизированных (1) дважды аденовирусом или (2) один раз комбинацией аденовирус/белок/адъювант;
самые сильные гуморальные ответы обычно определяются в группе, дважды иммунизированной белком, в сутки 21 после иммунизации. Однако именно в этой группе также наблюдается наивысшая вариабельность между индивидуумами. Кроме того, что касается анти-ЫеГ серологии, группа, дважды иммунизированная аденовирусом с последующими двумя иммунизациями белком, по-видимому, демонстрирует самый сильный ответ при сравнении с другими группами;
ответы, наблюдавшиеся в группах, иммунизированных (1) дважды комбинацией аденовирус/белок/адъювант или (2) дважды белком с последующими двумя иммунизациями аденовирусом, или (3) дважды аденовирусом с последующими двумя иммунизациями белком, являются сравнимыми, достигают пика в сутки 21 после последней иммунизации и затем слегка ослабевают со временем.
Гуморальные ответы против р17 (фиг. 7) были во всех группах от очень слабых до неопределимых.
Заключение.
В целом, самый сильный антигенспецифичный клеточно-опосредованный иммунный ответ наблюдается в группе обработки ААРР после 4 иммунизаций. Однако, при сравнении групп после 2 иммунизаций (т.е. группы АА, РР и 2хсотЬо), индукция антигенспецифичных ответов и Т-клеток СЭ4, и СИ8 наблюдается только в группе, дважды иммунизированной комбинацией белок/аденовирус/адъювант. Кроме того, аналогичные уровни ответов Т-клеток СЭ4 и СИ8 могут достигаться после одной инъекции комбинации белок/аденовирус/адъювант. Кроме того, в показателях стойкости, антигенспецифичные ответы Тклеток, наблюдавшиеся через 112 суток после 2-й иммунизации комбинацией белок/аденовирус/адъювант, являются сравнимыми с ответами, наблюдавшимися через 112 суток после 4-й иммунизации в группе обработки ААРР. Наконец, по-видимому, требуются 2 иммунизации комбинацией белок/аденовирус/адъювант для получения гуморального ответа, сравнимого с ответом, полученным в группе, дважды иммунизированной адъювантным белком, в группе, которая в общем давала самые сильные гуморальные ответы.
Пример 2.
Исследование иммуногенности у мышей, иммунизированных аденовирусом Рап7СКЫ и белком Р4/адъювантом В, приготовленных в виде комбинированного препарата.
Использовали штамм мышей СВ6Р1, с 9 мышами на группу. Мышей иммунизировали один раз комбинированным препаратом белка Р4 (инъецировали 1/10 человеческой дозы, т.е. 9 мкг) вместе с 10х106 вирусных частиц Рап7СКЫ в 50 мкл адъюванта В или с разведениями последнего (1/2, 1/4 или 1/10). Клеточные ответы СЭ4 и СЭ8 против пула каждого из пептидов №Г, р17, р24 или КТ определяли через 21 сутки после иммунизации (3 пула из 3 селезенок для каждой группы).
- 22 021391
Получили следующие показатели.
Клеточные ответы (фиг. 9):
измеренные проточной цитометрией после окрашивания на поверхностные и внутриклеточные цитокины после повторной стимуляции клеток селезенки пулами пептидов р24, КТ, №£ или р17 в течение ночи. Клетки селезенки объединяли (3 пула из 3 селезенок на группу) для анализа.
Результаты.
Результаты, показанные на фиг. 9, представляют собой клеточные ответы, наблюдавшиеся после повторной стимуляции пулом пептидов р24 или КТ.
Метки оси X соответствуют следующему:
Аб) В - Мыши, иммунизированные 9 мкг Р4/108 вирусных частиц Рап7СК^неразведенным адъювантом В
1/2 Аб.) В - Мыши, иммунизированные 9 мкг Р4/108 вирусных частиц Рап7СКМадъювантом В, разведенным 1/2
1/4 Аб.) В - Мыши, иммунизированные 9 мкг Р4/108 вирусных частиц Рап7СКМадъювантом В, разведенным 1/4
1/10 Аб.) В - Мыши, иммунизированные 9 мкг Р4/108 вирусных частиц Рап7СК^адъювантом В, разведенным 1/10
Наивные - Наивные мыши (нет иммунизации).
Результаты показывают, что ответы СЭ4 (фиг. 9, левая панель) и СЭ8 (фиг. 9, правая панель) главным образом наблюдаются против р24 и КТ, причем ответ Т-клеток СЭ8. специфичный к КТ, слабее, чем ответ, специфичный к р24. Кроме того, данные результаты показывают, что ответы СЭ4 против р24 и КТ в сутки 21 после иммунизации в группах, иммунизированных неразведенным адъювантом В или его разведением 1/2, являются аналогичными. Эти ответы СЭ4 имеют тенденцию к снижению, когда адъювант разведен 1/4. Когда адъювант В разведен 1/10, наблюдавшиеся ответы СЭ4 являются аналогичными ответам в группах, иммунизированных разведением 1/4 адъюванта В. Анти-СО8 ответы против р24 являются сравнимыми независимо от того, разведен ли адъювант 1/2 или нет. Однако ответ снижается, когда адъювант В разведен 1/4, и даже более, если он разведен 1/10. Напротив, такие тенденции не наблюдаются для анти-КТ ответов ί'.Ό8, где отсутствует реальный эффект интервала дозы использованного адъюванта.
Заключение.
Клетки СЭ4+ и клетки СЭ8+ против компонентов Р4 были индуцированы одним введением композиции, содержащей иммуногенный полипептид, аденовирусный вектор, содержащий гетерологичный полинуклеотид, кодирующий иммуногенный полипептид, и адъювант, даже когда последний был разведен. Влияние разведения адъюванта различалось, в зависимости от интересующих антигенспецифичных ответов СЭ4 или СЭ8. Конкретно, самыми сильными наблюдавшимися ответами были ответы против р24, и ответы анти-р24 Т-клеток СЭ4 и СЭ8 показывают эффект интервала дозы, коррелирующий с дозой адъюванта, использованного в комбинированной вакцине. В то время как тот же самый эффект можно наблюдать для ответа анти-КТ Т-клеток ί'.Ό4, эффект интервала доз дозы адъюванта, использованной в сотЬо, менее ясен для ответа анти-КТ Т-клеток СЭ8. Наконец, при рассмотрении общих антигенспецифичных ответов Т-клеток СЭ4 или СЭ8 и суммы ответов против 4 антигенов, можно наблюдать (эффект) интервала доз.
Пример 3.
Исследование иммуногенности у новозеландских белых кроликов, иммунизированных Раη7СКN или Р4/адъювант В последовательно или обеими аденовирусным и белковым компонентами, приготовленными вместе в виде комбинированного препарата.
Для иммунизации Р4/адъювантом В инъецировали человеческую дозу, т.е. 90 мкг белка Р4 в 500 мкл адъюванта В. Для иммунизации Раη7СКN использовали 10х1010 или 10х1012 вирусных частиц в 500 мкл физиологического раствора. Для иммунизации как аденовирусным, так и и белковым компонентами, приготовленными вместе в виде вместе препарата, использовали 90 мкг белка Р4, 10х 1011 вирусных частиц Раη7СКN в 500 мкл адъюванта В.
Схема вакцинации была следующей:
Группа Сутки 0 Сутки 14 Сутки 126
1 Р4/ ад) В Р4/ ад] В Р4/ ад] В
2 Рап7От 10Л10 Ρ3Π7ΘΚΝ 10л10
3 Рап7СРЫ 10л12 Рап7СР1М 10л12
4 Р4/ ад] В/ Ρθη7ΟΒΝ10Λ11 Р4/ асЦ В/ Рап7СК1Ч 10л11 Р4/ ад] В/ Рап7СРМ 10л11
Было 3 кролика на группу, за исключением группы 1, которая включала только 2 кроликов. Получили следующие показатели:
гуморальные ответы (ЕЬ1§А проводили на сыворотке из каждого отдельного животного из каждой группы):
- 23 021391 гуморальный ответ против Р4, гуморальный ответ против компонентов Р4 - р24, КТ, №Г и р17.
Лимфопролиферативные ответы:
лимфопролиферацию определяли по поглощению тритированного тимидина одноядерными клетками периферической крови (выделенные из цельной крови после градиента плотности), повторно стимулированными ίη νίίτο пулами пептидов №Г, р17, р24 и/или КТ в течение 88 ч в присутствии тритированного тимидина в течение последних 16 ч инкубации.
Результаты.
Лимфопролиферативный ответ.
Как показано на фиг. 10, самые сильные лимфопролиферативные ответы наблюдаются в группе, дважды иммунизированной белком. Лимфопролиферативный ответ у животных, дважды иммунизированных комбинацией аденовирус/белок/адъювант, наблюдали у всех кроликов из данной группы. Он на самом деле достигал пика после одной инъекции и мог быть дополнительно возвращен (до аналогичных уровней, что и после 1-й инъекции) после третьей инъекции комбинации аденовирус/белок/адъювант, свидетельствуя о том, что первые две инъекции не индуцируют нейтрализующий ответ, который ингибировал бы любой ответ на дополнительную аналогичную инъекцию. Пролиферативный ответ, наблюдавшийся у кроликов, иммунизированных комбинацией аденовирус/белок/адъювант, был сравнимым по его интенсивности с ответом, наблюдавшимся у животных, иммунизированных один или два раза 1012 вирусных частиц аденовируса, и оказывался более сильным, чем ответ у животных, иммунизированных один или два раза 1010 вирусных частиц аденовируса. В целом, это свидетельствует о том, что использование комбинации аденовирус/белок/адъювант могло снизить дозу аденовируса, подлежащую применению. Наконец, после третьей инъекции комбинации аденовирус/белок/адъювант ответ, наблюдавшийся в группе 4, был аналогичным ответу у животных, иммунизированных белком 3 раза (группа 1).
Серология.
Как показано на фиг. 11, кинетика гуморального ответа против Р4, наблюдавшаяся у животных, дважды иммунизированных комбинацией аденовирус/белок/адъювант, является аналогичной кинетике у животных, дважды иммунизированных белком: он уже определялся в сутки 7 после 2-й инъекции и затем уменьшался со временем. Однако, в показателях интенсивности, анти-Р4 ответ животных, дважды иммунизированных комбинацией аденовирус/белок/адъювант, остается более сильным в более поздние моменты времени (21 и 63 суток после 2-й иммунизации) по сравнению с анти-Р4 ответом у животных, дважды иммунизированных белком. У кроликов, иммунизированных один раз 1010 вирусных частиц аденовируса, не наблюдается гуморальный ответ против Р4. У кроликов, иммунизированных один раз 1012 вирусных частиц аденовируса, ответ против Р4 определяется только в сутки 21 и 63 после иммунизации. В этой группе высокая вариабельность ответа, наблюдавшаяся в момент времени 63 суток после иммунизации (ά77), происходит из-за одного животного (из 3), демонстрирующего более высокие титры против разных компонентов Р4, особенно против р24 и КТ, как показано на фиг. 12а и 12б соответственно. Гуморальный ответ против Р4 главным образом состоит из антител, имеющих в качестве мишени р24 и КТ, и в значительно меньшей степени - №Г и р17.
Заключение.
Лимфопролиферативные и гуморальные ответы у кроликов могли быть индуцированы после двух инъекций композиции, содержащей иммуногенный полипептид, аденовирусный вектор, содержащий гетерологичный полинуклеотид, кодирующий иммуногенный полипептид, и адъювант. Кроме того, авторы данного изобретения имеют доказательство того, что лимфопролиферативный ответ может быть вызван повторно после третьей инъекции такой композиции. Наконец, наилучший гуморальный ответ (по интенсивности и стойкости) наблюдается с комбинацией аденовирус/белок/адъювант.
Пример 4.
Иммуногенность Р4 (с оптимизированными кодонами)/адъювант В и С7-СКЫ при введении в виде комбинации мышам СВ6Р1.
Схема эксперимента.
Мышей СВ6Р1 дважды иммунизировали (сутки 0 и 21) разными комбинациями, перечисленными ниже. Ρ4οο (Р4 с оптимизированными кодонами)/адъювант В использовали в дозе 9 мкг Р4со/животное в 50 мкл адъюванта В (1/10 человеческой дозы) и вирус С7-СКЫ - в дозе 108 вирусных частиц/животное. Ρ4οο в примере 4 представляет собой Р4, полученный, как описано в \УО 2006/013106, пример 1, способом с оптимизированными кодонами.
Комбинации
С7-С^
С7-СКМ/адъювант В
С7-СΚN/Ρ4сο
С7-СΚN/Ρ4сο/адъювант В
Ρ4οο
Р4со/адъювант В адъювант В
- 24 021391
С7 пустой
С7 пустой/адъювант В
С7 пустой/Р4со
С7 пустой/Р4со/адъювант В
Схема иммунизации и анализ иммунного ответа.
Иммунизации проводили в сутки 0 и в сутки 21. Окрашивание на внутриклеточные цитокины (1С8) проводили в сутки 21, сутки 28 (7 суток после иммунизации 2), сутки 42 (21 сутки после иммунизации 2) и в сутки 77 (56 суток после иммунизации 2).
Результаты.
ВИЧ-специфичные ответы Т-клеток СЭ4.
Результаты показаны на следующих фигурах.
Фиг. 13. Количественная оценка ВИЧ-1-специфичных Т-клеток СЭ4.
% Т-клеток СЭ3 СЭ4, секретирующих ΙΡΝ-γ и/или 1Ь-2, представлен для каждого протокола иммунизации в четыре момента времени. Лимфоциты периферической крови (РВЬ) стимулировали ех νίνο (за 2 ч до добавления брефельдина, затем - в течение ночи) пулом пептидов, охватывающих последовательность Р4, и продукцию цитокинов измеряли 1С8. Каждое значение представляет собой среднее геометрическое значение 5 пулов из 3 мышей.
Фиг. 14. Распределение частот Р4-специфичных Т-клеток СЭ4 через 7 суток после двух иммунизаций.
Частота Р4-специфичных циркулирующих Т-клеток СЭ4 через 7 суток после двух иммунизаций представлена для каждого протокола. Каждая точка представляет собой значение, полученное для одного пула из 3 мышей.
Фиг. 15. Продукция цитокинов Р4-специфичными Т-клетками СЭ4 через 7 суток после двух иммунизаций.
% Р4-специфичных Т-клеток СЭ4, секретирующих 1Ь-2 и/или ΙΡΝ-γ, представлен для 5 пулов из 3 мышей. Представлены результаты для иммунизации Р4со/адъювант В (А), Р4со/адъювант В/С7 пустой (Б) и Р4со/адъювант В/С7-СΚN (В).
Частота Р4-специфичных циркулирующих Т-клеток СЭ4 достигает 2,82% через 21 сутки после двух иммунизаций комбинацией Р4со/адъювант В и снижается до 0,91% через 56 суток после иммунизации (фиг. 13). Две дозы одного вируса С7-СΚN приводят к 0,52% Р4-специфичных циркулирующих Т-клеток СЭ4 через 21 сутки после последней иммунизации, и присутствие адъюванта Б не изменяет этот ответ.
Присутствие пустого вектора С7 или рекомбинантного вируса С7-СΚN помимо смеси Р4со/адъювант В не увеличивает и не влияет на частоту ответа Р4-специфичных Т-клеток СЭ4 (3,58% и 2,82% соответственно через 21 сутки после последней иммунизации). Даже если бы не проводился статистический анализ, распределение популяции свидетельствует о том, что интенсивность ответов Ρ4специфичных Т-клеток СЭ4 не различается между тремя протоколами - Р4со/адъювант В, Р4со/адъювант В/С7 пустой и Р4со/адъювант В/С7-СΚN (фиг. 14). Как ожидалось, введение Р4со без адъюванта В не индуцирует значительно Р4-специфичные Т-клетки СЭ4.
Профиль продукции цитокинов показывает, что после иммунизации Р4со/адъювант В, Ρ4специфичные Т-клетки СЭ4 секретируют как ΙΡΝ-γ, так и 1Ь-2. Добавление пустого С7 или С7-СΚN в данный протокол иммунизации не изменяет этот профиль.
В результате, эти данные говорят о том, что наибольший ответ Р4-специфичных Т-клеток СЭ4 получают после иммунизации комбинацией Р4со/адъювант В, и что присутствие вируса С7-СΚN не улучшает и не изменяет этот ответ.
Ответы антигенспецифичных Т-клеток СЭ8.
Результаты показаны на следующих фигурах.
Фиг. 16. Количественная оценка ВИЧ-1-специфичных Т-клеток СЭ8.
% Т-клеток СЭ3 СЭ8, секретирующих ΙΡΝ-γ и/или 1Ь-2, представлен для каждого протокола иммунизации в четыре момента времени. Лимфоциты периферической крови (РВЬ) стимулировали ех νί\Ό (за 2 ч до добавления брефельдина, затем - в течение ночи) пулом пептидов, охватывающих Ρ4, и продукцию цитокинов измеряли 1С8. Каждое значение представляет собой среднее геометрическое значение 5 пулов из 3 мышей.
Фиг. 17. Продукция цитокинов Р4-специфичными Т-клетками СЭ8 через 7 суток после двух иммунизаций.
% Р4-специфичных Т-клеток СЭ8, секретирующих 1Ь-2 и/или ΙΡΝ-γ, представлен для 5 пулов из 3 мышей. Представлены результаты для иммунизации С7-СКЫ (А), С7-СКЫ/адъювант В (Б) и С7СКН+Р4со/адъювант В (В).
После одной инъекции рекомбинантный вектор С7-СКЫ индуцирует высокую частоту Ρ4специфичных циркулирующих Т-клеток СЭ8 (всего 9,70% Т-клеток СЭ8, 21 сутки после иммунизации) (фиг. 4). Вторая инъекция не индуцирует ответ Р4-специфичных Т-клеток СЭ8. Комбинация Р4со/адъювант В индуцирует от слабого до неопределимого (ответа) Р4-специфичных Т-клеток СЭ8, и
- 25 021391 добавление этой комбинации к С.'7-ΟΚΝ не улучшает или не ухудшает ответ Р4-специфичных Т-клеток СЭ8.
Ответ Р4-специфичных Т-клеток СЭ8 задерживается, когда адъювант В добавляют к 07-ΟΚΝ, но достигает того же самого уровня, что и с одним С7-СΚN или с комбинацией С7-СΚN/Ρ4со/адъювант В через 21 сутки после второй иммунизации.
Р4-специфичные Т-клетки СЭ8 главным образом секретируют ΙΡΝ-γ независимо от того, инъецируется ли вектор 07-ΟΚΝ один или в комбинации с Р4со/адъювант В (фиг. 17).
Интересно, что ответ Р4-специфичных Т-клеток СЭ8 сохраняется вплоть до 56 суток после последней иммунизации без снижения, свидетельствуя о том, что вектор С7 вызывает сильный и стойкий (ответ) Т-клеток СЭ8.
Заключения.
Вакцина Р4со/адъювант В индуцирует высокую частоту полифункциональных ВИЧ-специфичных Т-клеток СЭ4, но не ВИЧ-специфичных Т-клеток СЭ8 у мышей СВ6Р1. В той же самой животной модели рекомбинантный аденовирус С7, экспрессирующий Сад, ΚΤ и №ί (Аб С7-ΟΚN), индуцирует сильный антигенспецифичный ответ Т-клеток СЭ8 и от слабого до неопределимого антигенспецифичного ответа Т-клеток СЭ4. Комбинация Р4/адъювант В и Аб С7-СΚN вызывает (ответы) как антигенспецифичных Тклеток СЭ4. так и СЭ8. в то же самое время. Комбинация трех компонентов - Р4со, адъювант В и С7ΟΚΝ вызывает самые высокие уровни как антигенспецифичных Т-клеток СЭ4, так и СЭ8, в то же самое время. Комбинирование Р4/адъюванта В и Аб С7-СΚN имеет аддитивный эффект относительно интенсивности обеих ветвей клеточного иммунного ответа. В этой модели остается определить эффект ответа антигенспецифичных Т-клеток СЭ4 на функциональность ответа антигенспецифичных Т-клеток СЭ8.
Пример 5.
Иммуногенность аденовируса шимпанзе С7, экспрессирующего конструкцию С82 белка С8Р из Р1а§тобшт 16101334141 (С7-С82), когда он вводится один.
Схема эксперимента.
Мышей СВ6Р1 один раз внутримышечно иммунизировали в интервале доз (1010, 109 и 108 вирусных частиц) аденовируса шимпанзе С7, экспрессирующего антиген малярии С8Р, и определяли С8Рспецифичные (к С-концу и Ν-концу) ответы Т-клеток СЭ4 и СЭ8 через 21, 28 и 35 суток после инъекции посредством 1С8 (окрашивание на внутриклеточные цитокины).
С8Р-специфичные ответы Т-клеток СЭ4.
Результаты показаны на следующих фигурах.
Фиг. 18. Количественная оценка С8Р-специфичных Т-клеток СЭ4.
% Т-клеток СЭ4, секретирующих ΙΡΝ-γ и/или 1Ь-2, представлен для каждого протокола иммунизации в три момента времени. Лимфоциты периферической крови (РВЬ) стимулировали ех νί\Ό (за 2 ч до добавления брефельдина, затем - в течение ночи) пулом пептидов, охватывающих последовательности Ν-конца С8Р или С-конца С8Р, и продукцию цитокинов измеряли посредством 1С8. Ответы на Сконцевые и Ν-концевые пептидные пулы складывали, и каждое значение представляет собой среднее 5 пулов из 4 мышей.
Фиг. 19. Количественная оценка С8Р-спеиифичных Т-клеток СЭ8.
% Т-клеток СЭ8, секретирующих ΙΡΝ-γ и/или 1Ь-2, представлен для каждого протокола иммунизации в три момента времени. Лимфоциты периферической крови (РВЬ) стимулировали ех νί\Ό (за 2 ч до добавления брефельдина, затем - в течение ночи) пулом пептидов, охватывающих последовательности Ν-конца С8Р или С-конца С8Р, и продукцию цитокинов измеряли посредством 1С8. Ответы на Сконцевые и Ν-концевые пептидные пулы складывали, и каждое значение представляет собой среднее 5 пулов из 4 мышей.
Эти результаты показывают, что обе дозы С7-С82, 1010 и 109, вызывают аналогичные уровни С8Рспецифичных ответов Т-клеток СЭ4 (пик 0,5%) и аналогичные уровни С8Р-специфичных ответов Тклеток СЭ8 (пик 8%). Доза С7-С82 1010 была выбрана в последующих экспериментах, где тестировали иммуногенность С7-С82 в комбинации с ΚΤ8,8 (см. ниже).
Пример 6.
Иммуногенность С7-С82 и ΚΤ8,8 при введении в виде комбинации у мышей СВ6Р1.
Схема эксперимента.
Мышей СВ6Р1 три раза внутримышечно иммунизировали (сутки 0, 14 и 28) либо комбинацией вакцины-кандидата против малярии ΚΤ8,8 (5 мкг) в 50 мкл адъюванта В (на фигурах, приведенных ниже, называется Р-Р-Р), либо комбинацией ΚΤ8,8 (5 мкг) и С7-С82 (1010 вирусных частиц) в 50 мкл адъюванта В (на фигурах, приведенных ниже, называется С-С-С). С8Р-специфичные (к С-концу и Ν-концу) ответы Т-клеток СЭ4 и СЭ8 определяли в следующие моменты времени:
суток после 2 иммунизации
7, 21, 35 и 49 суток после 3 иммунизации
С8Р-специфичные ответы Т-клеток определяли посредством 1С8 (окрашивание на внутриклеточные цитокины).
- 26 021391
С8Р-специфичные гуморальные ответы в сыворотке от иммунизированных животных также определяли ЕЫ8А в сутки 14 и 42 после 3-й иммунизации.
С8Р-специфичные ответы Т-клеток СЭ4.
Результаты показаны на следующих фигурах.
Фиг. 20. Количественная оценка С8Р(Ы-конец)-специфичных Т-клеток СЭ4.
% Т-клеток ί'.Ό4. секретирующих ΙΡΝ-γ и/или 1Ь-2, представлен для каждого протокола иммунизации в пять моментов времени. Лимфоциты периферической крови (РВЬ) стимулировали ех У1уо (за 2 ч до добавления брефельдина, затем - в течение ночи) пулом пептидов, охватывающих последовательность Νконца С8Р, и продукцию цитокинов (ΙΡΝ-γ и/или 1Ь-2) измеряли посредством 1С8. Каждое значение представляет собой среднее 4 пулов из 7 мышей.
Фиг. 21. Количественная оценка С8Р(С-конец)-специфичных Т-клеток СЭ4.
% Т-клеток ί'.Ό4, секретирующих ΙΡΝ-γ и/или 1Ь-2, представлен для каждого протокола иммунизации в пять моментов времени. Лимфоциты периферической крови (РВЬ) стимулировали ех У1уо (за 2 ч до добавления брефельдина, затем - в течение ночи) пулом пептидов, охватывающих последовательность Сконца С8Р, и продукцию цитокинов (ΙΡΝ-γ и/или 1Ь-2) измеряли посредством 1С8. Каждое значение представляет собой среднее 4 пулов из 7 мышей.
Эти результаты показывают, что мыши, иммунизированные 3 инъекциями комбинации [КТ8.8 + С7-С82 1010 + адъювант В] демонстрируют более сильные антигенспецифичные ответы Т-клеток СЭ4 (как против С-концевой, так и против Ν-концевой части С8Р), чем мыши, иммунизированные 3 инъекциями КТ§,§ + адъювант В.
С8Р-специфичные ответы Т-клеток СЭ8.
Результаты показаны на следующих фигурах.
Фиг. 22. Количественная оценка С8РЩ-конец)-специфичных Т-клеток СЭ8.
% Т-клеток ί'.Ό8, секретирующих ΙΡΝ-γ и/или 1Ь-2, представлен для каждого протокола иммунизации в пять моментов времени. Лимфоциты периферической крови (РВЬ) стимулировали ех У1уо (за 2 ч до добавления брефельдина, затем - в течение ночи) пулом пептидов, охватывающих последовательность Νконца С8Р, и продукцию цитокинов (ΙΡΝ-γ и/или ΙΚ-2) измеряли посредством Ιί','δ. Каждое значение представляет собой среднее 4 пулов из 7 мышей.
Фиг. 23. Количественная оценка С8Р(С-конец)-специфичных Т-клеток СЭ8.
% Т-клеток ί'.Ό8, секретирующих ΙΡΝ-γ и/или ГО-2, представлен для каждого протокола иммунизации в пять моментов времени. Лимфоциты периферической крови (РВЬ) стимулировали ех У1уо (за 2 ч до добавления брефельдина, затем - в течение ночи) пулом пептидов, охватывающих последовательность Сконца С8Р, и продукцию цитокинов (ΙΡΝ-γ и/или ГО-2) измеряли посредством Ю8. Каждое значение представляет собой среднее 4 пулов из 7 мышей.
Эти результаты показывают, что мыши, иммунизированные 3 инъекциями комбинации [КТ§,§ + С7-С82 1010 + адъювант В], демонстрируют более сильные антигенспецифичные ответы Т-клеток СЭ8 (как против С-концевой, так и против Ν-концевой части С8Р), чем мыши, иммунизированные 3 инъекциями КТ§,§ + адъювант В.
С8Р-специфичные гуморальные ответы.
Результаты показаны на следующей фигуре.
Фиг. 24. Количественная оценка С8Р-специфичных титров антител.
Сыворотку у мышей брали в сутки 14 и 42 после 3-й иммунизации. Титры антител против С8Р измеряли в каждой из этих индивидуальных сывороток посредством ЕЫ8А. Показанные данные представляют собой среднее геометрическое титров антител ± 95%-ный доверительный интервал.
Эти результаты показывают, что мыши, иммунизированные 3 инъекциями комбинации [КТ§,§ + С7-С82 1010 + адъювант В], демонстрируют аналогичные титры С8Р-специфичных антител, что и мыши, иммунизированные 3 инъекциями КТ§,§ + адъювант В.
Заключения.
Вакцина КТ§,§/адъювант В индуцирует высокую частоту Т-клеток СЭ4, специфичных к С-концу С8Р, но не Т-клеток СЭ4, специфичных к Ν-концу С8Р. Кроме того, вакцина КТ§,§/адъювант В индуцирует от низких до непределимых (уровней) Т-клеток СЭ8, специфичных к С- и Ν-концу С8Р. В той же самой животной модели рекомбинантный аденовирус С7, экспрессирующий С8Р, индуцирует сильные ответы С8Р(С-конец и ^конец)-специфичных Т-клеток СЭ8 и слабые ответы С8Р(С-конец и Ν-конец)специфичных Т-клеток СЭ4. Комбинация КТ§,§/адъювант В и Αά С7-С82 вызывает высокие уровни как С8Р(С-конец и ^конец)-специфичных Т-клеток СЭ4, так и СЭ8, в то же самое время. Комбинация КТ§,§/адъюванг В и Αά С7-С82 имеет аддитивный эффект относительно интенсивности обоих ветвей ответа Т-клеток. Наконец, комбинация КТ§,§/адъювант В и Αά С7-С82 вызывает высокие уровни С8Рспецифичных антительных ответов, которые являются сравнимыми с ответами, индуцированными КТ8,8/адъювант В.
- 27 021391
Последовательности
5ЕО Ю ΝΟ: 1:
аЬддд^дссс дадсбСсддг асГдСсбддС ддададсбдд 51 дааааСОадд сСдсдсссдд даддсааааа даааСасаад 101 СсдСдЬдддс сесдадддад сеедаасдде еедссдедаа 151 седдаааеае седадддаед есдссадаес седдддсааС 201 сссссадасс дддадСдаад адсСдаддес сССдеаеаас 251 сссЪсСасСд сдЪасассад аддаесдада ССааддаСас 301 ссддасаааа ссдаддадда дсаааасаад адсаадаада 351 ддеадссдсс дасаседддс асадсаасса ддсассасад 401 Седсссаааа саССсадддс садаСддССс аСсаддссаС 451 асдсссааед ссСдддСдаа ддсСдСсдаа дадааддссС 501 ддссасессе аСдесеСссд сСССдадСда дддддссасс 551 СеааСасааС дсССааСасс дедддсддсс аСсаддссдс 501 седааддада сСаСсаасда ддаддсадсс дадсдддаса 551 сдессасдсе ддсссаассд сдсссддаса даСдсдддад 701 сСдасаСсдс сддсассасс СсСасасСдс аададсаааС 751 ассаасаасс сСсссаСссс адесддадаа аессасааас 001 ссСдддесСд аасаадаесд Сдедсасдса сСсСссдаса 851 асаССадаса дддасссааа дадссССССа дддаССасдС 901 СаСаадаосс Сдсдадсада дсаддссссе саддаддсса 951 дасддадаса сСсссддСас адаасдсСаа ссссдасСдс 1001 СдааддсасС аддсссддсс дссассседд аададаСдаС 1051 садддадСад дсддасесдд асасааадсе ададСдССда 1101 садесссаСс дадассдСдс сддСдаадсе дааасссддд 1151 ссааддссаа дсадСддсса сСсассдадд адаадаСсаа 1201 дадасссдса ссдадасдда дааададддс аадассадса 1251 ддадаассса Сасаасассс ссдСдСССдс саСсаадаад 1301 ссаадСддсд саадсЪддСд даСССссддд адсСдааеаа 1351 даееСсСддд аддессадсС дддеаСсссс саСссддссд 1401 даадаададс дсдассдсдс Сддасдеддд сдасдсССас 1451 сСседдасда ддасСССада аадСасассд ссСсСассаС 1501 аасаасдада ссссСддсас садаСаСсад СасаасдСсс 1551 ссддаадддс есесссдсса ссссссадад сСссаСдасс 1501 адссдСССсд даадсадаас еседасаСсд СсаСсСасса 1551 дассСдСасд СдддсСсСда ссСддаааСс дддсадсаЬс 1701 едаддадсСд аддсадсаСс СдсСдадаСд дддссСдасс 1751 адаадсаСса дааддадссд ссаССссСда адаСдддсСа 1001 сссдасааде ддассдсдса дссСзссдсс ссссссдада 1851 дассдсдаас дасаСссада адсСддСддд саадсссаас 1901 ада!сСаСсс сдддаСсаад дСдсдссадс СсСдсаадсС 1951 ассааддссс сдаесдаддС дасессссес асддаддаад 2001 дсСддсСдад аассдддада СссСдаадда дсссдСдсас 2051 аедассссСс сааддассСд аЬсдссдааа Ьссадаадса 2101 садсддасве ассадаеееа ссаддадссе ССсаадаасс 2151 саадСзсдсс сдсасдаддд дсдсссасас саасдаСдСс 2201 ссдаддссдС ссадаадаЬс асдассдадЬ ссаьсдьдас 2251 асассеаадЬ ссаадсСдсс сасссадаад дадасссддд 2301 дассдаасаС Сддсаддсса ссСддаССсс сдадсдддад 2351 еасссссСсе ддедаадссд сддСаесадс ссдадаадда 2401 ддсдсддада саСЬссасдЬ ддасддсдсд дссаассдсд 2451 едддааддсс дддсасдсса ссаассдддд ссдссадаод 2501 ьдассдасас сассаассад аадасддвдс ЬдсаддссаЬ 2551 сСссаддасС ссддссЬдда ддсдаасасс дСдасддаса 2501 дсСдддсаСС аьссаддссс адссддасеа дСссдададс 2551 ассадаесас сдадсадССд ассаадааад адааддесса 2701 дСсссддссс асаадддсас Сддеддсаас дадсаддЬсд 2751 дадедсдддд аььадааадд СдсСдаСддС дддссьссса 2001 ’аддсассеье аадасеаасд асссасаадд садсьдСада 2851 сссссаааад аааадддддд асСддааддд сСааЬСсасС асадаСддда сЬсаадсаСа сссаддссЬд
Сдсадссаес асадеддсса еааддаддсо аддессадса аассаессеа садсссеедд
СССсСССЬда ссееаддасс саСдсаааСд дадСдсаЬсс
ССЬсдсддсС сддаеддаьд ддЬддаССаС сссасесссд сдассддССС аааассддас аааасааСсС дассдссСдЬ
Ьдддссссас аСддасддсс ддсссСддСд адассдддсс ааддасадса дсддасссад дссСдаадаа
ЬЬсадсдЬсс сссаьсьасс
Ссссссаддд аадаесссдд дСасаСддас дсасдаадае асессддаса сдадсСссаС аддасадссд
СдддсСадсс дссдсдсддс ссдадсСсда ддсдСдСасС дддссадддд
Ссаадассдд аадсадсСда сСдддддаад адасдеддед еесдьдааса дсссассдед ааасааадсС дссдесассс ссассссдсс дссадСаедс дааседдсда ссСсдсседд асаадсСдде десасясссс
СсеСадссас сееааадаад
- 28 021391
3901 асаадакакс сккдакскдк ддакскасса сасасааддс касккссскд 2951 аккддсадаа скасасасса дддссадддд ксадакаксс аскдассккк 3001 ддакддкдсс асаадскадк асеадккдад ссадакаадд садаададдс 3051 сааСаааддэ дадаасасса дсккдккаса ссскдкдадс скдсакддда 3101 кддакдассс ддадададаа дкдккададк ддаддкккда садссдсска 3151 дсаккксакс асдкддсссд ададскдсак ссддадкаск ксаадааскд 3201 скда
ЗЕО 10 N0: 2:
ИСДКАЗУЬЗС ОЕЬВННЕКГН ЬКРОСКХКУХ ЬКНХУМАЗКВ ЬЕЕРАУЫРОЬ 51 ЬЕТЗЕОСКО! 1ХЗОИЗРЙЕОГ ОЗВВЬКВЬУЫ ТУАТЬУСУНО ЕХЕХЮЗТКЕА
101 ΕΏΚΙΕΕΕΟΝΚ ЗКККАфОААА ОТСНЗН0У50 ВУРГУОИХОО 2МУНСА13РЙ 151 ТЬЫАНУКУУЕ ЕКАГЗРЕУХР МГЗАЪЗЕОАТ РОШ-ЭТИЮТ УССНОААМОМ 201 ЬКЕПНЕЕАА ЕНОНУНРУНА ΟΡΙΑΡΟ0ΜΚΕ РЙОЗШАОТТ ЗТЬОЕОЮИМ 251 ΤΗΗΡΡΙΡνσΕ ΙΥΚΚΗΙΙΙιΟΙι НК1УЯНУЗРТ 51Ы31ВООРК ЕРРВОУТОЙР 301 УКТЬЙАЕОАЗ ОЕУКИММТБТ ЬЬУОНАЫРОС КТХЬКАЬСРА АТЬБЕММТАС 351 οσνσσροκκΑ йуьиорхзрх етурукькро мооркукоир ътеекхкаьу 401 ЕХСТВМЕКЕО ΚΙ3ΚΙ0ΡΕΒΡ УНТРУГА1КК КОЗТКНККЬУ ΠΡΒΕϋίίΚΚΤζ! 451 ОШЕУОЬОТР НРАОЬККККЗ УТУЬОУЗПАУ РЗУРЬОЕОРК КУТАЕТΙΡ3Ι 501 ΝΗΒΤΡΘΙΚΥΟ УНУЬРООИКО 3ΡΑΙΡ033ΜΤ КХЬЕРРЙЩМГ ΡΟϊνΐΥΟΥΜΕ 551 оьууозоьех сднпткхввь нояыннаьт ΤΡϋΚΚΗ<3ΚΕΡ ррькноуеьн 501 РОКИТУдРТУ ЬРЕЮЗЗИТУЯ МОХЬТОКЬИ ΗΑ30ΙΥΡΟΙΚ УйдЬСКЕЬКа 651 ТКАЬТЕУ1РЬ ТЕЕАЕЕЁ1АЕ НКЕ1ЕКЕРУН ВУУТОРЗИЗЬ 1АЕЮКОСОО 701 0ΜΤΥ<3ΙΥ<}ΕΡ ΓΚΝΧ,ΚΤΟΚΥΑ КМЙСАНТНРУ ΚΟΙ,ΓΕΑνςΚΙ ТТЕЙ1У1ИОК 751 ТРКРКЬРХОК ЕТНВТНИТЕУ Н0АТН1РЕНВ РУИТРРЬУКЬ ИУОЪЕКВИУ 801 САВТРУТООА АНКЕТКИКА ΟΥνΤΝΗΟΚΟΚ УУТЬТОТТНО ΚΤΕΧβΑΙΥΧΑ 851 ЕСО50ЬЕУКХ УТОЗдУАХЛХ Ι0Α0ΡΕΗ53Ε3 ЕЬУИОИЕОЬ ХККЕКУУЬАИ 901 урднксхеов еоуокьузао хккухмусзрр утроурхйрм тукаауохзн 951 гъкЕкаоьЕа ынз(гкк<зо1 ызипунтоа υρρβνονυτρ орсукурьтр
1001 ОИСУКЬУРУЕ ΡΕΚνΕΕΑΝΚα ЕЫТЗЬХНРУЗ ХНОМБОРБКЕ УЬЕИНРаЗРЬ 1051 АГННУДНЕЬН РЕУРКИС
ЗЕО Ю N0: 3:
акддссдсса дадссадсак сскдадсддд ддсаадскдд асдсскддда 51 даадаксада скдаддсскд дсддсаадаа даадкассдд скдаадсасс
101 кддкдкдддс садсададад скддаксдск ксдссскдаа ксскадсскд 151 скддадасса ссдадддскд ссадсадакс акдаассадс кдсадсссдс 201 сдкдаааасс ддсассдадд адаксаадад сскдкксаас ассдкддсеа 251 ссскдкаскд сдкдсассад сддаксдасд кдааддакас сааддаддсс 301 скддасаада ксдаддадак ссадаасаад адсаадсада ааасссадса 351 ддссдскдсс дасассддсд асадсадсаа адкдадссад ааскасссса 401 ксакссадаа кдсссадддс садакдаксс ассадаасск дадссссада 451 ассскдаакд сссдддкдаа адкдаксдад дааааддсск ссадссссда 501 адкдакссск акдкксадсд ссскдадсда дддсдссасс ссссаддасс 551 кдаасдкдак дскдаасаек дкдддсддас ассаддсодс сакдсадакд 601 скдааддаса ссаксаакда ддаддссдсс дадкдддаса даскдсассс 651 сдкдеаддсс ддасссаксс сссскддсса даксададад сссададдса 701 деда сак сдс сддсассасс кссасссскс аадаасадск дсадкддакд 751 ассддсаасс сксссакссс кдкдддсаас акскасаадс ддсддаксак В01 сскдддсс-д аасаадаккд кдеддакдка садссссдкд кссаксскдд 851 акаксаадса дддссссаад дадсссккса дадаскасдк ддассддккс 901 кксааддссс кдададесда дсаддссасс саддасдкда адддскддак 951 дассдадасс скдскддкдс адаасдссаа ссссдаскдс аададсаксс
1001 кдааддссск дддсадсддс дссасаскдд аддадакдак дассдсскдс 1051 садддадкдд дсддасссдд ссасваддсс ададкдекдд ссдаддссак 1101 дадссаддсс садсадасса асаксакдак дсадсддддс ааскксадад 1151 ^ссадаадсд_даксаадкдс_Хк£ззсЬдсд дсааддаддд ггягскддсс 1201 адаааскдса дадсссссад даадаадддс кдекддаадк дкддсаадда 1251 адддсассад акдааддаск дсассдадад дсаддссаак кксскдддса
- 29 021391
1301 адаСЕЕддсо Еадоадсаад ддсадасссд дсаасЕЕссс ссададсада 1351 сссдадссса ссдссссЕсс сдссдадсЕд сссддсаЕдд дсдадддсаЕ 1401 сдссадссЕд сссаадсадд адеадаадда садададсад дЕдссссссс 1451 ЕддЕдЕсссЕ даадЕсссЕд СЕсддсэасд аЕссьссдад ссадддаЕсс 1501 сссаЕсадсс ссаЕсдадас сдЕдсссдЕд асссЕдаадс ссддсаЕдда 1551 Еддссссааа дЕдааасадЕ ддссссЕдас сдаддадаад асЕааддссс 1601 ЕдассдаааЕ сЕдЕассдад аЕддадаадд адддсаадаЕ садсаадаЕс 1651 ддссссдада ассссЕасаа сасссссагс ЕссдссаЕса адаадаадда 1701 садсассаад Еддсддааас ЕддЕддасЕЕ ссдддадсЕд аасаададда 1751 сссаддасЕЕ сЕдддаадЕд садсЕдддса Есссесассс ЕдссддссСд 1801 аадаадаада адгссдЕдас адЕдссддаЕ дсдддсдасд ссЕасЕЕсад 1851 сдЕдссссЕд дасдадаасЕ ЕсаддаадЕа сассдссЕЕс ассаЕсссса 1901 дсассаасаа сдадассссс ддадЕдадаЕ ассадЕасаа сдЕдссдсес 1951 садддсСдда адддсадссс сдссаЕсЕСс сададсадса ЕдассаадаЕ 2001 ссСддадссс ЕЕссддадса адаассссда даЕсаЕсаСс ЕассадЕаса 2051 сддседсесС дСаСдСдддс адсдаЕседд адаЕсддсса дсасаддасс 2101 аадаЕсдаад адсЕдадддс ссассЕдсСд адсСддддсЕ ссассасссс 2151 сдаСаадаад сассадаадд адсссссССС ссСдСддаСд ддсСасдадс 2201 сдсассссда саадЕддасс дЕдсадссса ЕсаЕдссдсс сдаеааддад 2251 адсЕддассд ЕдаасдасаС ссадааасЕд дЕдддсаадс ЕдааССдддс 2301 садссаааСс Сасдссддса ЕЕааадЕдаа дсадсЕдЕдс аддсЕдсЕда 2351 даддсдссаа адсссСдаса дасассдЕда сассдасада ддаддссдад 2401 сСддадсСдд ссдадаасад ддадаЕссЕд ааддассссд ЕдсасддсдЕ 2451 деасЕасдас сссадсаадд ассЕддЕддс сдадаЕСсад аадсадддсс 2501 аддассадЕд дассЕассаа аЕоЕассадд адссЕЕЕсаа даассЕдааа 2551 ассдддаадЕ асдссаддаа дадаадсдсс сасассаасд аЕдЬдаддса 2601 дсЕддссдаа дЕддЕдсада иадеддсЕаь ддададсасс дедаЕсЕддд 2651 дсаадасссс «аадЕЕсаад сЕдсссаЕсс адааддадас сЕдддааасс 2701 ЕддЕддаЕдд асЕасЕддса ддссассЕдд аЕЕесЕдадЕ дддадЕЕсдЕ 2751 даасассссс ссЕсЕддЕда адсЕдЕддЕа Есадседдад ааддасссса 2В01 ЕесЬдддеде сдадассЕЕс ЕасдЕддаед дадссдссаа Ьадададасс 2851 аадсЕдддса аддссддсьа сдЕдассдас ададдсадас адааадЕддЕ 2901 дЕсЕсЕдасс дадасаасса ассадаааас сдадсЕдсас дссаЕссЕдс 2951 ЕддсесЕдса ддаеадсддс «дедаодЕда аевЕсдЕдас сдасЕессад 3001 оасдсссЕдд дсаЕсаЕЕса ддсссадссс даЕадаадсд ададсдадсЕ 3051 ддЕдаассад аЕсаЕсдада адсЕдаЕсдд сааддасааа аЕсЕассЕда 3101 дсЕдддЕдсс сдсссасаад ддсаЕсддсд дсаасдадса ддЕддасаад 3151 сЕддЕдЕсса дсддсаЕссд дааадЕдсЕд ЕЕЕеЕддасд дсаесдасаа 3201 ддсесаддад даесаодада даЕассаеад саасЕддсдд асааЕддсса 3251 дсдасЕЕсаа ссЕдссЕссс ассдсддсса аддадаЕсдЕ ддссадсЕдс 3301 даЕаадЕдЕс адсЕдааддд сдаддссаЕд сасддсеадд ЕддасЕдсад 3351 сссЕддсаЕс ЕддсадсЕдд ссЕдсассса ссЕддадддс ааадЕдаЕЕс 3401 ЕддЕддссдЕ дсаедсддсс адсддсЕаса Есдаддссда адЕдаЕЕесс 3451 дссдадассд дссаддадас сдсоЕасЕЕс сЕдсЕдаадс Еддссддсад 3501 аЕддсссдЕд ааадЕддЕдс асассдссаа сддсадсаас ЕЕсасеЕсЕд 3551 ссдссдЕдаа ддссдссЕдс Еддедддсса аеаессадса ддадЕЕсддс 3601 аЕссссЕаса асссЕсадад ссадддсдЕд дЕддссадса Едаасаадда 3651 дседаадаад аЕсаЕсддсс аддЕдаддда ссаддссдад сассЕдаааа
3701 садссдЕдса даЕддссдЕд ЕЕсаЕссаса асЕЕсаадсд даадддоддс 3751 аЕЕддсддсЕ асадсдесдд ададеддаьс аесдасаЕса ьсдссассда 3801 ЕаЕссадасс ааддаасЕдс адаадсадаЕ сассаадаЕЕ садаасЕЕса 3851 дадЕдЕасЕа ссдддасаде адддасссса ЕсЕддааддд сссЕдсеаад 3901 сЕдсЕдЕдда адддсдаадд сдссдЕддЕд асссаддаса асадсдасаЕ 3951 сааадЕддЕд ссссддадда аддсеаадаЕ ЕсЕдсдддас еасддсааас 4001 адаеддеедд сдаедасЕдс дЕддссддса ддсаддаЕда ддасадассе 4051 аЕдддсддса адЕддЕссаа дддсадсаЕЕ дЕдддсЕддс ссдадаЕссд 4101 ддададааЕд адаададссс седссдссдс сссЕддадЕд ддсдссдЕдЕ 4151 сЕсаддаЕсЕ ддаЕаадсас ддсдссаЕса ссадсадсаа саЕсаасаас 4201 сссадсЕдЕд ЕдЕддсЕдда ддсссаддаа даддаддаад ЕдддсЕЕссс 4251 едедадассс саддЕдсссс Едадасссаг дассеасаад ддсдссеесд 4301 ассЕдадсса сЕЕССЕдаад дадаадддсд дссЕддасдд ссЕдаЕсЕас
- 30 021391
4351 адесддаадс ддсаддадак сскддакскд кдддкдкасс асасссаддд 4401 скаскксссс даскддсада аккасасссс кддссскдда дкдсдчкакс «451 ссскдассск сддскддкдс кксаадскдд кдсскакдда дсеедаедаа 4501 дкддадаадд сеаеададдд сдадаасаас адсскдскдс ассскакскд 4551 ссадеасддс акддасдакд аддадсддда адкдскдакс кддаадккед 4601 асадсаддсс ддесскдаад сасададссс аддааскдся сссададккс 4551 касааддаск дскда
ЗЕО Ю N0: 4:
ИДАЯАЗХЕЗЯ 0К1ЛАМЕК1К ЬЕРвСКККУР. ЬКНЕУМАЗЕВ ΕΟΒΡΑΕΝΡ3Ε 51 ЬБТТЕЗСМ! МНОЕОРАУКТ СТЕЕ1КЗЕРЫ ТУАТЕУСУНО ВЮУКБТКЕА ιοί εοκιεειονκ звдктооааа етзбззкузо νυριιοναοο омшсзнезре 151 ТЬЫАИУКУХЕ ЕКАР5РЕУ1Р МРВАЕЗЕЗАТ РОШДУМЕН! УОСНОААМОМ 201 ЕКБТ1НЕЕАА ВИОВЕНРУОА СР1РР001КБ РН<ЗЗБХА<ЗТТ 5ТР<2Е01Х}ИМ 251 ТСКРР1РУОЫ 1УККИ111ЛЕ ΝΚίνΕΜΥΒΡν 5Ι1ΧΙΚ0ΟΡΚ ЕРРНБУУБВР 301 ΡΚΑΕΗΑΒΟΑΤ ОБУКОИИТЕТ ЬЬУОНАЫРОС К31ЬКА1Х386 АТЕЕЕМИТАС 351 ΟΟναΟΡΟΗΚΑ КУЬАЕАМЗОА оотихмндна НРКСОКК1КС рнсокеонеа 401 НИСКАРВККО СМКСОКЕОНО МКВСТЕКСЗАН ΡΙΧ3ΚΙΜΡ35Κ СКРОКРРОЗК 451 РЕРТАРРАВБ РСМСЕСХАЗЕ ΡΚΟΕζ}ΚΠΒΕΟ УРРЬУЗЕКЗЕ РОМСРЬЗООЗ 501 Р13Р1ЕТУРУ ТЕКРОНБЭРК УКЭНРЕТЕВК I КАЕТЕ ЮТЕ ΜΕΚΒΟΚΙΞΚΙ 551 ΟΡΕΗΡΥΝΤΡΙ ΓΑΙΚΧΚ03ΤΚ ИИКЦУБГВЕЕ ЮШТООРИЕУ <31X31РНРАСЬ 601 ККККЗУГУЕБ УООАУРЗУРЕ БЕНРНКУТАР ΤΙΡ3ΤΗΝΕΤΡ ОУЕУОУЫУЕР 651 0СЗИЮЗЗРА1Р 033ИТК1ЬЕР ΡΒ3ΚΝΡΕΙΙΙ УОУНААЬУУО ЗИЕЕКЗОНЕТ 701 КГЕЕЬЕАНЬЬ ЗИОРТТРОКК ВДКЕРРГЕИМ ОУВЕНРБКМТ νςΡΙΜΕΡϋΚΕ 751 знттаоюкь У<ЭКЕН»АЗ<}1 ΥΑΟΙΚνΚΟΙ,Ο ВЕЫКЭАКАЕТ ЫУТЕТВЕАЕ 301 ΕΕΙΑΕΝΚΕΙί КБРУНОУУУБ РЗКЫЛГАВЮ Κ0β<2ΟΟΗΤΥ<3 ΙΥΟΕΡΡΚΝίΚ 351 ΤαΚΥΑΒΚΗΕΑ НТНБУВдЕАЕ νν<3ΚνΑΜΕ5Ι У1ИСКТРКГК ΕΡΙΟΚΒΤΗΒΤ »01 ИИМОУИ0АТН ΙΡΒΗΒΡνΝΤΡ РЫ/КЬНУОЬЕ ΚΟΡΙΕΟΑΕΓΡ УУКЗААВВЕТ »51 КЫЗКАОУУТБ КЯВОЮГУЗЕТ ЕТПГдКТЕЬВ АЫииДОЗЗ ЗЕУМ1УТБ50
1001 УА1Х31ЮА0Р ОЕЗЕЗЕЬУИО ΙΙΒΚΕΙΟΚΟΚ ХУЕЗМУРАНК ОКЗОНЕОУОК 1051 ЬУЗЗВ1НК1/Ь ГЫХ31БКАОВ БНЕКУНЗНИК ТМАЗБРНЕРР 1УАКЕ1УАЗС 1101 БКС2ЕКСЕАМ НООТОСЗРСХ ндЬАСТВЬВО КУХЕУАУНУА ЗСУХЕАЕУГР 1151 ΑΕΤΟ0ΒΤΑΥΡ ЬЬКЬАОКНРУ КУУНГАНЯЗЫ РТЗААУКААС НИАИЮ0ЕГЙ 1201 хрунрозооу уазмкквекк ивоукооде нектауомау рхныркексо 1251 ΙΘΟΥ8ΑΟΒΚΙ ХПХХАТОЩТ КВЬдкдХТК! даПРВУУУГОЗ ВОР1ИКОРАК 1301 ЬЕНКОЕОАУУ ЮЛНбОХКУУ РВККАК1ЕЯБ УСК0МАСВБС УАОВООЕБЯЗ 1351 моакнзковх УОНРЕХНЕНМ ЯВДРАААРОУ САУЗдОЬОКН ЯА1ТЗЗН1ЫЫ 1401 РЗСУНЬВАОЕ ЕЕЕУЯГРУЕР ОУРЕВРМТУК (ЗАРБЕЗНРЕК ЕКОО1ЛОЕ1У 14 51 ЗПКЯдВХЕОЕ ИУУНТООУРР БИОНУТРЯРЯ УНУРЕТРОНС РКБУРМЕРБЕ 1501 УЕКАТЕСЕНН ЗЕЕКР1С0Н0 МББЕЕКЕУЫ НКРБЗВЕАЕК НКАОЕЬНРЕГ 1551 УКПС
ЗЕО Ю ΝΟ: 5:
акдадддкда кддадаксса дсддааскдс садеассьдс едадэедддд 51 саксакдасс скдддсаСда скаксасскд садсассдсс двсаассСдС
101 дддкдассдС дсассасддс дСдссСдкдк ддададаедс сдадассасс 151 ссдссскдод ссадсдасдс сааддсскас адсассдада адсасааедс 201 дкдддссасс сасдсскдсд сдсскасода ссссаассск саддадаксс 251 ссскддвсаа сдСдассдад дадССсааса сдкддаадаа саасакддкд 301 дассадакдс асдаддасяк сассядсскд кдддассада дсскдаадсс 351 скдсдкдсад скдасссссс Сдкдсдкдас сскдааскдс адсаасдсса 401 дадкдаасдс сасссссаас сссассдадд асадддаддд сасдаадаас 451 едсадсССса асаедассас сдадскдсдд дасаадаадс адеаддСдСа 501 садсссдсес Саесддседд асаСедадаа даСсаасадс адсаасааса 551 асадсдадка ссддскддкд эассдсаака ссадсдссяк сасссаддсс 601 кдесекаадд кдасекксда дсссассссс акссаекаск дсдсссскдс £51 сддскксдсс аксскдаадк дсаасдасас сдадкксаакддсассддсс 701 сскдсаадаа кдкдадсасс дкдсадкдса сссасддсак саадсссдкд 751 дкдкссассс адскдеьдоь даасддсадс скддссдада дадаадкдод
- 31 021391
801 даСсаддадс дадаасаьсд ссаасаасдс саадаасасс
851 Ссдссадссс сдСдаадаСс аассдсассс ддсссаасаа
501 аададсСаса дааСсддссс Сддссадасс ССсСасдсса
Э51 дддсдасаес адасаддссс асСдсаасдС дСссаддасс
1001 асасссСдад асЪддеддсс аассадсСдс ддаадсассс
1051 ассаесаесс Ьсасеаасад садсддсдда дасссддада
1101 садсССсаае СдСддсддсд адССсССсЪа сСдсаасасс
1151 СсааСадсас ссддассасс алсаасасдс аддадЬссаа
1201 аасддсасса Ъсассседсс седосддаСс аадсадасса
1251 дсадсдсдсд ддссаддсса Сдсасдсссс СсссаСсдад
1301 дссдсдадад саасаСсасс ддссСдаЬсс Сдассадада
1351 аасааьсссд ссаасдадас сСесадассс ддсддсддад
1401 саасСддсдд адсдадсСдЬ асаадСасаа ддеддСдаад
1451 сдддсдсддс ссссассада дссаададаа дадсддсдда
1501 ададссдСдд дсаСсддсдс сдСдСССсСд ддсССссСдд
1551' аСсСасааСд ддадссдсеа дсаСсасссС дассдсдсад
1601 сдссдадсдд сассдСдсад садсададса асссдссдад
1651 дсссадсадс адсСдсСдаа дсСдасадСд СддддсаСса
1701 ддссадддСд седдссдСдд ададаЬаесс дадддассад
1751 дсасссдддд сСдсадсддс аадсСдаСсС дсассассаа
1801 ааСадсадсЬ ддадсаасаа дадсЬасдас дасаСсСддс
1851 сСддсСдсад Сдддасаадд адаСсадсаа сСасассдас
1901 дссСдаСсда ддададссад аассадсадд адаадаасда
1951 сСддсссСдд аеаадСдддс саассЬдСдд аасСддССсд
2001 дСддесдСдд Саса СсадаЬ еССда
ЗЕО ГО ΝΟ: 6:
МКУМЕКЗНМС 0НЫЛИ31М1 1ЛМШСВТА ΚΠ,ΗντνΥΥΟ
ЬРСАЗПАКАУ ЗТЕКЮТУМАТ НАСТРТОРНР 0Е1Р1Л)ЫОТЕ
101 БОМНЕБПЗЪ ГООЗЬКРОЛ} ЬТРЬСЭТЪНС ЗНАКУНАТРН
151 СЗГНМТТЕЬК БККЮУУЗЬГ УКЬОХЕКХИЗ ЗННВЗЕУКЬУ
201 ΟΡΚνΤΡΒΡΙΡ ХНУСАРАОЕА ХЬКСТГОТЕРЫ ОТОРСЮТВТ
251 νβταϋΐ,ωΐαβ ьаекеук!КЗ εηιαηηακηχ χνοΡΑβρνκι
301 ΚβΥΚΪβΡβΟΤ ΡΥΑΤΒίνΟΕΙ ЙОАНСНУЗЙТ ЮШНТЫгЬУА
351 тпгатзеоо бьбхтткзог οοοερρυοντ аеьрнетитт
401 ВСТХТЬРСКХ ΚΟΙΙΚΗΗΟΚν 30ΑΜΥΑΡΡΙΕ ανΙΕ0Ε3ΝΧΤ
451 НН8АИЕТРНР (ΜΟΟΙΚΒΝΗΚ δΒΒΥΚΥΚννΚ ΙΕΡΙΧΤ/ΑΡΤΡ
501 КАТС1САУГЬ СГЬЗААаЗТМ ОААЗХТЬТУО ΑΚ(2ΙΛ50ΐνθ
551 АОООЬЬКЬТУ ΗβΙΚΟΙΟΑΚν ЬАУЕКУХЛОО С)ЬЬС1НОСЗ<3
601 Η55Η3ΝΚ3ΥΟ Б1И0НМТНЬ0 ΗΟΚΕΙ3ΝΥΤΟ ПУЗЫЕЕЗО
651 ЬАЬОКНАКЬН ИИРОХЗКМЬИ ΥΙΕ3 аСсдСдсадс сааСасссдд ссдасаесдс дасСддааса садсаасаад ссассассса
СссддссСдС сдасассадс
СссддасдСд ддсдЬдаССс
Сддсддсаас асасссддда аСсдадсссс дсдддадаад дадссдссдд дссадасадс адссаСсдад адсадсСдса садсСссСдд сдСдсссСдд адаасасдас ассаСсСаса дсаддасссд асассадсаа νρνΜΚΟΑΕΤΤ ΕΡΗΜΗΚΝΗΚν ЗТЕОКЕСМКН НСВТЗАХТОА νοστΗοικρν ΝΟΙΡΡΝΝΝΤΚ НОЬКЮГРЗНК ΝΗΜΟΕ3ΝΟΤ3 оыьтмхзан АККЮЛГЕВВК 023НЫ.КА1Е КЫСТТЫУРИ НОвЕКИЕОБЬ
ЗЕО ГО N0: 7:
асдааадСда аддадассад даадааССаС садсасссдс ддадаСдддд 50 сассаЬдсЬс сссдддаьдс СдаСдаСсСд СадСдссдса даасааССдС 100 дддСсасадС сСаССаСддд дСассСдСдС ддааадаадс аасСассасС 150 сСасссСдСд сассадасдс сааадсасас даСасададд сасасаасдс 200
ССдддссаса саСдссСдСд сасссасада ссссаассса саадаадсад 250
СаССдддааа СдСдасадаа ЬаССССааса СдСддааааа СаасаСддСа 300 дассадаСдс асдаддасас аассадссса СдддаСсааа дсССдаадсс 350 асдСдсаааа ссаассссас сссдсдссас сссадассдс дасдасдсда 400 аСассасСаа СадСасСасС ассасСадСа аСддССддас аддадаааСа 450 аддаааддад аааСаааааа сСдсСсСССС ааСассасса саадсаСаад 500 адаСааддСС сааааадааС аСдсасСССС ССаСаассСС даСдСадСас 550 сааСадасда сдасаасдсс ассассаааа аСаааасСас садааасссс 600 аддссдасас ассдСаассс сСеадСсаСд асасаддссС дсссаааддс 650 аСсасССдаа ссааССссса СасаССаССд СдссссддсЬ ддСЬССдсда . 700
ССсСда'адСд Саасаасаад асдсссдасд дааааддасс эсдсасаааС 750 дСсадсасад СасааСдСас асаСддааСС аддссадСад СдСсаасСса 600
- 32 021391 асЬдс+дееа ааСддсадгс садсадаада ададдгадуа ахсадасссд 850 асааЬЕЬеае ддасааЬасс аааассаЪаа еадеасадсЬ дааЬдаассЬ 900 деадсааЪСа асбдеасаад асесаасалс аасасаадаа ааддьаьаса 950 сасаддасса дддададссс сеъасдсадс аадаааааса асаддадаса 1000 Ьаадасаадс асаССдеаас сЬЬадЬадад еаеааЬддаа ЬааеасЬССа 1050 ааасадаСад ЬЬаЬааааЪб аададааеас ЕССдддааЬа ааасаасааа 1100 аСССааСсаа СссСсаддад дддасссада аассдсаадд саСадССССа 1150 ассдСддадд ддааССЕССс СасСдСдаСа саасасаасЕ дСЕЕааЕадЕ 1200 асСЕддааЕд дСасСдаадд ааасаасасс дааддаааЕа дсасааЕсас 1250 асссссаСдЕ адааьаааас аааЕЕаЕааа сасдЕддсад даадСаддаа 1300 аадсааЕдса Едсссссссс аСсддаддас ааассадаЕд сссассааас 1350 аеСасадддс СдсСаСЕаас аададасддс ддсассдаад ддааСдддас 1400 ададаасдад асададассс ссадассЕдд аддаддадас асдадддаса 1450 ассддадаад Сдаассасас ааасасааад садсаааадс Едаассаеса 1500 ддадсадсас ссассадддс ааададаада дСддСдсада даСаа 1545
ЗЕО 10 N0: 8:
ΜΚνΚΕΤΚΚΝΥ аНЬНВНСЗТМЬ ЬОМЬШСЗАА ЕОЬИУТУУУЗ УРУМКЕАТГТ 50 ЬРСАЗОАКАУ ОТЕУНКУИАТ НАСУРТОРМР ОЕУУЬОНУТВ УРНИНКЮГМУ 100 П0МНБП1151* НЛОЗЬКРСУК ЬТРЬСУТЪОС СЕУиТШЗТТ ΤΤ5Η0ΗΤ0ΕΙ 150 ККОЕ1КЫС5Р ΜΙΤΤΒΪΕΠΚν ОКВУАЬтЬ ϋννΡΙΟΠΟΝΑ ΤΤΚΝΚΤΓΚΝΡ 200 ЯЫНСНЗЗУМ ТОАСРКУЗРЕ Р1Р1НУСАРА ОЕАНЖСНМК ТЕООКОЬСТИ 250 УЗТТОСТНСП НРУУЗТОЬЬЬ НЗЗЬАЕЕЕУУ ΙΗ30ΝΓΜ0ΗΤ КТИУОЬНЕЗ 300 УАШСТНИМ НТВКС1Н1СР СЙАРУДАНК1 ЮП1ОДАКС1Т ЬЗЙАОИШТТЬ 350 КОГУТКЬКЕН ΡΟΝΚΤΙΚΓΝΟ 33000ΡΒΙ УН КЗРМСООЕРР УСПТТОЬРЫЗ 400 ТНЮТЕСИОТ БОН5Т1ТЬРС ЯХКОНГООД ВУОКАНУАРР КЗС01ЙСЗЗ» 450 ГОЗЬЫгТКОО ОТВОЫСТЕИЕ ΤΕΙΡΗΡΟΟΟΟ ΜΗϋΝΗΗΕΕΕΥ КУКУУКУЕРЬ £00 ОУАРТКАККК УУОН 514
ЗЕО ΙΟ ΝΟ: 9:
аСдсаСсаса сддссдсдСс сдаЪаасССс садсСдСссс вдддСдддса дддаЬЬсдсс 50 аСЬссдаЪсд ддсаддсдаС ддсдаСсдсд ддссадаСсс д&СсдддСдд ддддСсассс 120 ассдССсаЬа СсдддссСас сдссЬЬссСс ддсСЬдддСд ъсдссдасаа саасддсаас 190 ддедсаедад СссаасдсдС ддссдддадс ^сСссддсдд саадЬсСсдд саесЪссасс 240 ддсдасдсда ссассдсддс сдасддсдсс ссдаСсаасС сддссассдс даСддсддас 300 дсдсССааед ддсаСсаСсс сддСдасдСс аСсСсддЬда ссЬддсааас саадесдддс 360 ддсведсдСа саддда&едъ дасаССддсс дадддасссс сддссдааСЬ саСддСддае 420 СССддддсдС ъаесассдда дассаасссс дсдаддасдс асдссддссс дддсссддсс <во ъсдсСддЬдд ссдсддсъса даЪдЬдддас адсд^ддсда дСдассСдСС ъъсддссдсд 540 Ьсддедьсъе адгеддьддъ сЬддддес^д аеддсддддъ сдеддаьадд ььсдьсддсд 600 ддСсЪдаЬдд Ъддсддсддс сЬсдссд±аЪ деддсдЬддя едадсдесае сдсддддсад 660 дссдадсьда ссдссдссса дд^ссдддХХ дс^дсддсдд ссЪасдадас ддсдСа&ддд 720 сЬдасддедс ссссдссддЬ даЪсдссдад аассд^дсСд аасЪдаСдас ссгдаБадсд 7во асеааесесе еддддсаааа сассссддсд аьсдсддьса асдаддседа аъасддсдад 94 о аЬдСдддесе аадасдссдс сдсдяЬдСЪС ддсСасдссд сддсдасддс дасддсдасд 900 дсдасдЬЬдс ъдеед^ьсда ддаддсдссд дадаЪдасса дедсдддедд дсССССсдад 960 саддссдссд сддссдадда ддсссссдас аесдссдсдд сдаассадСС дасдаасаас 1020 дЪдссссадд сдсЪдсаасв дсЪддсссад сссасдсадд дсассасдсс ^ЪсЬЬссаад 10Θ0 сСддд^ддсс ЪдСддаадас дд£с&едссд еаСсддСсдс еда^садсаа еаСддСдесд 1140 асддссааса ассасаСдСс дасдассаас ьсддд€дСд€ сдаЪдассаа сассьсдадс 1200 ЬсдасдЪЪда адддсЪЬСдс сссддсддсд дссдсссадд ссд&деааае сдсддедеаа 1250 аасддддссс дддсдаьдад сссдссдддс адсгсдссдд дсссессддд ессдддсддс 1320 ддддеддссд ссаас&еддд ьсдддсддсс есддесддСС сд€СдссддС дссдсаддсс изо Сдддссдсдд ссаассаддс адссассссд дсддедсддд сдссдссдсс дассадсссд 1440 ассадсдссд сддааададд дсссдддсад асдсгдддсд ддссдссддс ддддеадасд 1500 ддсдссаддд ссддсддсдд дсссадСддс дСдсСдсдСд ССссдссдсд асссСаСдСд 1560 аьдссдсаСС сСссддсадс сддсдаСаСс дссссдссдд ссЪЩСсдса _ддассдсССс 1520 дссдасССсс седсдссдсс ссссдасссд СссдсдаСдд СсдсссаадС ддддссасад 1690 дсддСсааса Ссаасассаа аседддсСас аасаасдесд Сдддсдссдд дассддсаес 1740
- 33 021391 дЕсаЕсдасс ссаасддЕдЕ сдедсЕдасс аасаассасд ЕдаЕсдсддд сдссассдас 1000 аЕсааЕдсдЕ есадсдЕсдд ссссддсеаа асесасддсд ссдасдсддс сдддеасдас 1В60 сдсасссадд асдссдсддс дсЕдсадсЕд сдсддСдссд дЕддсссдсс дЕсддсддсд 1030 ассддЕддсд дсдЕсдсддЕ сддедадссс дЕсдЕсдсда сдддсаасад сддсдддсад иго ддсддааодс сссдСдсддЕ дссЕддсадд дЕддЕсдсдс Ссддссааае сдСдсаддсд 3040 ЕсддаЕЕсдс ЕдассддЕдс сдаададаса ССдаасдддЕ ЕдаЕссадсЕ сдаЕдссдсд 2100 асссадсссд дСдасдсддд сдддсссдЕс дссаасддсс СаддасаддЕ ддЕсддСаЕд 2100 аасасддссд сдЕссСзд 217в
ЗЕО ГО N0: 10:
мннтаазоир оъзоосоорд ιριοοαμαια сохкзооозр тунюртарь оизалгомнон бо ОАКУОКУТОЗ АРААЗЬСНЗТ ΟΟνίΊΑνΟΟΑ ΡΙΝ3ΑΤΑΗΑΒ ДЬНОННРОРУ I3УТНфТКЗО 120 ОТКТОНУПЛ ЕОРРАЕРМТО РОАЬРРБИГЗ АККУАСРОЗА ЗЬУАААОМНО ЗУА5РЬР5АА 180 ЗАРфЗУУНбЬ ТУОБНЮЗЗА вЬИУАААЗРУ УАНМЗУТАО0 АЕЬТАДОУКУ ΑΑΑΑΥΕΤΑΥΟ 240 ЕТУРРРУ1АЕ НЕАЕЬМГЫА ТНЫЛОНТРА 1АУНЕАВУОЕ МНАОТАААМР ΟΥΑΑΑΤΑΤΑΤ 100 АТЬЬРГЕЕАР ЕМТЗАОСЬЬЕ ОАААУЕЕАБО ΤΑΑΑΗΟΕΜΝΝ УРОАЦЗОЪАО РТОСТТРЗЗК 360 ЬОСЬИКТУЗР НЙ8Р15НМУ5 ΜΑΜΝΗΜΕΜΤΝ ЗСУЗМТНТЬЗ ЗМЬКОРАРАА ΑΑΟΑνΟΤΑΑΟ 420 ИСУКАИЗЭМ ЗЗЬОЗЗОЬОЗ ОУААИЛКАА 8УС8ЬЗУР0А НАААН0АУТР ААКАЬРЬТЗЬ 480 ГЗААЕЕОРОО МЬСОЬРУООМ ОАЯАОЗОЬЗО УЬКУРРЕРУУ НРНЗРААСО1 АРРАЬЗДОКР 640 АОРРАЬРЬОР ВАМУАОУОРО ννΝ1ΚΓΚΙΧ3Υ ΝΗΑνΟΑΟΤΟΙ УЮРНСЗУУЬТ ЫННУ1АОАТО 600 1НАГЗУ<ЗЗОО ΤΥανονναΥΌ КТДОУАУЬОЬ НОАСаЬРЗАА ПЗООУАУОЕР УУАНСНЗООО 660 СвТРКАУРбВ УУАЬСОТУОА ЗПЗЬТСАЕЕТ ЬНСЫОРПДА ЮРСОАСОРУ УНаЬООУУвМ 320 ΝΤΑΑ8 72 5
ЗЕО ГО N0:11:
аЕдаЕдадаа аасЕЕдссаЕ ссЕсадсдЕс адсЕсЕЕЕсс ЕдЕЕсдЕдда 50 ддсссЕсЕЕс саддадЕаЕс адсдссасдд аадсадсадс ааЕасааддд 100 ЕссЕдаасда дсЕсаасЕаЕ дасаасдсЕд даасдаассЕ дсаЕаасдад 150 сЕддадаЕда асЕасЕаЕдд саадеаддад аасЕддЕаЕа дссЕдаадаа 200 даасадссдд ЕсссЕдддсд адаасдасда сддсаасаас аасаасддсд 350 асаасддсад ддадддсааа даСдаддаса ададддасдд даасаасдад зоо даЕаасдада адсЕдсддаа дсссаадсас аадааасЕса адсадсссдс 350 сдасдддаас ссддасссса асдсааассс саасдссдас ссааасдсаа 400 асссЕаасдЕ ддаесссаас дссааЕссса асдЕсдаЕсс ЕааЕдссааЕ 450 есааасдеса ассссаасдс аааЕссЕааЕ дсааасесса асдссааЕсс 500 Еаасдссаас ссаааСдсса асссааасдс саасссеаас дссаасссаа 550 асдсааассс сааЕдсЕаас ссааасдЕдд ассссаасдс Еаассссаас 600 дсааасесса асдссааЕсс Еаасдсааас сссааЕдсаа асссааасдс 650 ааассссаас дсЕаасссЕа асдсааассс саасдссаас ссСааЕдсса 700 ассссаасдс Еаассссаас дссаасссаа осдсаааЕсс ааасдссаас 750 ссааасдсаа ассссаасдс ЕааЕсссаас дссаасссаа асдссааЕсс 800 Еааеаадаас аассадддса асдддсаддд ссасаасаЕд ссдаасдасс 850 сЕааЕсддаа сдЕддасдад аасдссаасд ссаасадсдс сдЕдаадаас 800 аасаасаасд аддадсссЕс сдасаадсас ассааддааЕ ассЕдаасаа 950 даЕссадаас адЕсЕдадса ссдадЕддЕс ссссЕдсссс дЕдассЕдсд 1000 дсаасддсаЕ ссаддЕдадд аЕсаадсссд дсЕссдссаа саадсссаад 1050 дасдадсЕдд асЕасдссаа сдасаЕсдад аадаадаЕсЕ дсаадаЕдда 1100 даааЕдсадсЕ сЕдЕдЕЕсаас дЕсдЕдаа сЕссдссаЕс ддссЕдЕда 1149
ЗЕО ГО N0: 12:
ММККЬАШЗУ ЗЗРЬРУЕАЬР ОЕУОСУОЗЗЗ НТВУЕЛЕЬНУ БНАОТКЬУНЕ 50
ЬЕННУУОКОЕ ННУЗЬККНЗП ЗЬСВтДОЯН ΗΝΟΟΝΟΒβΟΚ ΟΕΟΚΚΜΝΝΕ 100
ΌΗΕΚΕΚΚΡΚΗ ХХЫСОРАЮЗЫ ΡΟΡΝΑΗΡΝνΟ РНАНРВУСРН АЫРНТОРНАН 150
ΡΗΑΝΡΝΑΝΡΝ ΑΗΡΝΑΗΡΝΑΝ ΡΗΑΜΡΒΑΜΡΝ ΑΗΡΝΑΗΡΝΑΝ ΡΝνΕΡΝΑΗΡΝ 300
ΑΗΡΝΑΝΡΝΑΝ ΡΝΑΝΡΝΑΗΡΝ ΑΗΡΝΑΗΡΝΑΝ ΡΗΑΗΡΝΑΝΡΝ ΑΝΡΝΑΜΡΝΑΝ 250
ΒΗΑΗΡΝΑΗΡΝ ΑΜΡΝΑΝΡΜΚΝ Л0СМХ}ОНИМ_РЫОРЫН1ГЛЗЕ-НАЫАЫЗАУКЫ---800
ΝΜΝΕΒΡ8ΒΚΗ 1КВУШК10Я ЗЬЗТЕИЗРСЗ УТСОЫОЮУК ΙΚΡΟ3ΑΝΚΡΚ 350
ΌΕΙ,ϋΥΑΜΙΙΕ КК1СКМЕКСЗ ЗУРНУУЫЗА! ОЬ 3 82
- 34 021391
ЗЕО Ю ΝΟ: 13:
асдаеддсЕс ссдаЕссЕаа ЕдсаааЕсса лаСдсааасс сааасдсааа 50 ссссааЕдса ааЕссЕааЕд сааассссаа ЕдсаааЕсеЕ ааЕдсаааЕс 100 сЕааедссаа ЕссаааЕдса ааЕссаааЕд сваасссааа сдеааасссс 150 ааедсаааЕе сЕааедссаа сесаааЕдеа ааЕссаааЕд сааасссааа 200 Едваааесса ааЕдсаааес ссааЬдсааа ЕссЕааЕааа аасааЕсаад 250 дСааЕддаса аддЬсасааЬ аЕдссаааЕд асссааассд аааЕдЕадас 300 дааааЕдсСа аЕдссаасад ЕдсЕдЕаэаа ааСааСааЕа асдаадаасс 350 аадЕдаЕаад сасаЕаааад ааЕаЕСЕааа сааааЕвсаа ааЕЕсЕсЕЕЕ 400 саасЕдаасд дЕссссаЕдЕ адсдЕаасЕЕ деддааасдд ЕаЕссаадсс 450 адааЕааадс сЕддсЕсЕдс ЕааЕааассЕ ааадаедааЕ ЕадаЕЕаЕдс 500 аааЕдаЕаЕЕ дааааааааа ЕЕЕдЕаалаЕ ддаааааЕдЕ ЕссадЕдЕдЕ 550 ЕЕааСдЕсдЕ ааасадссса аЕаддасСад ддссЕдсдас дааеасддад 600 аасаСсасаС саддаССссС аддассссСд сСсдСдЕСас аддсддддСС 650 СЕЕсЕЕдЕЕд асаадааЕсс ЕсасаяЕасс дсададЕсЕа дасЕодЕддЕ 700 ддасЕЕсЕсЕ сааССЕЕсСа дддддаЕсас ссдсдЕдссЕ ЕддссааааЕ 750 СсдсадСссс саассЕссаа ЕсасЕсасса ассСссЕдСс сЕссааЕЕЕд 300 ЕссЕддссаЕ сдсЕддаЕдЕ дЕсЕдсддсд ЕЕЕЕаЕсаЕа ЕЕссЕсЕЕса 350 ЕссЕдсЕдсЕ аЕдссЕсаСс ССсСЕаССдд ЕЕсЕЕсЕдда ЕЕаЕсааддЕ 900 аЕдЕЕдсссд ЕЕЕдессЕсЕ аасЕссадда Есаасаасаа ссааЕасддд 950 ассасдсааа ассСдсасда сссседссса аддсаасЕсЕ аЕдЕЕЕсссЕ юоо саЕдЕЕдсЕд ЕасаааассЕ аоддаЕддаа аЕЕдсассЕд СаЕСсссаСс 1050 ссаесдЕссе дддсЕЕЕсдс ааааЕассЕа ЕдддадЕддд ссЕсадЕссд 1100 ЕЕЕсЕсЕЕдд сссадсЕЕае садсдесаЕс ЕдссеадЕдд ЕЕсдЕадддс 1150 ЕЕЕсссссас ЕдЕЕСддсЕС ЕсадсЕаЕаЕ ддаЕдаЕдЕд дЕаЕЕддддд 1200 ссаадЕсСдЕ асадсаЕсдЕ дадСсссЕЕЕ аСассдсЕдЕ ЕассааЕЕЕЕ 1250 сСЕЕСдЕсЕс ЕдддЕаЕаса ЕЕЕаа 1275
ЗЕО Ю ΝΟ: 14:
ММАРОРНА17Р НАЫРКАКРНА НРНАКРНАНР ΝΑΝΡΝΑΝΡΝΑ НРНАНРНАДР 50 ΝΑΝΡΝΑΗΡΝΑ ΝΡΝΑΝΡΝΑΝΡ ΝΑΝΡΝΑΝΡΝΚ НИОО№ЭД(ЗНН МРЫОРНРИУО 100 ЕНАНАЫЗАУК ЫККНЕЕРЗОК. Н1КЕУШК1<3 ЫЗЬЗТЕИЗРС ЗТ1СОТ(31<ЭУ 150 ΗΙΚΡ33ΑΝΚΡ ГОЕЬПУАНМ ЕКК1СКМЕКС ЗЗУГЩП/ИЗЗ КЗЬОРТТНМЕ 200 ЩТЗдРЬОРЪ ПОКОРИЛ ТЙ1ЬТ1Р03Ь ЦЗННТЗЬНРЬ ЗСЗРТСЬОдН 250 303ΡΤ3ΝΗ3Ρ ТЗСРР1СРЗУ КНМСЫКГН РЬРХШСЫ ГЫОУЫЛУОО 300 МЬРОСРЫРС ЗТТТЯТОРСК ТСТТРАООИЗ ИГРЗСССТКР ТКЛ»СТС1Р1 350 РЗЗНАГАКУЪ ИЕНАЗУНРЗН ЬЗЫЛТРРОфИ ГТСЬЗРТУМ. ЗА1ИМММУИО 400 Ρ3ϋϊ3ΙνβΡΡ 1РЬЬР1ЕТСЬ ΜνΥΙ 424
ЗЕО ΙΟ ΝΟ: 15:
аЕддЕсаЕЕд ЕЬсадаасаЕ асадддсеаа аЕддЕссасс аддсааЕЕад 50 ЕссдсдаасС СЕЕааЕдсаЕ дддЬдааддЕ сдЕддаддаа ааддсасЕсЕ 100 ссссддаддЕ саЕЕссдаЕд ЕЕЕЕсЕдсдс ЕаЕсЕдаддд сдсаасдссд 150 саадассЕЕа аЕассаЕдсЕ ЕаасасддЕа ддсдддсасс аадссдсЕаЕ 200 дсаааЕдеЕа ааададасЕа ЕааасдааЗа ддссдссдаа ЕдддаЕодад 250 ЕдсасссддЕ дсаодссддс ссааЕЕдсас саддссадаЕ дсдсдадссд 300 сдсдддЕсЕд аЕаЕЕдсадд аасЕасдЕеЕ асссЕЕсадд адсадаЕЕдд 350 дЕддаЕдасЕ аасааЕссас сааЕсссддЕ сддададаЕс ЕаЕаададдЕ 400 ддаЕсасасс дддасЕааас аадаЕадссс дсаЕдСаЕЕс ЕссдасЕЕсс 450 аеассддаЕа Еасдссаадд сссаааддад ссдЕЕсаддд ассаЕдЕсда 500 ссдаЕЕсЕаЕ аадасссЕЕс дсдсададса ддсаЕсссад даддЕсаааа 550 ассддасдае адаааеЕсЕЕ ЕЕддЕдсада аЕдсдааЕсс ддаЕЕдЕааа 600 асааЕЕЕЕаа аддсСсСадд ассддседса асдоЕадаад адаЕдаЕдас 650 ддсЕЕдЕсад ддадЕсддЕд дассддддса еааадессдс дЕсЕЕасаса 700 ЕдддсссдаЕ аЕсЕссдаЕа дааасадЕЕЕ сддЕсаадсЕ Еааассаддд 750 аЕддаЕддос саааддЕсаа дсадЕддссд сЕаасддаад адаадаЕЕаа 600 ддсдсседЕа- дадаЕЕЕдса СЕдаааЕдда дааддааддс аадаЕаадса 650 адассдддсс ададаасссд ЕасааЕасас сддЕаЕЕЕде ааЕааадааа 900
- 35 021391 ааддаСЬсаа оааааСддсд дсдаасссаа дасССПЬддд дьсьааадаа даадааассд СССадедСас сдсСедаСда ассдадсаСа аасааСдааа Сеседсаддд сСддаадддд аааасаесед аассасСссд асасаСддас даьсСсСаЬд дсаесаадае едаддаасСд аессссдаса адаадсасса сдадесесас ссддаеаадс аддаСССССд дассдСаааС СдддссСсСс адаСССаесс ассдадддда ассааддссс сададсССда дсСддсадад ддддСаСасС асдассссСс ддддсадддс сааСддасде СдаадасСдд даадсасдсд аадсаассса сддаадсадс аСддддсаад аесссааадС ааасаСддСд дасСдааЬаС СССдСсааса сдссдссасС дссдаСадСа ддддсадада ааасдаадсС аддсааддсд дСсдСаассс ССасддасас сСассССдеа сССсаддаСа сссаасаедс дссСддсасс дадсССдСаа ассаааСааС Сседдсссдд дСссссдссс аеаадесадС садсдссддд СддСсеаадС сеадсдСадС асдсдссдаа ссадссдсад адаадсаодд ддсСаСаасЪ сдсдсвсддс садаадссса сссссаддсд ссдееааддс сСсасССссС Сааддадааа аддодасадд аСаССсССда еесддассдд садаассаса сссссдддсд дсдссасааа даддссааса адддсдадаа сдддасддас дасссадаае даессдедсс ссаесасдСа аассдссдсс сааСдддсдс адаСсдаедд даааадаСае адсЬСаадса саССдСдСдд аасссаддсс СдсССдадас дсСасадссд адсссасада аСассдСсдс дасссссеас ассааададд сссесдаСаа дааддсссад саддссдссд аааасСасеа а
ЗЕО Ю N0: 16:
МУТУОН 10*30 КУН0А18РКТ ООЬНТМЫГПГ ООНОААМОМЬ ЕОЗШАОТТЗ ТГЮЕОПЗИМТ 1ьо1восрке рряоууввру ТЗЬКАЫЗРАА ТЕЕЕММТАСО МПСРКУКОНР ΕΤΕΕΚΙΚΑΙΛ* КРЗГКИНКЬУ ЕРВЕЫЖЯТО ааадсссдса аадсссаасс дСсасадСсс ддасССссд* сдссаддсаС ссессддсда ааадсадааС
СдддсСсдда аддсаасасс дааддадссд ддасадсаса даСаССсада аддсаССаад саасададдс ааСсдсдааа сааддасссс ассадасаса сдсаСдсдад асаааадасс
СсаадсСдсс
СддсаадсСа сдесаадссс ссССсЬаСдС ддаСасдСда сассааСсад дСддссСада асссаадсдс адаасадеСС асаадддаас аССсдсаадд сддссддссд асддсдсддд
ЕссадЕаа.са адаададдаа едаедассСа ддддддсСдд сссдсддасе ссссддддсс ссадссссад сасССсСсСС дададдСССС дсасдсдадс садддссадЕ десСасдесс дееСеесдсд дадСдааддс седдеадеда
ЕдсдЕЕсаЕс аассдаддад ссдасассдд
ЬИАНУКУУЕЕ
ΚΕΤΙΝΕΕΑΑΕ
ΝΝΡΡΙΡνΟΕΙ
КТЬКАЕОАЗО ανααρσΗΚΑΗ
Е1СТЕМЕКЕС
ΒΡΗΕνβί,αΐΡ дассссаддд адддаСсеса
СддасдСадд аадсасасед
ЕсдсЕаЕсад сасеесадад ссддаСаСсд сссадааасс сдесссдаед ссдссссеаа дссдасадсд аасЕадЕсдд дСссдасадс сассссасса
ССсССаадда аеадссдада есаадаассд дддсСсаСас ассасЕдадЕ саСасадаад ссСддаССсс еддеассадс сдасддсдсс ссаасадддд аадасСдаас ддСсаасаСа адссадаеса аСааадааад
ЕддсддсааЕ
ЕЕсЕЕдсдаЕ ас&дессдсд ддсадсдссс сддсддсдас даадсадддс еааддеадсд адддсЬСаас еассаеассс аддсдедсдс сддаасссда сЕЕсасссдд адааЬддадд сдсаессада дСасССадСд ддддддеаад аасЬЕдадсд
ЕдЕаддсааа ддадсЕЕсдЕ аасдааССда даасадааеа дсасадсавс аассааасаа саСсеадссд адасдсаеаС сдессасСас
ЕасааедЕдс есдсасдаса
СааСССасса дддсадсаСс дддссССасе адасдддсса ссдсесдааа саадсССаас
СССдсаадсС асддаддаад десддСдсас
Ессадаадса
ЕЕЕаадааЕс
СааСдаедСа
ССаССдСдаС дааасаСддд адааСдддаа
ССдаааадда дсдааСсдсд ссдееаааад
ЕаеаадсдаЕ дСсасддасС аадсдааадс адааддЬаСа дадсаадСдд ддддддсаад адсдеаСдсд адддассСдд даасдссдса
ССссддСаас дсддасессс есасадссад аддддсассс
СаессссСда сааддЕсдаа саадсссдса
ССсдасСсСс аСаСССсаад дсддадаасС аадаадсаса аССсдсадСд ссссддддса адСсСССаСа ааСаааддаС адесдааааа саддедСссс
9Е0 юоо
1050
1100
1150
1200
1250
1300
1350
1400
1450
1500
1550
1500
1650
1700
1750
1000
1850
1900
1950
2000
2050
2100
2150
2200
2250
2300
2350
2400
2450
2500
2550
2600
2650
2700
2750
2900
2950
2900
2950
3000
3050
3100
3150
3200
3250
3300
3350
3400
3411
КАР5РЕУ1РИ
ТОЗНУНРУНАО уккиньоеы
ЕАТдаНМТЕТЬ
УЬНН0Р1ЭР1
ΧΪ8ΚΚ3ΡΕΝΡ
НРАЗЕКХККЗ
ГЗАЬВЕвАТР
ΡΙΑΡΟ0ΜΗΕΡ
К1УЯМУ5РТ5 и/днАЫРпск етузукьхро
УЫТРУРА1КК
УТУЕОУСЕАУ
100
150
200 .250
300
350
РЗУРЬОБОРК КУТАШР81 ΗΝΒΤΡΟΙΒΥΟ УМУЬРОСМКС ЗРА1РОЗСМТ 400 К1ЬЕРРВК0М ΡΟϊνΐΥΟΥΜϋ ОЬУУОЗОЬЕ1 С0НЕТК1ЕЕЬ ВОНЬЬВНОЬТ 450 ТИЖКВДКЕР ΡΓΈΚΜΟΥΕΕΗ РОККТУОРТУ ЦРЕКОЗИТУИ ОВДКЬУСЮН 500 ΜΑ50ΙΥΡΟΙΚ УКОЬСКЬЕКО ТКАЬТЕУХРЬ ТВВАВЬВЕАВ ЫВЕ1ЬКЕРУН 550 СУУУОРЗКОЬ ΙΑΒΙΟΚΟΟΟβ ΟΗΤΥφΙΥΟΕΡ ГКЫЬКТОКУА ΚΜΗΟΑΗΤΗΟν 600 ΚΟΙ,ΤΕΑνΟΚΙ ΤΤΕΒίνίΒΟΚ ТРКРКЬРЮК ЕТНЕГИИТЕУ ΗβΑΤΗΙΡΕΜΕ 650 РУНТРРЫ/КЬ ΗΥβΙΕΚΕΡίν САЕТРУТООА АНКЕТКЬСКА ОУУТЫКСЕОК 700 УУТЬТОТТОО КТВЬОА1У1А ЬОВЙОЬЕУ»! УТО50УА1Л31 ЮА0РЭО5Е5 750 ЕЬУНОИВОЬ ΙΚΚΕΚνΥΙιΑΜ УРАНКОЮСЫ ЕОУОКЬУЗАС 1ВКУ1АМСЮК 900 Η8Κ88ννβΝΡ ТУПЕКМРКАЕ РААСИЗУОАА9 ЩЗЬВКНОАГГ 88НТААТЕАА 950 САИЬЕАОЕЕЕ ЕУОГРУТРОУ РЕКРИГУКАА ТОЬЗНРЕКЕК (ЗЭЕЕСЫНЗО 900 ВКООИЛЗЬИ! УНТОЗУРРБН ОНУТРЗРОУВ УРЕТРСНСУК ЕУРУВРСКУЕ 950 ЕАНКОВНТЗЬ ЬНРУЗЕНОМО ОРЕЕЕУЬВИК РОЗКЕАРННУ АИЕЕНРЕУРК ЮОО ИСКРМСАКАЗ уьзаавьояи ЕКУВЬВРООК ККУКЬКНГУИ АЗЕЕЬЕНРАУ 1050 ИРОЕЬБТЗЕС СНОИЛОЪОР ЗЬдТОЗЕВЬВ ЗЬУНТУАТЕУ СУН0Е1Е1ЮЗ 1100 ТКЕАЬВКГВВ В0МК5КККАО ОААДВТОНЗН (ЗУЗОНУ 1136
- 36 021391
Все ссылки, указанные в этом патенте, включая патенты и патентные заявки, включены сюда посредством ссылки в самой полной возможной степени.
Будет понятно, что всем данном описании изобретения и формуле изобретения, которая следует далее, если контекст не требует иного, слово включать и его вариации, такие как включает и включающий, подразумевает включение указанного целого числа, стадии, группы целых чисел или группы стадий, но не исключение любого другого целого числа, стадии, группы целых чисел или группы стадий.
Заявку, часть которой образуют это описание и формула изобретения, можно использовать как основу для приоритета в отношении любой последующей заявки. Формула изобретения такой последующей заявки может быть направлена на любой признак или комбинацию признаков, описанных здесь. Она может принимать форму пунктов продукта, композиции, способа или применения и может включать, в качестве примера и без ограничения, следующие пункты.

Claims (16)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Вакцинная композиция, содержащая (1) один или более чем один первый иммуногенный полипептид, содержащий один или более чем один антиген ВИЧ (вирус иммунодефицита человека), выбранный из Εην, №£, Сад и/или Ро1, или их иммуногенных фрагментов, или их иммуногенных производных; (2) один или более чем один аденовирусный вектор, содержащий один или более чем один гетерологичный полинуклеотид, кодирующий один или более чем один второй иммуногенный полипептид, содержащий один или более чем один антиген ВИЧ, выбранный из Εην, №£, Сад и/или Ро1, или их иммуногенных фрагментов, или их иммуногенных производных; и (3) адъювант, содержащий 3Э-МРБ (3деацилированный монофосфориллипид А) и 0821.
  2. 2. Вакцинная композиция по п.1, где один или более чем один из указанного одного или более чем одного первого иммуногенного полипептида является, по существу, тем же самым или содержит по меньшей мере один антиген, который является, по существу, тем же самым, что и антиген, содержащийся в одном или более чем одном из указанных одного или более чем одного второго иммуногенного полипептида.
  3. 3. Вакцинная композиция по любому из пп.1, 2, где один или более чем один первый иммуногенный полипептид содержит по меньшей мере один Т-клеточный эпитоп и по меньшей мере один Вклеточный эпитоп.
  4. 4. Вакцинная композиция по любому из пп.1-3, где один или более чем один из указанного одного или более чем одного первого иммуногенного полипептида и один или более чем один из указанного одного или более чем одного второго иммуногенного полипептида имеют один или более чем один идентичный В-клеточный и/или Т-клеточный эпитоп.
  5. 5. Вакцинная композиция по любому из пп.1-4, где ни один из одного или более чем одного из указанного одного или более чем одного первого иммуногенного полипептида, по существу, не является тем же самым или не содержит какой-либо антиген, общий с одним или более чем одним из указанного одного или более чем одного второго иммуногенного полипептида.
  6. 6. Вакцинная композиция по любому из пп.1-5, где один или более чем один аденовирусный вектор происходит из человеческого аденовируса или аденовируса примата, не являющегося человеком.
  7. 7. Вакцинная композиция по п.6, где серотип человеческого аденовируса выбран из Άά1, Άά2, Άά4, Άά5, Άά6, Άά11, Άά24, Άά34 и Άά35 и серотип аденовируса примата, не являющегося человеком, выбран из серотипов аденовируса шимпанзе Рап5, Рап6, Рап7 и Рап9.
  8. 8. Вакцинная композиция по п.1, где первый иммуногенный полипептид представляет собой р24КТ-№£-р17 и/или второй иммуногенный полипептид представляет собой Сад-КТ-№£.
  9. 9. Вакцинная композиция по п.8, где один или более чем один первый иммуногенный полипептид и/или один или более чем один второй иммуногенный полипептид содержат Εην.
  10. 10. Вакцинная композиция по любому из пп.1-9, где адъювант дополнительно содержит СрС (цитозин-гуанозиновый динуклеотидный мотив).
  11. 11. Вакцинная композиция по любому из пп.1-10, где адъювант содержит эмульсию типа масло-вводе или где адъювант содержит липосомы.
  12. 12. Вакцинная композиция по любому из пп.1-11, где первый иммуногенный полипептид содержит р24-КТ-№£-р17, адъювант содержит 3Э-МРБ и 0821 в виде препарата с липосомами и аденовирусный вектор содержит вектор на основе серотипа Ран7 аденовируса шимпанзе, содержащий полинуклеотид, кодирующий иммуногенный полипептид Сад-КТ-№£, возможно с оптимизированными кодонами.
  13. 13. Вакцинная композиция по любому из пп.1-12, где один, или два, или все из компонентов полипептида, аденовирусного вектора и адъюванта соединены с фармацевтически приемлемым эксципиентом.
  14. 14. Вакцинная композиция по любому из пп.1-13 для применения при стимулировании иммунного ответа против ВИЧ или для применения при стимулировании продукции ВИЧ-специфичных Т-клеток СЭ4+ и/или СЭ8+ и/или антител у млекопитающего.
  15. 15. Применение вакцинной композиции по любому из пп.1-14 в изготовлении лекарственного сред- 37 021391 ства для стимулирования иммунного ответа против ВИЧ или для стимулирования продукции ВИЧспецифичных Т-клеток СЭ4+ и/или СЭ8+ и/или антител у млекопитающего.
  16. 16. Набор, содержащий (1) один или более чем один первый иммуногенный полипептид, выбранный из ВИЧ-полипетидов Εην, №Г, Сад и/или Ро1, или их иммуногенных фрагментов, или их иммуногенных производных; (2) один или более чем один аденовирусный вектор, содержащий один или более чем один гетерологичный полинуклеотид, кодирующий один или более чем один второй иммуногенный полипептид, выбранный из ВИЧ-полипептидов Εην, №Г, Сад и/или Ро1, или их иммуногенных фрагментов, или их иммуногенных производных; и (3) адъювант, содержащий 30-МРЬ и 0821.
EA200901060A 2007-03-02 2008-02-28 Способ индукции иммунного ответа, вакцинная композиция, ее применение и набор EA021391B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US89271407P 2007-03-02 2007-03-02
PCT/EP2008/052448 WO2008107370A1 (en) 2007-03-02 2008-02-28 Novel method and compositions

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200901060A1 EA200901060A1 (ru) 2010-06-30
EA021391B1 true EA021391B1 (ru) 2015-06-30

Family

ID=39415279

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200901060A EA021391B1 (ru) 2007-03-02 2008-02-28 Способ индукции иммунного ответа, вакцинная композиция, ее применение и набор

Country Status (25)

Country Link
US (1) US20100055166A1 (ru)
EP (2) EP2137210B1 (ru)
JP (3) JP5869206B2 (ru)
KR (1) KR101532062B1 (ru)
CN (3) CN105106971A (ru)
AR (1) AR065523A1 (ru)
AU (1) AU2008223951B2 (ru)
BR (1) BRPI0808553A2 (ru)
CA (2) CA2679410C (ru)
CL (1) CL2008000611A1 (ru)
CY (1) CY1118372T1 (ru)
DK (1) DK2137210T3 (ru)
EA (1) EA021391B1 (ru)
ES (2) ES2609418T3 (ru)
HR (1) HRP20161606T1 (ru)
HU (1) HUE031411T2 (ru)
LT (1) LT2137210T (ru)
MX (3) MX2009009342A (ru)
PE (1) PE20081875A1 (ru)
PL (1) PL2137210T3 (ru)
PT (1) PT2137210T (ru)
SG (1) SG194360A1 (ru)
SI (1) SI2137210T1 (ru)
TW (1) TW200902054A (ru)
WO (1) WO2008107370A1 (ru)

Families Citing this family (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040136963A1 (en) * 2001-06-22 2004-07-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Simian adenovirus vectors and methods of use
SG165153A1 (en) 2001-11-21 2010-10-28 Univ Pennsylvania Simian adenovirus nucleic acid and amino acid sequences, vectors containing same, and methods of use
EP1998804B1 (en) * 2006-03-27 2014-04-16 Crucell Holland B.V. Compositions comprising a recombinant adenovirus and an adjuvant
HUE031411T2 (en) * 2007-03-02 2017-07-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa New Methods and Preparations
US9717788B2 (en) 2007-03-02 2017-08-01 Glaxosmithkline Biologicals Sa Method of inducing an immune response against HIV employing HIV immunogens, adenoviral vectors encoding said immunogens, and adjuvant
US8400408B2 (en) * 2007-06-13 2013-03-19 Apple Inc. Touch screens with transparent conductive material resistors
GB2452958A (en) * 2007-09-20 2009-03-25 Glaxosmithkline Biolog Sa HIV vaccine compositions
CA2707245A1 (en) * 2007-12-06 2009-06-11 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vaccine
MX2011000981A (es) * 2008-07-25 2011-03-02 Glaxosmithkline Biolog Sa Composiciones y metodos novedosos.
PL2315834T3 (pl) 2008-07-25 2018-12-31 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Białko rv2386c związane z gruźlicą, jego kompozycje i zastosowania
GB0815872D0 (en) * 2008-09-01 2008-10-08 Pasteur Institut Novel method and compositions
JP5770633B2 (ja) * 2008-11-03 2015-08-26 クルセル ホランド ベー ヴェー アデノウイルスベクターの産生方法
KR20120129927A (ko) * 2010-01-27 2012-11-28 글락소 그룹 리미티드 변형된 투베르쿨로시스 항원
JP2013523617A (ja) * 2010-03-26 2013-06-17 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム Ｈｉｖワクチン
ITRM20100411A1 (it) * 2010-07-23 2012-01-24 Massimo Amicosante Uso di sequenze amminoacidiche da mycobacterium tuberculosis o dei loro corrispondenti acidi nucleici per la diagnosi e la prevenzione di infezione tubercolare, relativo kit diagnostico e vaccino.
JP2014501225A (ja) * 2010-09-27 2014-01-20 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム ワクチン
CN102260712B (zh) * 2011-05-31 2013-10-02 北京锤特生物科技有限公司 溶肿瘤能力增强的B型人腺病毒Ad11突变体的构建和应用
WO2015092710A1 (en) 2013-12-19 2015-06-25 Glaxosmithkline Biologicals, S.A. Contralateral co-administration of vaccines
EP3116479A1 (en) * 2014-03-12 2017-01-18 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Liposomal compositions for mucosal delivery
CA2942235A1 (en) * 2014-03-12 2015-09-17 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Immunogenic liposomal formulation
GB201405921D0 (en) 2014-04-02 2014-05-14 Glaxosmithkline Biolog Sa Novel methods for inducing an immune response
JP6664338B2 (ja) * 2014-06-13 2020-03-13 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム 免疫原性組合せ物
BR112017005917A2 (pt) 2014-09-26 2017-12-12 Beth Israel Deaconess Medical Ct Inc processos e composições para indução de imunidade protetora contra infecção com o vírus da imunodeficiência humana
EP3307313A1 (en) 2015-06-12 2018-04-18 GlaxoSmithKline Biologicals SA Adenovirus polynucleotides and polypeptides
GB201513176D0 (en) 2015-07-27 2015-09-09 Glaxosmithkline Biolog Sa Novel methods for inducing an immune response
EA038974B1 (ru) 2015-12-15 2021-11-17 Янссен Вэксинс Энд Превеншн Б.В. Антигены вируса иммунодефицита человека, векторы, композиции и способы их применения
WO2017189448A1 (en) 2016-04-25 2017-11-02 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Bivalent immunogenic conjugate for malaria and typhoid
AU2017286375B2 (en) 2016-06-16 2019-04-18 Janssen Vaccines & Prevention B.V. HIV vaccine formulation
CN106248934B (zh) * 2016-08-25 2018-04-06 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 结核分枝杆菌抗原蛋白Rv0446c及其T细胞表位肽的应用
CN106248935B (zh) * 2016-08-31 2018-04-06 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 结核分枝杆菌抗原蛋白Rv1798及其T细胞表位肽的应用
AU2017318689A1 (en) 2016-09-02 2019-04-11 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Methods for inducing an immune response against human immunodeficiency virus infection in subjects undergoing antiretroviral treatment
DK3512543T3 (da) 2016-09-15 2020-10-12 Janssen Vaccines & Prevention Bv Trimerstabiliserende mutationer af hiv-kappeprotein
GB201621686D0 (en) 2016-12-20 2017-02-01 Glaxosmithkline Biologicals Sa Novel methods for inducing an immune response
GB201701239D0 (en) 2017-01-25 2017-03-08 Glaxosmithkline Biologicals Sa Novel formulation
IE20190086A1 (en) 2017-05-30 2019-12-25 Glaxosmithkline Biologicals Sa Novel methods for manufacturing an adjuvant
EA202090049A1 (ru) 2017-06-15 2020-04-15 Янссен Вэксинс Энд Превеншн Б.В. Поксвирусные векторы, кодирующие антигены вич, и способы их применения
AU2018304502B2 (en) 2017-07-19 2022-03-31 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Trimer stabilizing HIV envelope protein mutations
WO2019106192A1 (en) 2017-12-01 2019-06-06 Glaxosmithkline Biologicals Sa Saponin purification
CA3091969A1 (en) * 2018-02-22 2019-08-29 Turnstone Limited Partnership Oncolytic viruses as adjuvants
WO2020064621A1 (en) 2018-09-25 2020-04-02 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Method of inducing an immune response against human immunodeficiency virus by co-localized administration of vaccine components
US20220211835A1 (en) * 2019-04-17 2022-07-07 The Wistar Institute Replication Deficient Adenoviral Vectors for HIV Vaccine Applications
EP3980044A1 (en) 2019-06-05 2022-04-13 GlaxoSmithKline Biologicals SA Saponin purification
CN110327314B (zh) * 2019-07-23 2021-10-22 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种可气溶胶化的A型肉毒毒素AHc亚单位疫苗干粉吸入剂
CN112220921B (zh) * 2020-08-25 2022-08-16 北京交通大学 一种针对呼吸道合胞病毒感染的组合疫苗
RU2752967C1 (ru) * 2021-02-10 2021-08-11 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр гематологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ гематологии" Минздрава России) Способ индукции антигенассоциированного иммунного ответа
WO2023242155A1 (en) * 2022-06-14 2023-12-21 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Compositions and methods for the diagnosis of hiv infection

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002022080A2 (en) * 2000-09-15 2002-03-21 Merck & Co., Inc. Enhanced first generation adenovirus vaccines expressing codon optimized hiv1-gag, pol, nef and modifications
WO2004110482A1 (en) * 2003-06-13 2004-12-23 Isis Innovation Limited Improved vaccines
WO2006013106A2 (en) * 2004-08-05 2006-02-09 Glaxosmithkline Biologicals Sa Vaccine for prevention and treatment of hiv-infection
WO2006120034A1 (en) * 2005-05-12 2006-11-16 Glaxo Group Limited Vaccine composition
WO2007003384A1 (en) * 2005-06-30 2007-01-11 Glaxosmithkline Biologicals Sa Anti-malaria vaccine

Family Cites Families (57)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1331443C (en) 1987-05-29 1994-08-16 Charlotte A. Kensil Saponin adjuvant
US5057540A (en) 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
GB8819209D0 (en) 1988-08-12 1988-09-14 Research Corp Ltd Polypeptide & dna encoding same
CA2005704C (en) 1988-12-16 2003-02-11 James C. Paton Pneumolysin mutants and pneumococcal vaccines made therefrom
EP0468520A3 (en) 1990-07-27 1992-07-01 Mitsui Toatsu Chemicals, Inc. Immunostimulatory remedies containing palindromic dna sequences
ES2279020T3 (es) 1991-07-19 2007-08-16 The University Of Queensland Vacuna contra el papilomavirus humano.
EP0614465B1 (en) 1991-11-16 1999-03-17 SMITHKLINE BEECHAM BIOLOGICALS s.a. HYBRID PROTEIN BETWEEN CS FROM PLASMODIUM AND HBsAG
PT647140E (pt) 1992-06-25 2007-12-27 Univ Georgetown Vacinas de papilomavírus
UA40597C2 (ru) 1992-06-25 2001-08-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Вакцинная композиция, способ лечения млекопитающих, больных или восприимчивых к инфекции, способ лечения млекопитающих, больных на рак, способ получения вакцинной композиции, композиция адъювантов
US5437951A (en) 1992-09-03 1995-08-01 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Self-assembling recombinant papillomavirus capsid proteins
EP1588713B1 (en) 1993-03-09 2010-12-22 The University Of Rochester Production of human papillomavirus HBV-11 capsid protein L1 and virus-like particles
ATE204762T1 (de) 1993-03-23 2001-09-15 Smithkline Beecham Biolog 3-0-deazylierte monophosphoryl lipid a enthaltende impfstoff-zusammensetzungen
RU2154068C2 (ru) 1993-11-17 2000-08-10 Лаборатуар Ом С.А. Глюкозаминовые дисахариды, способ их получения, фармацевтическая композиция
GB9326253D0 (en) 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
CA2560114A1 (en) 1994-07-15 1996-02-01 The University Of Iowa Research Foundation Immunomodulatory oligonucleotides
EP1728800A1 (de) 1994-10-07 2006-12-06 Loyola University Of Chicago Papillomavirusähnliche Partikel, Fusionsproteine sowie Verfahren zu deren Herstellung
AUPM873294A0 (en) 1994-10-12 1994-11-03 Csl Limited Saponin preparations and use thereof in iscoms
WO1996026277A1 (en) 1995-02-24 1996-08-29 Cantab Pharmaceuticals Research Limited Polypeptides useful as immunotherapeutic agents and methods of polypeptide preparation
UA56132C2 (ru) 1995-04-25 2003-05-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Композиция вакцины (варианты), способ стабилизации qs21 по отношению к гидролизу (варианты), способ приготовления вакцины
GB9620795D0 (en) 1996-10-05 1996-11-20 Smithkline Beecham Plc Vaccines
US5843464A (en) 1995-06-02 1998-12-01 The Ohio State University Synthetic chimeric fimbrin peptides
US6083716A (en) 1996-09-06 2000-07-04 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Chimpanzee adenovirus vectors
ES2241042T3 (es) 1996-10-11 2005-10-16 The Regents Of The University Of California Conjugados de polinucleotido inmunoestimulador/ molecula inmunomoduladora.
US6113918A (en) 1997-05-08 2000-09-05 Ribi Immunochem Research, Inc. Aminoalkyl glucosamine phosphate compounds and their use as adjuvants and immunoeffectors
US6764840B2 (en) 1997-05-08 2004-07-20 Corixa Corporation Aminoalkyl glucosaminide phosphate compounds and their use as adjuvants and immunoeffectors
US6303347B1 (en) 1997-05-08 2001-10-16 Corixa Corporation Aminoalkyl glucosaminide phosphate compounds and their use as adjuvants and immunoeffectors
GB9711990D0 (en) 1997-06-11 1997-08-06 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
US6764686B2 (en) 1997-07-21 2004-07-20 Baxter International Inc. Modified immunogenic pneumolysin compositions as vaccines
WO1999010008A1 (en) 1997-08-29 1999-03-04 Aquila Biopharmaceuticals, Inc. Compositions comprising the adjuvant qs-21 and polysorbate or cyclodextrin as excipient
GB9718901D0 (en) 1997-09-05 1997-11-12 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
EP1009382B1 (en) 1997-09-05 2003-06-18 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Oil in water emulsions containing saponins
IL138809A0 (en) 1998-04-07 2001-10-31 Corixa Corp Fusion proteins of mycobacterium tuberculosis antigens and pharmaceutical compositions containing the same
HUP0102332A3 (en) 1998-06-08 2002-11-28 Sca Emballage France Fast flattening packaging
WO2000000462A1 (fr) 1998-06-30 2000-01-06 Om Pharma Nouveaux pseudodipeptides acyles, leur mode de preparation et les compositions pharmaceutiques en renfermant
WO2001046127A1 (fr) 1999-12-22 2001-06-28 Om Pharma Pseudodipeptides acyles porteurs d'un bras auxiliaire fonctionnalise
US20030158134A1 (en) * 2000-01-31 2003-08-21 Gerald Voss Vaccine for the prophylactic or therapeutic immunization against hiv
GB0027088D0 (en) 2000-11-06 2000-12-20 Glaxo Group Ltd DNA expression vectors
GB0019375D0 (en) 2000-08-07 2000-09-27 Int Centre Genetic Eng & Bio Method of polypeptide renaturation
BR0210586A (pt) 2001-06-22 2005-07-12 Wistar Inst Métodos para induzir uma reação imune citotóxica e composições de adenovìrus de sìmio recombinante úteis das mesmas
GB0118367D0 (en) * 2001-07-27 2001-09-19 Glaxosmithkline Biolog Sa Novel use
US20070015721A1 (en) 2001-09-20 2007-01-18 Andrew Beaton Hiv-gag codon-optimised dna vaccines
SG165153A1 (en) 2001-11-21 2010-10-28 Univ Pennsylvania Simian adenovirus nucleic acid and amino acid sequences, vectors containing same, and methods of use
CN100333791C (zh) * 2002-10-23 2007-08-29 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 抗疟疾的疫苗接种方法
GB0225788D0 (en) * 2002-11-05 2002-12-11 Glaxo Group Ltd Vaccine
JP4754480B2 (ja) 2003-06-20 2011-08-24 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア キメラアデノウイルスの作成法およびそのようなキメラアデノウイルスの使用
GB0321615D0 (en) 2003-09-15 2003-10-15 Glaxo Group Ltd Improvements in vaccination
GB0420634D0 (en) * 2004-09-16 2004-10-20 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccines
SG158145A1 (en) 2005-03-31 2010-01-29 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccines against chlamydial infection
EP2457926B1 (en) * 2005-04-29 2014-09-24 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Novel method for preventing or treating M. tuberculosis infection
AT502275B8 (de) 2005-08-08 2007-08-15 Greenhills Biotechnology Res D Immunantwort-induzierende zusammensetzungen
WO2008045601A2 (en) * 2006-06-16 2008-04-17 Introgen Therapeutics, Inc. Adenovirus-based genetic vaccines for biodefense
HUE031411T2 (en) * 2007-03-02 2017-07-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa New Methods and Preparations
GB0706914D0 (en) * 2007-04-10 2007-05-16 Isis Innovation Novel adenovirus vectors
GB2452958A (en) * 2007-09-20 2009-03-25 Glaxosmithkline Biolog Sa HIV vaccine compositions
GB0815872D0 (en) * 2008-09-01 2008-10-08 Pasteur Institut Novel method and compositions
EP2352516A2 (en) * 2008-09-26 2011-08-10 Auburn University Immunization of avians by mucosal administration of non-replicating vectored vaccines

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002022080A2 (en) * 2000-09-15 2002-03-21 Merck & Co., Inc. Enhanced first generation adenovirus vaccines expressing codon optimized hiv1-gag, pol, nef and modifications
WO2004110482A1 (en) * 2003-06-13 2004-12-23 Isis Innovation Limited Improved vaccines
WO2006013106A2 (en) * 2004-08-05 2006-02-09 Glaxosmithkline Biologicals Sa Vaccine for prevention and treatment of hiv-infection
WO2006120034A1 (en) * 2005-05-12 2006-11-16 Glaxo Group Limited Vaccine composition
WO2007003384A1 (en) * 2005-06-30 2007-01-11 Glaxosmithkline Biologicals Sa Anti-malaria vaccine

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GANNE V. ET AL.: "Enhancement of the efficacy of a replication-defective adenovirus-vectored vaccine by the addition of oil adjuvants". VACCINE, BUTTERWORTH SCIENTIFIC. GUILDFORD, GB, vol. 12, no. 13, 1 January 1994 (1994-01-01), pages 1190-1196, XP002393618, ISSN: 0264-410X, the whole document, table 1 *

Also Published As

Publication number Publication date
PT2137210T (pt) 2017-01-09
MX2009009342A (es) 2009-09-11
JP6097795B2 (ja) 2017-03-15
AR065523A1 (es) 2009-06-10
DK2137210T3 (en) 2017-01-30
LT2137210T (lt) 2016-12-27
HRP20161606T1 (hr) 2017-01-13
TW200902054A (en) 2009-01-16
US20100055166A1 (en) 2010-03-04
CN101675068A (zh) 2010-03-17
EP2137210A1 (en) 2009-12-30
SG194360A1 (en) 2013-11-29
CL2008000611A1 (es) 2008-09-05
PL2137210T3 (pl) 2017-06-30
CN103550764A (zh) 2014-02-05
MX347425B (es) 2017-04-26
CA2679410A1 (en) 2008-09-12
AU2008223951A1 (en) 2008-09-12
HUE031411T2 (en) 2017-07-28
CY1118372T1 (el) 2017-06-28
BRPI0808553A2 (pt) 2014-08-19
PE20081875A1 (es) 2009-01-09
KR101532062B1 (ko) 2015-06-26
EP2998316A1 (en) 2016-03-23
EP2137210B1 (en) 2016-10-19
EP2998316B1 (en) 2019-06-12
ES2609418T3 (es) 2017-04-20
CA2896131C (en) 2020-04-07
CA2679410C (en) 2017-01-17
CA2896131A1 (en) 2008-09-12
WO2008107370A1 (en) 2008-09-12
EA200901060A1 (ru) 2010-06-30
JP2016014023A (ja) 2016-01-28
AU2008223951B2 (en) 2014-03-27
JP5869206B2 (ja) 2016-02-24
SI2137210T1 (sl) 2017-01-31
JP2010520177A (ja) 2010-06-10
MX362698B (es) 2019-02-01
JP6110347B2 (ja) 2017-04-05
ES2744676T3 (es) 2020-02-25
CN105106971A (zh) 2015-12-02
KR20100015379A (ko) 2010-02-12
JP2015028031A (ja) 2015-02-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA021391B1 (ru) Способ индукции иммунного ответа, вакцинная композиция, ее применение и набор
EP1880012B1 (en) Vaccine composition
US20110236468A1 (en) Vaccine compositions
Raviprakash et al. Synergistic neutralizing antibody response to a dengue virus type 2 DNA vaccine by incorporation of lysosome-associated membrane protein sequences and use of plasmid expressing GM-CSF
KR20150118131A (ko) 안정화된 사람 면역결핍 바이러스 (ｈｉｖ) 외피 (ｅｎｖ) 삼량체 백신 및 이의 사용 방법
JP2007259870A (ja) Ｄｎａワクチン及び組換えウイルスベクターとして作用し得る二機能性プラスミド
WO2020063370A2 (zh) 免疫组合物及其制备方法与应用
JP2021506767A (ja) Ｂ型肝炎免疫化レジメン及び組成物
JP2024028762A (ja) Ｂ型肝炎免疫化レジメン及び組成物
JP2022524007A (ja) Ｂ型肝炎免疫化レジメンおよび組成物
EP1417973B1 (en) Vaccine formulation potentiated by the combination of a dna and an antigen
Andersson Production and delivery of recombinant subunit vaccines
MXPA01010481A (es) Acidos nucleicos y polipeptidos de lisavirus quimerico.
CN115843270A (zh) 包括缺失可变结构域的e2多肽的丙型肝炎核酸疫苗
WO2023128799A1 (ru) ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО ДЛЯ ИНДУКЦИИ ИММУННОГО ОТВЕТА ПРОТИВ SARS-CoV-2 И СПОСОБ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ (ВАРИАНТЫ)
KR20240027571A (ko) 키메라 아데노바이러스 벡터들
AU2012201827B2 (en) Vaccine composition
US20110177115A1 (en) Vaccination regimen

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ KG MD TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): BY KZ RU