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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Diese
Erfindung betrifft Papillomviren und insbesondere Antigene und Impfstoffe,
die in der Behandlung von Infektionen, die durch solche Viren verursacht
werden, wirksam sind.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Papillonvirusinfektionen
sind nicht nur in Menschen, sondern auch in Tieren wie Schafen,
Hunden, Rindern, Koyoten, Wölfen,
Opposums, Hirschen, Antilopen, Bibern, Schildkröten, Bären, Eidechsen, Affen, Schimpansen,
Giraffen, Impala, Elefanten, Walen, Katzen, Schweinen, Wüstenrennmäusen, Rothirschen
bzw. Elchen, Yaks, Delfinen, Papageien, Ziegen, Rhinozerosen, Kamelen,
Lemmingen, Gämsen,
Stinktieren, tasmanischen Beutelteufeln, Dachsen, Lemuren, Karibus,
Gürteltieren,
Molchen und Schlangen bekannt (siehe zum Beispiel „Papilloma
Virus Infections in Animals" von
J P Sundberg, die beschrieben sind in Papilloma viruses and Human
Disease, herausgegeben von K Syrjanen, L Gissmann und L G Koss,
Springer Verlag 1987).
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Es
ist auch bekannt (z.B. in Papilloma viruses and Human Cancer, herausgegeben
von H Pfister und veröffentlicht
von CRC Press Inc 1990), dass Papillomviren in einige verschiedene
Gruppen, wie humane Papillomviren (HPV) eingeteilt werden, die in
die Typen 1-56 in Abhängigkeit
von DNA Sequenzhomologie unterteilt werden. Eine klinisch-pathologische
Gruppierung von HPV und dem malignen Potenzial der Läsionen,
mit denen sie am häufigsten
assoziiert sind, kann wie folgt eingeteilt werden.
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In
einer ersten Gruppe können
die Typen 1 und 4, die gutartige (benigne) flache Warzen verursachen, die
Typen 2, 26, 28 und 29, die gutartige gemeine Warzen verursachen,
die Typen 3, 10 und 27, die gutartige flache Warzen verursachen
und Typ 7, der die Metzger's
Warzen verursacht, aufgelistet werden. Die erste Gruppe von Infektionen
findet in normalen oder immunkompetenten Individuen statt.
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In
einer zweiten Gruppe, die sich auf immungeschwächte Individuen bezieht, können die
Typen 5 und 8, die stark bösartige
(hochmaligne) makulare Läsionen
verursachen, die Typen 9, 12, 14, 15, 17, 19-25, 36 und 46-50, die
makulare oder flache Läsionen
verursachen, die gutartig oder selten bösartig sind, aufgelistet werden.
Diese makularen Läsionen
sind auch als Epidermodysplasia verrucciformis (EV) bekannt.
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In
einer dritten Gruppe, die insbesondere den Genitaltrakt infizieren,
können
die Typen 6, 11, 34 und 39, 41-44 und 51-55, die Kondylome verursachen,
die selten bösartig
sind, die Typen 13 und 32, die gutartige focale epitheliale Hyperplasie
verursachen, die Typen 16 und 18, die epitheliale Dysplasie und
andere Läsionen
verursachen, die beachtliches Potenzial aufweisen, einschließlich Bowenoide
Papulose, und die Typen 30, 31, 33, 35, 45 und 65, die Kondylome
mit mittlerem bösartigen
Potenzial verursachen, aufgelistet werden. Die Kondylome erscheinen
am häufigsten
im Anogenitaltrakt und insbesondere dem Gebärmutterhals (Zervix). Die Typen
16 und 18 sind mit dem Großteil
der in situ und invasiven Karzinome, der Zervix, der Vagina, der Vulva
und dem Analkanal assoziiert. Die Kondylome können auch im Luft- und Verdauungstrakt
auftreten.
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Insbesondere
HPV16 ist mit prämalignen
und malignen Erkrankungen des Genital-Harntraktes assoziiert, und
insbesondere mit Karzinomen der Zervix (Dürst et al., PNAS 80 3812-3815,
1983; Gissmann et al., J. Invest. Dermatol 83 265-285, 1984). Gegenwärtig gibt
es keine Informationen über
die Rolle von humoralen Antworten in der Neutralisierung von HPV16.
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Der
Nachweis von Antikörpern
gegen HPV16 Fusionsproteine (Jenison et al., J Virol 65 1208-1212, 1990;
Köchel
et al., Int. J Cancer 48 682-688, 1991) und synthetischen HPV16L1
Peptiden (Dillner et al., Int. J Cancer 45 529-535, 1990) in dem
Serum von Patienten mit HPV16 Infektion bestätigt, dass es B Epitope innerhalb
der Kapsidproteine von HPV gibt, obwohl wenige Patienten HPV16L1
spezifische Antikörper
aufweisen, die durch diese Techniken identifiziert wurden. Es gibt
kein System für
die HPV16 Vermehrung in vitro, und die humanen Genitalläsionen bilden
wenig HPV16 Virionen; deshalb standen HPV16 Teilchen bzw. Partikel
für immunologische
Untersuchungen nicht zur Verfügung.
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Die
tierischen Papillomviren können
auch das Rinderpapillomvirus (BPV) und insbesondere die Typen BVP1,
BVP2, BVP3, BVP4, BVP5 und BVP6 einschließen, die ebenfalls durch DNA
Sequenzhomologie differenziert werden. Im Allgemeinen infizieren
die anderen tierischen Papillomviren den Hirsch, Pferde, Kaninchen,
Hunde, Nager und Vögel.
Papillomviren sind kleine DNA-Viren, die für bis zu acht frühe und zwei
späte Gene
kodieren. (Bzgl. eines Übersichtsartikels
siehe Lancaster und Jenson 1987 Cancer Metast. Rev. S. 6653-6664;
und Pfister 1987 Adv. Cancer Res 48, 113-147). Die Organisation
der späten
Gene ist einfacher als die der frühen Gene. Die späten Gene
L1 und L2 überlappen
in den meisten Fällen
geringfügig
miteinander. Die putativen L2 Proteine sind hochkonserviert zwischen
verschiedenen Papillomviren, insbesondere die Sequenz von 10 basischen
Aminosäuren
an dem C-terminalen Ende. Die große Domäne in der Mitte zeigt nur geringe
geclusterte Ähnlichkeiten.
Der L1 ORF scheint jedoch übereinstimmend
in allen bekannten Fällen
konserviert zu sein (siehe Syrjanen et al., oben). Die Aminosäuresequenzhomologie
erreicht 50 % bei dem Vergleich zwischen HPV1a, HPV6b, BPV1 und
CRPV (Papillomvirus des Baumwollschwanz Kaninchens bzw. des cotton
tail rabbit).
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Bezüglich der
Immuntherapie betreffend Papillomvirusinfektionen wurden früher Verfahren
zur Behandlung von Warzen und epithelialen Hautläsionen entwickelt, welche Chirurgie
verwenden, die schmerzhaft und traumatisch sein kann, wobei Narbenbildung
oft ein Ergebnis mit dem Risiko der erneuten Infektion ist, die stattfinden
kann. Die Behandlung mit Chemikalien wurde ebenfalls verwendet.
Ein häufiges
Behandlungsmittel ist Salicylsäure,
die der Hauptbestandteil ist, in Stärken im Bereich von 10 % bis
40 % in Tinkturen und Pflastern. Formalin in Stärken von 3 %–20 % wurde
ebenfalls vorgeschlagen. Die Kryotherapie wurde für die Behandlung
von Hautwarzen verwendet. Glutaraldehyd als ein Behandlungsmittel
wurde ebenfalls verwendet. Podophyllin wurde ebenfalls mit unterschiedlichem
Erfolg für
sowohl Hautwarzen als auch anogenitalen Kondylome verwendet. Die
Arten der Chirurgie, die für
anogenitale Kondylome verwendet wurde, schlossen chirurgische Entfernung,
Kryochirurgie und Laserchirurgie ein. Die Verwendung von Interferonen
wurde ebenfalls vorgeschlagen (siehe Syrjanan et al., oben).
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Die
Antikörper
gegen das L1 Protein des Rinderpapillomvirus (BPV) weisen Virus
neutralisierende Aktivität
(Pilacinski et al., 1986) auf, und HPV11 Virionen können in
einem in vitro Modell durch spezifische Antiseren inaktiviert werden
(Christensen und Kreider, J Virol 64 3151-3156, 1990). Es gibt auch
einigen Beweis, dass die spontane Regression von HPV1 induzierten
kutanen Warzen mit gesteigerten humoralen Immunantworten gegenüber Warzenprotein
assoziiert ist (Kirchner, Prog. Med. Virol 33 1-41, 1986).
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Es
wurden auch Impfstoffe mit unterschiedlichem Erfolg vorgeschlagen.
Er wurde vorgeschlagen, Impfstoffe mit autogenen Tumorhomogenaten
zu verwenden [Abcarian et al., J. Surg Res 22: 231-236 (1977) Dis
Colon Rectum 25: 648-51 (1982) Dis Colon Rectum 19: 237-244 (1976)].
Jedoch wurde kürzlich
befürwortet,
dass die Patienten nicht länger
mit autogenen Impfstoffen auf Grund der potenziellen onkogenen Wirkung der
viralen DNA behandelt werden sollten (Bunney 1986 Br Med J 293 1045-1047).
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Bezüglich der
Herstellung von genetisch veränderten
Impfstoffen wurde diese Tatsache in Pfister (1990) oben diskutiert,
und es sieht so aus, dass Schwierigkeiten beim Erhalten eines wirksamen
Impfstoffs beobachtet wurden, auf Grund der Vielzahl von verschiedenen
Papillomvirus Typen. Pfister betont jedoch, dass das Augenmerk auf
die so genannten frühen
Proteine gerichtet werden sollte (d.h. E1, E2, E3, E4, E5, E6, E7
oder E8), weil es für
diese Proteine am wahrscheinlichsten ist, dass sie in proliferierenden
Basalzellen einer Warzeninfektion synthetisiert werden, im Vergleich
zu den Strukturproteinen, die in den oberen epidermalen Schichten
exprimiert werden. Deshalb scheint, nach Pfister (1990), das Viruskapsidprotein
bezüglich der
Verwendung in einem Impfstoff beschränkt zu sein.
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Die
Verwendung von rekombinanten Vacciniaviren in in vitro Testsystemen
für Papillomvirus
frühe Proteine
in eukaryotischen bzw. eukaryonten Zellen wurde ebenfalls in Pfister
(1990) diskutiert. Dies kann die Form eines Lebendimpfstoffs annehmen,
der aus genetisch modifiziertem Vacciniavirus besteht, der Papillomvirus
Proteine exprimiert oder auf der Oberfläche von Formaldehyd fixierten
autologen Zellen, die in vitro mit Vaccinia Rekombinanten infiziert
wurden oder mit anderen Expressionsvektoren transfiziert wurden.
Eine andere Strategie für
die Impfstoffentwicklung, wie im Pfister (1990) diskutiert, ist
die Verwendung eines immunstimulierenden Komplexes des Glycosids
Quil A.
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Daten über erfolgreiche
prophylaktische Impfung existieren nur für Rinder Fibropapillome aus
homogenisierten Homogenaten von Rinder Fibropapillomen, und von
ihnen wurde gezeigt, dass sie eine begrenzte Immunität bereitstellen
(Olsen et al., J Am Vet Med Assoc 135, 499 (1959) Cancer Res 22
463 (1962)). Ein Impfstoff einschließlich einem veränderten
L1 Fusionsprotein (Pilacinski et al., UCLA Symp. Molecular and Cellular
Biology; Neue Serie, Band 32; Papilloma Viruses Molecular and Clinical
Aspects, Alan R Liss New York 1985 257) wurde ebenfalls in Kälbern verwendet,
aber erwies sich als nicht erfolgreich in Menschen (Barthold et
al., J. Am Vet Med Assoc. 165, 276, 1974). In Pfister (1990) ist
angegeben, dass es gegenwärtig keinen
Beweis für
eine mögliche
Prävention
von HPV Infektion durch die Verwendung eines Kapsidprotein Impfstoffs
gibt, aber die Induktion einer Antitumorzellimmunität scheint
machbar zu sein.
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Die
L1 und L2 Gene waren die Basis für
Impfstoffe für
die Prävention
und Behandlung von Papillomvirusinfektionen, und Immunogene wurden
in der Diagnose unter Nachweis von Papillomviren verwendet (internationale
Patentanmeldungen WO 86/05816 und WO 83/03623). Jedoch scheint es,
dass keine kommerzielle Verwendung dieser Impfstoffe stattgefunden
hat.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Deshalb
ist es ein Ziel der Erfindung, virusartige Teilchen bzw. virusähnliche
Partikel (engl: virus like particles (VLPs)) bereitzustellen, die
als diagnostische Mittel ebenso nützlich sein können wie
für die
Bildung eines Bestandteils eines Impfstoffs für die Verwendung bei Papillomvirusinfektionen.
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Die
Erfindung schließt
deshalb in einem Aspekt ein Verfahren zur Herstellung von Papillomvirus ähnlichen
Partikeln (VLPs) ein, das die Schritte umfasst:
- (i)
Konstruieren eines oder mehrerer rekombinanter DNA-Moleküle, von
denen jedes ein Papillomvirus L1 Protein oder einer Kombination
von Papillomvirus L1 Protein und Papillomvirus L2 Protein kodiert;
und
- (ii) Transfizieren einer geeigneten Wirtszelle mit dem einen
oder mehreren rekombinanten DNA-Molekülen, so dass virusähnliche
Partikel (VLPs) innerhalb der Zelle nach Expression des L1 oder
der Kombination von L1 und L2 Proteinen gebildet werden.
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Die
Erfindung schließt
in einem anderen Aspekt einen Impfstoff ein, der Papillomvirus VLPs
in Kombination mit einem geeigneten Adjuvans enthält.
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Bezüglich Schritt
(i) wird nur Papillomvirus L1 Protein benötigt, um VLPs von einigen Papillomviren
zu bilden. Geeigneter Weise wird nur das L1 Protein benötigt, um
VLPs aus BVP1, HPV11 und HPV6 einschließlich HPV6b zu bilden. Jedoch
können
VLPs auch bezüglich
BPV1, HPV11 oder HPV6b gebildet werden, die sowohl L1 als auch L2
Proteine enthalten. Für
die Bildung von VLPs von anderen Papillomviren, wie HPV16, werden
sowohl die L1 als auch die L2 Proteine benötigt. Es wird auch angenommen,
dass diese Situation auf HPV18 anwendbar ist, das ähnliche
pathologische Symptome wie HPV16 und auch eine ähnliche DNA Sequenzhomologie
zeigt. Weiterhin ist vorgesehen, dass die L1 und L2 Gene in dasselbe
DNA rekombinante Molekül
oder in verschiedene DNA rekombinante Moleküle eingeschlossen werden können.
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Vorzugsweise
sind die rekombinanten DNA-Moleküle
in einem rekombinanten Virus enthalten, das die Wirtszelle transfizieren
kann. Geeignete Viren, die für
diesen Zweck verwendet werden können,
schließen
Baculovirus, Vaccinia, Sindbisvirus, SV40, Sendaivirus, Adenovirus,
Retrovirus oder Pockenviren ein. Geeignete Wirtszellen können Wirtszellen
einschließen,
die mit den obigen Viren verträglich sind,
und diese schließen
Insektenzellen wie Spodoptera frugiperda, CHO Zellen, Hühnchenembryo
Fibroblasten, BHK Zellen, humane SW13 Zellen, Drosophila, Moskitozellen,
abgeleitet von Aedes albopictus oder Affen epitheliale Zellen ein.
Es wird auch angenommen, dass andere eukaryonte Zellen Hefezellen
oder andere Säugerzellen
umfassen können.
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Das
DNA rekombinante Molekül
wird geeigneter Weise aus einer Quelle von Papillomvirusgenom erhalten,
wobei das L1 Protein oder L2 Protein durch PCR Amplifikation unter
Verwendung geeignet gestalteter Primer, wie im Folgenden diskutiert
wird, amplifiziert werden kann. Vorzugsweise wird ein Gen, welches
das L1 Protein kodiert, in ein Plasmid eingebaut, das einen geeigneten
Promotor und ein DNA-Fragment mit dem L1 Protein enthält, und
das Fragment und der Promotor werden in ein primäres Plasmid eingebaut, das
ein rekombinantes DNA-Molekül bilden
kann, das in einen rekombinanten Virusvektor, wie oben beschrieben,
eingebaut werden kann.
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Ein
Gen welches das L2 Protein kodiert, kann auch mit einem geeigneten
Promotor verbunden werden, und vorzugsweise werden ein DNA-Fragment,
welches das L2 Gen einbaut, und der Promotor in das primäre Plasmid
eingebaut, um ein doppelt rekombinantes Plasmid oder sekundäres Plasmid
bereitzustellen, wobei dieses Plasmid auch in einen rekombinanten
Virusvektor, wie oben beschrieben, eingebaut werden kann, um einen
doppelt rekombinanten Virusvektor zu bilden.
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Jedoch
schließt
die Erfindung auch die Ausführungsform
ein, in der das primäre
Plasmid und/oder das sekundäre
Plasmid eine geeignete Wirtszelle infizieren kann, um VLPs mit L1
Protein oder VLPs mit L1 und L2 Protein unter geeigneten experimentellen
Bedingungen herzustellen. Die zuletzt genannten VLPs sind das ideale
Immunogen für
einen Papillomvirus spezifischen Impfstoff, weil das L2 Protein
in einer natürlichen
Infektion immundominant ist.
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Andere
geeignete DNA rekombinante Moleküle
schließen
Cosmide ebenso wie rekombinante Viren ein. Geeignete Expressionssysteme
schließen
prokaryontische bzw. prokaryote Expressionssysteme einschließlich E.
coli und irgendeinen Plasmid oder Cosmid Expressionsvektor oder
eukaryonte Systeme einschließlich
der oben beschriebenen Wirtszellen in Kombination mit einem rekombinanten
Virusvektor oder alternativ Hefezellen und Hefeplasmide, ein.
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In
der Situation, wo Plasmide verwendet werden, die Gene einschließen, die
L1 oder sowohl L1 als auch L2 kodieren, und wo solche Plasmide eine
geeignete Wirtszelle für
die Herstellung von VLPs infizieren können, sollten solche Plasmide
auch einen geeigneten Promotor enthalten, um die Expression der
VLP Strukturproteine zu verstärken,
und einen Polymerase sollte ebenfalls verwendet werden, die mit
dem relevanten Promoter assoziiert ist. Jedoch können in dieser Situation VLPs
nur unter besonderen experimentellen Bedingungen erhalten werden.
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Die
L1 und L2 Gene können
häufig
durch irgendeinen Säuger
oder viralen Promotor mit einem Säuger oder viralen Polyadenylierungssignal
gesteuert werden. Vorzugsweise werden die L1 und L2 Gene von irgendeinem
Vacciniavirus Promotor transkribiert, der ein früher Promotor oder ein später Promotor
sein kann, je nach dem was als geeignet erachtet wird. Eine Liste
von solchen Promotoren wird in Davision und Moss (1989) J. Mol.
Biol 210 749-769 und (1989) J. Mol. Biol 210 771-784 angegeben.
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In
der experimentellen Arbeit, die stattgefunden hat, ist das L1 Gen
unterhalb eines Vaccinia 4b-Promotors angeordnet, und das L2 Gen
ist unterhalb eines synthetischen Vaccinia 28k späten Promotors
angeordnet. Die Wirtszelle sind Affen epitheliale Zellen.
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Die
VLPs können
aus den transfizierten Zellen durch irgendein geeignetes Reinigungsmittel
erhalten werden. Die VLPs können
mit irgendeinem geeigneten Adjuvans, wie ISCOMS, Alum, Freund'sches unvollständiges oder
vollständiges
Adjuvans, Quil A oder anderen Saponinen oder irgendeinem anderen
Adjuvans kombiniert werden, wie zum Beispiel in Vanselow (1987)
S. Vet. Bull. 57 881-896 beschrieben ist.
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Es
wird jetzt Bezug genommen auf verschiedene bevorzugte Ausführungsformen
der Erfindung, wie durch die beigefügten Zeichnungen dargestellt
wird. In diesen bevorzugten Ausführungsformen
sollte angemerkt werden, dass die spezifischen Papillomviren, VLPs
und spezifischen Konstrukte von DNA rekombinanten Molekülen beispielhaft
angegeben sind.
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KURZBESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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1 ist
eine schematische Darstellung von Plasmiden, die verwendet wurden,
um HPV16 rekombinante Vacciniaviren zu konstruieren.
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2A ist
eine Western Blot Analyse von rekombinantem HPV16 L1 in Vacciniavirus
infizierten CV-1 Zellen.
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3 ist
eine Northern Blot Analyse von rekombinanten Vacciniavirus infizierten
CV-1 Zellen.
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4A und 4B sind
eine Elektronenmikroskopie von HPV virusähnlichen Partikeln aus CV-1
Zellen, die mit rekombinantem Vacciniavirus infiziert wurden.
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5 stellt
eine CsCl Äquilibriums
Dichte-Gradienten Sedimentation von leerem HPV16 Kapsid dar.
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6 stellt
die Glykosylierung von L1 Proteinen in gereinigten Viruspartikeln
dar.
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7 ist
ein Flussdiagram der Konstruktionen von Plasmid pLC200, das L1 kodiert,
und pLC201, das L1 und L2 kodiert.
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8 ist
eine Western Blot Analyse der Reaktivität der murinen Seren mit Baculovirus
rekombinantem L1 Protein.
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Die 9 und 10 stellen
Kartierungsergebnisse für
Seren aus BALB/c, C57B1/6 und CBA Mäusen dar, die mit synthetischen
HPV16 Kapsiden und vereinigten CFA immunisierten Kontrollseren immunisiert wurden.
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Die 11 und 11A stellen die Reaktivität von zwei L1 spezifischen
MAbs mit einer Reihe von überlappenden
Peptiden des HPV16 L1 Moleküls
dar.
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11B stellt die antigene Index Vorhersage von HPV16
L1 dar.
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12 zeigt
eine Epitopkarte von HPV16 L1.
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13A stellt synthetische HPV16 VLPs, wie sie für die Immunisierung
verwendet wurden, dar.
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13B zeigt die Reaktivität der gereinigten VLPs mit
anti-HPV16 L2 Antiserum durch Western Blot.
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13C stellt Plasmide dar, die verwendet
wurden, um rekombinante Vacciniaviren im Verhältnis zu BPV1 zu konstruieren.
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Die 14A und 14B zeigen
die Analyse von BPV1 L1 und L2 Expression in CV-1 Zellen, die mit Wildtyp
und rekombinanten Vacciniaviren infiziert wurden; und
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Die 15A und 15B zeigen
eine Elektronenmikroskopie von BPV1 Kapsiden, die aus Zellen erhalten wurden,
die mit rekombinantem Vacciniavirus infiziert wurden.
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BEISPIEL 1: VLPs; DIE
VON HPV16 ABGELEITET SIND
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Das
HPV-16 L1 Gen, von dem zweiten ATG (nt5637) wurde durch Polymerase-Kettenreaktion aus pHPV16
(von Dr. L. Gissmann bereitgestellt) unter Verwendung der folgenden
Primer amplifiziert:
1/ 5'-CAGATCTAGTTCTCTTTGGCTGCCTAGTGAGGCC-3'
2/ 5'-CAGATCTAATCAGCTTACGTTTTTTGCGTTTAGC-3'
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Das
erste Methioninkodon und das Stoppkodon sind durch Unterstreichen
angegeben, und BgIII Stellen wurden eingeschlossen, um die Subklonierung
zu erleichtern. Das amplifizierte 1527 bp Fragment wurde mit Phenol
extrahiert und durch 1 % Agrosegel Elektrophorese gereinigt. Nach
Spaltung mit BgIII wurde das L1 Gen in die BamHI Stelle des RK19
Plasmids subkloniert (Kent 1988 Doktorarbeit, Universität von Cambridge),
das einen starken Vacciniavirus Promotor (4b) enthält. Das
resultierende Plasmid wurde sequenziert (Sanger et al., 1977, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 74,5463-5467) und verwendet, um ein Fragment
herzustellen, welches das HPV16 L1 Gen verbunden mit dem 4b-Promotor
durch Spaltung mit Mlul und Sst1 enthält. Dieses Fragment wurde mit
stumpfen Enden mit T4 DNA Polymerase versehen und in die BamHI Stelle
des Vaccinia Zwischenvektors pLC1 kloniert, der das B24R Gen von
Vacciniavirus (Kotwal und Moss, 1989, J. Virol. 63, 600-606; Smith
et al., 1989, J. Gen. Virol. 70, 2333-2343), ein E. coli pgt Gen
(Flakner und Moss, 1988, J. Virol. 64, 1849-1854; Boyle and Coupar,
1988, Gene 65, 123-128) und multiple Klonierungsstellen enthält, um das Plasmid
pLC200 herzustellen.
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Das
HPV16 L2 Gen wurde durch teilweise Spaltung von pHPV16 mit Acc1
hergestellt, um ein Fragment (4138nt-5668nt) herzustellen, das mit
Klenow aufgefüllt
und mit synthetischen BamHI Linkern verbunden wurde. Diese L2 Fragment
wurde in die BamHI Stelle eines pUC abgeleiteten Plasmids kloniert,
das als p480 bezeichnet wurde, das einen synthetischen Vaccinia
28K späten
Promotor, mit einigen Modifikationen enthält (Davison und Moss, 1989,
J. Mol. Biol. 210, 771-784).
Die Promotorsequenz ist wie folgt:
5'-GAGCTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGCATATAAATGGAGGTACCC-3'
wobei das späte Promotormotiv
unterstrichen ist. Ein Fragment mit dem L2 Gen, verbunden mit dem
28K-Promotor, wurde durch Spalten mit SstI/SalI isoliert, durch
T4 DNA-Polymerase mit stumpfen Enden versehen und anschließend in
die SstI und SalI Stellen von pLC200 kloniert, um pLC201 (1)
herzustellen.
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Im 1 stehen
HPV16 L1, L2 (offene Kästchen)
unter der Kontrolle der späten
Vacciniapromotoren (ausgefüllte
Kästchen).
Das E.coli gpt Gen (schraffiertes Kästchen) wird als Selektionsmarker
verwendet. Flankierende Sequenzen für homologe Kombination. Die
Richtung der Transkription ist durch Pfeile angegeben.
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Das
pLC2001 Plasmid wird anschließend
verwendet, um ein rekombinantes Vacciniavirus, wie kürzlich beschrieben
(Mackett et al., 1984, J. Virol. 49, 857-864) zu konstruieren. Rekombinantes
Virus pLC201VV und pLC202VV wurden durch Plaque Assay in der Anwesenheit
von Mycophenolsäure,
Xanthin und Hypoxanthin (Falkner und Moss, 1988) selektiert. Rekombinantes
Vacciniavirus (VV), das HPV16L1 und HPV16L2 exprimiert, wurde hergestellt
und verwendet wie zuvor beschrieben (Zhou et al., 1990, J. Gen.
Virol. 71, 2185-2190).
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Das
rekombinante Plasmid pLC201 wurde bei der American Type Culture
Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, USA am 27.
März 1992
hinterlegt, und ihm wurde die Bezeichnung 75226 zugewiesen.
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Rekombinantes
Vacciniavirus pLC201VV wurde bei der American Type Culture Collection,
12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, USA am 03. April 1992
hinterlegt, und ihn wurde die Bezeichnung VR2371 zugewiesen.
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REINIGUNG
VON VIRUSÄHNLICHEN
PARTIKELN
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CV-1
Zellen, die mit rekombinanten Viren pLC201VV infiziert wurden, wurden
in 10 mM Tris (pH 9,0) 32 hr nach der Infektion geerntet und mit
einem Dounce Homoginisator homogenisiert. Die Homogenate wurden
durch Zentrifugation bei 2000 g geklärt, um den Zelldebris zu entfernen
und auf ein 30 % (Gew./Vol) Sucrosekissen gelagert. Das Pellet,
das sich durch Zentrifugation bei 110.000 g in einem SW38 Rotor
für 90
min bildete, wurde in 10 mM Tris pH 9,0 suspendiert und auf einen
20-60 % diskontinuierlichen Sucrosegradienten gelagert. Nach Zentrifugation
bei 100.000 g für
18 hrs wurden 10 gleiche Fraktionen von 0,25 ml gesammelt. Die Proben
wurden mit 0,6 ml Ethanol gemischt. Das Pellet, das nach der Zentrifugation
bei 4°C
und 12.000 g für
20 Minuten erhalten wurde, wurde für die weitere Analyse gesammelt.
Um die Dichte der virusähnlichen Partikel
zu bestimmen, wurde eine Äquilibrium
Dichte-Gradienten Sedimentation in CsCl (1,30 g/ml) durchgeführt. Nach
Zentrifugation bei 125.000 × g
für 20
hrs wurden 11 Fraktionen mit 0,25 ml gesammelt. Die Dichte jeder
Fraktion wurde bestimmt, und jede wurde hinsichtlich virusähnlichen
Partikeln durch Transmissionselektronenmikroskopie untersucht.
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In 2A wurden
die Zellen bei 10 pfu/Zelle mit wt.VV (Spur 1) und pLC201VV (Spur
2) infiziert und 48 h nach der Infektion geerntet. Die L1 Proteine
wurden mit einem HPV16 L1 spezifischen MAb Camvir 1 nachgewiesen.
Das 57 kDa L1 Protein ist durch den Pfeil angezeigt. Die Bindung
von Camvir 1 an das 35 kDa Protein in allen drei Spuren ist unspezifisch.
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In 3 wurden
RNAs aus Zellen extrahiert, die mit pLC201VV (Spur 2), pLC202VV
(Spur 3), das auch Gene einschließt, die HPV16 Proteine E1 und
E4 kodieren ebenso wie Gene, die HPV16 L1 und L2 kodieren, oder
wt.VV (Spur 4) infiziert wurden, wurden auf einem 1,2 % Formaldehyd-Agarosegel
aufgetrennt. Die RNA wurde auf Nylonmembran transferiert und mit
einer 32P-markierten L2 Sonde hybridisiert.
Fomaldehyd behandelter Lambda DNA-HindIII geschnittener Marker ist
gezeigt (Spur 1).
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ELEKTRONONMIKROSKOPIE
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CV-1
Zellen, die mit rekombinantem Vacciniavirus infiziert wurden, wurden
in 3 % (Vol/Vol) Glutaraldehyd in 0,1 M Natrium Cacodylatpuffer
fixiert und in 1 % Osmiumtetroxid postfixiert, dehydriert in reinen
Alkoholen und in Epoxyharz eingebettet. Dünne Schnitte wurden geschnitten
und mit Uranylacetat und Leadcitrat gefärbt. Es wurden Fraktionen des
Sucrosegradienten auf EM-Gittern getrocknet, und mit 1 % (Gew./Vol.) Phosphorwolframsäure (pH
7,0) negativ gefärbt.
Die Fraktionen wurden unter Verwendung eines JEOL 1200Ex Transmissionselektronenmikroskops
untersucht.
-
In 4A sind
CV-1 Zellen, die mit pLC201VV für
32 Stunden infiziert wurden, gezeigt. In den CV-1 Kernen wurden
Partikel von ungefähr
40 nm Durchmesser (mit Pfeil versehen) häufig gefunden. Der Balken entspricht
100 nm.
-
In 4B ist
die Fraktion 5 des Sucrosegradienten gezeigt. Papillomvirus ähnliche
Partikel, die offensichtlich aus regulären Mustern von Kapsomeren
bestehen, wurden beobachtet (mit Pfeil versehen). Der Balken entspricht
50 nm.
-
ANALYSE VON
HPV ORF PRODUKTEN
-
Die
HPV16L1 Expression wurde durch Immunpräzipitation und Immunblot analysiert.
Für die
Immunpräzipitation
wurden 35S metabolisch markierte rekombinante
VV infizierte CV-1 Zellen in RIPA Puffer (0,1 % SDS, 1 % Tritron
X-100, 1 % Natiumdesoxycholate, 150 mM NaCl, 0,5 μg/ml Aprotinin,
10 mM Tris-HCl, pH 7,4) lysiert. Die Immunoblot Analyse von teilweise
gereinigten virusähnlichen
Partikeln, unter Verwendung des L1 spezifischen MAb Camvir 1 (McLean
et al., 1990, J. Clin. Pathol. 43, 488-492) und 125I
anti-Maus IgG (Amerscham) wurde wie zuvor beschrieben unter Verwendung
von Proben durchgeführt,
die in 2x SDS Gel Auftragspuffer mit 2-Mercaptoethanol gelöst wurden.
Die Analyse von HPV16L2 Genexpression ist in 13B gezeigt.
Für die
Analyse von N-Glycosylierung, wurden teilweise gereinigte virusähnliche
Partikel in 100 μl
Puffer aufgenommen (0,5 M Natriumacetat, pH 6,5, 20 mM EDTA und
10 mM 2-Mercaptoethanol) und mit 0,5 μl Endoglycosidase F (Boehringer
Mannheim) bei 37°C
für 18
hrs vor dem Immunoblotten umgesetzt.
-
Mycophenolsäure wurde
verwendet, um ein Vacciniavirus zu selektieren, das rekombinant
hinsichtlich des gpt Plasmids pLC201 ist, und dieses wurde als pLC201VV
bezeichnet. Die Synthese von L1 in Zellen, die mit pLC201VV infiziert
wurden, wurden durch Immunblotten und Immunipräzipitation bestätigt. Das
L1 Protein wurde als eine Bande in der Autoradiografie von ungefähr 57 kDa
gezeigt.
-
Ein
Northern Blot mit RNA, die aus CV-1-Zellen extrahiert wurde, die
mit diesen rekombinanten Viren infiziert wurden, bestätigte große Mengen
an L2 RNA Transkription in Zellen, die mit einem dieser Viren (3) infiziert
wurden. Die L2 Transkription von dem synthetischen Vacciniavirus
späten
Promotor ergab ein heterogenes Northern Blot Muster, weil VV späte RNAs
kein spezifisches Transkriptionsterminationssignal verwenden.
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Die
CV-1 Zellen wurden mit pLC201VV infiziert und hinsichtlich virusähnlicher
Partikeln untersucht. Die Elektronenmikrografen von dünnen Schnitten
von Zellen, die mit pLC201VV infiziert, aber nicht die Kontrollzellen,
die nur mit Wildtyp Vaccinia infiziert wurden, zeigten ungefähr 40 nm
virusähnliche
Partikel in den Zellkernen. In den meisten Fällen waren diese Partikel in
Ketten verbunden und lagen nahe der Kernmembran (4a).
Die Zellen, die mit rekombinanten Vacciniaviren infiziert wurden,
die nur HPV16L1 oder nur L2 exprimierten und das korrespondierende
Protein (L1) oder mRNA (L2) bildeten, enthielten keine virusähnlichen Partikel.
Zellen, die gleichzeitig mit zwei verschiedenen rekombinanten Vacciniaviren
infiziert wurden, die jeweils HPV16L1 und HPV16L2 exprimierten,
zeigten auch keine HPV ähnlichen
Partikel; obwohl L1 Protein und L2 mRNA in Pools dieser doppelt
infizierten Zellen identifiziert werden konnten, während die
gleichzeitige Synthese von sowohl L1 als auch L2 innerhalb einzelner
Zellen nicht nachgewiesen wurde.
-
In 5 wurden
HPV16 virusähnliche
Partikel, die aus CV-1 Zellen erhalten wurden, die mit pLC201VV
infiziert wurden, über
einem Sucrosekissen zentrifugiert und anschließend einer CsCl isopynischen Sedimentation
zugeführt.
Virusähnliche
Partikel (+) wurden in den Fraktionen 8 und 9 gefunden. Der Transmissionselektronenmikrograf
eines negativ gefärbten
Partikels aus Fraktion 8 ist in dem Insert gezeigt. Die Dichte (g/ml)
jeder Gradientenfraktion ist angegeben.
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In 6 wurden
CV-1 Zellen mit pLC201VV für
32 hrs infiziert, und virusähnliche
Partikel wurden auf einem Sucrosegradienten gereinigt. Die Proben
wurden mit Ethanol präzipitiert
und mit Endoglycosidase F vor der Analyse durch Immunblotten mit
einem anti-HPV16 L1 Antikörper
Camvir 1 behandelt. Spur 1: gereinigte virusähnliche Partikel; Spur 2 und
3: nach der Behandlung mit Endoglycosidase F über Nacht. Die L1 Doppellinie
ist durch (=) angegeben, und deglycosiliertes L1 ist durch den Pfeil
angegeben. Die Molekulargewichtsmarker sind auf der linken Seite
gezeigt.
-
Um
zu bestätigen,
dass die virusähnlichen
Partikel, die durch Elektronenmikroskopie beobachtet wurden, HPV16L1
Protein enthielten, wurden Zellextrakte aus pLC201VV infizierten
Zellen einer teilweisen Reinigung in einem 20 %–60 % Sucrosegradienten unterzogen.
Zehn Fraktionen wurden gesammelt und hinsichtlich L1 Protein untersucht.
Aus den Fraktionen 3 und 7 konnte L1 nachgewiesen werden, und in
Fraktion 5 wurde die höchste
Menge an L1 gefunden. Jede Fraktion wurde auch durch EM hinsichtlich
virusähnlicher
Partikeln untersucht: diese wurden in Fraktion 5 beobachtet. Ein
typisches Papillomvirus, das mit Natriumphosphowolfram negativ gefärbt wurde,
weist 72 reguläre
enggepackte Kapsomere auf (Finch und Klug, 1965, J. Mol. Biol. 13,
1-12; Rowson und Mahy, 1967, Bacteriol. Rev. 31, 110.131) und weist
einen Durchmesser von ungefähr
50 nm auf. Der Durchmesser der virusähnlichen Partikel, die aus
den infizierten CV-1 Zellen gereinigt wurden, schwankte zwischen
35 nm und 40 nm. Diese virusähnlichen
Partikel besaßen
jedoch eine ähnliche EM-Erscheinung
im Vergleich zu Papillomviren, und eine regelmäßige Anordnung von Kapsomeren
konnte erkannt werden (4b). Die virusähnlichen
Partikel, die in Fraktion 5 des Sucrosegradienten identifiziert
wurden, wurden deshalb als leer und nicht korrekt zusammengebaute
Anordnungen von HPV Kapsomeren angenommen. In CsCl sedimentierten
HPV16 virusähnlich
Partikel bei ungefähr
1,31 g/ml (5) und zeigten ein typisches
leeres Papillomviruskapsid Erscheinungsbild unter dem Transmissionselektronenmikroskop
(5, Insert).
-
Camvir
1 identifizierte ein Proteinduplett in Western Blots von virusähnlichen
Partikeln, die aus pLC201VV infizierten CV-1 Zellen (6)
gereinigt wurden. HPV16L1 enthält
vier potenzielle N-Glycosylierungsstellen (Asparagin 157, 242, 367
und 421). Um zu untersuchen, ob das Duplett Glykosylierungsvarianten des
L1 Polypeptids darstellte, wurden teilweise gereinigte virusähnliche
Partikel einer Behandlung mit Endoglycosidase F vor der SDS-PAGE
und dem Immunblotten unterzogen. Dies führte zu dem Austausch des Dupletts
durch eine einzelne Bande von geringfügig niedriger auftretendem
Molekulargewicht, bei dem erwarteten Molekulargewicht von ungefähr 57 kDa
(6, Spur 2, 3).
-
Die
virusähnlichen
Partikel, die aus Fraktionen des CsCl Gradienten mit einer Auftriebsdichte
von 1,29-1,30 g/ml gesammelt wurden, wurden als Antigen in einem
ELISA Assay verwendet. Alle Antiseren von Mäusen, die mit VLPs immunisiert
wurden, waren positiv (Tabelle 2). Kontrollseren von Mäusen, die
mit ähnlichen
Fraktionen eines Dichtegradienten immunisiert wurden, der mit Lysat
aus CV-1 Zellen hergestellt wurde, die mit Wildtyp Vaccinia infiziert
wurden, waren mit den virusähnlichen
Partikeln nicht reaktiv. Unter Verwendung von zwei verschiedenen
Protokollen, um virusähnlichen
Partikel auf ELISA Platten zu schichten (Dillner et al., 1991, J
Virol 65, 6862-6871) wurden Versuche unternommen, um die Reaktivität mit nativen
HPV virusähnlichen
Partikeln von der Reaktivität
mit den teilweise denaturierten Proteinen von zerstörten Partikeln zu
vergleichen. Die murinen Antiseren, die gegen die VPLs gerichtet
waren, waren gleichmäßig reaktiv
mit den nativen (OD 1,00 ± 0,20)
und den denaturierten (OD 1,60 ± 0,45) Partikeln. Ein Muster
von 6 monoklonalen Antikörpern,
die spezifisch für
definierte L1 Epitope sind, schloss nur 1 (Camvir 1) ein, das schwach
reaktiv (OD 0,064) mit nativen VLPs war, und es zeigte sich als
reaktiver mit denaturierten Partikeln (OD 0,107) als mit nativen
Partikeln, was nahe legt, dass die Reaktivität an dem denaturierten L1 Protein
in der nativen VLP Präparation
hing.
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In 8 wurde 125I-markiertes anti-Maus IgG als der zweite
Antikörper
verwendet. Die 57 kDa L1 Bande ist durch den Pfeil gekennzeichnet.
Schlüssel:
Seren aus einzelnen Mäusen,
die mit VLPs immunisiert wurden: Spuren 1-5, BALB/c; Spuren 6-10,
C57B1/6; Spuren 11-15, B10A; Seren von einzelnen Mäusen, die
mit CFA immunisiert wurden; Spur 16, BALB/c; Spur 17, C57B1/6; Spur
18, B10A; anti-HPV16L1 MAb Camvir 1, Spur 19. Die Molekulargewichte
sind auf der linken Seite angegeben.
-
Die
Reaktivität
der anti-VLP Antiseren mit den L1 und L2 Proteinen von HPV16 wurde
durch Immunblot unter Verwendung von Baculovirus rekombinanten HPV16L1
und L2 Proteinen bestätigt.
Die Seren von allen Mäusen,
die mit den virusähnlichen
Partikeln immunisiert wurden und jeder der monoklonalen anti-HPV16L1 Antikörper erkannte
ein 57 kDa Protein (8) in den L1 rekombinanten Baculovirus
infizierten S. frugiperda Zelllysaten, und es wurde keine vergleichbare
Reaktivität
mit Lysaten aus S. frugiperda Zellen beobachtet, die mit Wildtyp
Baculovirus infiziert wurden. Die Intensität der Reaktivität mit dem
L1 Protein variierte von Maus zu Maus, aber alle Seren waren mit
der verlängerten
Reaktionszeit des Immunblots reaktiv. Ähnliche Ergebnisse wurden mit
den L2 rekombinanten Baculovirus infizierten Zelllysaten beobachtet:
murine anti-VLP Antiseren und ein Kaninchen Antiserum gegen L2 Protein
reagierten beide mit einem einzelnen Protein in dem Lysat. Die Seren
von Mäusen,
die mit CFA alleine immunisiert wurden, reagierten nicht mit Protein
aus Lysaten von L1 oder L2 rekombinanten Baculovirus infizierten
S. frugiperda.
-
BEISPIEL 2: DEFINITION
VON LINEAREN ANTIGENEN REGIONEN VON HPV16L1
-
PROTEIN VERWENDENDE
VLPs
-
In
einer weiteren Reihe von Experimenten wurden die linearen antigenen
Regionen des HPV16 L1 Kapsidproteins unter Verwendung von sythetischen
VLPs bestimmt. In solchen Experimenten wurden Mäuse mit drei Haplotypen (H-2d, H-2b, und H-2d/b) mit synthetischen HPV16 virusähnlichen
Partikeln (VLPs) immunisiert, die unter Verwendung einer Vacciniavirus
doppelten Rekombinante für
die L1 und L2 Proteine von HPV16 hergestellt wurden. Die resultierenden
anti-VLP Antiseren erkannten HPV16 Kapside durch ELISA Assay und
Baculovirus rekombinantes HPV16L1 und L1 Protein in Immunblots.
Es wurden überlappende
Peptide verwendet, die der Aminosäuresequenz von HPV16L1 entsprechen,
um die immunreaktiven Regionen des L1 Proteins zu definieren. Der
Hauptteil der L1 Peptide war mit IgG aus den Mäusen reaktiv, die mit den synthetischen
HPV16 Kapsiden immunisiert wurden. Ein Computeralgorithmus sagte
sieben B Epitope in HPV16L1 vorher, von denen fünf innerhalb von Peptiden lagen,
die mit murinen Antiseren stark reaktiv waren. Die murinen anti-VLP
Antiseren reagierten nicht mit den zwei Peptiden, die durch anti-HPV16L1
monoklonale Antikörper
erkannt wurden, die von anderen gegen rekombinantes L1 Fusionsprotein
hergestellt wurden. Wir schlossen daraus, dass die immunreaktiven
Epitope von HPV16, die unter Verwendung von virusähnlichen
Partikeln definiert wurden, sich signifikant von jenen unterschieden,
die unter Verwendung von rekombinanten HPV16L1 Fusionsproteinen
definiert wurden, was impliziert, dass solche Fusionsproteine nicht
die Antigene sind, um nach HPV16L1 spezifischen Immunantworten in
HPV infizierten Patienten zu suchen.
-
Herstellung
von HPV16 Kapsiden. Das Plasmid pLC201 mit HPV16L1 und L2 offenen
Leserahmen (ORFs) unter der Kontrolle der Vacciniavirus Promotoren
4b (natürlich)
und p480 (synthetisch) wurden verwendet, um das rekombinante Vacciniavirus
(rVV) pLC201VV wie zuvor beschrieben zu konstruieren, aber mit den Ausnahmen,
die unten erwähnt
sind. Es wurden HPV16 virusähnliche
Partikel aus pLC201VV infizierten CV-1 Zellen wie zuvor erwähnt hergestellt,
aber die Zellen wurden in Medium kultiviert, das Rifampicin in 100 μg/ml enthielt,
um den Zusammenbau und die Reifung von Vacciniavirus zu verhindern
(Moss, „Virology" S. 685-703 Raven,
New York, 1985; Karacostas et al., PNAS 86, 8964-8967, 1989). Die
infizierten Zellen wurden geerntet und durch Einfrieren und Auftauen
nach einer Dounce Homogenisierung in 10 mM Tris-HCl (pH 9,0) lysiert. Die
Lysate wurden durch Zentrifugation bei 2.000 g geklärt und anschließend bei
100.000 g für
2 hr über
einem 20 % Sucrosekissen in PBS Puffer zentrifugiert. Das Pellet
wurde mit CsCl in einer anfänglichen
Dichte von 1,30 g/ml gemischt und bei 100.000 g für 18 hr
bei 18°C
zentrifugiert. Die Fraktionen wurden gesammelt und Immunblots wurden
auf Ethanol präzipitierten
Proteinen durchgeführt.
Die für
L1 Protein positiv getesteten Fraktionen wurden vereinigt, und die
Anwesenheit von virusähnlichen
Partikeln wurde durch Elektronenmikroskopie wie oben beschrieben
bestätigt.
-
Herstellung
von Antiseren. Es wurden Gruppen von fünf Mäusen BALB/c (H-2d),
C57B1/6 (H-2b) und B10A (H-2b/d)
mit CsCl Gradient gereinigten HPV16 virusähnlichen Partikeln immunisiert.
Die Tiere wurden mit 5 μg
Kapsidprotein durch subkutane Injektion inokuliert. Die anfängliche
Injektion wurde mit Freund'schem
vollständigen
Adjuvans verabreicht, und drei weitere Injektionen in dreiwöchigen In tervallen
wurden in Salzlösung verabreicht.
Vierzehn Tage nach der vierten Injektion wurden die Seren gesammelt
und bei -20°C
gelagert. Material, das von CV-1 Zellen, die mit Wildtyp Vacciniavirus
infiziert wurden, hergestellt und exakt wie für pLC201VV infizierte Zellen
verarbeitet wurde, wurde verwendet, um Kontrollgruppen von Mäusen nach
demselben Protokoll zu immunisieren.
-
Peptide.
Eine Reihe von 15-mer Peptiden, die um fünf Reste überlappen und die abgeleitete
Aminosäuresequenz
von HPV16L1 Protein umspannen (Seedorf et al., 1985, Virology 145
181-185; Parton, 1990, Nucleic Acids Res 18 363) wurde mit dem DuPont
RaMPS multiplen Peptidsythesesystem unter Verwendung von Fmoc Chemie
gemäß Standardprotokollen
hergestellt (Fields und Noble, 1990 Int. J. Pept. Proetin Res 35 161-214)
und anschließend
mit Glutaraldehyd an Rinderserum Albumin (BSA) konjugiert. Um die
Position der Aminosäuren
(aas) in dem L1 Protein zu notieren, wurde das putative erste Initationskodon
als Aminosäurenummer
1 bezeichnet (Tabelle 1). Aus technischen Gründen wurde das C-terminale Peptid,
das den aas 521-531 entspricht, nicht verwendet. Alle verwendeten
Peptide waren größer als
80 % rein, wie durch HPLC Analyse bewertet wurde.
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Rekombinante
L1 + L2 Proteine. Rekombinante Baculoviren, die den HPV16L1 oder
den HPV16L2 ORF exprimieren, wurden verwendet, um Insekten SF9 Zellen
zu infizieren. Nach 3 Tagen Inkubation bei 25°C wurden die Zellen durch Zentrifugation
bei 14.000 g für
5 min pelletiert. Das Pellet wurde in RIPA Puffer (20 mM Tris-HCl,
pH 7,6; 2 mM EDTA; 50 mM NaCl; 1 % Desoxycholat; 1 % Triton X-100;
0,25 % SDS, 1 % Aproptinin; 1 mM PMSF) gelöst.
-
Western
Blotten. Virusähnliche
Partikel oder rekmbinantes L1 oder L2 Protein wurde mit 2x Autragungspuffer
mit 2 % SDS/DTT gemischt und für
5 min aufgekocht. Die Proteine wurden in 10 % Polyacrylamidgelen
getrennt und auf Nitrocellulose geblottet (Towbin et al., 1979,
Virology 175 1-9). Die Filter wurden in Streifen geschnitten, in
3 % BSA in PBS bei 37°C
für 1 hr
inkubiert. Die geblockten Streifen wurden gegenüber verschiedenen murinen Antiseren
(1:200) oder monoklonalen Antikörpern über Nacht
bei 4°C
ausgesetzt. Die reaktiven Proteine wurden durch Autoradiografie
nach Reaktion mit 125I-konjugiertem anti-Maus
IgG (0,2 μCi/ml)
(Amersham) sichtbar gemacht.
-
ELISA
Assay. Polyklonale Antiseren wurden hinsichtlich der Reaktivität mit synthetischen
HPV16 Kapsiden durch einen Enzym-verknüpften Immunosorbent Assay (ELISA)
wie zuvor beschrieben untersucht (Christensen et al., 1990, PNAS
76 4350-4354, Cowsert et al., 1987, JNC1 79 1053-1057). Für die Assays
mit „natürlichen" synthetischen HPV16
Kapsiden wurden 100 ng Protein in PBS (pH 7,5) an jede ELISA Plattenvertiefung
(Flow Labs) durch Inkubation für
1 hr bei 37°C
angeheftet. Für
die Assays mit „denaturierten" Partikeln wurden
die Partikel in Carbonatpuffer, pH 9,6 suspendiert und an die Platte Übernacht
bei 37°C
adsorbiert. Alle weiteren Inkubationen wurden bei Raumtemperatur
durchgeführt.
Die Platten wurden mit PBS gewaschen, und nicht angeheftete Stellen
wurden durch Inkubation für
1 hr in Blockierungspuffer (5 % Milchpulver in PBS, pH 7,5) blockiert.
Die murinen Antiseren (1:200), die zuvor mit Wildtyp VV-infiziertem
CV-1 Zellextrakt absorbiert wurden, wurden zugegeben und für 1 hr inkubiert,
und die Platten wurden mit PBS gewaschen. Mehrrettich Peroxidase
konjugiertes anti-Maus IgG (Sigma) in einer 1:1.000 Verdünnung in
Blockierungspuffer wurde zugegeben und für 1 hr inkubiert, gefolgt von
10 Waschschritten mit PBS. Es wurde Substratpuffer (pH 4,6) mit
ABTS (Boehringer) und H2O2 zugegeben
und die OD415 nach 15 min ausgelesen.
-
Lineare
B Epitopkartierung. Es wurden B Epitope durch Screenen von Antiseren
von immunisierten Tieren gegen einen Satz von überlappenden HPV16L1 Peptiden
durch ELISA identifiziert. Es wurden synthetische Peptide, die an
BSA gekoppelt waren, in 10 mM Natriumcarbonatpuffer (pH 9,3) verdünnt und
an ELISA Platten Übernacht
bei 4°C
adsorbiert. Das Blockieren der restlichen Bindungsstellen auf den
Platten wurde unter Verwendung von 3 % BSA in PBS für 2 hr bei
37° durchgeführt. Verdünnte Maus
Antiseren (1:500) wurden mit beschichteten Platten bei Raumtemperatur
für 2 hr
inkubiert. Die Platten wurden mit PBS mit Tween 20 (0,1 %) gewaschen
und mit Peroxidase konjugiertem anti-Maus IgG (1:1.000) (Sigma)
oder IgA (1:2.000) (Sigma) für
2 hr inkubiert. Die Platten wurden gewaschen und mit 0,5 mg/ml ABTS
in Substratpuffer (pH 4,6) für
15 min vor der Auf nahme der Absorptionswerte bei 415 nm entwickelt.
Ein Peptid wurde als reaktiv erachtet wenn der OD 415 Wert mit dem
Testserum größer als
3 SDs über
dem Durchschnitt für
das Kontrollserum lag: Dies ergab einen Ausschlusswert von 0,260.
Eine OD 415 von fünf
mal größer als
die durchschnittliche OD 415, die mit Kontrollseren (0,55) erhalten
wurde, wurde willkürlich
dahingehend erachtet, dass sie ein hauptreaktives Epitope definiert.
-
Monoklonale
Antikörper
und Antiseren. Fünf
monoklonale Antikörper
(MAb), die gegen das HPV16L1 Fusionsprotein gerichtet sind, wurden
verwendet. Die MAb 5A4, 1D6, 3D1 und 8C4 (Cason et al., 1989, J.
Gen Virol 70 2973-2987) wurden von Dr. Phil Shephard aus London,
U.K. bereitgestellt, und MAb Camvir 1 (McLean et al., 1990, J. Clin.
Pathol. 43 488-492) wurde von Dr. C. McLean (Abteilung für Pathologie,
Universität
von Cambridge) erhalten. Das Kaninchen Antiserum gegen HPV16L2 Trp-E
Fusionsprotein wurde von Dr. Denise Galloway (Universität von Washington,
Seattle) bereitgestellt.
-
Aminosäuresequenzanalyse
und die antigene Index Vorhersage. Der antigene Index (A1) (Jameson und
Wolf, 1988, Comp. Appl., Biosci 4 181-186) ist eine Messung der
Wahrscheinlichkeit, das eine Peptidsequenz antigen ist. Sie wird
durch das Summieren einiger gewichteter Messungen der Sekundärstruktur
berechnet. Die Werte für
die vorhergesagte HPV16L1 Sequenz wurden unter Verwendung der PLOTSTRUCTURE
Software berechnet.
-
In
den 9 und 10 ist die Reaktivität (OD 415)
der Seren im ELISA mit einer Reihe von überlappenden Peptiden, die
der Sequenz des HPV16L1 entsprechen, gezeigt. Die Peptidzahlen,
die der HPV16L1 Sequenz entsprechen (siehe Tabelle 1) sind angegeben.
-
In
den 11 und 11A entspricht
das Nummerierungssystem für
die Aminosäuren
HPV16L1 von dem ersten putativen Initiationskodon. Die Regionen
mit einem AI Wert von über
1,5 sind angegeben.
-
In 12 sind
die Regionen von HPV16L1 gezeigt, innerhalb der gezeigt wurde, dass
B Epitope in einem Bereich des Kartierungssystems liegen. Die Ergebnisse
mit Seren aus Mäusen,
die mit VLPs (Partikeln) und mit IgA und IgG Antikörpern in
Seren aus Menschen mit Zervixkrebs (humanes IgA und humanes IgG) immunisiert
wurden (Dillner et al., 1990 Int. J Cancer 45 529-535), wurden unter
Verwendung von überlappenden
Peptiden erhalten. Die murinen anti-VLP Antiseren wurden als signifikant
reaktiv mit einem Peptid erachtet, wenn die OD größer als
0,55 war. Die Ergebnisse von Kaninchen, die mit einem L1 Fusionsprotein
(Kaninchenserum) immunisiert wurden (Müller et al., 1990 J Gen Virol
71 2709-2717) wurden aufgetragen. Diese wurden unter Verwendung
einer Reihe von Expressionsklonen mit teilweiser Länge bestimmt,
und die Gesamtlänge
der Sequenz, innerhalb der das/die Epitop/e lag/en, ist gezeigt.
Ebenfalls angegeben sind die Algorithmus vorhergesagten B-Epitope
(Computer) (Jameson und Wolf Comp. Appl. Biosci 4 181-186 1988)
und die Epitope, die von den publizierten anti-HPV16L1 monoklonalen
Antikörpern
(Monoclonale) (Cason et al., J. Gen Virol. 70 2973-2987 1989; McLean
et al., J. Clin Pathol. 43 488-492 1990) erkannt werden. Der Maßstab zeigt die
Position der Epitope entlang des 531 aa L1 Proteins, und es ist
ausgehend von dem N-terminalen Methionin (Rest 1) nummeriert. Für jedes
Epitope enthaltende Peptid ist auch die exakte Lage bzgl. des N-terminalen Methionins
angegeben.
-
Eine
Reihe von 15-mer synthetischen Peptiden des HPV16L1 Proteins, welche
die gesamte Länge des
Proteins mit fünf
aa Überlappungen
abdecken, wurden verwendet, um die Epitope in L1 zu definieren,
die von den verschiedenen Immunseren erkannt werden. Jedes der 16
Antiseren aus den drei gestesteten Inzuchtmäusestämmen, BALB/c(H-2d),
C57B1/6(H-2b) und B10A (H-2b/d)
erkannten multiple lineare Peptide des L1 Proteins, und im Wesentlichen
dieselben Peptide aus HPV16L1 wurden durch alle getesteten Stämme erkannt
(10). Fünf
einzelne Seren wurden für
jeden Stamm getestet. Ein Peptid wurde als reaktiv bezeichnet, wenn
die OD mit einem Serum größer als
der Durchschnitt + 3SD der ODs der negativen Kontrollseren war;
dies ergab eine Ausschlussgrenze für die Reaktivität von 0,260.
Die Seren von Mäusen,
die mit CFA alleine immunisiert wurden, wiesen eine OD 415 Reaktivität von weniger
als 0,260 mit all den L1 Peptiden auf.
-
Während einige
Schwankungen in der Intensität
der Reaktivität
von jedem anti-VLP
Serum von einem gegebenen Stamm mit jedem Peptid beobachtet wurden,
war jedes der Peptide reaktiv (OD > 0,260)
mit entweder allen oder keinem der anti-VLP Seren aus jedem Mausstamm.
Das Isoepitop des peptidspezifischen Antikörpers in den anti-VLP Seren
wurden unter Verwendung von IgG und IgA spezifische anti-Maus Immunoglobulin
Antikörpern
untersucht. Die IgG Antwort war wie gezeigt (9 und 10),
und es konnte keine signifikante IgA Reaktivität gegen irgendein Peptid nachgewiesen
werden (OD < 0,050).
Weil die meisten Peptide mit den anti-VLP Seren reaktiv waren, wurde
ein willkürlicher
OD Wert von fünf
mal des mittleren negativen Werts verwendet, um hauptreaktive Regionen
des L1 Proteins zu definieren; Die hauptimmunreaktiven L1 Peptide
waren gleichmäßig entlang
der Länge
des L1 Proteins verteilt, wobei sieben im aminoterminalen Drittel des
Moleküls,
sieben im mittleren Drittel und acht in dem carboxyterminalen Drittel
lagen. Im Gegensatz dazu erkannten die monoklonalen Antikörper, die
spezifisch für
HPV16L1 waren, einzelne hauptlineare Epitope, wie zuvor beschrieben
wurde (Cason et al., oben, McLean et al., 1990 oben). Vier der fünf reaktiven
anti-HPV16L1 monoklonalen
Antikörper
(5A4, 1D6, 3D1, 8C4) waren mit dem Peptid 30 (291-305) reaktiv,
wohingegen Camvir 1 das Peptid 24 (231-245) erkannte (11 und 11A). Die Seren von Mäusen, die mit den virusähnlichen
Partikeln immunisiert wurden, reagierten mit keinem dieser Peptide.
-
Es
wurde ein Algorithmus verwendet, um wahrscheinliche B Epitope von
HPV16L1 abzuleiten, basierend auf der vorhergesagten Proteinsekundärstruktur.
Mögliche
antigene Regionen wurden als ein antigener Index (A1) (Jameson und
Wolf, 1988, oben) auf der Basis von Kettenflexibilität, hoher
Erreichbarkeit und hohem Grad an Hydrophilizität (11) berechnet.
Eine Region mit einem A1 Wert von über 1,5 wurde als ein vorhergesagtes
B Epitop erachtet. Sieben solche Regionen wurden gefunden (Aminosäuren 79-84,
105-108, 120-122, 134-135, 267, 269, 298-299, 363-367), und fünf von diesen
sieben Regionen lagen innerhalb der 22 Peptide, gegen welche die
Hauptreaktivität
mit Antiseren aus Mäusen
beobachtet wurde, die mit synthetischen HPV16 Kapsiden immunisiert
wurden. Die Zusammenfassung der B Epitop Spezifität von Antiseren
aus verschiedenen Quellen ist in 12 gezeigt.
-
Bei
der weiteren Betrachtung der Beispiele 1-2 wird bemerkt, dass Papillomviren
im allgemeinen Virionen in infizierten Keratinozyten herstellen,
die einfach durch Elektronenmikroskopie identifizierbar sind (Almeida
et al., 1962, J. Invest, Dermatol 38, 337-345), und die in einigen
Fällen
gereinigt und als infektiös
gezeigt werden können
(Rowson und Mahy, 1967, Bacterial. Reo. 31, 110-113). HPV16 Virionen
werden jedoch nicht in HPV16 infiziertem zervikalen epithelialen
Gewebe beobachtet, obwohl HPV16L1 und L2 späte Gentranskription in differenziertem
genitalen Epithel stattfindet (Crum et al., 1988, J. Virol. 62,
84-90), und die L1 Translation immunreaktives L1 Protein in diesen
Geweben bildet (Stanley et al., 1989, Int. J. Cancer 43, 672-676). In
dieser Beschreibung haben wir gezeigt, dass die Expression von HPV16L1
und L2 Genen in epithelialen Zellen sowohl notwendig als auch hinreichend
ist, um den Zusammenbau von HPV16 virionähnlichen Partikeln zu erlauben,
und hiermit sind die L1 und L2 Proteine von HPV16 nicht bzgl. des
Virionzusammenbaus defekt. Die Expression von HPV16 späten Genen
in Geweben scheint strikt durch die epitheliale Umgebung reguliert zu
sein (Taichman et al., 1983, J. Invest. Dermatol 1, 137-140). Das
Versagen, HPV16 Virionen in vivo trotz der Transkription von L1
und L2 und der Translation von L1 nachzuweisen, liegt nahe, das
es entweder eine posttranskriptionelle Blockierung der L2 Herstellung
in zervikalem Epithel oder einen Inhibitor des Virionzusammenbaus
gibt. In der HPV16 enthaltenden Zelllinie W12, die von zervikalem
Gewebe abgeleitet ist, wurden virusähnliche Partikel beobachtet,
wenn die Zellen eine terminale Differenzierung in vivo in einer
murinen Mikroumgebung durchlaufen (Sterling et al., 1990 J. Virol
64, 6305-6307), was nahe liegt, dass solche Zellen keine Blockierung
im Virionzusammenbau aufweisen, und dass ungenügende Translation von L2 oder
andere unbekannte Gründe
das Versagen, HPV16 Virionen in zervikalen Geweben nachzuweisen,
erklären
können.
-
Unsere
EM Studien zeigen, dass das leere HPV16 Virion eine durchschnittliche
Größe von ungefähr 40 nm
aufweist, was kleiner ist als bei anderen Papillomviren, aber dass
es eine ähnliche
Oberflächenstruktur im
Vergleich zu anderen Papillomviren, wie dem Kaninchen Papillomvirus
(Finch und Klug, 1965 J. Mol Biol 13 1-12) oder dem humanen Warzenvirus
(Rowson und Mahy 1968 oben) aufweist.
-
Die
Sedimentation zeigte eine leere Kapsiddichte von ungefähr 1,32
g/ml, der erwarteten Dichte eines leeren Papillomviruskapsids im
Vergleich zu ungefähr
1,36 g/ml für
intakte HPV1 Virionen (Doorbar und Gallimore, 1987, J. Virol. 61,
2793-2799).
-
Das
L1 Protein von HPV weist potenzielle Glykosylierungsstellen auf,
und gereinigte BPV Partikel weisen kleinere elektrophoretische Formen
von L1 auf, deren Mobilität
gegenüber
einer Endoglycosidase Behandlung sensitiv ist (Larsen et al., 1987,
J. Virol 61, 3596-3601). L2 von HPV 1a und HPV 11 wurde als eine Doppelbande
beobachtet (Rose et al., 1990, J. Gen. Virol, 71, 2725-2729; Doorbar
und Gallimore, 1987 oben; Jin et al., 1989, J. Gen. Virol. 70, 1133-1140),
und dies wurde den Unterschieden in der Glykosylierung zugeschrieben.
Unsere Daten zeigen, dass das L1 Protein in HPV16 Kapsomeren auch
glykosyliert ist, und dass zwei verschiedene Glykosylierungsstellen
existieren.
-
In
dieser Beschreibung haben wir synthetische virusähnliche Partikel verwendet,
um Immunogenität der
HPV16 Kapsidproteine zu untersuchen, die in einem eukaryonten System
hergestellt werden. Die Kapsidproteine, die in eukaryonten Zellen
hergestellt wurden, wurden verwendet, weil Papillomvirus Kapsidproteine, die
in eukaryonten Zellen hergestellt wurden, eine posttranslationale
Modifikation durchlaufen (Browne et al., 1988 J. Gen. Virol. 69
1263-1273; Zhou et al., 1991 Virology 185 625-632), was eine wichtige
Determinante der Antigen Präsentation
sein kann. Ein rekombinanter Vaccinia Expressionsvektor wurde gewählt, weil
keine nativen HPV16 Partikel aus klinischen Läsionen oder aus der viralen
Vermehrung in Zellkultur zur Verfügung stehen. Wir verwendeten
die HPV16 VLPs, um polyklonale anti-VLP Antiseren in Mäusen herzustellen,
und diese Seren reagierten stark mit den HPV16 Kapsiden im ELISA.
Wir haben durch Immunblotten gezeigt, dass die anti-VLP Antiseren
Epitope in denaturiertem L1 (2) und
L2 erkannten. Darüber
hinaus definierten die anti-VLP Seren 22 hauptreaktive Peptide in
einer Serie von einundfünfzig
15-mer Peptiden von L1. Diese Daten zeigen, dass die Antiseren,
die gegen virale Partikel gerichtet sind, dennoch häufig lineare
Determinanten erkennen. Das Profil der humoralen Reaktivität in dem
Satz von L1 Peptiden war nahezu identisch über zwei MHC ungleiche Mausstämme, was
nahe legt, dass es ausreichend T Epitope in L1 gibt, dass die MHC
Restriktion bei der Bestimmung der humoralen Antwort gegen das HPV16L1
Protein in den hier getesteten Mausstämmen nicht limitierend ist.
-
Die
Daten für
B Epitope Spezifität,
die mit unseren murinen anti-VLP Antiseren erhalten wurden, können mit
einer ähnlichen
Studie von „Immun" Serum aus Frauen
mit Zervixdysplasie (Dillner et al., 1990 Int. J Cancer 45 529-535)
verglichen werden (12). Mehrere Peptide wurden
durch sowohl die Immunhumanseren als auch die anti-VLP Antiseren
erkannt, aber der Hauptteil der Peptide, der mit den murinen anti-VLP
Antiseren reaktiv war, war nicht reaktiv mit den Immunhumanseren
(12). Keine der Regionen von L1 (221-235, 291-305),
die von L1 spezifischen monoklonalen Antikörpern erkannt wurden (Cason
et al., 1989; Mc-Lean
et al., 1990) wurden durch unsere murinen anti-VLP Antiseren erkannt.
Weil L1 Fusionsproteine verwendet wurden, um diese MAbs herzustellen
und auch verwendet wurden, um nach einem Antikörper gegen L1 in humanen Seren
zu screenen, kann der Mangel an Reaktivität von humanen Seren mit L1
Fusionsprotein (Jenison et al., 1991 Int. J. Cancer 48 682-688)
durch das Versagen der L1 Fusionsproteine, die Epitope von L1 zu
zeigen, die dem humanen Immunsystem durch natives L1 Protein präsentiert
werden, erklärt
werden.
-
Screening
nach Antikörpern
gegen das L1 Protein mit Peptiden kann nur lineare Epitope nachweisen. In
einem Versuch, zu bestimmen, ob die Reaktivität in den murinen Seren gegen
sowohl lineare als auch konformationelle Determinanten gerichtet
war, führten
wir ELISA Assays mit Partikeln durch, die auf zwei Weisen behandelt
wurden. Von der einen nahm man an, dass sie native Partikel bewahrte
und von der anderen, dass sie denaturiertes Protein bildet (Dillner
et al., 1991 J. Virol. 65 6862-6871). Wir haben kein Serum oder
monoklonalen Antikörper
gefunden, das/der ausschließlich
mit Partikeln reaktiv ist, die auf die eine oder andere Weise behandelt
wurden, obwohl ein MAb (Camvir 1) stärker mit den denaturierten
als mit den „nativen" Partikeln reagierte.
Der Mangel an Reaktivität
des Hauptteils der MAbs mit den denaturierten Partikeln liegt nahe,
das sie nur teilweise denaturiert waren, weil dieselben Antikörper mit
denaturiertem Protein in einem Western Blot reagieren. Im Gegensatz
dazu ist die Reaktivität
von Camvir 1 mit den nativen Partikeln kein Beweis, dass das lineare
Epitope, dass von diesem Antikörper
erkannt wird, denaturiertes L1 Protein erkennt, das in einigen Mengen
in der nativen Partikelpräparation
anwesend ist, und wir haben keinen Beweis dafür, dass intakte VLPs unter
unseren ELISA Bedingungen bewahrt werden.
-
Weil
die meisten Antikörper
konformationsabhängige
Determinanten erkennen (Benjamin et al., 1984 Ann. Rev. Immunol.
2, 67-101) die mehrere nicht kontinuierliche Polypeptidsequenzen
einschließen
können (Amit
et al., 1986 Science 233 747-753) ist es für Antikörper gegen Virionen unwahrscheinlich,
dass sie fusionierte oder denaturierte Proteine ebenso wie natives
Protein erkennen, wie für
HPV1 Antiseren gezeigt wurde (Steele and Gallimore, 1990 Virology
174 388-398). Virionen von einigen Hautwarzen assoziierten HPV stehen in
ausreichenden Mengen für
serologische Assays (Almeida und Goffe, 1965 Lancet 2 1205-1207;
Kienzler et al., 1983 Br J. Dermatol. 108 665-672; Pfister und zur
Hausen, 1978 Int. J Cancer 21 161-165; Pyrhsonen et al., 1980 Br.
J. Dermatol 102 247-254; Pass und Maizel, 1973 J. Invest. Dermatol
60 307-311) für
den Warzenvergleich zur Verfügung.
Die Prävalenz
von Antikörpern
gegenüber
gereinigten Virionen in humanem Immunserum schwankt von 20 (Genner,
1971 Acta. Derm. Venereol (Stockh) 51 365-373) bis 88 % (Morison
, 1975 Br J Dermatol 93 545-552) in Abhängigkeit von dem verwendeten
Nachweissystem. Jedoch standen bis kürzlich Virionen der genitalen
HPV Typen für
eine serologische Studie nicht zur Verfügung. Das Nacktmäuse Xenograftsystem
(Kreider et al., 1987 J Virol 61 590-593) hat die Herstellung von
HPV11 Partikeln für
den Nachweis von humanen Antikörpern
erlaubt (Bonnez et al., 1991 J. Gen Virol 72 1343-1347). Wir folgern,
dass die hier beschriebenen HPV16 VLPs die Entwicklung von ähnlichen
Studien der Seronegativität
gegenüber
nativen HPV16 Partikeln erlauben, und der beobachtete Mangel an
Reaktivität
in humanem Serum gegen HPV15 L1 Fusionsproteine (Jenison et al.,
1991 J Virol 65 1208-1218; Köchel
et al., 1991 oben) kann einfach mit den ähnlichen Beobachtungen mit
HPV1 (Steele und Gallimore, 1990 Virology 174 388-398) verglichen
werden.
-
Antikörper gegen
BPV Strukturproteine weisen eine Virus neutralisierende Aktivität auf (Pilacinski
et al., 1986 Ciba Found. Symp. 120 136-156), und Antiseren gegen gereinigte
HPV11 Virionen sollten auch infektiöses HPV11 in einem athymischen
Maus Xenograftsystem (Christensen und Kreifer, 1990 J Virol 64 3151-3156)
neutralisieren. Unsere Ergebnisse zeigten, dass die gereinigten
synthetischen HPV16 Kapside immunogen sind und verwendet werden
könnten,
um Virus neutralisierende Antikörper
herzustellen und zu bewerten, die für dieses oncogene Virus spezifisch
sind. BPV1 L1 Protein, das in Escherichi coli exprimiert wurde und
BPV Partikel haben beide Rinder vor der Entwicklung von Warzen geschützt (Pilacinski
et al., 1986; Jarrett et al., 1990 Vet. Rec. 126 449-452). Eine ähnliche
Immunantwort gegen HPV16 virusähnliche
Partikel wäre
die Basis eines möglichen
Impfstoffs, um HPV16 assoziierten Zervixkrebs zu verhindern.
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In 13A, nach Infektion mit pLC201VV, wurden CV-1
Zelllysate einer Äquilibrium
Gradientensedimentation unterzogen. Gereinigte virusähnliche
Partikel wurden durch Transmissionselektronenmikroskopie nach Negativfärbung mit
Phosphorwolframsäure
untersucht. [Balken = 100 nm].
-
In 13B, Spur 1, Lysat aus CV-1 Zellen, infiziert
mit Wildtyp Virus; Spur 2 Lysat von L1 und L2 exprimierendem Virus
pLC201VV; Spur 3, gereinigte virusähnliche Partikel. Das L2 Protein
wurde mit einem Kaninchen anti-HPV16L2 Antikörper als Sonde inkubiert, gefolgt
von 125I-Protein A. Die Molekulargewichte
sind auf der linken Seite angegeben, und L2 Banden sind mit einem
Pfeil gekennzeichnet.
-
Es
kann auch Bezug genommen werden auf die 13A und 13B, die zeigen, dass HPV16L1 und L2 doppelt rekombinantes
VV L2 Protein enthält,
wie durch Western Blot unter Verwendung von gereinigten VLPs und
einem Kaninchen Antiserum gegen VV rekombinantes L2 Protein gezeigt
wurde.
-
BEISPIEL 3: BPV1 VLPS
-
Es
wurde auch bestätigt,
dass Rinder Papillomvirus (BPV) 1 Virionen, die auf ähnliche
Weise in vitro unter Verwendung der VV Rekombinante für die BPV
Kapsidproteine hergestellt wurde, BPV1 DNA verpacken kann. Vollständige Virionen
sind in der Lage, eine permissive Maus Fibroblasten Zelllinie zu
infizieren, wie durch Transkription des E1 viralen offenen Leserahmens
gezeigt wird, und die Infektion wird durch Inkubation von Virionen
mit Antikörpern
gegen das Kapsidprotein von BPV1 inhibiert. Im Gegensatz zu den
Beobachtungen für
HPV16, lagern sich virusähnliche
Partikel in Zellen, die mit der VV Rekombinante für das BPV1
L1 Kapsidprotein infiziert sind, alleine zusammen, aber L2 Protein
wird für
die Verpackung von BPV1 DNA benötigt, um
infektiöse
Virionen herzustellen.
-
Unter
Bezugnahme auf die HPV16 VLPs, auf die oben Bezug genommen wird,
scheinen diese Partikel aus Kapsomeren zu bestehen, die typisch
sind für
jene, die in HPV1 und BPV1 Partikeln beobachtet werde, die aus klinischen
Läsionen
gereinigt wurden (Bakar et al., J.C. Biphys J 60 1445-1456 1991,
Staquet et al., J. Dermatologica 162 213-219, 1981), obwohl die
Gesamtmorphologie der HPV16 Partikel eher unterschiedlich zu den
natürlich
vorkommenden HPV1 und BPV1 Partikeln war. Weil natürliche HPV16
Virionen aus klinischen Läsionen
nicht gereinigt wurden, wurde es als wünschenswert erachtet, zu bestätigen, ob
diese morphologischer Unterschied eine Eigenschaft von HPV16 oder
des rekombinanten Vacciniavirus (rVV) Systems war, das für die Herstellung
von Virionen verwendet wurde. Eine Reihe von VVs wurde deshalb hergestellt,
die jeweils doppelt rekombinant für die L1 und L2 Kapsidproteine
von HPV6, HPV11 und von BPV1 waren. Die Infektion von CV-1 Zellen
mit jeder dieser doppelt Rekombinanten VVs bildete virusähnliche
Partikel, und diese waren den authentischen HPV1 und BPV1 Virionen ähnlicher
als den HPV16 Partikeln. Wir haben beschlossen, die BPV-1 Partikel
zu untersuchen, weil natürliche
BPV-1 Partikel besser morphologisch und immonologisch charakterisiert
sind (Chen et al., Baker et al., 1991, Cowsert et al., J. Natl Cancer
Inst. 79 1053-1057) und Zelllinien zur Verfügung zu stehen, die für die episomale
Replikation von BPV-1 DNA permissiv sind (Law et al., 1981 DNAS
78 2727-2731).
-
In 13C wird BPV1 L1 von dem p4b natürlichen
Vaccinia späten
Promotor und L2 von dem p480 synthetischen Vaccinia späten Promotor
exprimiert. Das E.coli gpt
Gen wird als der Selektionsmarker verwendet. Flankierende Sequenzen
sind das Vaccinia B24R Gens, was eine Vacciniasequenz für homologe
Rekombination bereitstellt. Die BPV1 L1 und L2 Gene wurden durch
PCR aus dem Plasmid pml-1 kloniert. Weil das BPV1 Genom linearisiert
und in dieses Plasmid an einer BamHI Stelle in dem BPV1 L2 ORF kloniert
ist, wurde das BPV1 Genom zuerst aus pml-1 durch BamHI Spaltung
isoliert und rezirkularisiert, und die zirkularisierte BPV-1 DNA
wurde als die PCR Matrize verwendet. Die für die L1 Amplifikation verwendeten
Oligonukleotid Primer waren:
5'-CGGGATCCATGGCGTTGTGGCAACAAGGCCAGAAGCTG.
5'-CGGGATCCTTATTTTTTTTTTTTTTTTGCAGGCTTACTGG.
-
Die
BamHI Stelle ist unterstrichen, und das erste Methionin und die
Stoppkodons sind in Fettschrift angegeben. Die Oligonukleotid Primer
für die
L2 Amplifikation waren:
5'-GCAGATCTATGAGTGCACGAAAAAGAGTAAAACGTGCCAGTGC.
5'-GCAGATCTTTAGGCATGTTTCCGTTTTTTTCGTTTCC.
-
Die
BgIII Stellen sind unterstrichen, und das erste Methionin und die
Stoppkodons sind in Fettschrift angegeben. Das amplifizierte 1478
bp L1 Fragment wurde in die BamHI Stelle in Plasmid RK19 kloniert,
um RK19BPVL1 herzustellen. Das L1 Gen und Vaccinia 4b Promotor wurden
aus diesem Plasmid durch Spaltung mit MluI und SmaI isoliert und
in das Plasmid pSX3 transferiert, um pSXBPVL1 herzustellen. Das
1409 bp L2 Fragment wurde mit BgIII gespalten und in die BamHI Stelle
in Plasmid p480 kloniert, um p480BPVL2 herzustellen. Der synthetische
Vaccinia späte
Promotor und das BPVL2 Gen wurden aus diesem Plasmid in die Sma1
Stelle im pSXBPVL1 kloniert um das doppelt rekombinante Plasmid
pSXBPVL1 L2 herzustellen. Die Transfektion von pSXBPVL1 oder pSXBPVL1
L2 DNA in Monolayer von CV-1, die mit dem Wildtyp (wt) VV WR Stamm
infiziert waren, führte
zu den rVVs pSXBPVL1VV (L1 exprimierend) und pSXBPVL1 L2W (L1 und
L2 exprimierend). Die rekombinanten Vacciaviren wurden dreimal in
der Anwesenheit von Mycophenolsäure
gereinigt. Nach der Reinigung wurden Präparationen der Rekombinanten
im großen
Maßstab
hergestellt und in diesen Experimenten verwendet.
-
In 14A ist die Immunpräzipitationsanalyse von rekombinantem
BPV1 L1 in Vaccinia infizierten Zellen gezeigt. Die CV-1 Zellen
wurden bei 10 pfu/Zelle mit wt Vacciniavirus (Spur 1); pSXBPVL1VV
(Spur 2); pSXBPVL1L2VV (Spur 3) infiziert und 48 hrs nach der Infektion
geerntet. Das BPVL1 Protein wurde mit BPV1 spezifischem Kaninchen
Antiserum nachgewiesen. Das 58 kDa L1 Protein ist durch einen Pfeil
gekennzeichnet.
-
In 14B ist die Northern Blot Analyse der BPV1 L2
Expression gezeigt. RNA, extrahiert aus CV-1 Zellen, infiziert mit
wt VV (Spur 1); pSXBPVL1 L2W (Spur 2) wurde mit dem BPV1 L2 Gen
als Sonde inkubiert. Die variable Länge der L2 homologen Transkripte
ist typisch für
Transkripte, die von VV Promotoren exprimiert werden. Für die Immunpräzipitation
wurden Zellen, die mit rVVs infiziert waren, mit RIPA Puffer (0,1
% SDS, 1 % Triton X-100, 1 % Natriumdesoxicholate, 150 mM NaCl,
0,5 μg/ml
Aprotinin, 10 Mm Tris, pH 7,4) lysiert. Lösliche Proteine wurden mit
Kaninchen anti-BPV1 Antikörper
(DAKO, Glostrup) in einer 1:1.000 Verdünnung immunpräzipitiert.
Präzipitierte
Proteine wurden mit Protein-A Sepharose gesammelt, auf 10 % SDS
Polyacrylamid Gelen getrennt und auf Nitrocellulose Filter geblottet.
Nach dem Blockieren mit Magermilch wurden die Filter gegenüber dem
anti-BPV1 Serum (1:1.000), gefolgt von 125I-Protein
A (auf 0,1 μCi/ml)
exponiert und durch Autoradiografie sichtbar gemacht. Gesamt RNA
wurde aus den Zellen extrahiert, und durch Zentrifugation durch
CsCl, wir zuvor beschrieben, gereinigt. Gesamt RNA, 30 μg pro Spur,
wurde auf 1,2 % Formaldehyd-Agarose Gellen gefahren, auf Nylonmembrane
transferiert und mit einem 32P-markierten
BPV1 L1 Gen als Sonde inkubiert.
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In 15A wird auf pSXBPVL1 L2W Bezug genommen.
Einige Partikel aus CON/BPV Zellen, die mit pSXBPVL1 L2W infiziert
wurden, weisen Elektronen dichte Kerne (Insert) auf.
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In 15B wird auf pXSBPVL1VV Bezug genommen.
Ein kontaminierendes Vacciniavirus (A) ist durch ein „V" angegeben. Die Maßstabsbalken
stellen 50 nm dar. Die Zellen wurden zwei Tage nach der Infektion
geerntet, mit PBS gewaschen, durch dreimaliges Einfreiren und Auftauen
lysiert und in PBS sonifiziert.
-
Der
Zelldebris wurde durch Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit
entfernt, und die Überstände wurden
auf ein 20 % (w/v) Sucrosekissen überschichtet und für zwei Stunden
bei 100.000 × g
zentrifugiert. Die Pellets wurden in PBS resuspendiert und in einem
JOEL 1.200EX Elektronenmikroskop nach Negativfärbung mit 1 % (w/v) Phosphorwolframsäure (pH
7,0) analysiert.
-
Weil
das Verhältnis
der L1 zu L2 Proteine in authentischen BPV1 Partikeln ungefähr 5:1 beträgt (Pfister,
H. & Fuchs, E.
in Papillomaviruses and human disease (Hrsg. Syrianen, K., Gissmann,
L & Koss, L.G.)
Vol. 1-18 (Springer-Verlag, Berlin, 1987) verwendeten wir einen
starken natürlichen
Promotor für
das L1 Gen und einen schwachen synthetischen Promotor für das L2
Gen für
unser doppelt rekombinantes VV (13C),
und das resultierende Verhältnis
von L1 mRNA zu L2 mRNA auf einem Northern Blot aus rVV infizierten
CV-1 Zellen betrug ungefähr
10:1. Die CV-1 Zellen, die mit dieser rVV infiziert wurden, exprimierten
BPV1 L1 Protein (14A) und L2 mRNA (14B), und große
Zahlen von 50 μm
icosaedrischen virusähnlichen
Partikeln von offensichtlich authentischer Morphologie (15A) konnten aus den infizierten Zellen
gereinigt werden. Unsere vorherige Arbeit mit HPV16 hatte gezeigt,
dass sowohl das L1 als auch das L2 Protein für den Zusammenbau von HPV16
virusähnlichen
Partikeln, wie oben beschrieben, benötigt wurde, was im Gegensatz
zu der Beobachtung steht, dass für
Parvovirus (Kajigaya et al., 1991 DNAS 4646-4650), Bluetongue Virus
(Loudon et al., 1991 Virology 182, 793-801) und Polyoma Virus (Salunke
et al., 1986, Cell 46, 895-904) die virusähnlichen Partikel in Zellen
zusammengebaut werden, wenn das Hauptkapsidprotein alleine als ein
rekombinantes Protein exprimiert wird. Wir haben deshalb eine VV
Rekombinante für
BPV1 L1 (13C) hergestellt und beobachtet,
dass wenn CV-1 Zellen mit dieser VV infiziert wurden, virusähnliche
Partikel mit ähnlicher
Homologie zu jener, die mit der L1 und L2 doppelt Rekombinanten
VV erhalten wurden, gereinigt werden konnten (15B). Ähnliche
leere icosaedrische Virionen wurden nach Infektion von CV-1 Zellen
mit der VV Rekombinanten für
die L1 Proteine von HPV6 oder HPV11 erhalten. Der Mangel an morphologisch
authentischem PV Virion in Zellen, die mit dem HPV16L1 und L2 VV
infiziert wurden, und der Mangel an PV Virionen, die in HPV16 infiziertem
Gewebe durch Elektronenmikroskopie beobachtet wurden (Schneider
(1987) Papillomaviruses and Human Disease Vol 19-39 Springer Verlag
Berlin) legt nahe, dass HPV16, im Gegensatz zu anderen PVs, bezüglich der
viralen Kapsidbildung defekt sein könnte.
-
Eine
Minderheit von virusähnlichen
Partikeln aus Zellen, die mit HPV1 L1/L2 rVV infiziert wurden, ist in
dem 15A Insert gezeigt.
-
Die
Klonierungsstrategie für
HPV11L1/L2 und HPV6bL1/L2 doppelt exprimierende rekombinante Vacciniaviren
ist unten beschrieben:
Für
HPV11 L1:
5'CAGATCTCAGATGTGGCGGCCTAGCGACAGCACAGTATATGTGCC
5'CGGGAATTCGTGTAACAGGACACACATAATAATTGTTTATTGCA
-
Das
PCR Produkt wurde mit BgIII/EcoRI gespalten und in RK19 unter die
Kontrolle des 4b Promotors kloniert. Die Promotor/11L1 Sequenz wurde
anschließend
in die BamHI Stelle von pSX3 kloniert, die mit Klenow mit stumpfen
Enden versehen wurde. Das resultierende Plasmid war pSX11L1.
Für 11L2
5'GCGGATCCATGAAACCTGGGGCACGCAGACGTAAACGTGCG
5'CGCCCGGGCTAGGCCGCCACATCTGTAAAAAATAAGGG
-
Das
BamHI/SmaI gespaltene PCR Fragment wurde in p480 unter den synthetischen
28k späten
Promotor kloniert. Anschließend
wurde das Promotor/11 L2 Fragment im pSX11 L1 transferiert. Das
11 L1/L2 doppelt Rekombinante exprimierende Plasmid wurde als pSX11
L1/L2 bezeichnet.
Für
HPV6bL1:
5'CGCCCGGGTTACCTTTTAGTTTTGGCGCGCTTACGTTTAGG
5'GCGGATCCAGATGTGGCGGCCTAGFCGACAGCACAGTATATG
-
Das
PCR Produkt wurde durch BamHI/Sma1 geschnitten und in RK19 unter
die Kontrolle des 4b Promotors kloniert. Der Promotor/6L1 wurde
anschließend
in pSX3 kloniert um pSX6L1 herzustellen.
Für HPV6L2:
Das HPV6L2 wurde
aus dem 6b Genome durch AccI/XbaI (4422-5903) isoliert. Das Fragment
wurde durch Klenow geblottet und in p480 eingebaut. Der synthetische
28k Promotor plus 6bL2 wurde in pSX6L1 kloniert, um das doppelt
rekombinante Plasmid pSX6L1/L2 zu bilden.
-
Danach
infizierten die Plasmide pSX11L1 und pSXL11L1/L2 eine Wirtszelle
(z.B. CV-1 Zellen oder C127 Zellen), um VV pSX11 L1 und VV pSX11
L1/L2 herzustellen, die nach der Transfektion einer Wirtszelle, die
mit Wildtyp Vacciniavirus infiziert war, VLPs mit L1 Protein (abgeleitet
von VV pSX11 L1) und L1 und L2 Proteine (abgeleitet von VV pSX11L1/L2)
bildeten. Auf ähnliche
Weise bildete VV pSX6L1 und VV pSX6L1/L2 nach Transfektion einer
Wirtszelle VLPs mit HPV6b L1 und VLPs mit HPV6b L1 und HPv6b L2.
-
Es
wird auch davon ausgegangen, dass die Erfindung in ihren Schutzbereich
Viren einschließt,
die doppelt rekombinant für
Papillomvirus Kapsidproteine L1 und L2 ebenso wie für rekombinante
Viren mit Papillomvirus Kapsidprotein L1 sind.
-
Es
wird weiter verstanden, dass die Erfindung in ihren Schutzbereich
ein Verfahren zur Diagnose einer Papillomvirusinfektion durch ELISA
einschließt,
umfassend den Schritt des Nachweises von VLP Partikeln mit den Proteinen
L1 und L2.
-
TABELLE
1 15
AA überlappende
Peptide aus der vorhergesagten Sequenz des HPV16L1 Proteins
-
Die
Sequenz für
jedes L1 Peptid ist unter Verwendung des Einzelbuchstabenkodes angegeben.
Die Lage jedes Peptids innerhalb des HPV16L1 Proteins ist angegeben,
wobei die Position 1 dem N-terminalen Methionin zugewiesen wurde.
Das kurze C-terminale Peptid (Nr. 53) wurde für diese Experimente nicht verwendet. TABELLE
2 Immunreaktivität gegenüber virusähnlichen
Partikeln von Viren aus Mäusen,
die mit synthetischen HPV16 Kapsiden immunisiert wurden.
- * Die Werte sind OD 415 Einheiten, und
sie sind als das Mittel ± 1
der Standardabweichung angegeben.