ES2279020T3 - Vacuna contra el papilomavirus humano. - Google Patents

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Abstract

Un método para producir partículas parecidas a virus (VLPs) de papilomavirus que comprende la etapa de: (i) producir VLPs en una célula hospedadora adecuada transfectada con una o más moléculas de ADN recombinante codificando cada una de ellas la proteína L1 de papilomavirus o una combinación de proteína L1 de papilomavirus y proteína L2 de papilomavirus por expresión de la proteína L1 o la combinación de proteínas L1 y L2; en el que el papilomavirus es HPV18.

Description

Vacuna contra el papilomavirus humano.
Campo de la invención
Esta invención se refiere a papilomavirus y, en particular, a antígenos y vacunas que pueden ser eficaces en el tratamiento de infecciones producidas por tales virus.
Antecedentes de la invención
Se conocen infecciones por papilomavirus no sólo en seres humanos, sino también en animales tales como ovejas, perros, vacas, coyotes, lobos, zarigüeyas, ciervo, antílope, castores, tortugas, osos, lagartos, monos, chimpancés, jirafas, impala, elefantes, ballenas, gatos, cerdos, jerbos, alces, yacs, delfines, loros, cabras, rinocerontes, camellos, lemmings, gamuzas, mofetas, demonios de Tasmania, tejones, lemures, caribú, armadillo, tritones y serpientes (véase, por ejemplo "Papilloma Virus Infections in Animals" por J P Sundberg que se describe en Papilloma viruses and Human Disease, editado por K Syrjanen, L Gissmany L G Koss, Springer Verlag 1987).
También se sabe (por ejemplo, en Papilloma viruses and Human Cancer editado por H Pfister y publicado por CRC Press Inc 1990) que los papilomavirus se incluyen en varios grupos distintos tales como papilomavirus humanos (HPV), que se diferencian en los tipos 1-56 dependiendo de la homología de secuencias de ADN. Un agrupamiento clínico-patológico de HPV y el potencial maligno de las lesiones con las que están asociados la mayoría de las veces puede separarse como se indica a continuación.
En un primer grupo pueden indicarse los tipos 1 y 4, que producen verrugas plantares benignas, los tipos 2, 26, 28 y 29 que producen verrugas comunes benignas, los tipos 10, 3 y 27 que producen verrugas planas benignas y el tipo 7 que produce verrugas de Butcher. Este primer grupo de infecciones se produce en individuos normales o inmunocompetentes.
En un segundo grupo que se refiere a individuos inmunocomprometidos, pueden indicarse los tipos 5 y 8, que producen lesiones maculares muy malignas, los tipos, 9, 12, 14, 15, 17, 19-25, 36 y 46-50 que producen lesiones maculares o planas que son benignas o rara vez malignas. Estas lesiones maculares se conocen de otra forma como epidermodisplasia verruciformis (EV).
En un tercer grupo que infecta particularmente al tracto genital, pueden indicarse los tipos 6, 11, 34 y 39, 41-44 y 51-55, que producen condilomas que rara vez son malignos. Los tipos 13 y 32 que producen hiperplasia epitelial focal benigna, los tipos 16 y 18 que producen displasia epitelial y otras lesiones con potencial considerable, incluyendo papulosis bowenoide, y los tipos 30, 31, 33, 35, 45 y 56 que producen condilomas con un potencial maligno intermedio. El condiloma aparece principalmente en el tracto anogenital y, en particular, en el cuello del útero. Los tipos 16 y 18 están asociados con la mayora de los carcinomas in situ e invasivos del cuello del útero, la vagina, la vulva y el canal anal. También puede producirse condiloma en el tracto aerodigestivo.
En particular, HPV 16 está asociado con enfermedades premalignas y malignas del tracto genitourinario y, en particular, con el carcinoma del cuello del útero (Durst, et al., PNAS 80 3812-3815, 1983; Gissmann et al., J. Invest. Dermatol 83 265-285, 1984). Actualmente no hay ninguna información sobre el papel de las respuestas humorales en la neutralización de HPV16.
La detección de anticuerpos contra proteínas de fusión de HPV16 (Jenison et al., J Virol 65 1208-1218,1990; Köchel et al., Int. J Cancer 48 682-688, 1991) y contra péptido sintéticos L1 de HPV16 (Dillner et al, Int. J. Cancer 45 529-535, 1990) en el suero de pacientes con infección por HPV16 confirma que hay epítopos B dentro de las proteínas de la cápsida de HPV, aunque algunos pacientes tienen anticuerpos específicos para L1 de HPV16 identificados por estas técnicas. No hay ningún sistema para la propagación de HPV16 in vitro, y las lesiones genitales humanas producen pocos viriones de HPV16; por lo tanto, no se dispone de partículas de HPV16 para estudios inmuno-
lógicos.
Los papilomavirus animales también pueden incluir el papilomavirus bovino (BPV) y, en particular, los tipos BPV1, BPV2, BPV3, BPV4, BPV5 y BPV6, que también se diferencian por la homología de secuencias de ADN. En general, los otros papilomavirus animales infectan a ciervos, caballos, conejos, perros, roedores y pájaros. Los papilomavirus son virus de ADN pequeños que codifican hasta ocho genes tempranos y dos genes tardíos. (como revisión véase Lancaster y Jenson 1987 Cancer Metast. Rev. p6653-6664; y Pfister 1987 Adv. Cancer Res 48, 113-147). La organización de los genes tardíos es más sencilla que la de los genes tempranos. Los genes tardíos L1 y L2 solapan ligeramente entre sí en la mayoría de los casos. Las proteínas L2 putativas están muy conservadas entre diferentes papilomavirus, particularmente la secuencia de 10 aminoácidos básicos en el extremo C-terminal. El dominio ancho en el medio sólo revela pequeñas similitudes agrupadas. Sin embargo, la ORF (fase de lectura abierta) de L1 parece conservarse de forma monótona en todos los casos conocidos. (Véase Syrjanen et al, mencionado anteriormente). La homología de las secuencias de aminoácidos alcanza un 50% cuando se comparan HPV1a, HPV6b, BPV1 y CRPV (papilomavirus de conejo de cola de algodón).
Con respecto a la inmunoterapia en relación con las infecciones por papilomavirus, los métodos previos de tratamiento de verrugas y lesiones cutáneas epiteliales han implicado el uso de la cirugía, que puede ser dolorosa y traumática, produciéndose a menudo problemas de cicatrización con el riesgo de que pueda producirse una reinfección. También se ha usado el tratamiento con agentes químicos. Un agente de tratamiento común es el ácido salicílico, que es el ingrediente principal en concentraciones que varían del 10% al 40% en tinturas y yesos. También se ha propuesto la formalina en concentraciones del 3% al 20%. Se ha usado la crioterapia para el tratamiento de verrugas cutáneas. También se ha usado el glutaraldehído como agente de tratamiento. También se ha usado la podofolina con un éxito variable tanto para verrugas de la piel como para el condiloma genital. Los tipos de cirugía que se han usado en el condiloma anogenital han incluido escisión quirúrgica, criocirugía y cirugía con láser. También se ha propuesto el uso de interferones (véase Syrjanen et al., mencionado anteriormente).
Los anticuerpos contra la proteína L1 del papilomavirus bovino (BPV) tienen actividad neutralizadora de virus (Pilacinski et al., 1986) y los viriones de HPV11 pueden inactivarse en un modelo in vitro por antisueros específicos (Christensen y Kreider, J. Virol 64 3151-3156 1990). También hay algunos indicios de que la regresión espontánea de verrugas cutáneas inducidas por HPV1 está asociada con un aumento de las respuestas inmunes humorales a la proteína de las verrugas (Kirchner, Prog. Med. Virol 33 1-41, 1986).
También se han propuesto vacunas con éxitos mediocres. Se ha propuesto usar vacunas que contienen homogeneizados de tumores autógenos [Abcarian et al. J. Surg Res 22:231-236 (1977) Dis Colon Rectum 25:648-51 (1982) Dic Colon Rectum 19:237-244 (1976)]. Sin embargo, recientemente se ha recomendado que los pacientes no se traten más con vacunas autógenas debido al efecto oncogénico potencial del ADN viral (Bunney 1986 Br Med J 293 1045-1047).
En relación con la producción de vacunas modificadas por ingeniería genética, esta materia se ha discutido en Pfister (1990), mencionado anteriormente, y parece ser que se han experimentado dificultades en la obtención de una vacuna eficaz debido a la plétora de diferentes tipos de papilomavirus. Sin embargo, Pfister indica que la atención debe dirigirse a las denominadas proteínas tempranas (es decir, E1, E2, E3, E4, E5, E6, E7 o E8) porque lo más probable es que estas proteínas se sinteticen en las células basales proliferativas de una infección de verruga, a diferencia de las proteínas estructurales, que se expresan en las capas epidérmicas superiores. Por lo tanto, de acuerdo con Pfister (1990), las proteínas de la cápsida del virus parecen estar limitadas en relación con el uso en una vacuna. En Pfister (1990) también se ha discutido sobre el uso de virus de vaccinia recombinantes en sistema de ensayo in vitro para proteínas tempranas de papilomavirus en células eucariotas. Esto puede tomar la forma de una vacuna viva que consta de un virus de vaccinia modificado genéticamente que expresa proteínas de papilomavirus o en la superficie de células autólogas fijadas con paraformaldehído infectadas in vitro con recombinantes de vaccinia o transfectadas con otros vectores de expresión. Otra estrategia para el desarrollo de vacunas, como se describe en Pfister (1990), es usar un complejo estimulante inmune del glucósido Quil A.
Sólo existen datos sobre una vacunación profiláctica satisfactoria para homogeneizados de fibropapilomas bovinos y se ha demostrado que proporcionan una inmunidad limitada (Olson et al J Am Vet Med Assoc 135, 499 (1959) Cancer Res 22 463 (1962)). También se ha usado una vacuna que incluye una proteína de fusión L1 modificada por ingeniería genética (Pilacinski et al. UCLA Symp, Molecular and Cellular Biology New Series vol 32 papilloma Viruses Molecular and Clinical Aspects Alan R Liss New York 1985 257) en terneros, pero resultó insatisfactoria en seres humanos (Barthold et al. J. Am Vet Med Assoc. 165, 276, 1974). En Pfister (1990) se indica que actualmente no hay ningún indicio de una posible prevención de la infección por HPV por medio del uso de una vacuna de proteína de la cápsida, pero parece ser factible la inducción de una inmunidad celular antitumoral.
Los genes L1 y L2 han sido la base de vacunas para la prevención y el tratamiento de infecciones por papilomavirus y de inmunógenos usados en la diagnosis y detección de papilomavirus (Memorias Descriptivas de Patente Internacional WO86/05816 y WO83/0623). Sin embargo, parece ser que no se ha usado comercialmente ninguna de estas vacunas.
Sumario de la invención
Por lo tanto, es un objeto de la invención proporcionar partículas parecidas a virus (VLPs) que puedan ser útiles como agentes de diagnóstico, así como formar un componente de una vacuna para uso con infecciones por papilomavirus.
La invención se define en las reivindicaciones adjuntas.
Por lo tanto, en un aspecto, la invención incluye un método para producir partículas parecidas a virues (VLPs) de papilomavirus, que comprende la etapa de:
(i) producir VLPs en una célula hospedadora adecuada transfectada con una o más moléculas de ADN recombinante codificando cada una de ellas la proteína L1 de papilomavirus o una combinación de proteína L1 de papilomavirus y proteína L2 de papilomavirus, por expresión de la proteína L1 o combinación de proteínas L1 y L2; en el que el papilomavirus es HPV18.
En otro aspecto, la invención incluye una vacuna que contiene VLPs de papilomavirus en combinación con un adyuvante adecuado.
En relación con la etapa (i), se apreciará que los genes L1 y L2 pueden incluirse en la misma molécula de ADN recombinante o en moléculas de ADN recombinantes diferentes.
Preferiblemente, las moléculas de ADN recombinante están contenidas en virus recombinantes que pueden transfectar a la célula hospedadora. Los virus adecuados que pueden usarse para este fin incluyen baculovirus, vaccinia, virus de Sindbis, SV40, virus Sendai, adenovirus, retrovirus o poxvirus. Las células hospedadoras adecuadas pueden incluir células hospedadoras que son compatibles con los virus anteriores, y éstas incluyen células de insectos tales como Spodoptera frugiperda, células CHO, fibroblastos de embrión de pollo, células BHK, células SW13 humanas, drosophila, células de mosquito derivadas de Aedes albopictus o células epiteliales de mono. También se apreciará que otras células eucariotas pueden comprender células de levadura u otras células de mamífero.
La molécula de ADN recombinante convenientemente se obtiene a partir de una fuente de genoma de papilomavirus, por lo que la proteína L1 o la proteína L2 se pueden amplificar por amplificación por PCR usando cebadores diseñados de manera conveniente descritos más adelante en este documento.
Preferiblemente, un gen que codifica la proteína L1 se inserta en un plásmido que contiene un promotor adecuado y un fragmento de ADN que contiene la proteína L1 y el promotor se incorpora en un plásmido primario que puede constituir la molécula de ADN recombinante, que puede insertarse en un vector de virus recombinante como se ha descrito anteriormente.
Un gen que codifica la proteína L2 también puede unirse a un promotor adecuado y preferiblemente un fragmento de ADN que codifica el gen L2 y el promotor se inserta en el plásmido primario para proporcionar un plásmido doblemente recombinante o un plásmido secundario, plásmido que también puede insertarse en un vector de virus recombinante como se ha descrito anteriormente para formar un vector de virus doblemente recombinante.
Sin embargo, la invención también incluye la realización en la que el plásmido primario y/o el plásmido secundario pueden infectar a una célula hospedadora adecuada para producir VLPs que contienen proteína L1 o VLPs que contienen proteína L1 y L2 en condiciones experimentales apropiadas. Estas últimas VLPs son el inmunógeno ideal para una vacuna específica de papilomavirus, ya que la proteína L2 es inmunodominante en la infección natural.
Otras moléculas de ADN recombinante adecuadas incluyen cósmidos, así como virus recombinantes. Los sistemas de expresión adecuados incluyen sistemas de expresión procariotas que incluyen E. coli y cualquier vector de expresión plasmídico o cosmídico, o sistemas eucariotas que incluyen las células hospedadoras descritas anteriormente en combinación con un vector de virus recombinante o, como alternativa, células de levadura y plásmidos de levadura.
En la situación en la que se usan plásmidos que incorporan genes que codifican L1 o tanto L1 como L2 y dónde tales plásmidos pueden infectar a una célula hospedadora adecuada para la producción de VLPs, tales plásmidos también deben incluir un promotor adecuado para potenciar la expresión de las proteínas estructurales de VLPs y también puede utilizarse una polimerasa que esté asociada con el promotor relevante. Sin embargo, en esta situación, las VLPs sólo pueden obtenerse en condiciones experimentales específicas.
Los genes L1 y L2 pueden dirigirse por cualquier promotor de mamífero o viral con una señal de poliadenilación de mamífero o viral. Preferiblemente, los genes L1 y L2 se transcriben a partir de cualquier promotor de virus de vaccinia, que puede ser un promotor temprano o un promotor tardío, según se considere apropiado. En Davision y Moss (1989) J. Mol. Biol 210 749-769 y (1989) J. Mol. Biol 210 771-784, se proporciona una lista de tales promotores.
En el trabajo experimental que ha tenido lugar, el gen L1 se localiza aguas abajo de un promotor 4b de vaccinia y el gen L2 se localiza aguas abajo de un promotor tardío 28k de vaccinia sintético. Las células hospedadoras son células epiteliales de mono.
Las VLPs pueden obtenerse a partir de las células transfectadas por cualquier medio de purificación adecuado. Las VLPs pueden combinarse con cualquier adyuvante adecuado tal como ISCOMS, alumbre, Adyuvante Incompleto o Completo de Freund, Quil A y otras saponinas, o cualquier otro adyuvante como se describe, por ejemplo, en Vanselow (1987) S. Vet. Bull. 57 881-896.
Ahora puede hacerse referencia a los dibujos adjuntos.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es una representación esquemática de plásmidos usados para construir virus de vaccinia recombinantes de HPV16.
La figura 2A es un análisis de transferencia de western de L1 de HPV16 recombinante en células CV-1 infectadas con virus de vaccinia.
La figura 3 es un análisis de transferencia de northern de células CV-1 infectadas con virus de vaccinia recombinante. Las figuras 4A y 4B son micrografías electrónicas de partículas parecidas a virus de HPV procedentes de células CV-1 infectadas con virus de vaccinia recombinantes.
La figura 5 ilustra la sedimentación en gradiente de densidad de equilibrio de CsCl de la cápsida vacía de HPV16.
La figura 6 ilustra la glicosilación de proteínas L1 en partículas de virus purificadas.
La figura 7 es un diagrama de proceso de las construcciones del plásmido pLC200 que codifica L1 y de pLC201 que codifica L1 y L2.
La figura 8 es un análisis de transferencia de western de la reactividad de suero murino con proteína L1 recombinante de baculovirus.
Las figuras 9 y 10 ilustran los resultados del mapeo de sueros de ratones BLAB/c, C57B1/6 y CBA inmunizados con cápsidas de HPV16 sintéticas y sueros de control inmunizados con CFA reunidos.
Las figuras 11 y 11A ilustran la reactividad de dos MAbs específicos para L1 con la serie de péptidos solapantes de la molécula L1 de HPV16.
La figura 11B ilustra la predicción del índice antigénico de L1 de HPV16.
La figura 12 muestra un mapa de epítopos de L1 de HPV16.
La figura 13A ilustra VLPs de HPV16 sintéticas usadas para inmunizacion.
La figura 13B muestra la reactividad de VLPs purificadas con antisuero de L2 de HPV16 por transferencia de western.
La figura 13C ilustra plásmidos usados para construir virus de vaccinia recombinantes en relación con BPV1.
Las figuras 14A y 14B muestran el análisis de la expresión de L1 y L2 de BPV1 en células CV-1 infectadas con virus de vaccinia de tipo silvestre y recombinantes; y
las figuras 15A y 15B muestran micrografías electrónicas de cápsidas de BPV1 obtenidas a partir de células infectadas con virus de vaccinia recombinantes.
Ejemplo de referencia 1
VLPs derivadas de HPV16
El gen L1 de HPV-16, desde el segundo ATG (nt5637), se amplificó por reacción en cadena de la polimerasa a partir de pHPV16 (proporcionado por Dr. L. Gissmann), usando los siguientes cebadores:
1
El primer codón de metionina y el codón stop se indican por subrayados, y se incluyeron sitios BglII para facilitar la subclonación. El fragmento de 1527 pb amplificado se extrajo con fenol y se purificó por electroforesis en gel de agarosa al 1%. Después de la digestión con BglII, el gen L1 se subclonó en el sitio BamHI del plásmido RK19 (Kent 1988, tesis doctoral, Universidad de Cambridge) que contiene un promotor de virus de vaccinia fuerte (4b). El plásmido resultante se secuenció (Sanger, et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74,5463-5467) y se usó para preparar un fragmento que contenía el gen L1 de HPV16 unido al promotor 4b por digestión con MluI y Sst1. Este fragmento se convirtió en un fragmento de extremos romos con ADN polimerasa de T4 y se clonó en el sitio BamHI del vector intermedio de vaccinia pLC1, que contiene el gen B24R del virus de vaccinia (Kotwal y Moss, 1989, J. Virol, 63, 600-606; Smith et al, 1989, J. Gen. Virol. 70, 2333-2343), un gen gpt de E. coli (Falkner y Moss, 1988, J. Virol. 64, 1849-1854; Boyle y Coupar, 1988, Gene 65, 123-128) y sitios de clonación múltiple para producir el plásmido pLC200.
El gen L2 de HPV16 se preparó por digestión parcial de pHPV16 con Acc1 para producir un fragmento (4138nt-5668nt) que se rellenó con Klenow y se unió a sitios de unión sintéticos BamHI. Este fragmento L2 se clonó en el sitio BamHI de un plásmido derivado de pUC denominado p480 que tiene un promotor tardío 28K de vaccinia sintético, con algunas modificaciones (Davison y Moss, 1989, J. Mol. Biol. 210,771-784). La secuencia del promotor es la
siguiente:
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el motivo del promotor tardío está subrayado. Se aisló un fragmento que contenía el gen L2 unido al promotor 28K por digestión con SstI/SalI, se transformó en un fragmento de extremo romos por la ADN polimerasa de T4 y después se clonó en los sitios SstI y SalI de pLC200 para producir pLC201 (figura 1).
En la figura 1, L1 y L2 de HPV16 (recuadros blancos) están bajo el control de promotores tardíos de vaccinia (recuadros negros). Como marcador de selección se usa el gen gpt de E. coli (recuadros sombreados). Secuencia flanqueante para recombinación homóloga. La dirección de la transcripción se indica por flechas.
Después, el plásmido pLC201 se usó para construir un virus de vaccinia recombinante como se ha descrito previamente (Mackett, et al, 1984, J. Virol. 49, 857-864). Se seleccionaron virus recombinantes pLC201VV y pLC202VV por ensayos en placa en presencia de ácido micofenólico, xantina e hipoxantina (Falkner y Moss, 1988). Se prepararon virus vaccinia recombinante (VV) que expresaban L1 de HPV16 (HPV16L1) y L2 de HPV16 (HPV16L2) y se usaron como se ha descrito previamente (Zhou et al., 1990, J. Gen. Virol.71, 2185-2190).
El plásmido recombinante pLC201 se depositó con la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, Estados Unidos, el 27 de marzo de 1992 y recibió la designación 75226.
El virus de vaccinia recombinante pLC201VV se depositó con la American Type Culture Collection, 12301
Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, Estados Unidos el 3 de abril de 1992 y recibió la designación VR2371.
Purificación de partículas parecidas a virus
Se recogieron células CV-1 infectadas con virus recombinantes pLC201VV en Tris 10 mM (pH 9,0) 32 horas después de la infección y se homogeneizaron con un homogeneizador Dounce. Los homogeneizados se clarificaron por centrifugación a 2000 g para retirar los desechos celulares y se depositaron sobre una capa de sacarosa al 30% (peso/vol). El sedimento formado por centrifugación a 110.000 g en un rotor SW38 durante 90 minutos se suspendió en Tris 10 mM pH 9,0 y se depositó sobre un gradiente de sacarosa discontinuo del 20 al 60%. Después de la centrifugación a 100.000 g durante 18 horas, se recogieron 10 fracciones iguales de 0,25 ml. Las muestras se mezclaron con 0,6 ml de etanol. El sedimento obtenido después de la centrifugación a 4ºC y a 12.000 g durante 20 minutos se recogió para un análisis adicional. Para determinar la densidad de las partículas parecidas a virus, se realizó una sedimentación en gradiente de densidad en equilibrio en CsCl (1,30 g/ml). Después de centrifugar a 125.000 x g durante 20 horas, se recogieron 11 fracciones de 0,25 ml. Se determinó la densidad de cada fracción y cada una se examinó con respecto a las partículas parecidas a virus por microscopía electrónica de transmisión.
En la figura 2A, se infectaron células a 10 pfu/célula con VV de tipo silvestre (calle 1) y pLC201VV (calle 2) y se recogieron 48 horas después de la infección. La proteína L1 se detectó con el MAb específico de L1 de HPV16 Camvir 1. La proteína L1 de 57 kDa está indicada por la flecha. La unión de Camvir 1 a la proteína de 35 kDa en tres calles no es específica.
En la figura 3, se resolvieron ARNs extraídos a partir de células infectadas con pLC201VV (calle 2), pLC202VV (calle 3) que también incorpora genes que codifican proteínas E1 y E4 de HPV16, así como genes que codifican L1 y L2 de HPV16 o VV de tipo silvestre (calle 4), en un gel de formaldehído al 1,2%-agarosa. El ARN se transfirió a membranas de nylon y se hibridó con una sonda de L2 marcada con 32P. Se muestra el marcador cortado con HindIII de ADN lambda tratado con formaldehído (calle 1).
Microscopía electrónica
Se fijaron células CV-1 infectadas con virus de vaccinia recombinantes en glutaraldehído al 3% (vol/vol) en tampón cacodilato sódico 0,1 M y posteriormente se fijaron en tetróxido de osmio al 1%, se deshidrataron en alcoholes graduados y se incluyeron en resina epoxídica. Se cortaron secciones finas y se tiñeron con acetato de uranilo y citrato de plomo. Las fracciones del gradiente de sacarosa se secaron en rejillas EM y se sometieron a una tinción negativa con ácido fosfotúngstico al 1% (peso/vol) (pH 7,0).
Las fracciones se examinaron usando un microscopio electrónico de transmisión JEOL 1200Ex.
En la figura 4A, se muestran células CV-1 infectadas con pLC201VV durante 32 horas. En los núcleos de CV-1 se encontraron con frecuencia partículas con un diámetro de aproximadamente 40 nm (señalado por una flecha). La barra corresponde a 100 nm.
En la figura 4B, se muestra la fracción 5 del gradiente de sacarosa. Se observaron partículas parecidas a virus de papilomavirus, que aparentemente constan de series regulares de capsómeros (señalados con una flecha). La barra corresponde a 50 nm.
Análisis de productos ORF de HPV
La expresión de L1 de HPV16 se analizó por inmunoprecipitación e inmunotransferencia. Para la inmunoprecipitación, se lisaron células CV-1 infectadas con VV recombinante marcadas metabólicamente con ^{35}S, en tampón RIPA SDS al 0,1%, Triton X-100 al 1%, desoxicolato sódico al 1%, NaCl 150 mM, 0,5 \mug/ml de aprotinina, Tris-HCl 10 mM, pH 7,4). Se realizó un análisis de inmunotransferencia de partículas parecidas a virus parcialmente purificadas usando el MAb específico de L1 Camvir 1 (Mclean et al., 1990, J. Clin. Pathol. 43, 488-492) e IgG anti-ratón marcada con ^{125}I (Amersham), como se ha descrito previamente, usando muestras solubilizadas en tampón de carga de gel 2x SDS que contenía 2-mercaptoetanol. En la figura 13B, se muestra el análisis de la expresión del gen de L2 de HPV16. Para el análisis de la N-glicosilación, se tomaron partículas parecidas a virus parcialmente purificadas en hasta 100 \mul de tampón (acetato sódico 0,25 M, pH 6,5, EDTA 20 mM y 2-mercaptoetanol 10 mM) y se hicieron reaccionar con 0,5 u de endoglicosidasa F (Boehringer Mannheim) a 37ºC durante las 18 horas previas a la inmunotransferencia.
Se usó ácido micofenólico para seleccionar un virus de vaccinia recombinante para el plásmido de gpt pLC201 y éste se denominó pLC201VV. La síntesis de L1 en las células infectadas con pLC201VV se confirmó por inmunotransferencia e inmunoprecipitación. Tras la autorradiografía, la proteína L1 se mostró como una banda de aproximadamente 57 kDa. Una transferencia de northern del ARN extraído de las células CV-1 infectadas con estos virus recombinantes confirmó altos niveles de transcripción de ARNm de L2 en las células infectadas con cualquiera de estos virus (figura 3). La transcripción de L2 desde un promotor tardío de virus de vaccinia sintético proporcionó un modelo de transferencia de Northern heterogéneo, porque los ARNs tardíos de VV no usan una señal de terminación de la transcripción específica.
Se infectaron células CV-1 con pLC201VV y se examinaron para determinar las partículas parecidas a virus. Las micrografías electrónicas de secciones finas de células infectadas con pLC201VV, pero no de células de control infectadas sólo con vaccinia de tipo silvestre, mostraron partículas parecidas a virus de aproximadamente 40 nm en los núcleos de las células. En la mayoría de los casos, estas partículas estaban asociadas en cadenas, y cerca de la membrana nuclear (figura 4a). Las células infectadas con virus de vaccinia recombinantes que expresaban sólo L1 o sólo L2 de HPV 16 y producían la proteína (L1) o el ARNm (L2) correspondiente, no contenían partículas parecidas a virus. Las células infectadas simultáneamente con dos virus de vaccinia recombinantes diferentes, que expresaban L1 de HPV16 y L2 de HPV16 respectivamente, tampoco produjeron ninguna partícula parecida al virus HPV; aunque pudieron identificarse la proteína L1 y el ARNm de L2 en grupos de estas células infectadas doblemente, no se demostró la síntesis simultanea de L1 y L2 dentro de las células individuales.
En la figura 5, se centrifugaron partículas parecidas a virus de HPV16 obtenidas a partir de células CV-1 infectadas con pLC201VV sobre una capa de sacarosa y después se sometieron a sedimentación isopícnica con CsCl. Se encontraron partículas parecidas a virus (+) en las fracciones 8 y 9. En el inserto se muestra la micrografía electrónica de transmisión de una partícula teñida negativamente procedente de la fracción 8. Se indica la densidad (g/ml) de cada fracción de gradiente.
En la figura 6, se infectaron células CV-1 con pLC201VV durante 32 horas, y se purificaron partículas parecidas a virus en un gradiente de sacarosa. Las muestras se precipitaron con etanol y se trataron con endoglicosidasa F antes del análisis por inmunotransferencia con un anticuerpo anti-L1 de MPV16 Camvir I. Calle 1: partículas parecidas a virus purificadas; calles 2 y 3: después del tratamiento con endoglicosidasa F durante una noche. El doblete de L1 se indica por (=) y la L1 desglicosilada se indica por la flecha. A la izquierda se muestran los marcadores de peso molecular.
Para confirmar que las partículas parecidas a virus observadas por microscopía electrónica contenían la proteína L1 de HPV16, se sometieron extractos celulares de células infectadas con pLC201VV a una purificación parcial en un gradiente de sacarosa del 20 al 60%. Se recogieron 10 fracciones y se examinaron para determinar la proteína L1. Pudo detectarse L1 en las fracciones 3 a 7 y en la fracción 5 se encontró el mayor nivel de L1. Cada fracción también se examinó por EM para determinar la presencia de partículas parecidas a virus: éstas se observaron en la fracción 5. Un papilomavirus típico teñido negativamente con fosfotungstato sódico tiene 72 capsómeros muy compactados regulares (Finch y Klug, 1965, J. Mol. Biol. 13, 1-12; Rowson y Mahy, 1967, Bacteriol. Rev. 31, 110-131) y tiene un diámetro de aproximadamente 50 nm. El diámetro de las partículas parecidas a virus purificadas a partir de las células CV-1 infectadas varió entre 35 nm y 40 nm. Sin embargo, estas partículas parecidas a virus tenían una apariencia según microscopía electrónica (ME) similar a los papilomavirus, y podía reconocerse una serie regular de capsómeros (figura 4b). Por lo tanto, las partículas parecidas a virus identificadas en la fracción 5 del gradiente de sacarosa supuestamente eran series vacías y ensambladas incorrectamente de capsómeros de HPV. En CsCl, las partículas parecidas a virus de HPV16 sedimentaron a aproximadamente 1,31 g/ml (figura 5) y mostraron un aspecto de cápsida de papilomavirus vacía típica por electromicroscopía de transmisión (figura 5, inserto).
Camvir-1 identificó un doblete de proteína en transferencias de western de partículas parecidas a virus purificadas a partir de células CV-1 infectadas con pLC201VV (figura 6). L1 de HPV16 contiene cuatro sitios de N-glicosilación potenciales (asparagina 157, 242, 367 y 421). Para ensayar si el doblete representaba variantes de glicosilación del polipéptido L1, se sometieron partículas parecidas a virus parcialmente purificadas al tratamiento con endoglicosidasa F antes de la SDS-PAGE y de la inmunotransferencia. Esto ocasionó el reemplazo del doblete por una sola banda de un peso molecular aparente ligeramente menor, al peso molecular esperado de aproximadamente 57 kDa (figura 6, calles 2,3). Las partículas parecidas a virus recogidas a partir de las fracciones del gradiente de CsCl con una densidad flotante de 1,29-1,30 g/ml se usaron como antígeno en un ensayo ELISA. Todos los antisueros de ratones inmunizados con VLPs fueron positivos (tabla 2). Los sueros de control de ratones inmunizados con las fracciones similares de un gradiente de densidad preparado con un lisado de células CV-1 infectadas con vaccinia de tipo silvestre no fueron reactivos con las partículas parecidas a virus. Usando dos protocolos diferentes para aplicar partículas parecidas a virus como recubrimientos en placas ELISA (Dillner et al., 1991, J. Virol 65, 6862-6871), se intentó distinguir la reactividad con partículas parecidas a virus HPV nativas de la reactividad con las proteínas parcialmente desnaturalizadas de partículas rotas. Los antisueros murinos inducidos contra las VLPs fueron igualmente reactivos con las partículas nativas (DO 1,00\pm0,20) y desnaturalizadas (DO 1,60\pm0,45). Un panel de seis anticuerpos monoclonales específicos para epítopos de L1 definidos incluía solo 1 (Camvir 1) que era débilmente reactivo (DO 0,064) con VLPs nativas, y resultó ser mas reactivo con partículas desnaturalizadas (DO 0,107) que con partículas nativas, lo que sugiere que la reactividad era con la proteína L1 desnaturalizada en la preparación de VLP nativa.
En la figura 8 se uso IgG anti-ratón marcada con ^{125}I como segundo anticuerpo. La banda L1 de 57 kDa se indica por la flecha. Clave: sueros de ratones individuales inmunizados con VLPs: calles 1-5,BALB/c; calles 6-10, C57B1/6; calles 11,15, B10A; sueros de ratones individuales inmunizados con CFA; calle 16, BALB/c; calle 17, C57B1/6; calle 18, B10A; MAb Camvir 1 anti-L1 de HPV16, calle 19. Los pesos moleculares se indican a la izquierda.
La reactividad de los antisueros anti-VLP con las proteínas L1 y L2 de HPV16 se confirmó por inmunotransferencia usando proteínas L1 y L2 de HPV16 de baculovirus recombinante. Los sueros de todos los ratones inmunizados con las partículas parecidas a virus y cada uno de los anticuerpos monoclonales anti-L1 de HPV16, reconocieron una proteína de 57 kDa (figura 8) en los lisados de células de S. frugiperda infectadas con baculovirus productores de L1 recombinante, y no se observó una reactividad comparable con los lisados de células de S. frugiperda infectadas con baculovirus de tipo silvestre. La intensidad de la reactividad con la proteína L1 varió de un ratón a otro, pero todos los sueros fueron reactivos con una exposición prolongada de las inmunotransferencias. Se obtuvieron resultados similares con los lisados de células infectadas con baculovirus recombinantes de L2: tanto el antisuero murino anti-VLP como un antisuero de conejo contra la proteína L2 reaccionaron con una sola proteína en el lisado. Los sueros de ratones inmunizados solo con CFA no pudieron reaccionar con la proteína de los lisados de S. frugiperda infectada con baculovirus recombinante de L1 o L2.
Ejemplo de referencia 2
Definición de regiones antigénicas lineales de L1 de HPV16 proteína usando VLPs
En otra serie de experimentos, se determinaron las regiones antigénicas lineales de la proteína L1 de la cápsida de HPV16 usando VLPs sintéticas. En tales experimentos, se inmunizaron ratones de tres haplotipos (H-2^{d}, H-2^{b} y H-2^{d/b}) con partículas parecidas a virus de HPV16 (VLPs) sintéticas, producidas usando un virus de vaccinia doblemente recombinante para las proteínas L1 y L2 de HPV16. Los antisueros anti-VLP resultantes reconocían las cápsidas de HPV16 por medio de un ensayo ELISA y la proteína L1 y L2 de HPV16 recombinante de baculovirus en inmunotransferencia. Para definir las regiones inmunorreactivas de la proteína L1, se usaron péptidos solapantes que correspondían a la secuencia de aminoácidos de L1 de HPV16. La mayoría de los péptidos L1 fueron reactivos con la IgG de los ratones inmunizados con cápsidas de HPV16 sintéticas. Un algoritmo informático predijo siete epítopos B en L1 de HPV16, cinco de los cuales están dentro de péptidos muy reactivos con los antisueros murinos. Los antisueros murinos anti-VLP no pudieron reaccionar con los dos péptidos reconocidos por anticuerpos monoclonales anti-L1 de HPV16 inducidos por otros contra la proteína de fusión L1 recombinante. Concluimos que los epítopos inmunorreactivos de HPV16 definidos usando partículas parecidas a virus difieren significativamente de los definidos usando proteínas de fusión L1 de HPV16 recombinantes, lo que implica que tales proteínas de fusión pueden no ser los antígenos buscados para las respuestas inmunes específicas de L1 de HPV16 en pacientes infectados con HPV.
Producción de cápsidas de HPV16. Se usó el plásmido pLC201 que contenía las fases de lectura abierta (ORF) de L1 y L2 de HPV16 bajo el control de los promotores 4b (natural) y p480 (sintético) del virus de vaccinia para construir el virus de vaccinia recombinante (rVV) pLC201VV como se ha descrito previamente, pero con las excepciones que se mencionan a continuación. Se prepararon partículas parecidas al virus de HPV16 a partir de células CV-1 infectadas con pLC201VV como se ha mencionado previamente, pero las células se cultivaron en un medio que contenía rifampicina a 100 g/ml para prevenir el ensamblaje y la maduración del virus de vaccinia (Moss, "Virology" p685-703 Raven, Nueva York, 1985; Karacostas et al., PNAS 86, 8964-8967, 1989). Las células infectadas se recogieron y se lisaron por congelación y descongelación después de una homogeneización Dounce en Tris-HCl 10 mM (pH 9,0). Los lisados se clarificaron por centrifugación a 2000 g y después se centrifugaron a 100.000 g durante 2 horas en una capa de sacarosa al 20% en tampón PBS. El sedimento se mezcló con CsCl a una densidad inicial de 1,30 g/ml y se centrifugó a 100.000g durante 18 horas a 18º. Se recogieron fracciones y se realizaron inmunotransferencias en proteínas precipitadas con etanol. Se reunieron las fracciones que dieron un resultado positivo en el ensayo de la proteína L1 y la presencia de partículas parecidas a virus se confirmó por microscopía electrónica como se ha descrito anteriormente.
Producción de antisueros: Se inmunizaron grupos de cinco ratones BALB/c (H-2^{d}), C57B1/6 (H-2^{b}) y B10A (H-2^{b/d}) con partículas parecidas a virus de HPV16 purificadas en gradiente de CsCl. A los animales se les inocularon 5 \mug de proteína de la cápsida por inyección subcutánea. La inyección inicial se administró con adyuvante completo de Freund y se proporcionaron tres inyecciones adicionales a intervalos de tres semanas en solución salina. Catorce días después de la cuarta inyección, se recogieron los sueros y se almacenaron a -20º. Se usó material preparado a partir de células CV-1 infectadas con virus de vaccinia de tipo silvestre y se procesó exactamente como las células infectadas con pLC201VV, para inmunizar grupos de control de ratones de acuerdo con el mismo protocolo.
Péptidos: Se sintetizó una serie de péptidos 15-meros, que solapaban en cinco restos, y que incluían la secuencia de aminoácidos deducida de la proteína L1 de HPV16 (Seedorf et al., 1985, Virology 145, 181-185; Parton, 1990, Nucleic Acids Res 18 363), con el sistema de síntesis de péptidos múltiples DuPont RaMPS usando la química de Fmoc de acuerdo con protocolos convencionales (Fields y Noble, 1990 Int. J. Pept. Protein Res 35 161-214) y después se conjugaron con glutaraldehído en albúmina de suero bovino (BSA). Para indicar la posición de los aminoácidos (aa) en la proteína L1, el supuesto primer codón de iniciación se designó aminoácido numero 1 (tabla 1). Por razones técnicas, no se usó el péptido C-terminal correspondiente a los aa 521-531. Todos los péptidos usados tenían una pureza mayor del 85% a juzgar por el análisis de HPLC.
Proteínas L1 + L2 recombinantes: Se usaron baculovirus recombinantes que expresaban la L1 de HPV16 o la ORF de L2 de HPV16 para infectar células de insecto SF9. Después de tres días de incubación a 25ºC, las células se sedimentaron por centrifugación a 14.000 g durante 5 minutos. El sedimento se disolvió en tampón RIPA (HCl-Tris 20 mM; pH 7,6; EDTA 2 mM; NaCl 50 mM; desoxicolato al 1%; Triton X-100 al 1%; SDS al 0,25%, aprotinina al 1%, PMSF 1 mM).
Transferencia de Western: Se mezclaron partículas parecidas a virus o proteína L1 o L2 recombinante con tampón de carga 2X que contenía SDS al 2%/DTT y se dejaron en ebullición durante 5 minutos. Las proteínas se separaron en geles de poliacrilamida al 10% y se transfirieron a nitrocelulosa (Towbin et al., 1979, Virology 175 1-9). Los filtros se cortaron en tiras, y se incubaron en BSA al 3% en PBS a 37ºC durante 1 hora. Las tiras bloqueadas se expusieron a diversos antisueros murinos (1:200) o anticuerpos monoclonales durante una noche a 4º. Las proteínas reactivas se visualizaron por autorradiografía después de la reacción con IgG anti-ratón conjugada con ^{125}I (0,2 \muCi/ml) (Amersham).
Ensayo ELISA: Se ensayaron antisueros policlonales con respecto a la reactividad con cápsidas de HPV16 sintéticas por medio de un ensayo de inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) como se ha descrito previamente (Christensen et al., 1990, PNAS 76 4350-4354, Cowsert et al., 1987, JNC1 79 1053-1057). Para los ensayos con cápsidas de HPV16 sintéticas "nativas", se unieron 100 ng de proteína en PBS (pH 7,5) a cada pocillo de la placa ELISA (Flow Labs) por incubación durante una hora a 37º. Para los ensayos con partículas "desnaturalizadas", las partículas se suspendieron en tampón carbonato, pH 9,6, y se adsorbieron en la placa durante una noche a 37º. Todas las incubaciones posteriores se realizaron a temperatura ambiente. Las placas se lavaron con PBS y los sitios no unidos se bloquearon por incubación durante 1 hora en tampón de bloqueo (leche en polvo al 5% en PBS, pH 7,5). Se añadieron los antisueros murinos (1:200), previamente absorbidos con extracto de células CV-1 infectadas con VV de tipo silvestre, y se incubaron durante 1 hora, y las placas se lavaron con PBS. Se añadió IgG anti-ratón conjugada con peroxidasa de rábano picante (Sigma) a una dilución de 1:1000 en tampón de bloqueo y se incubó durante 1 hora seguido de 10 lavados con PBS. Se añadieron tampón substrato (pH 4,6) que contenía ABTS (Boehringer) y H2O2 y se tomó la lectura de DO415 después de 15 minutos.
Mapeo del epítopo B lineal: Se identificaron epítopos B por selección de antisueros de animales inmunizados contra la serie de péptidos solapantes de L1 de HPV16 por medio de un ELISA. Se diluyeron péptidos sintéticos acoplados a BSA en tampón carbonato sódico 10 mM (pH 9,3) y se adsorbieron en placas ELISA durante una noche a 4º. El bloqueo de los sitios de unión residuales en las placas se realizó usando BSA al 3% en PBS durante 2 horas a 37º. Se incubaron antisueros de ratón diluidos (1:500) con placas recubiertas a temperatura ambiente durante 2 horas. Las placas se lavaron con PBS que contenía Tween 20 (0,1%) y se incubaron con IgG anti-ratón conjugada con peroxidasa (1:1000) (Sigma) o IgA (1:2000) (Sigma) durante 2 horas. Las placas se lavaron y se revelaron con 0,5 mg/ml de ABTS en tampón substrato (pH 4,6) durante 15 minutos antes de registrar los valores de absorbancia a 415 nm. Un péptido se consideró reactivo si el valor DO 415 con el suero de ensayo era mayor que 3 SDs por encima de la media para el suero de control: esto proporcionó un valor límite de 0,260. Se consideró arbitrariamente que una DO 415 de cinco veces la DO 415 media obtenida con los sueros de control (0,55) definía un epítopo reactivo importante.
Anticuerpos monoclonales y antisueros: Se usaron cinco anticuerpos monoclonales (MAb) inducidos contra la proteína de fusión L1 de HPV16. Los MAb 5A4, 1D6, 3D1 y 8C4 (Cason et al., 1989, J. Gen Virol 70 2973-2987) se proporcionaron por Dr. Phil Shepherd de Londres, Reino Unido, y el MAb Camvir 1 (McLean et al., 1990, J. Clin. Pathol.43 488-492) se obtuvo de Dr. C. McLean (Departamento de Patología, Universidad de Cambridge). El antisuero de conejo contra la proteína de fusión L2 de HPV16-Trp-E se proporcionó por el Dr Denise Galloway (Universidad de Washington, Seattle).
Análisis de la secuencia de aminoácidos y predicción del índice antigénico: El índice antigénico (AI) (Jameson y Wolf, 1988, Comp. Appl., Biosci 4 181-186) es una medida de la probabilidad de que una secuencia peptídica sea antigénica. Se calcula sumando varias medidas ponderadas de la estructura secundaria. Los valores para la secuencia prevista de L1 de HPV16 se calcularon usando el software PLOTSTRUCTURE.
En las figuras 9 y 10, se muestra la reactividad (DO 415) de los sueros en ELISA con una serie de péptidos solapantes que corresponden a la secuencia de L1 de HPV16. Se indican los números de péptidos que corresponden a la secuencia de L1 de HPV16 (véase la tabla 1).
En las figuras 11 y 11A, el sistema de numeración para los aminoácidos corresponde a la L1 de HPV16 del primer supuesto codón de iniciación. Se indican las regiones con un valor de AI superior a 1,5.
En la figura 12, se muestran las regiones de L1 de HPV16 dentro de las cuales se ha demostrado que existen epítopos B en una serie de sistemas de mapeo. Los resultados con sueros de ratones inmunizados con las VLPs (partículas) y con anticuerpos IgA e IgG en sueros procedentes de humanos con cáncer cervical (IgA humana e IgG humana) (Dillner et al., 1990, Int. J Cancer 45 529-535) se obtuvieron usando péptidos solapantes. Se consideró que los antisueros anti-VLP murinos eran significativamente reactivos con un péptido si la DO era mayor que 0,55. Se representan los resultados de conejos inmunizados con una proteína de fusión L1 (Suero de Conejo) (Muller et al., 1990 J Gen Virol 71 2709-2717): éstos se determinaron usando una serie de clones de expresión de longitud parcial y la longitud entera de la secuencia dentro de la cual se muestra la situación del epítopo o epítopos. También se indican los epítopos B previstos por el algoritmo (Ordenador) (Jameson y Wolf Comp. Appl. Biosci 4 181-186 1988) y los epítopos reconocidos por los anticuerpos monoclonales anti-L1 de HPV16 publicados (Monoclonales) (Cason et al., J. Gen Virol. 70 2973-2987 1989; McLean et al., J. Clin. Pathol. 43 488-492 1990). La escala muestra la posición de los epítopos a lo largo de la proteína L1 de 531 aa, y se numera desde la metionina N-terminal (resto 1). Para cada péptido que contiene el epítopo, también se proporciona la localización exacta con respecto a la metionina
N-terminal.
Se usó una serie de péptidos sintéticos 15-meros de la proteína L1 de HPV16, que cubrían la longitud entera de la proteína con solapamientos de 5 aa, para definir los epítopos en L1 reconocidos por los diversos sueros inmunes. Cada uno de 16 antisueros de 3 cepas de ratón endógamas ensayadas, BALB/c(H-2^{d}),C57B1/6(H-2^{b}) y B10A (H-2^{b/d}), reconoció múltiples péptidos lineales de la proteína L1, y esencialmente los mismos péptidos de L1 de HPV16 fueron reconocidos por todas las cepas ensayadas (figura 10). Se ensayaron cinco sueros individuales de cada cepa. Un péptido se consideraba reactivo si la DO con un suero era mayor que la media + 3SD de las DOs de los sueros de control negativos; esto proporcionó un límite de reactividad de 0,260. Los sueros de ratones inmunizados con CFA solo tuvieron una reactividad de DO 415 menor de 0,260 con todos los péptidos de L1. Aunque se observó alguna variación en la intensidad de la reactividad de cada suero anti-VLP de una cepa dada con cada péptido, cada uno de los péptidos fue reactivo (DO>0,260) con todos o ninguno de los sueros anti-VLP de cada cepa de ratón. El isotipo del anticuerpo específico de péptido en el suero anti-VLP se examinó usando anticuerpos de inmunoglobulina anti-ratón específicos de IgG y IgA. La respuesta de IgG fue como se muestra (figuras 9 y 10) y no pudo detectarse ninguna reactividad de IgA significativa ante ningún péptido (DO < 0,050). Como la mayoría de los péptidos fueron reactivos con el suero anti-VLP, se usó un valor de DO arbitrario de cinco veces el valor negativo medio para definir las regiones reactivas principales de la proteína L1: los péptidos de L1 inmunorreactivos principales estaban distribuidos uniformemente a lo largo de la proteína L1, ya que siete estaban en el tercio amino terminal de la molécula, siete en el tercio central y ocho en el tercio carboxi terminal. Por el contrario, los anticuerpos monoclonales específicos para L1 de HPV16 reconocieron epítopos lineales principales individuales como se ha descrito previamente (Cason et al., mencionado anteriormente, McLean et al., 1990, mencionado anteriormente). Cuatro de los cinco anticuerpos monoclonales anti-L1 de HPV16 reactivos (5A4, 1D6, 3D1, 8C4) fueron reactivos con el péptido 30 (291-305), mientras que Camvir 1 reconoció al péptido 24 (231-245) (figuras 11 y 11A). Los sueros de ratones inmunizados con las partículas parecidas a virus no pudieron reaccionar con ninguno de estos péptidos.
Se usó un algoritmo para deducir los epítopos B probables de L1 de HPV16 basándose en la estructura secundaria prevista de la proteína. Se calcularon posibles regiones antigénicas como un índice antigénico (AI) (Jameson y Wolf, 1988, mencionado anteriormente) basándose en la flexibilidad de la cadena, la alta accesibilidad y el alto grado de hidrofilia (figura 11). Una región con un valor AI superior a 1,5 se consideró un epítopo B previsto. Se encontraron siete de tales regiones (aminoácidos 79-84, 105-108, 120-122, 134-135, 267-269, 298-299, 363-367) y cinco de estas siete regiones estaban dentro de los 22 péptidos en los que se vio reactividad importante con antisueros de ratones inmunizados con cápsidas de HPV16 sintéticas. En la figura 12, se muestra el resumen de la especificidad del epítopo B de antisueros de diferentes fuentes.
Considerando adicionalmente los ejemplos 1-2, se indica que los papilomavirus generalmente producen viriones en queratinocitos infectados que se pueden identificar fácilmente por microscopía electrónica (Almeida et al, 1962, J, Invest, Dermatol 38, 337-345) y que, en algunos casos, pueden purificarse y resultar ser infecciosos (Rowson y Mahy, 1967, Bacterial. Reo. 31, 110-131). Sin embargo, no se ven viriones de HPV16 en tejido epitelial cervical infectado con HPV16 aunque existe una transcripción de genes tardíos L1 y L2 de HPV16 en el epitelio genital diferenciado (Crum et al. 1988, J. Virol. 62,84-90) y la traducción de L1 produce proteína L1 inmunorreactiva en estos tejidos (Stanley et al 1989, Int. J. Cancer 43, 672-676). En esta memoria descriptiva, hemos demostrado que la expresión de genes L1 y L2 de HPV16 en células epiteliales es tanto necesaria como suficiente para permitir el ensamblaje de partículas parecidas a viriones de HPV16 y, de esta manera, las proteínas L1 y L2 de HPV16 no son defectuosas con respecto al montaje de los viriones. La expresión de genes tardíos de HPV16 en los tejidos parece estar estrictamente regulada por el medio epitelial (Taichman et al, 1983, J. Invest. Dermatol 1, 137-140). La imposibilidad de detectar viriones de HPV16 in vivo, a pesar de la transcripción de L1 y L2 y la traducción de L1, sugiere que hay un bloqueo post-transcripcional para la producción de L2 en el epitelio cervical, o un inhibidor del ensamblaje de viriones. En la línea de células W12 que contiene HPV16, derivada de tejido cervical, se observaron partículas parecidas a virus cuando las células experimentaron una diferenciación terminal in vivo en un micromedio murino (Sterling et al., 1990. J. Virol 64, 6305-6307) lo que sugiere que tales células no tienen bloqueado el ensamblaje de viriones y que una traducción insuficiente de L2 u otras razones desconocidas pueden explicar la incapacidad de mostrar viriones de HPV16 en tejidos cervicales.
Nuestros estudios de ME demuestran que el virión de HPV16 vacío tiene un tamaño medio de aproximadamente 40 nm que es más pequeño que otros papilomavirus, pero tiene una estructura superficial similar en comparación con otros papilomavirus tales como el papilomavirus de conejo (Finch y Klug, 1965 J. Mol. Biol. 13 1-12) o virus de verrugas humanas (Rowson y Mahy 1967, mencionado anteriormente). La sedimentación mostró una densidad de cápsida vacía de aproximadamente 1,31 g/ml, la densidad esperada de la cápsida del papilomavirus vacía en comparación con aproximadamente 1,36 g/ml en el caso de los viriones de HPV1a intactos (Doorbar y Gallimore, 1987, J. Virol. 61, 2793-2799).
La proteína L1 de HPV tiene sitios de glicosilación potenciales, y las partículas de BPV purificadas tienen formas electroforéticas minoritarias de L1 cuya movilidad es sensible al tratamiento con endoglicosidasa (Larsen et al., 1987, J. Virol 61, 3596-3601). Se ha observado que L2 de HPV1a y HPV11 es un doblete (Rose et al, 1990, J. Gen. Virol, 71, 2725-2729; Doorbar y Gallimore, 1987, mencionado anteriormente; Jin et al., 1989, J. Gen. Virol. 70, 1133-1140) y esto se ha atribuido a diferencias en la glicosilación. Nuestros datos demuestran que la proteína L1 de capsómeros de HPV16 también está glicosilada y que existen dos estados de glicosilación diferentes.
En esta memoria descriptiva usamos partículas parecidas a virus sintéticas para estudiar la inmunogenicidad de proteínas de la cápsida de HPV16 producidas en un sistema eucariota. Se usaron proteínas de la cápsida producidas en células eucariotas ya que las proteínas de la cápsida de papilomavirus producidas en células eucariotas experimentan una modificación post-traduccional (Browne et al., 1988 J. Gen. Virol. 69 1263-1273; Zhou et al, 1991 Virology 185 625-632) que puede ser un determinante importante de la presentación de antígenos. Se eligió un vector de expresión de vaccinia recombinante porque no se dispone de partículas de HPV16 nativas procedentes de lesiones clínicas o de la propagación viral en cultivo celular. Usamos las VLP de HPV16 para producir antisueros anti-VLP policlonales en ratones, y estos sueros se hicieron reaccionar fuertemente con las cápsidas de HPV16 por ELISA. Hemos demostrado por inmunotransferencia que los antisueros anti-VLP reconocieron epítopos en L1 desnaturalizada (figura 2) y L2. Además, los sueros, anti-VLP definieron 22 péptidos reactivos principales en una serie de 51 péptidos 15-meros de L1. Estos datos indican que los antisueros inducidos contra partículas virales, sin embargo, reconocen con frecuencia determinantes lineales. El perfil de reactividad humoral con la serie de péptidos L1 fue casi idéntico en dos cepas de ratón con el MHC diferente, lo que sugiere que hay suficientes epítopos T en L1 como para que la restricción del MHC no sea
limitante en la determinación de la respuesta humoral a la proteína L1 de HPV16 en las cepas de ratón ensayadas aquí.
Los datos para la especificidad del epítopo B obtenidos con nuestros antisueros anti-VLP murinos pueden compararse (figura 12) con un estudio similar de suero "inmune" de mujeres con displasia cervical (Dillner et al., 1990 Int. J. Cancer 45 529-535). Varios péptidos fueron reconocidos tanto por sueros humanos inmunes como por el antisuero anti-VLP, pero la mayoría de los péptidos reactivos con el antisuero anti-VLP murino no fueron reactivos con el suero humano inmune (figura 12). Ninguna de las regiones de L1 (221-235, 291-305) reconocidas por anticuerpos monoclonales específicos para L1 (Cason et al., 1989; McLean et al, 1990) fue reconocida por nuestro antisuero anti-VLP murino. Como se usaron proteínas de fusión L1 para inducir estos MAbs, y también se han usado para seleccionar anticuerpos contra L1 en suero humano, la ausencia de reactividad del suero humano con la proteína de fusión L1 (Jenison, et al., 1990, J. Infect. Dis 162 60-69; Köchel et al., 1991 Int. J. Cancer 48 682-688) puede explicarse por la incapacidad de las proteínas de fusión L1 de presentar los epítopos de L1 que se presentan al sistema inmune humano por la proteína L1 nativa.
La selección de anticuerpos contra la proteína L1 con péptidos solo puede detectar epítopos lineales: En un intento por determinar si la reactividad en el suero murino estaba dirigida tanto contra determinantes lineales como contra determinantes conformacionales, realizamos ensayos ELISA con las partículas tratadas de dos formas: una que se dice que conserva las partículas nativas y la otra para producir proteína desnaturalizada (Dillner et al., 1991, J. Virol. 65 6862-6871). No encontramos ningún suero o anticuerpo monoclonal reactivo exclusivamente con las partículas tratadas de una o la otra manera, aunque un MAB (Camvir 1) reaccionó más fuertemente con las partículas desnaturalizadas que con las "nativas". La ausencia de reactividad de la mayoría de los MAbs con las partículas desnaturalizadas sugiere que estaban sólo parcialmente desnaturalizadas, ya que los mismos anticuerpos reaccionan con la proteína desnaturalizada en una transferencia de Western. A la inversa, la reactividad de Camvir 1 con las partículas nativas no demuestra que el epítopo lineal reconocido por este anticuerpo esté reconociendo la proteína L1 desnaturalizada presente en alguna cantidad en la preparación de partículas nativas, y no tenemos pruebas de que se conserven las VLPs intactas en nuestras condiciones ELISA.
Como la mayoría de los anticuerpos reconocen determinantes dependientes de la conformación (Benjamín et al., 1984 Ann. Rev. Immunol. 2, 67-101), que pueden incluir varias secuencias polipeptídicas no contiguas (Amit et al., 1986 Science 233 747-753), es poco probable que los anticuerpos inducidos contra viriones reconozcan proteínas fusionadas o desnaturalizadas así como la proteína nativa, como se ha demostrado para antisueros de HPV1 (Steele y Gallimore, 1990 Virology 174 388-398). Se dispone de viriones de algunos HPV asociados a verrugas de la piel en cantidades suficientes para realizar ensayos serológicos (Almeida y Goe, 1965 Lancet 2 1205-1207; Kienzler et al., 1983 Br J. Dermatol. 108 665-672; Pfister y Zur Hausen, 1978 Int. J Cancer 21 161-165; Pyrhsonen et al., 1980 Br J. Dermatol 102 247-254; Pass y Maizel, 1973 J. Invest. Dermatol 60 307-311) para raspaduras de verrugas. La prevalencia de anticuerpos contra viriones purificados en suero inmune humano varía de un 20 (Genner, 1971, Acta. Derm. Venereol (Stockh) 51 365-373) a un 88% (Horison, 1975 Br J Dermatol 93 545-552) dependiendo del sistema de detección usado. Sin embargo, hasta hace poco no se disponía de viriones de los tipos de HPV genital para estudios serológicos. El sistema de xenoinjertos de ratones desnudos (Kreider et al., 1987 J Virol 61 590-593) ha permitido la producción de partículas de HPV11 para la detección de anticuerpos humanos (Bonnez et al., 1991 J. Gen Virol 72 1343-1347). Nosotros prevemos que las VLPs de HPV16 descritas en este documento permitirán estudios similares de serorreactividad contra partículas de HPV16 nativas a desarrollar, y la falta de reactividad observada en suero humano contra proteínas de fusión L1 de HPV15 (Jenison et al., 1991 J Virol 65 1208-1218; Köchel et al., 1991, mencionado anteriormente) puede equipararse simplemente a las observaciones similares con HPV1 (Steele y Gallimore, 1990 Virology 174 388-398).
Los anticuerpos contra proteínas estructurales de BPV tienen actividad neutralizadora de virus (Pilacinski et al., 1986 Ciba Found. Symp. 120 136-156) y los antisueros inducidos contra viriones de HPV11 purificados también pudieron neutralizar HPV11 infecciosos en un sistema de xenoinjerto de ratón atímico (Christensen y Kreider, 1990 J Virol 64 3151-3156). Nuestros resultados indicaron que las cápsidas de HPV16 sintéticas purificadas son inmunogénicas y podrían usarse para producir y evaluar anticuerpos neutralizadores de virus específicos para este virus oncogénico. La proteína L1 de BPV1 expresada en Escherichia coli y las partículas de BPV han protegido al ganado del desarrollo de verrugas (Pilacinski et al., 1986; Jarrett et al., 1990 Vet. Rec. 126 449-452). Una respuesta inmune similar a partículas parecidas a virus de HPV16 sería la base de una vacuna potencial para prevenir el cáncer cervical asociado a HPV16.
En la figura 13A, después de la infección con pLC201VV, se sometieron lisados de células CV-1 a sedimentación en gradiente en equilibrio. Las partículas parecidas a virus purificadas se examinaron por microscopía electrónica de transmisión después de una tinción negativa con ácido fosfotúngstico [barra =100 nm].
En la figura 13B, calle 1, el lisado de células CV1 infectadas con virus de tipo silvestre; calle 2, lisado del virus pLC201VV que expresa L1 y L2; calle 3, partículas parecidas a virus purificadas. La proteína L2 se trató con una sonda de anticuerpo anti-L2 de HPV16 de conejo seguido de ^{125}I-proteína A. Los pesos moleculares se indican a la izquierda y las bandas de L2 están indicadas con una flecha.
También puede hacerse referencia a las figuras 13A y 13B, que demuestran que VV doble recombinante de L1 y L2 de HPV16 contiene la proteína L2 como se demuestra por transferencia de western, usando VLPs purificadas y un antisuero de conejo inducido contra la proteína L2 recombinante de VV.
Ejemplo de referencia 3
VLPs de BPV1
También se ha descubierto que los viriones de papilomavirus bovino (BPV) 1 producidos de forma similar in vitro usando VV recombinante para las proteínas de la cápsida de BPV1 pueden compactar el ADN de BPV1. Los viriones completos pueden infectar una línea celular de fibroblastos de ratón, como se indica por la transcripción de la fase de lectura abierta viral de E1, y la infección se inhibe por incubación de los viriones con anticuerpos contra la proteína de la cápsida de BPV1. A diferencia de las observaciones para HPV16, las partículas parecidas a virus se ensamblan en células infectadas con VV recombinante para la proteína de la cápsida L1 de BPV sola, pero se requiere la proteína L2 para compactar el ADN de BPV1 para producir viriones infecciosos.
Haciendo referencia a las VLPs de HPV16 mencionadas anteriormente, estas partículas parecen constar de capsómeros típicos de los observados en partículas de HPV1 y BPV 1 purificadas a partir de lesiones clínicas (Bakar et al, J.C. Biphys J 60 1445-1456-1991, Staguet et al., J. Dermatologica 162 213-219,1981), aunque la morfología global de las partículas de HPV16 era bastante diferente de las partículas de HPV1 y BPV1 que se producen de forma natural. Como no se han purificado viriones de HPV16 naturales a partir de lesiones clínicas, se consideró deseable averiguar si esta diferencia morfológica era una propiedad de HPV16 o del sistema del virus de vaccinia recombinante (rVV) usado para producir los viriones. Por lo tanto, se realizo una serie de VVs, cada uno doblemente recombinante para las proteínas de la cápsida L1 y L2 de HPV6, HPV11 y de BPV1. La infección de células CV-1 con cada uno de estos VVs doble recombinantes produjo partículas parecidas a virus, y estas se parecían a los viriones de HPV1 y BPV1 auténticos más que las partículas de HPV16. Elegimos estudiar las partículas de BPV-1, ya que las partículas de BPV-1 naturales se caracterizan mejor morfológica e inmunológicamente (Chen et al., Baker et al 1991, Cowsert et al., J. Natl Cancer Inst. 79 1053-1057) y se dispone de líneas celulares que son permisivas para la replicación episomal del ADN de BPV-1 (Law et al., 1981 DNAS 78 2727-2731).
En la figura 13C, L1 de BPV1 se expresa a partir del promotor tardío de vaccinia natural p4b y L2 a partir del promotor tardío de vaccinia sintético p480. Como marcador de selección se usa el gen gpt de E. coli. Las secuencias flanqueantes son el gen B24R de vaccinia, que proporciona una secuencia de vaccinia para recombinación homóloga. Los genes de L1 y L2 de BPV1 se clonaron por PCR a partir del plásmido pml-1. Como el genoma de BPV1 está linealizado y clonado en este plásmido en un sitio BamHI en la ORF de L2 de BPV1, el genoma de BPV1 primero se aisló a partir de pml-1 por digestión con BamHI y se recircularizó, y el ADN de BPV-1 circularizado se usó como plantilla de PCR. Los cebadores oligonucleotídicos usados para la amplificación de L1 fueron:
3
El sitio BamHI está subrayado y el primer codón de metionina y el codón stop están en negrita. Los cebadores oligonucleotídicos para la amplificación de L2 fueron:
4
Los sitios Bgl II están subrayados y el primer codón de metionina y el codón stop están en negrita. El fragmento L1 de 1478 pb amplificado se clonó en el sitio BamHI en el plásmido RK19 para producir RK19BPVL1. El gen L1 y el promotor 4b de vaccinia se aislaron a partir de este plásmido por digestión con MluI y SmaI y se transfirieron al plásmido pSX3 para producir pSXBPVL1. El fragmento L2 de 1409 pb se digirió con BglII y se clonó en el sitio BamHI en el plásmido p480 para producir p480BPVL2. El promotor tardío de vaccinia sintético y el gen L2 de BPV se clonaron a partir de este plásmido en el sitio Sma1 en pSXBPVL1 para producir el plásmido doblemente recombinante pSXBPVL1L2. La transfección del ADN del pSXBPVL1 o pSXBPVL1L2 en monocapas de CV-1 infectadas con la cepa VV WR de tipo silvestre (wt) dio como resultado los rVVs pSXBPVL1VV (que expresa L1) y pSXBPVL1L2VV (que expresa L1 y L2). Los virus de vaccinia recombinantes se purificaron tres veces en presencia de ácido micofenólico. Después de la purificación, se realizaron preparaciones a gran escala de los recombinantes y se usaron a lo largo de estos experimentos.
En la figura 14A, se muestra un análisis de inmunoprecipitación de L1 de BPV1 recombinante en células infectadas con vaccinia. Las células CV-1 se infectaron a 10 pfu/células con virus de vaccinia de tipo silvestre (calle 1); pSXBPVL1VV (calle 2); y pSXBPVL1L2VV (calle 3), y se recogieron 48 horas después de la infección. La proteína L1 de BPV1 fue detectada con antisuero de conejo específico para BPV1. La proteína L1 de 58 kDa esta indicada por una flecha.
En la figura 14B, se muestra un análisis de transferencia de northern de la expresión de L2 de BPV1. El ARN extraído de células CV-1 infectadas con VV de tipo silvestre (calle 1); pSXBPVL1L2VV (calle 2) se trató con una sonda del gen L2 de BPV1. La longitud variable de los transcritos homólogos de L2 es típica de los transcritos expresados a partir de promotores de VV. Para la inmunoprecipitación, las células infectadas con rVV se lisaron con tampón RIPA (SDS al 0,1%, Triton X-100 al 1%, desoxicolato sódico al 1%, NaCl 150 mM, 0,5 \mug/ml de aprotinina, Tris 10 mM, pH 7,4). Las proteínas solubles se inmunoprecipitaron con anticuerpo anti BPV1 de conejo (DAKO, Glostrup) a una dilución de 1:1000. Se recogieron las proteínas precipitadas con proteína-A sepharose, se separaron en geles de SDS-poliacrilamida al 10% y se transfirieron a filtros de nitrocelulosa. Después de bloquear con leche desnatada, los filtros se expusieron al suero anti-BPV1 (1:1000) seguido de ^{125}I-proteína A (0,1 \muCi/ml) y se visualizaron por autorradiografía. El ARN total se extrajo de las células y se purificó por centrifugación a través de CsCl como se ha descrito previamente. El ARN total, 30 mg por pista, se procesó en geles de formaldehído al 1,2%-agarosa, se transfirió a membranas de nylon y se sometió a una sonda del gen L1 de BPV1 marcado con ^{32}P.
En la figura 15A, se hace referencia a pSXBPVL1L2VV. Algunas partículas de CON/BPV infectadas con
pSXBPVL1L2VV tienen núcleos densos a los electrones (inserto).
En la figura 15B, se hace referencia a pSXBPVL1VV. El virus de vaccinia contaminante en (A) está indicado por una "V". Las barras de escala representan 50 nm. Las células se recogieron dos días después de la infección, se lavaron con PBS, se lisaron por congelación y descongelación tres veces y se sonicaron en PBS. El desecho celular se "retiró por centrifugación de baja velocidad" y los sobrenadantes se depositaron sobre una capa de sacarosa al 20% (p/v) y se centrifugaron durante 2 horas a 100.000 x g. Los sedimentos se resuspendieron en PBS y se analizaron en un microscopio electrónico JEOL 1200EX después de la tinción negativa con ácido fosfotúngstico al 1% (p/v) (pH 7,0).
Como la relación entre las proteínas L1 y L2 en las partículas de BPV1 auténticas es de aproximadamente 5:1 (Pfister, H. & Fuchs, E. en Papillomaviruses and human disease (eds Syrjanen, K., Gissman, L & Koss, L. G.) vol. 1-18 (Springer-Verlag, Berlín, 1987) usamos un promotor natural fuerte para el gen L1 y un promotor sintético débil para el gen L2 para nuestro VV doble recombinante (figura 13C), y la relación resultante entre el ARNm de L1 y ARNm de L2 en una transferencia de northern de células CV-1 infectadas con rVV fue de aproximadamente 10:1. Las células CV-1 infectadas con este rVV expresaban la proteína L1 de BPV1 (figura 14A) y el ARNm de L2 (figura 14B), y pudieron purificarse grandes números de partículas parecidas a virus icosaédricos de 50 nm con una morfología aparentemente auténtica (figura 15a) a partir de las células infectadas. Nuestro trabajo previo con HPV16 había demostrado que se requerían tanto las proteínas L1 como las proteínas L2 para el ensamblaje de las partículas parecidas a virus de HPV16 como se ha descrito anteriormente, lo cual contrasta con la observación de que, en el caso del parvovirus (Kajigaya et al., 1991 DNAS 4646-4650), el virus de la lengua azul (London et al., 1991 Virology 182, 793-801) y el virus del polioma (Salunke et al., 1986, Cell 46, 895-904), las partículas parecidas a virus se ensamblan en células si se expresa la proteína de la cápsida principal sola como una proteína recombinante. Por lo tanto, produjimos un VV recombinante para L1 de BPV1 (figura 13C) y observamos que cuando las células CV-1 se infectaban con este VV, podían purificarse partículas parecidas a virus de morfología similar a las obtenidas con el VV doble recombinante de L1 y L2 (figura 15b). Se obtuvieron viriones icosaédricos vacíos similares después de la infección de células CV-1 con VV recombinante para las proteínas L1 de HPV6 o HPV11. La ausencia de viriones PV morfológicamente auténticos en células infectadas con la L1 de HPV16 y L2rVV, y la ausencia de viriones PV observada en tejido infectado con HPV16 por microscopía electrónica (Schneider (1987) Papilloaaviruses and Human Disease vol 19-39 Springer Verlag Berlín), sugiere que HPV16, a diferencia de otros PVs, puede ser defectuoso con respecto a la formación de la cápsida viral.
En el inserto de la figura 15A, se muestra una minoría de partículas parecidas a virus procedentes de células infectadas con L1/L2 rVV de VPV1.
A continuación se describe la estrategia de clonación para virus de vaccinia recombinantes dobles que expresan L1/L2 de HPV11 y L1/L2 de HPV6b:
Para L1 de HPV11:
5
El producto de PCR se digirió con BgIII/EcoRI y se clonó en RK19 bajo el control del promotor 4b. Después, la secuencia promotor/11L1 se clonó en un sitio BamHI de pSX3 que se transformó en una secuencia de extremos romos por Klenow. El plásmido resultante fue pSX11L1.
Para L2 de HPV11:
6
El fragmento de PCR digerido con BamHI/SmaI se clonó en p480 bajo el promotor tardío 28k sintético. Después, el fragmento promotor/11L2 se transfirió a pSX11L1. El plásmido de expresión recombinante doble 11L1/L2 se denominó pSX11L1/L2.
Para L1 de HPV6b:
7
El producto de PCR se cortó por BamHI/SmaI y se clonó en RK19 bajo el control del promotor 4b. El promotor/6L1 después se clonó en pSX3 para producir pSX6L1.
Para L2 de HPV6:
El L2 de HPV6 se aisló a partir del genoma de 6b por Accl/Xba1 (4422-5903). El fragmento se transformó en un fragmento de extremos romos por Klenow y se insertó en p480. El promotor 28k sintético más 6bL2 se clonó en pSX6L1 para formar el plásmido doble recombinante pSX6L1/L2.
Posteriormente, los plásmidos pSX11L1 y pSX11L1/L2 infectaron una célula hospedadora (por ejemplo, células CV1 o células C127) para producir VV pSX11L1 y VV pSX11L1/L2 que, después de la transfección de una célula hospedadora infectada con virus de vaccinia de tipo silvestre, formó VLPs que contenían proteína L1 (derivada de VV pSX11L1) y proteínas L1 y L2 (derivadas de VV pSX11L1/L2). De una manera similar, VV pSX6L1 y VV pSX6L1/L2, después de la transfección de una célula hospedadora, produjeron VLPs que contenían L1 de HPV6b y VLPs que contenían L1 de HPV6b y L2 de HPV6b.
También se apreciará que la invención incluye dentro de su alcance virus doblemente recombinantes para las proteínas de la cápsida de papilomavirus L1 y L2, así como virus recombinantes que contienen proteína L1 de la cápsida de papilomavirus.
Además se apreciara que la invención incluye dentro de su alcance un método de diagnosis de infecciones por papilomavirus por medio de ELISA que incluye la etapa de detección de partículas VLP que contienen proteínas L1 y L2.
TABLA 1 Péptidos solapantes de 15 AA de la secuencia prevista de la proteína L1 de HPV16
8
La secuencia de cada péptido L1 se proporciona usando el código de una sola letra. Se proporciona la localización de cada péptido dentro de la proteína L1 de HPV16, asignando la posición 1 a la metionina N terminal. Para estos experimentos no se usó el péptido C terminal corto (n 53).
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 2
9
* Los valores son unidades de DO 415 y se proporcionan como media \pm 1 desviación típica.

Claims (17)

1. Un método para producir partículas parecidas a virus (VLPs) de papilomavirus que comprende la etapa de:
(i)
producir VLPs en una célula hospedadora adecuada transfectada con una o más moléculas de ADN recombinante codificando cada una de ellas la proteína L1 de papilomavirus o una combinación de proteína L1 de papilomavirus y proteína L2 de papilomavirus por expresión de la proteína L1 o la combinación de proteínas L1 y L2;
en el que el papilomavirus es HPV18.
2. Un método según la reivindicación 1, que comprende además la etapa de:
(ii) obtener VLPs de las células transfectadas.
3. Un método según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que las moléculas de ADN que codifican las proteínas L1 y L2 están incluidas en la misma molécula de ADN.
4. Un método según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que las moléculas de ADN que codifican las proteínas L1 y L2 están incluidas en diferentes moléculas de ADN recombinante.
5. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la célula hospedadora en la etapa (i) fue transfectada usando un virus recombinante que contiene dicha una o más moléculas de ADN recombinante.
6. Un método según la reivindicación 5, en el que dicho virus recombinante se produjo infectando una célula hospedadora ya infectada con un virus de tipo silvestre usando un plásmido primario que contiene dicha(s) \hbox{molécula(s)} de ADN recombinante.
7. Un método según la reivindicación 6, en el que dicho plásmido primario contiene dicha(s) molécula(s) de ADN recombinante unida(s) a un promotor para potenciar la expresión de las proteínas L1 o L1 y L2 en la etapa (i).
8. Un método según la reivindicación 7, en el que antes de la formación de dicho plásmido primario, se insertó un gen que codifica dicha proteína L1 o L2 en un plásmido secundario que contiene dicho promotor antes de la formación del plásmido primario.
9. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en el que la célula hospedadora infectada con el virus de tipo silvestre fue transfectada tanto con dicho plásmido primario que contiene dicha molécula de ADN recombinante que codifica la proteína L1 como con el plásmido primario que tiene insertado en el mismo una molécula de ADN recombinante adicional que codifica la proteína L2 para formar un plásmido de expresión doble recombinante.
10. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, en el que dicho virus recombinante se deriva de baculovirus que infectan una célula de insecto tal como Spodoptera frugiperda.
11. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, en el que dicho virus recombinante se deriva de vaccinia virus.
12. Un método según la reivindicación 11, en el que la molécula de ADN recombinante contiene un gen L1 localizado aguas abajo de un promotor 4b de vaccinia.
13. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la célula hospedadora es una célula eucariota.
14. Un método según la reivindicación 13, en el que la célula eucariota se selecciona entre una célula de levadura, célula de insecto o célula de mamífero.
15. VLPs obtenibles según el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.
16. Una vacuna que comprende VLPs obtenibles según el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.
17. Una vacuna según la reivindicación 16, que comprende además un adyuvante.
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