DE69233639T2

DE69233639T2 - Polynukleotidabschnitt des HPV16-Genoms

Info

Publication number: DE69233639T2
Application number: DE69233639T
Authority: DE
Inventors: Ian St Lucia Frazer; Jian Jindalee Zhou
Original assignee: University of Queensland UQ; CSL Ltd
Current assignee: University of Queensland UQ; CSL Ltd
Priority date: 1991-07-19
Filing date: 1992-07-20
Publication date: 2007-05-31
Anticipated expiration: 2012-07-21
Also published as: WO1993002184A1; LU91385I2; DE69233687T2; ATE356142T1; US20040214331A1; DE69232967T2; EP0595935B1; SG48769A1; LU91317I2; DE122007000018I1; CA2113712C; LU91316I2; ES2279020T3; DK0595935T3; LU91387I2; CY2007016I2; JP2004000269A; EP1207203A2; CY2007016I1; JPH07505042A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft Papillomviren und insbesondere Antigene und Impfstoffe, die in der Behandlung von Infektionen, die durch solche Viren verursacht werden, wirksam sind.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Papillonvirusinfektionen sind nicht nur in Menschen, sondern auch in Tieren wie Schafen, Hunden, Rindern, Koyoten, Wölfen, Opposums, Hirschen, Antilopen, Bibern, Schildkröten, Bären, Eidechsen, Affen, Schimpansen, Giraffen, Impala, Elefanten, Walen, Katzen, Schweinen, Wüstenrennmäusen, Rothirschen bzw. Elchen, Yaks, Delfinen, Papageien, Ziegen, Rhinozerosen, Kamelen, Lemmingen, Gämsen, Stinktieren, tasmanischen Beutelteufeln, Dachsen, Lemuren, Karibus, Gürteltieren, Molchen und Schlangen bekannt (siehe zum Beispiel „Papilloma Virus Infections in Animals" von J P Sundberg, die beschrieben sind in Papilloma viruses and Human Disease, herausgegeben von K Syrjanen, L Gissmann und L G Koss, Springer Verlag 1987).
Es ist auch bekannt (z.B. in Papilloma viruses and Human Cancer, herausgegeben von H Pfister und veröffentlicht von CRC Press Inc 1990), dass Papillomviren in einige verschiedene Gruppen, wie humane Papillomviren (HPV) eingeteilt werden, die in die Typen 1-56 in Abhängigkeit von DNA Sequenzhomologie unterteilt werden. Eine klinisch-pathologische Gruppierung von HPV und dem malignen Potenzial der Läsionen, mit denen sie am häufigsten assoziiert sind, kann wie folgt eingeteilt werden.
In einer ersten Gruppe können die Typen 1 und 4, die gutartige (benigne) flache Warzen verursachen, die Typen 2, 26, 28 und 29, die gutartige gemeine Warzen verursachen, die Typen 3, 10 und 27, die gutartige flache Warzen verursachen und Typ 7, der die Metzger's Warzen verursacht, aufgelistet werden. Die erste Gruppe von Infektionen findet in normalen oder immunkompetenten Individuen statt.
In einer zweiten Gruppe, die sich auf immungeschwächte Individuen bezieht, können die Typen 5 und 8, die stark bösartige (hochmaligne) makulare Läsionen verursachen, die Typen 9, 12, 14, 15, 17, 19-25, 36 und 46-50, die makulare oder flache Läsionen verursachen, die gutartig oder selten bösartig sind, aufgelistet werden. Diese makularen Läsionen sind auch als Epidermodysplasia verrucciformis (EV) bekannt.
In einer dritten Gruppe, die insbesondere den Genitaltrakt infizieren, können die Typen 6, 11, 34 und 39, 41-44 und 51-55, die Kondylome verursachen, die selten bösartig sind, die Typen 13 und 32, die gutartige focale epitheliale Hyperplasie verursachen, die Typen 16 und 18, die epitheliale Dysplasie und andere Läsionen verursachen, die beachtliches Potenzial aufweisen, einschließlich Bowenoide Papulose, und die Typen 30, 31, 33, 35, 45 und 65, die Kondylome mit mittlerem bösartigen Potenzial verursachen, aufgelistet werden. Die Kondylome erscheinen am häufigsten im Anogenitaltrakt und insbesondere dem Gebärmutterhals (Zervix). Die Typen 16 und 18 sind mit dem Großteil der in situ und invasiven Karzinome, der Zervix, der Vagina, der Vulva und dem Analkanal assoziiert. Die Kondylome können auch im Luft- und Verdauungstrakt auftreten.
Insbesondere HPV16 ist mit prämalignen und malignen Erkrankungen des Genital-Harntraktes assoziiert, und insbesondere mit Karzinomen der Zervix (Dürst et al., PNAS 80 3812-3815, 1983; Gissmann et al., J. Invest. Dermatol 83 265-285, 1984). Gegenwärtig gibt es keine Informationen über die Rolle von humoralen Antworten in der Neutralisierung von HPV16.
Der Nachweis von Antikörpern gegen HPV16 Fusionsproteine (Jenison et al., J Virol 65 1208-1212, 1990; Köchel et al., Int. J Cancer 48 682-688, 1991) und synthetischen HPV16L1 Peptiden (Dillner et al., Int. J Cancer 45 529-535, 1990) in dem Serum von Patienten mit HPV16 Infektion bestätigt, dass es B Epitope innerhalb der Kapsidproteine von HPV gibt, obwohl wenige Patienten HPV16L1 spezifische Antikörper aufweisen, die durch diese Techniken identifiziert wurden. Es gibt kein System für die HPV16 Vermehrung in vitro, und die humanen Genitalläsionen bilden wenig HPV16 Virionen; deshalb standen HPV16 Teilchen bzw. Partikel für immunologische Untersuchungen nicht zur Verfügung.
Die tierischen Papillomviren können auch das Rinderpapillomvirus (BPV) und insbesondere die Typen BVP1, BVP2, BVP3, BVP4, BVP5 und BVP6 einschließen, die ebenfalls durch DNA Sequenzhomologie differenziert werden. Im Allgemeinen infizieren die anderen tierischen Papillomviren den Hirsch, Pferde, Kaninchen, Hunde, Nager und Vögel. Papillomviren sind kleine DNA-Viren, die für bis zu acht frühe und zwei späte Gene kodieren. (Bzgl. eines Übersichtsartikels siehe Lancaster und Jenson 1987 Cancer Metast. Rev. S. 6653-6664; und Pfister 1987 Adv. Cancer Res 48, 113-147). Die Organisation der späten Gene ist einfacher als die der frühen Gene. Die späten Gene L1 und L2 überlappen in den meisten Fällen geringfügig miteinander. Die putativen L2 Proteine sind hochkonserviert zwischen verschiedenen Papillomviren, insbesondere die Sequenz von 10 basischen Aminosäuren an dem C-terminalen Ende. Die große Domäne in der Mitte zeigt nur geringe geclusterte Ähnlichkeiten. Der L1 ORF scheint jedoch übereinstimmend in allen bekannten Fällen konserviert zu sein (siehe Syrjanen et al., oben). Die Aminosäuresequenzhomologie erreicht 50 % bei dem Vergleich zwischen HPV1a, HPV6b, BPV1 und CRPV (Papillomvirus des Baumwollschwanz Kaninchens bzw. des cotton tail rabbit).
Bezüglich der Immuntherapie betreffend Papillomvirusinfektionen wurden früher Verfahren zur Behandlung von Warzen und epithelialen Hautläsionen entwickelt, welche Chirurgie verwenden, die schmerzhaft und traumatisch sein kann, wobei Narbenbildung oft ein Ergebnis mit dem Risiko der erneuten Infektion ist, die stattfinden kann. Die Behandlung mit Chemikalien wurde ebenfalls verwendet. Ein häufiges Behandlungsmittel ist Salicylsäure, die der Hauptbestandteil ist, in Stärken im Bereich von 10 % bis 40 % in Tinkturen und Pflastern. Formalin in Stärken von 3 %–20 % wurde ebenfalls vorgeschlagen. Die Kryotherapie wurde für die Behandlung von Hautwarzen verwendet. Glutaraldehyd als ein Behandlungsmittel wurde ebenfalls verwendet. Podophyllin wurde ebenfalls mit unterschiedlichem Erfolg für sowohl Hautwarzen als auch anogenitalen Kondylome verwendet. Die Arten der Chirurgie, die für anogenitale Kondylome verwendet wurde, schlossen chirurgische Entfernung, Kryochirurgie und Laserchirurgie ein. Die Verwendung von Interferonen wurde ebenfalls vorgeschlagen (siehe Syrjanan et al., oben).
Die Antikörper gegen das L1 Protein des Rinderpapillomvirus (BPV) weisen Virus neutralisierende Aktivität (Pilacinski et al., 1986) auf, und HPV11 Virionen können in einem in vitro Modell durch spezifische Antiseren inaktiviert werden (Christensen und Kreider, J Virol 64 3151-3156, 1990). Es gibt auch einigen Beweis, dass die spontane Regression von HPV1 induzierten kutanen Warzen mit gesteigerten humoralen Immunantworten gegenüber Warzenprotein assoziiert ist (Kirchner, Prog. Med. Virol 33 1-41, 1986).
Es wurden auch Impfstoffe mit unterschiedlichem Erfolg vorgeschlagen. Er wurde vorgeschlagen, Impfstoffe mit autogenen Tumorhomogenaten zu verwenden [Abcarian et al., J. Surg Res 22: 231-236 (1977) Dis Colon Rectum 25: 648-51 (1982) Dis Colon Rectum 19: 237-244 (1976)]. Jedoch wurde kürzlich befürwortet, dass die Patienten nicht länger mit autogenen Impfstoffen auf Grund der potenziellen onkogenen Wirkung der viralen DNA behandelt werden sollten (Bunney 1986 Br Med J 293 1045-1047).
Bezüglich der Herstellung von genetisch veränderten Impfstoffen wurde diese Tatsache in Pfister (1990) oben diskutiert, und es sieht so aus, dass Schwierigkeiten beim Erhalten eines wirksamen Impfstoffs beobachtet wurden, auf Grund der Vielzahl von verschiedenen Papillomvirus Typen. Pfister betont jedoch, dass das Augenmerk auf die so genannten frühen Proteine gerichtet werden sollte (d.h. E1, E2, E3, E4, E5, E6, E7 oder E8), weil es für diese Proteine am wahrscheinlichsten ist, dass sie in proliferierenden Basalzellen einer Warzeninfektion synthetisiert werden, im Vergleich zu den Strukturproteinen, die in den oberen epidermalen Schichten exprimiert werden. Deshalb scheint, nach Pfister (1990), das Viruskapsidprotein bezüglich der Verwendung in einem Impfstoff beschränkt zu sein.
Die Verwendung von rekombinanten Vacciniaviren in in vitro Testsystemen für Papillomvirus frühe Proteine in eukaryotischen bzw. eukaryonten Zellen wurde ebenfalls in Pfister (1990) diskutiert. Dies kann die Form eines Lebendimpfstoffs annehmen, der aus genetisch modifiziertem Vacciniavirus besteht, der Papillomvirus Proteine exprimiert oder auf der Oberfläche von Formaldehyd fixierten autologen Zellen, die in vitro mit Vaccinia Rekombinanten infiziert wurden oder mit anderen Expressionsvektoren transfiziert wurden. Eine andere Strategie für die Impfstoffentwicklung, wie im Pfister (1990) diskutiert, ist die Verwendung eines immunstimulierenden Komplexes des Glycosids Quil A.
Daten über erfolgreiche prophylaktische Impfung existieren nur für Rinder Fibropapillome aus homogenisierten Homogenaten von Rinder Fibropapillomen, und von ihnen wurde gezeigt, dass sie eine begrenzte Immunität bereitstellen (Olsen et al., J Am Vet Med Assoc 135, 499 (1959) Cancer Res 22 463 (1962)). Ein Impfstoff einschließlich einem veränderten L1 Fusionsprotein (Pilacinski et al., UCLA Symp. Molecular and Cellular Biology; Neue Serie, Band 32; Papilloma Viruses Molecular and Clinical Aspects, Alan R Liss New York 1985 257) wurde ebenfalls in Kälbern verwendet, aber erwies sich als nicht erfolgreich in Menschen (Barthold et al., J. Am Vet Med Assoc. 165, 276, 1974). In Pfister (1990) ist angegeben, dass es gegenwärtig keinen Beweis für eine mögliche Prävention von HPV Infektion durch die Verwendung eines Kapsidprotein Impfstoffs gibt, aber die Induktion einer Antitumorzellimmunität scheint machbar zu sein.
Die L1 und L2 Gene waren die Basis für Impfstoffe für die Prävention und Behandlung von Papillomvirusinfektionen, und Immunogene wurden in der Diagnose unter Nachweis von Papillomviren verwendet (internationale Patentanmeldungen WO 86/05816 und WO 83/03623). Jedoch scheint es, dass keine kommerzielle Verwendung dieser Impfstoffe stattgefunden hat.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Deshalb ist es ein Ziel der Erfindung, virusartige Teilchen bzw. virusähnliche Partikel (engl: virus like particles (VLPs)) bereitzustellen, die als diagnostische Mittel ebenso nützlich sein können wie für die Bildung eines Bestandteils eines Impfstoffs für die Verwendung bei Papillomvirusinfektionen.
Die Erfindung schließt deshalb in einem Aspekt ein Verfahren zur Herstellung von Papillomvirus ähnlichen Partikeln (VLPs) ein, das die Schritte umfasst:

(i) Konstruieren eines oder mehrerer rekombinanter DNA-Moleküle, von denen jedes ein Papillomvirus L1 Protein oder einer Kombination von Papillomvirus L1 Protein und Papillomvirus L2 Protein kodiert; und
(ii) Transfizieren einer geeigneten Wirtszelle mit dem einen oder mehreren rekombinanten DNA-Molekülen, so dass virusähnliche Partikel (VLPs) innerhalb der Zelle nach Expression des L1 oder der Kombination von L1 und L2 Proteinen gebildet werden.

Die Erfindung schließt in einem anderen Aspekt einen Impfstoff ein, der Papillomvirus VLPs in Kombination mit einem geeigneten Adjuvans enthält.
Bezüglich Schritt (i) wird nur Papillomvirus L1 Protein benötigt, um VLPs von einigen Papillomviren zu bilden. Geeigneter Weise wird nur das L1 Protein benötigt, um VLPs aus BVP1, HPV11 und HPV6 einschließlich HPV6b zu bilden. Jedoch können VLPs auch bezüglich BPV1, HPV11 oder HPV6b gebildet werden, die sowohl L1 als auch L2 Proteine enthalten. Für die Bildung von VLPs von anderen Papillomviren, wie HPV16, werden sowohl die L1 als auch die L2 Proteine benötigt. Es wird auch angenommen, dass diese Situation auf HPV18 anwendbar ist, das ähnliche pathologische Symptome wie HPV16 und auch eine ähnliche DNA Sequenzhomologie zeigt. Weiterhin ist vorgesehen, dass die L1 und L2 Gene in dasselbe DNA rekombinante Molekül oder in verschiedene DNA rekombinante Moleküle eingeschlossen werden können.
Vorzugsweise sind die rekombinanten DNA-Moleküle in einem rekombinanten Virus enthalten, das die Wirtszelle transfizieren kann. Geeignete Viren, die für diesen Zweck verwendet werden können, schließen Baculovirus, Vaccinia, Sindbisvirus, SV40, Sendaivirus, Adenovirus, Retrovirus oder Pockenviren ein. Geeignete Wirtszellen können Wirtszellen einschließen, die mit den obigen Viren verträglich sind, und diese schließen Insektenzellen wie Spodoptera frugiperda, CHO Zellen, Hühnchenembryo Fibroblasten, BHK Zellen, humane SW13 Zellen, Drosophila, Moskitozellen, abgeleitet von Aedes albopictus oder Affen epitheliale Zellen ein. Es wird auch angenommen, dass andere eukaryonte Zellen Hefezellen oder andere Säugerzellen umfassen können.
Das DNA rekombinante Molekül wird geeigneter Weise aus einer Quelle von Papillomvirusgenom erhalten, wobei das L1 Protein oder L2 Protein durch PCR Amplifikation unter Verwendung geeignet gestalteter Primer, wie im Folgenden diskutiert wird, amplifiziert werden kann. Vorzugsweise wird ein Gen, welches das L1 Protein kodiert, in ein Plasmid eingebaut, das einen geeigneten Promotor und ein DNA-Fragment mit dem L1 Protein enthält, und das Fragment und der Promotor werden in ein primäres Plasmid eingebaut, das ein rekombinantes DNA-Molekül bilden kann, das in einen rekombinanten Virusvektor, wie oben beschrieben, eingebaut werden kann.
Ein Gen welches das L2 Protein kodiert, kann auch mit einem geeigneten Promotor verbunden werden, und vorzugsweise werden ein DNA-Fragment, welches das L2 Gen einbaut, und der Promotor in das primäre Plasmid eingebaut, um ein doppelt rekombinantes Plasmid oder sekundäres Plasmid bereitzustellen, wobei dieses Plasmid auch in einen rekombinanten Virusvektor, wie oben beschrieben, eingebaut werden kann, um einen doppelt rekombinanten Virusvektor zu bilden.
Jedoch schließt die Erfindung auch die Ausführungsform ein, in der das primäre Plasmid und/oder das sekundäre Plasmid eine geeignete Wirtszelle infizieren kann, um VLPs mit L1 Protein oder VLPs mit L1 und L2 Protein unter geeigneten experimentellen Bedingungen herzustellen. Die zuletzt genannten VLPs sind das ideale Immunogen für einen Papillomvirus spezifischen Impfstoff, weil das L2 Protein in einer natürlichen Infektion immundominant ist.
Andere geeignete DNA rekombinante Moleküle schließen Cosmide ebenso wie rekombinante Viren ein. Geeignete Expressionssysteme schließen prokaryontische bzw. prokaryote Expressionssysteme einschließlich E. coli und irgendeinen Plasmid oder Cosmid Expressionsvektor oder eukaryonte Systeme einschließlich der oben beschriebenen Wirtszellen in Kombination mit einem rekombinanten Virusvektor oder alternativ Hefezellen und Hefeplasmide, ein.
In der Situation, wo Plasmide verwendet werden, die Gene einschließen, die L1 oder sowohl L1 als auch L2 kodieren, und wo solche Plasmide eine geeignete Wirtszelle für die Herstellung von VLPs infizieren können, sollten solche Plasmide auch einen geeigneten Promotor enthalten, um die Expression der VLP Strukturproteine zu verstärken, und einen Polymerase sollte ebenfalls verwendet werden, die mit dem relevanten Promoter assoziiert ist. Jedoch können in dieser Situation VLPs nur unter besonderen experimentellen Bedingungen erhalten werden.
Die L1 und L2 Gene können häufig durch irgendeinen Säuger oder viralen Promotor mit einem Säuger oder viralen Polyadenylierungssignal gesteuert werden. Vorzugsweise werden die L1 und L2 Gene von irgendeinem Vacciniavirus Promotor transkribiert, der ein früher Promotor oder ein später Promotor sein kann, je nach dem was als geeignet erachtet wird. Eine Liste von solchen Promotoren wird in Davision und Moss (1989) J. Mol. Biol 210 749-769 und (1989) J. Mol. Biol 210 771-784 angegeben.
In der experimentellen Arbeit, die stattgefunden hat, ist das L1 Gen unterhalb eines Vaccinia 4b-Promotors angeordnet, und das L2 Gen ist unterhalb eines synthetischen Vaccinia 28k späten Promotors angeordnet. Die Wirtszelle sind Affen epitheliale Zellen.
Die VLPs können aus den transfizierten Zellen durch irgendein geeignetes Reinigungsmittel erhalten werden. Die VLPs können mit irgendeinem geeigneten Adjuvans, wie ISCOMS, Alum, Freund'sches unvollständiges oder vollständiges Adjuvans, Quil A oder anderen Saponinen oder irgendeinem anderen Adjuvans kombiniert werden, wie zum Beispiel in Vanselow (1987) S. Vet. Bull. 57 881-896 beschrieben ist.
Es wird jetzt Bezug genommen auf verschiedene bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung, wie durch die beigefügten Zeichnungen dargestellt wird. In diesen bevorzugten Ausführungsformen sollte angemerkt werden, dass die spezifischen Papillomviren, VLPs und spezifischen Konstrukte von DNA rekombinanten Molekülen beispielhaft angegeben sind.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine schematische Darstellung von Plasmiden, die verwendet wurden, um HPV16 rekombinante Vacciniaviren zu konstruieren.
2A ist eine Western Blot Analyse von rekombinantem HPV16 L1 in Vacciniavirus infizierten CV-1 Zellen.
3 ist eine Northern Blot Analyse von rekombinanten Vacciniavirus infizierten CV-1 Zellen.
4A und 4B sind eine Elektronenmikroskopie von HPV virusähnlichen Partikeln aus CV-1 Zellen, die mit rekombinantem Vacciniavirus infiziert wurden.
5 stellt eine CsCl Äquilibriums Dichte-Gradienten Sedimentation von leerem HPV16 Kapsid dar.
6 stellt die Glykosylierung von L1 Proteinen in gereinigten Viruspartikeln dar.
7 ist ein Flussdiagram der Konstruktionen von Plasmid pLC200, das L1 kodiert, und pLC201, das L1 und L2 kodiert.
8 ist eine Western Blot Analyse der Reaktivität der murinen Seren mit Baculovirus rekombinantem L1 Protein.
Die 9 und 10 stellen Kartierungsergebnisse für Seren aus BALB/c, C57B1/6 und CBA Mäusen dar, die mit synthetischen HPV16 Kapsiden und vereinigten CFA immunisierten Kontrollseren immunisiert wurden.
Die 11 und 11A stellen die Reaktivität von zwei L1 spezifischen MAbs mit einer Reihe von überlappenden Peptiden des HPV16 L1 Moleküls dar.
11B stellt die antigene Index Vorhersage von HPV16 L1 dar.
12 zeigt eine Epitopkarte von HPV16 L1.
13A stellt synthetische HPV16 VLPs, wie sie für die Immunisierung verwendet wurden, dar.
13B zeigt die Reaktivität der gereinigten VLPs mit anti-HPV16 L2 Antiserum durch Western Blot.
13C stellt Plasmide dar, die verwendet wurden, um rekombinante Vacciniaviren im Verhältnis zu BPV1 zu konstruieren.
Die 14A und 14B zeigen die Analyse von BPV1 L1 und L2 Expression in CV-1 Zellen, die mit Wildtyp und rekombinanten Vacciniaviren infiziert wurden; und
Die 15A und 15B zeigen eine Elektronenmikroskopie von BPV1 Kapsiden, die aus Zellen erhalten wurden, die mit rekombinantem Vacciniavirus infiziert wurden.
BEISPIEL 1: VLPs; DIE VON HPV16 ABGELEITET SIND
Das HPV-16 L1 Gen, von dem zweiten ATG (nt5637) wurde durch Polymerase-Kettenreaktion aus pHPV16 (von Dr. L. Gissmann bereitgestellt) unter Verwendung der folgenden Primer amplifiziert:
1/ 5'-CAGATCTAGTTCTCTTTGGCTGCCTAGTGAGGCC-3'
2/ 5'-CAGATCTAATCAGCTTACGTTTTTTGCGTTTAGC-3'
Das erste Methioninkodon und das Stoppkodon sind durch Unterstreichen angegeben, und BgIII Stellen wurden eingeschlossen, um die Subklonierung zu erleichtern. Das amplifizierte 1527 bp Fragment wurde mit Phenol extrahiert und durch 1 % Agrosegel Elektrophorese gereinigt. Nach Spaltung mit BgIII wurde das L1 Gen in die BamHI Stelle des RK19 Plasmids subkloniert (Kent 1988 Doktorarbeit, Universität von Cambridge), das einen starken Vacciniavirus Promotor (4b) enthält. Das resultierende Plasmid wurde sequenziert (Sanger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74,5463-5467) und verwendet, um ein Fragment herzustellen, welches das HPV16 L1 Gen verbunden mit dem 4b-Promotor durch Spaltung mit Mlul und Sst1 enthält. Dieses Fragment wurde mit stumpfen Enden mit T4 DNA Polymerase versehen und in die BamHI Stelle des Vaccinia Zwischenvektors pLC1 kloniert, der das B24R Gen von Vacciniavirus (Kotwal und Moss, 1989, J. Virol. 63, 600-606; Smith et al., 1989, J. Gen. Virol. 70, 2333-2343), ein E. coli pgt Gen (Flakner und Moss, 1988, J. Virol. 64, 1849-1854; Boyle and Coupar, 1988, Gene 65, 123-128) und multiple Klonierungsstellen enthält, um das Plasmid pLC200 herzustellen.
Das HPV16 L2 Gen wurde durch teilweise Spaltung von pHPV16 mit Acc1 hergestellt, um ein Fragment (4138nt-5668nt) herzustellen, das mit Klenow aufgefüllt und mit synthetischen BamHI Linkern verbunden wurde. Diese L2 Fragment wurde in die BamHI Stelle eines pUC abgeleiteten Plasmids kloniert, das als p480 bezeichnet wurde, das einen synthetischen Vaccinia 28K späten Promotor, mit einigen Modifikationen enthält (Davison und Moss, 1989, J. Mol. Biol. 210, 771-784). Die Promotorsequenz ist wie folgt:
5'-GAGCTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGCATATAAATGGAGGTACCC-3'
wobei das späte Promotormotiv unterstrichen ist. Ein Fragment mit dem L2 Gen, verbunden mit dem 28K-Promotor, wurde durch Spalten mit SstI/SalI isoliert, durch T4 DNA-Polymerase mit stumpfen Enden versehen und anschließend in die SstI und SalI Stellen von pLC200 kloniert, um pLC201 (1) herzustellen.
Im 1 stehen HPV16 L1, L2 (offene Kästchen) unter der Kontrolle der späten Vacciniapromotoren (ausgefüllte Kästchen). Das E.coli gpt Gen (schraffiertes Kästchen) wird als Selektionsmarker verwendet. Flankierende Sequenzen für homologe Kombination. Die Richtung der Transkription ist durch Pfeile angegeben.
Das pLC2001 Plasmid wird anschließend verwendet, um ein rekombinantes Vacciniavirus, wie kürzlich beschrieben (Mackett et al., 1984, J. Virol. 49, 857-864) zu konstruieren. Rekombinantes Virus pLC201VV und pLC202VV wurden durch Plaque Assay in der Anwesenheit von Mycophenolsäure, Xanthin und Hypoxanthin (Falkner und Moss, 1988) selektiert. Rekombinantes Vacciniavirus (VV), das HPV16L1 und HPV16L2 exprimiert, wurde hergestellt und verwendet wie zuvor beschrieben (Zhou et al., 1990, J. Gen. Virol. 71, 2185-2190).
Das rekombinante Plasmid pLC201 wurde bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, USA am 27. März 1992 hinterlegt, und ihm wurde die Bezeichnung 75226 zugewiesen.
Rekombinantes Vacciniavirus pLC201VV wurde bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, USA am 03. April 1992 hinterlegt, und ihn wurde die Bezeichnung VR2371 zugewiesen.
REINIGUNG VON VIRUSÄHNLICHEN PARTIKELN
CV-1 Zellen, die mit rekombinanten Viren pLC201VV infiziert wurden, wurden in 10 mM Tris (pH 9,0) 32 hr nach der Infektion geerntet und mit einem Dounce Homoginisator homogenisiert. Die Homogenate wurden durch Zentrifugation bei 2000 g geklärt, um den Zelldebris zu entfernen und auf ein 30 % (Gew./Vol) Sucrosekissen gelagert. Das Pellet, das sich durch Zentrifugation bei 110.000 g in einem SW38 Rotor für 90 min bildete, wurde in 10 mM Tris pH 9,0 suspendiert und auf einen 20-60 % diskontinuierlichen Sucrosegradienten gelagert. Nach Zentrifugation bei 100.000 g für 18 hrs wurden 10 gleiche Fraktionen von 0,25 ml gesammelt. Die Proben wurden mit 0,6 ml Ethanol gemischt. Das Pellet, das nach der Zentrifugation bei 4°C und 12.000 g für 20 Minuten erhalten wurde, wurde für die weitere Analyse gesammelt. Um die Dichte der virusähnlichen Partikel zu bestimmen, wurde eine Äquilibrium Dichte-Gradienten Sedimentation in CsCl (1,30 g/ml) durchgeführt. Nach Zentrifugation bei 125.000 × g für 20 hrs wurden 11 Fraktionen mit 0,25 ml gesammelt. Die Dichte jeder Fraktion wurde bestimmt, und jede wurde hinsichtlich virusähnlichen Partikeln durch Transmissionselektronenmikroskopie untersucht.
In 2A wurden die Zellen bei 10 pfu/Zelle mit wt.VV (Spur 1) und pLC201VV (Spur 2) infiziert und 48 h nach der Infektion geerntet. Die L1 Proteine wurden mit einem HPV16 L1 spezifischen MAb Camvir 1 nachgewiesen. Das 57 kDa L1 Protein ist durch den Pfeil angezeigt. Die Bindung von Camvir 1 an das 35 kDa Protein in allen drei Spuren ist unspezifisch.
In 3 wurden RNAs aus Zellen extrahiert, die mit pLC201VV (Spur 2), pLC202VV (Spur 3), das auch Gene einschließt, die HPV16 Proteine E1 und E4 kodieren ebenso wie Gene, die HPV16 L1 und L2 kodieren, oder wt.VV (Spur 4) infiziert wurden, wurden auf einem 1,2 % Formaldehyd-Agarosegel aufgetrennt. Die RNA wurde auf Nylonmembran transferiert und mit einer ³²P-markierten L2 Sonde hybridisiert. Fomaldehyd behandelter Lambda DNA-HindIII geschnittener Marker ist gezeigt (Spur 1).
ELEKTRONONMIKROSKOPIE
CV-1 Zellen, die mit rekombinantem Vacciniavirus infiziert wurden, wurden in 3 % (Vol/Vol) Glutaraldehyd in 0,1 M Natrium Cacodylatpuffer fixiert und in 1 % Osmiumtetroxid postfixiert, dehydriert in reinen Alkoholen und in Epoxyharz eingebettet. Dünne Schnitte wurden geschnitten und mit Uranylacetat und Leadcitrat gefärbt. Es wurden Fraktionen des Sucrosegradienten auf EM-Gittern getrocknet, und mit 1 % (Gew./Vol.) Phosphorwolframsäure (pH 7,0) negativ gefärbt. Die Fraktionen wurden unter Verwendung eines JEOL 1200Ex Transmissionselektronenmikroskops untersucht.
In 4A sind CV-1 Zellen, die mit pLC201VV für 32 Stunden infiziert wurden, gezeigt. In den CV-1 Kernen wurden Partikel von ungefähr 40 nm Durchmesser (mit Pfeil versehen) häufig gefunden. Der Balken entspricht 100 nm.
In 4B ist die Fraktion 5 des Sucrosegradienten gezeigt. Papillomvirus ähnliche Partikel, die offensichtlich aus regulären Mustern von Kapsomeren bestehen, wurden beobachtet (mit Pfeil versehen). Der Balken entspricht 50 nm.
ANALYSE VON HPV ORF PRODUKTEN
Die HPV16L1 Expression wurde durch Immunpräzipitation und Immunblot analysiert. Für die Immunpräzipitation wurden ³⁵S metabolisch markierte rekombinante VV infizierte CV-1 Zellen in RIPA Puffer (0,1 % SDS, 1 % Tritron X-100, 1 % Natiumdesoxycholate, 150 mM NaCl, 0,5 μg/ml Aprotinin, 10 mM Tris-HCl, pH 7,4) lysiert. Die Immunoblot Analyse von teilweise gereinigten virusähnlichen Partikeln, unter Verwendung des L1 spezifischen MAb Camvir 1 (McLean et al., 1990, J. Clin. Pathol. 43, 488-492) und ¹²⁵I anti-Maus IgG (Amerscham) wurde wie zuvor beschrieben unter Verwendung von Proben durchgeführt, die in 2x SDS Gel Auftragspuffer mit 2-Mercaptoethanol gelöst wurden. Die Analyse von HPV16L2 Genexpression ist in 13B gezeigt. Für die Analyse von N-Glycosylierung, wurden teilweise gereinigte virusähnliche Partikel in 100 μl Puffer aufgenommen (0,5 M Natriumacetat, pH 6,5, 20 mM EDTA und 10 mM 2-Mercaptoethanol) und mit 0,5 μl Endoglycosidase F (Boehringer Mannheim) bei 37°C für 18 hrs vor dem Immunoblotten umgesetzt.
Mycophenolsäure wurde verwendet, um ein Vacciniavirus zu selektieren, das rekombinant hinsichtlich des gpt Plasmids pLC201 ist, und dieses wurde als pLC201VV bezeichnet. Die Synthese von L1 in Zellen, die mit pLC201VV infiziert wurden, wurden durch Immunblotten und Immunipräzipitation bestätigt. Das L1 Protein wurde als eine Bande in der Autoradiografie von ungefähr 57 kDa gezeigt.
Ein Northern Blot mit RNA, die aus CV-1-Zellen extrahiert wurde, die mit diesen rekombinanten Viren infiziert wurden, bestätigte große Mengen an L2 RNA Transkription in Zellen, die mit einem dieser Viren (3) infiziert wurden. Die L2 Transkription von dem synthetischen Vacciniavirus späten Promotor ergab ein heterogenes Northern Blot Muster, weil VV späte RNAs kein spezifisches Transkriptionsterminationssignal verwenden.
Die CV-1 Zellen wurden mit pLC201VV infiziert und hinsichtlich virusähnlicher Partikeln untersucht. Die Elektronenmikrografen von dünnen Schnitten von Zellen, die mit pLC201VV infiziert, aber nicht die Kontrollzellen, die nur mit Wildtyp Vaccinia infiziert wurden, zeigten ungefähr 40 nm virusähnliche Partikel in den Zellkernen. In den meisten Fällen waren diese Partikel in Ketten verbunden und lagen nahe der Kernmembran (4a). Die Zellen, die mit rekombinanten Vacciniaviren infiziert wurden, die nur HPV16L1 oder nur L2 exprimierten und das korrespondierende Protein (L1) oder mRNA (L2) bildeten, enthielten keine virusähnlichen Partikel. Zellen, die gleichzeitig mit zwei verschiedenen rekombinanten Vacciniaviren infiziert wurden, die jeweils HPV16L1 und HPV16L2 exprimierten, zeigten auch keine HPV ähnlichen Partikel; obwohl L1 Protein und L2 mRNA in Pools dieser doppelt infizierten Zellen identifiziert werden konnten, während die gleichzeitige Synthese von sowohl L1 als auch L2 innerhalb einzelner Zellen nicht nachgewiesen wurde.
In 5 wurden HPV16 virusähnliche Partikel, die aus CV-1 Zellen erhalten wurden, die mit pLC201VV infiziert wurden, über einem Sucrosekissen zentrifugiert und anschließend einer CsCl isopynischen Sedimentation zugeführt. Virusähnliche Partikel (+) wurden in den Fraktionen 8 und 9 gefunden. Der Transmissionselektronenmikrograf eines negativ gefärbten Partikels aus Fraktion 8 ist in dem Insert gezeigt. Die Dichte (g/ml) jeder Gradientenfraktion ist angegeben.
In 6 wurden CV-1 Zellen mit pLC201VV für 32 hrs infiziert, und virusähnliche Partikel wurden auf einem Sucrosegradienten gereinigt. Die Proben wurden mit Ethanol präzipitiert und mit Endoglycosidase F vor der Analyse durch Immunblotten mit einem anti-HPV16 L1 Antikörper Camvir 1 behandelt. Spur 1: gereinigte virusähnliche Partikel; Spur 2 und 3: nach der Behandlung mit Endoglycosidase F über Nacht. Die L1 Doppellinie ist durch (=) angegeben, und deglycosiliertes L1 ist durch den Pfeil angegeben. Die Molekulargewichtsmarker sind auf der linken Seite gezeigt.
Um zu bestätigen, dass die virusähnlichen Partikel, die durch Elektronenmikroskopie beobachtet wurden, HPV16L1 Protein enthielten, wurden Zellextrakte aus pLC201VV infizierten Zellen einer teilweisen Reinigung in einem 20 %–60 % Sucrosegradienten unterzogen. Zehn Fraktionen wurden gesammelt und hinsichtlich L1 Protein untersucht. Aus den Fraktionen 3 und 7 konnte L1 nachgewiesen werden, und in Fraktion 5 wurde die höchste Menge an L1 gefunden. Jede Fraktion wurde auch durch EM hinsichtlich virusähnlicher Partikeln untersucht: diese wurden in Fraktion 5 beobachtet. Ein typisches Papillomvirus, das mit Natriumphosphowolfram negativ gefärbt wurde, weist 72 reguläre enggepackte Kapsomere auf (Finch und Klug, 1965, J. Mol. Biol. 13, 1-12; Rowson und Mahy, 1967, Bacteriol. Rev. 31, 110.131) und weist einen Durchmesser von ungefähr 50 nm auf. Der Durchmesser der virusähnlichen Partikel, die aus den infizierten CV-1 Zellen gereinigt wurden, schwankte zwischen 35 nm und 40 nm. Diese virusähnlichen Partikel besaßen jedoch eine ähnliche EM-Erscheinung im Vergleich zu Papillomviren, und eine regelmäßige Anordnung von Kapsomeren konnte erkannt werden (4b). Die virusähnlichen Partikel, die in Fraktion 5 des Sucrosegradienten identifiziert wurden, wurden deshalb als leer und nicht korrekt zusammengebaute Anordnungen von HPV Kapsomeren angenommen. In CsCl sedimentierten HPV16 virusähnlich Partikel bei ungefähr 1,31 g/ml (5) und zeigten ein typisches leeres Papillomviruskapsid Erscheinungsbild unter dem Transmissionselektronenmikroskop (5, Insert).
Camvir 1 identifizierte ein Proteinduplett in Western Blots von virusähnlichen Partikeln, die aus pLC201VV infizierten CV-1 Zellen (6) gereinigt wurden. HPV16L1 enthält vier potenzielle N-Glycosylierungsstellen (Asparagin 157, 242, 367 und 421). Um zu untersuchen, ob das Duplett Glykosylierungsvarianten des L1 Polypeptids darstellte, wurden teilweise gereinigte virusähnliche Partikel einer Behandlung mit Endoglycosidase F vor der SDS-PAGE und dem Immunblotten unterzogen. Dies führte zu dem Austausch des Dupletts durch eine einzelne Bande von geringfügig niedriger auftretendem Molekulargewicht, bei dem erwarteten Molekulargewicht von ungefähr 57 kDa (6, Spur 2, 3).
Die virusähnlichen Partikel, die aus Fraktionen des CsCl Gradienten mit einer Auftriebsdichte von 1,29-1,30 g/ml gesammelt wurden, wurden als Antigen in einem ELISA Assay verwendet. Alle Antiseren von Mäusen, die mit VLPs immunisiert wurden, waren positiv (Tabelle 2). Kontrollseren von Mäusen, die mit ähnlichen Fraktionen eines Dichtegradienten immunisiert wurden, der mit Lysat aus CV-1 Zellen hergestellt wurde, die mit Wildtyp Vaccinia infiziert wurden, waren mit den virusähnlichen Partikeln nicht reaktiv. Unter Verwendung von zwei verschiedenen Protokollen, um virusähnlichen Partikel auf ELISA Platten zu schichten (Dillner et al., 1991, J Virol 65, 6862-6871) wurden Versuche unternommen, um die Reaktivität mit nativen HPV virusähnlichen Partikeln von der Reaktivität mit den teilweise denaturierten Proteinen von zerstörten Partikeln zu vergleichen. Die murinen Antiseren, die gegen die VPLs gerichtet waren, waren gleichmäßig reaktiv mit den nativen (OD 1,00 ± 0,20) und den denaturierten (OD 1,60 ± 0,45) Partikeln. Ein Muster von 6 monoklonalen Antikörpern, die spezifisch für definierte L1 Epitope sind, schloss nur 1 (Camvir 1) ein, das schwach reaktiv (OD 0,064) mit nativen VLPs war, und es zeigte sich als reaktiver mit denaturierten Partikeln (OD 0,107) als mit nativen Partikeln, was nahe legt, dass die Reaktivität an dem denaturierten L1 Protein in der nativen VLP Präparation hing.
In 8 wurde ¹²⁵I-markiertes anti-Maus IgG als der zweite Antikörper verwendet. Die 57 kDa L1 Bande ist durch den Pfeil gekennzeichnet. Schlüssel: Seren aus einzelnen Mäusen, die mit VLPs immunisiert wurden: Spuren 1-5, BALB/c; Spuren 6-10, C57B1/6; Spuren 11-15, B10A; Seren von einzelnen Mäusen, die mit CFA immunisiert wurden; Spur 16, BALB/c; Spur 17, C57B1/6; Spur 18, B10A; anti-HPV16L1 MAb Camvir 1, Spur 19. Die Molekulargewichte sind auf der linken Seite angegeben.
Die Reaktivität der anti-VLP Antiseren mit den L1 und L2 Proteinen von HPV16 wurde durch Immunblot unter Verwendung von Baculovirus rekombinanten HPV16L1 und L2 Proteinen bestätigt. Die Seren von allen Mäusen, die mit den virusähnlichen Partikeln immunisiert wurden und jeder der monoklonalen anti-HPV16L1 Antikörper erkannte ein 57 kDa Protein (8) in den L1 rekombinanten Baculovirus infizierten S. frugiperda Zelllysaten, und es wurde keine vergleichbare Reaktivität mit Lysaten aus S. frugiperda Zellen beobachtet, die mit Wildtyp Baculovirus infiziert wurden. Die Intensität der Reaktivität mit dem L1 Protein variierte von Maus zu Maus, aber alle Seren waren mit der verlängerten Reaktionszeit des Immunblots reaktiv. Ähnliche Ergebnisse wurden mit den L2 rekombinanten Baculovirus infizierten Zelllysaten beobachtet: murine anti-VLP Antiseren und ein Kaninchen Antiserum gegen L2 Protein reagierten beide mit einem einzelnen Protein in dem Lysat. Die Seren von Mäusen, die mit CFA alleine immunisiert wurden, reagierten nicht mit Protein aus Lysaten von L1 oder L2 rekombinanten Baculovirus infizierten S. frugiperda.
BEISPIEL 2: DEFINITION VON LINEAREN ANTIGENEN REGIONEN VON HPV16L1
PROTEIN VERWENDENDE VLPs
In einer weiteren Reihe von Experimenten wurden die linearen antigenen Regionen des HPV16 L1 Kapsidproteins unter Verwendung von sythetischen VLPs bestimmt. In solchen Experimenten wurden Mäuse mit drei Haplotypen (H-2^d, H-2^b, und H-2^d/b) mit synthetischen HPV16 virusähnlichen Partikeln (VLPs) immunisiert, die unter Verwendung einer Vacciniavirus doppelten Rekombinante für die L1 und L2 Proteine von HPV16 hergestellt wurden. Die resultierenden anti-VLP Antiseren erkannten HPV16 Kapside durch ELISA Assay und Baculovirus rekombinantes HPV16L1 und L1 Protein in Immunblots. Es wurden überlappende Peptide verwendet, die der Aminosäuresequenz von HPV16L1 entsprechen, um die immunreaktiven Regionen des L1 Proteins zu definieren. Der Hauptteil der L1 Peptide war mit IgG aus den Mäusen reaktiv, die mit den synthetischen HPV16 Kapsiden immunisiert wurden. Ein Computeralgorithmus sagte sieben B Epitope in HPV16L1 vorher, von denen fünf innerhalb von Peptiden lagen, die mit murinen Antiseren stark reaktiv waren. Die murinen anti-VLP Antiseren reagierten nicht mit den zwei Peptiden, die durch anti-HPV16L1 monoklonale Antikörper erkannt wurden, die von anderen gegen rekombinantes L1 Fusionsprotein hergestellt wurden. Wir schlossen daraus, dass die immunreaktiven Epitope von HPV16, die unter Verwendung von virusähnlichen Partikeln definiert wurden, sich signifikant von jenen unterschieden, die unter Verwendung von rekombinanten HPV16L1 Fusionsproteinen definiert wurden, was impliziert, dass solche Fusionsproteine nicht die Antigene sind, um nach HPV16L1 spezifischen Immunantworten in HPV infizierten Patienten zu suchen.
Herstellung von HPV16 Kapsiden. Das Plasmid pLC201 mit HPV16L1 und L2 offenen Leserahmen (ORFs) unter der Kontrolle der Vacciniavirus Promotoren 4b (natürlich) und p480 (synthetisch) wurden verwendet, um das rekombinante Vacciniavirus (rVV) pLC201VV wie zuvor beschrieben zu konstruieren, aber mit den Ausnahmen, die unten erwähnt sind. Es wurden HPV16 virusähnliche Partikel aus pLC201VV infizierten CV-1 Zellen wie zuvor erwähnt hergestellt, aber die Zellen wurden in Medium kultiviert, das Rifampicin in 100 μg/ml enthielt, um den Zusammenbau und die Reifung von Vacciniavirus zu verhindern (Moss, „Virology" S. 685-703 Raven, New York, 1985; Karacostas et al., PNAS 86, 8964-8967, 1989). Die infizierten Zellen wurden geerntet und durch Einfrieren und Auftauen nach einer Dounce Homogenisierung in 10 mM Tris-HCl (pH 9,0) lysiert. Die Lysate wurden durch Zentrifugation bei 2.000 g geklärt und anschließend bei 100.000 g für 2 hr über einem 20 % Sucrosekissen in PBS Puffer zentrifugiert. Das Pellet wurde mit CsCl in einer anfänglichen Dichte von 1,30 g/ml gemischt und bei 100.000 g für 18 hr bei 18°C zentrifugiert. Die Fraktionen wurden gesammelt und Immunblots wurden auf Ethanol präzipitierten Proteinen durchgeführt. Die für L1 Protein positiv getesteten Fraktionen wurden vereinigt, und die Anwesenheit von virusähnlichen Partikeln wurde durch Elektronenmikroskopie wie oben beschrieben bestätigt.
Herstellung von Antiseren. Es wurden Gruppen von fünf Mäusen BALB/c (H-2^d), C57B1/6 (H-2^b) und B10A (H-2^b/d) mit CsCl Gradient gereinigten HPV16 virusähnlichen Partikeln immunisiert. Die Tiere wurden mit 5 μg Kapsidprotein durch subkutane Injektion inokuliert. Die anfängliche Injektion wurde mit Freund'schem vollständigen Adjuvans verabreicht, und drei weitere Injektionen in dreiwöchigen In tervallen wurden in Salzlösung verabreicht. Vierzehn Tage nach der vierten Injektion wurden die Seren gesammelt und bei -20°C gelagert. Material, das von CV-1 Zellen, die mit Wildtyp Vacciniavirus infiziert wurden, hergestellt und exakt wie für pLC201VV infizierte Zellen verarbeitet wurde, wurde verwendet, um Kontrollgruppen von Mäusen nach demselben Protokoll zu immunisieren.
Peptide. Eine Reihe von 15-mer Peptiden, die um fünf Reste überlappen und die abgeleitete Aminosäuresequenz von HPV16L1 Protein umspannen (Seedorf et al., 1985, Virology 145 181-185; Parton, 1990, Nucleic Acids Res 18 363) wurde mit dem DuPont RaMPS multiplen Peptidsythesesystem unter Verwendung von Fmoc Chemie gemäß Standardprotokollen hergestellt (Fields und Noble, 1990 Int. J. Pept. Proetin Res 35 161-214) und anschließend mit Glutaraldehyd an Rinderserum Albumin (BSA) konjugiert. Um die Position der Aminosäuren (aas) in dem L1 Protein zu notieren, wurde das putative erste Initationskodon als Aminosäurenummer 1 bezeichnet (Tabelle 1). Aus technischen Gründen wurde das C-terminale Peptid, das den aas 521-531 entspricht, nicht verwendet. Alle verwendeten Peptide waren größer als 80 % rein, wie durch HPLC Analyse bewertet wurde.
Rekombinante L1 + L2 Proteine. Rekombinante Baculoviren, die den HPV16L1 oder den HPV16L2 ORF exprimieren, wurden verwendet, um Insekten SF9 Zellen zu infizieren. Nach 3 Tagen Inkubation bei 25°C wurden die Zellen durch Zentrifugation bei 14.000 g für 5 min pelletiert. Das Pellet wurde in RIPA Puffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,6; 2 mM EDTA; 50 mM NaCl; 1 % Desoxycholat; 1 % Triton X-100; 0,25 % SDS, 1 % Aproptinin; 1 mM PMSF) gelöst.
Western Blotten. Virusähnliche Partikel oder rekmbinantes L1 oder L2 Protein wurde mit 2x Autragungspuffer mit 2 % SDS/DTT gemischt und für 5 min aufgekocht. Die Proteine wurden in 10 % Polyacrylamidgelen getrennt und auf Nitrocellulose geblottet (Towbin et al., 1979, Virology 175 1-9). Die Filter wurden in Streifen geschnitten, in 3 % BSA in PBS bei 37°C für 1 hr inkubiert. Die geblockten Streifen wurden gegenüber verschiedenen murinen Antiseren (1:200) oder monoklonalen Antikörpern über Nacht bei 4°C ausgesetzt. Die reaktiven Proteine wurden durch Autoradiografie nach Reaktion mit ¹²⁵I-konjugiertem anti-Maus IgG (0,2 μCi/ml) (Amersham) sichtbar gemacht.
ELISA Assay. Polyklonale Antiseren wurden hinsichtlich der Reaktivität mit synthetischen HPV16 Kapsiden durch einen Enzym-verknüpften Immunosorbent Assay (ELISA) wie zuvor beschrieben untersucht (Christensen et al., 1990, PNAS 76 4350-4354, Cowsert et al., 1987, JNC1 79 1053-1057). Für die Assays mit „natürlichen" synthetischen HPV16 Kapsiden wurden 100 ng Protein in PBS (pH 7,5) an jede ELISA Plattenvertiefung (Flow Labs) durch Inkubation für 1 hr bei 37°C angeheftet. Für die Assays mit „denaturierten" Partikeln wurden die Partikel in Carbonatpuffer, pH 9,6 suspendiert und an die Platte Übernacht bei 37°C adsorbiert. Alle weiteren Inkubationen wurden bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Platten wurden mit PBS gewaschen, und nicht angeheftete Stellen wurden durch Inkubation für 1 hr in Blockierungspuffer (5 % Milchpulver in PBS, pH 7,5) blockiert. Die murinen Antiseren (1:200), die zuvor mit Wildtyp VV-infiziertem CV-1 Zellextrakt absorbiert wurden, wurden zugegeben und für 1 hr inkubiert, und die Platten wurden mit PBS gewaschen. Mehrrettich Peroxidase konjugiertes anti-Maus IgG (Sigma) in einer 1:1.000 Verdünnung in Blockierungspuffer wurde zugegeben und für 1 hr inkubiert, gefolgt von 10 Waschschritten mit PBS. Es wurde Substratpuffer (pH 4,6) mit ABTS (Boehringer) und H₂O₂ zugegeben und die OD415 nach 15 min ausgelesen.
Lineare B Epitopkartierung. Es wurden B Epitope durch Screenen von Antiseren von immunisierten Tieren gegen einen Satz von überlappenden HPV16L1 Peptiden durch ELISA identifiziert. Es wurden synthetische Peptide, die an BSA gekoppelt waren, in 10 mM Natriumcarbonatpuffer (pH 9,3) verdünnt und an ELISA Platten Übernacht bei 4°C adsorbiert. Das Blockieren der restlichen Bindungsstellen auf den Platten wurde unter Verwendung von 3 % BSA in PBS für 2 hr bei 37° durchgeführt. Verdünnte Maus Antiseren (1:500) wurden mit beschichteten Platten bei Raumtemperatur für 2 hr inkubiert. Die Platten wurden mit PBS mit Tween 20 (0,1 %) gewaschen und mit Peroxidase konjugiertem anti-Maus IgG (1:1.000) (Sigma) oder IgA (1:2.000) (Sigma) für 2 hr inkubiert. Die Platten wurden gewaschen und mit 0,5 mg/ml ABTS in Substratpuffer (pH 4,6) für 15 min vor der Auf nahme der Absorptionswerte bei 415 nm entwickelt. Ein Peptid wurde als reaktiv erachtet wenn der OD 415 Wert mit dem Testserum größer als 3 SDs über dem Durchschnitt für das Kontrollserum lag: Dies ergab einen Ausschlusswert von 0,260. Eine OD 415 von fünf mal größer als die durchschnittliche OD 415, die mit Kontrollseren (0,55) erhalten wurde, wurde willkürlich dahingehend erachtet, dass sie ein hauptreaktives Epitope definiert.
Monoklonale Antikörper und Antiseren. Fünf monoklonale Antikörper (MAb), die gegen das HPV16L1 Fusionsprotein gerichtet sind, wurden verwendet. Die MAb 5A4, 1D6, 3D1 und 8C4 (Cason et al., 1989, J. Gen Virol 70 2973-2987) wurden von Dr. Phil Shephard aus London, U.K. bereitgestellt, und MAb Camvir 1 (McLean et al., 1990, J. Clin. Pathol. 43 488-492) wurde von Dr. C. McLean (Abteilung für Pathologie, Universität von Cambridge) erhalten. Das Kaninchen Antiserum gegen HPV16L2 Trp-E Fusionsprotein wurde von Dr. Denise Galloway (Universität von Washington, Seattle) bereitgestellt.
Aminosäuresequenzanalyse und die antigene Index Vorhersage. Der antigene Index (A1) (Jameson und Wolf, 1988, Comp. Appl., Biosci 4 181-186) ist eine Messung der Wahrscheinlichkeit, das eine Peptidsequenz antigen ist. Sie wird durch das Summieren einiger gewichteter Messungen der Sekundärstruktur berechnet. Die Werte für die vorhergesagte HPV16L1 Sequenz wurden unter Verwendung der PLOTSTRUCTURE Software berechnet.
In den 9 und 10 ist die Reaktivität (OD 415) der Seren im ELISA mit einer Reihe von überlappenden Peptiden, die der Sequenz des HPV16L1 entsprechen, gezeigt. Die Peptidzahlen, die der HPV16L1 Sequenz entsprechen (siehe Tabelle 1) sind angegeben.
In den 11 und 11A entspricht das Nummerierungssystem für die Aminosäuren HPV16L1 von dem ersten putativen Initiationskodon. Die Regionen mit einem AI Wert von über 1,5 sind angegeben.
In 12 sind die Regionen von HPV16L1 gezeigt, innerhalb der gezeigt wurde, dass B Epitope in einem Bereich des Kartierungssystems liegen. Die Ergebnisse mit Seren aus Mäusen, die mit VLPs (Partikeln) und mit IgA und IgG Antikörpern in Seren aus Menschen mit Zervixkrebs (humanes IgA und humanes IgG) immunisiert wurden (Dillner et al., 1990 Int. J Cancer 45 529-535), wurden unter Verwendung von überlappenden Peptiden erhalten. Die murinen anti-VLP Antiseren wurden als signifikant reaktiv mit einem Peptid erachtet, wenn die OD größer als 0,55 war. Die Ergebnisse von Kaninchen, die mit einem L1 Fusionsprotein (Kaninchenserum) immunisiert wurden (Müller et al., 1990 J Gen Virol 71 2709-2717) wurden aufgetragen. Diese wurden unter Verwendung einer Reihe von Expressionsklonen mit teilweiser Länge bestimmt, und die Gesamtlänge der Sequenz, innerhalb der das/die Epitop/e lag/en, ist gezeigt. Ebenfalls angegeben sind die Algorithmus vorhergesagten B-Epitope (Computer) (Jameson und Wolf Comp. Appl. Biosci 4 181-186 1988) und die Epitope, die von den publizierten anti-HPV16L1 monoklonalen Antikörpern (Monoclonale) (Cason et al., J. Gen Virol. 70 2973-2987 1989; McLean et al., J. Clin Pathol. 43 488-492 1990) erkannt werden. Der Maßstab zeigt die Position der Epitope entlang des 531 aa L1 Proteins, und es ist ausgehend von dem N-terminalen Methionin (Rest 1) nummeriert. Für jedes Epitope enthaltende Peptid ist auch die exakte Lage bzgl. des N-terminalen Methionins angegeben.
Eine Reihe von 15-mer synthetischen Peptiden des HPV16L1 Proteins, welche die gesamte Länge des Proteins mit fünf aa Überlappungen abdecken, wurden verwendet, um die Epitope in L1 zu definieren, die von den verschiedenen Immunseren erkannt werden. Jedes der 16 Antiseren aus den drei gestesteten Inzuchtmäusestämmen, BALB/c(H-2^d), C57B1/6(H-2^b) und B10A (H-2^b/d) erkannten multiple lineare Peptide des L1 Proteins, und im Wesentlichen dieselben Peptide aus HPV16L1 wurden durch alle getesteten Stämme erkannt (10). Fünf einzelne Seren wurden für jeden Stamm getestet. Ein Peptid wurde als reaktiv bezeichnet, wenn die OD mit einem Serum größer als der Durchschnitt + 3SD der ODs der negativen Kontrollseren war; dies ergab eine Ausschlussgrenze für die Reaktivität von 0,260. Die Seren von Mäusen, die mit CFA alleine immunisiert wurden, wiesen eine OD 415 Reaktivität von weniger als 0,260 mit all den L1 Peptiden auf.
Während einige Schwankungen in der Intensität der Reaktivität von jedem anti-VLP Serum von einem gegebenen Stamm mit jedem Peptid beobachtet wurden, war jedes der Peptide reaktiv (OD > 0,260) mit entweder allen oder keinem der anti-VLP Seren aus jedem Mausstamm. Das Isoepitop des peptidspezifischen Antikörpers in den anti-VLP Seren wurden unter Verwendung von IgG und IgA spezifische anti-Maus Immunoglobulin Antikörpern untersucht. Die IgG Antwort war wie gezeigt (9 und 10), und es konnte keine signifikante IgA Reaktivität gegen irgendein Peptid nachgewiesen werden (OD < 0,050). Weil die meisten Peptide mit den anti-VLP Seren reaktiv waren, wurde ein willkürlicher OD Wert von fünf mal des mittleren negativen Werts verwendet, um hauptreaktive Regionen des L1 Proteins zu definieren; Die hauptimmunreaktiven L1 Peptide waren gleichmäßig entlang der Länge des L1 Proteins verteilt, wobei sieben im aminoterminalen Drittel des Moleküls, sieben im mittleren Drittel und acht in dem carboxyterminalen Drittel lagen. Im Gegensatz dazu erkannten die monoklonalen Antikörper, die spezifisch für HPV16L1 waren, einzelne hauptlineare Epitope, wie zuvor beschrieben wurde (Cason et al., oben, McLean et al., 1990 oben). Vier der fünf reaktiven anti-HPV16L1 monoklonalen Antikörper (5A4, 1D6, 3D1, 8C4) waren mit dem Peptid 30 (291-305) reaktiv, wohingegen Camvir 1 das Peptid 24 (231-245) erkannte (11 und 11A). Die Seren von Mäusen, die mit den virusähnlichen Partikeln immunisiert wurden, reagierten mit keinem dieser Peptide.
Es wurde ein Algorithmus verwendet, um wahrscheinliche B Epitope von HPV16L1 abzuleiten, basierend auf der vorhergesagten Proteinsekundärstruktur. Mögliche antigene Regionen wurden als ein antigener Index (A1) (Jameson und Wolf, 1988, oben) auf der Basis von Kettenflexibilität, hoher Erreichbarkeit und hohem Grad an Hydrophilizität (11) berechnet. Eine Region mit einem A1 Wert von über 1,5 wurde als ein vorhergesagtes B Epitop erachtet. Sieben solche Regionen wurden gefunden (Aminosäuren 79-84, 105-108, 120-122, 134-135, 267, 269, 298-299, 363-367), und fünf von diesen sieben Regionen lagen innerhalb der 22 Peptide, gegen welche die Hauptreaktivität mit Antiseren aus Mäusen beobachtet wurde, die mit synthetischen HPV16 Kapsiden immunisiert wurden. Die Zusammenfassung der B Epitop Spezifität von Antiseren aus verschiedenen Quellen ist in 12 gezeigt.
Bei der weiteren Betrachtung der Beispiele 1-2 wird bemerkt, dass Papillomviren im allgemeinen Virionen in infizierten Keratinozyten herstellen, die einfach durch Elektronenmikroskopie identifizierbar sind (Almeida et al., 1962, J. Invest, Dermatol 38, 337-345), und die in einigen Fällen gereinigt und als infektiös gezeigt werden können (Rowson und Mahy, 1967, Bacterial. Reo. 31, 110-113). HPV16 Virionen werden jedoch nicht in HPV16 infiziertem zervikalen epithelialen Gewebe beobachtet, obwohl HPV16L1 und L2 späte Gentranskription in differenziertem genitalen Epithel stattfindet (Crum et al., 1988, J. Virol. 62, 84-90), und die L1 Translation immunreaktives L1 Protein in diesen Geweben bildet (Stanley et al., 1989, Int. J. Cancer 43, 672-676). In dieser Beschreibung haben wir gezeigt, dass die Expression von HPV16L1 und L2 Genen in epithelialen Zellen sowohl notwendig als auch hinreichend ist, um den Zusammenbau von HPV16 virionähnlichen Partikeln zu erlauben, und hiermit sind die L1 und L2 Proteine von HPV16 nicht bzgl. des Virionzusammenbaus defekt. Die Expression von HPV16 späten Genen in Geweben scheint strikt durch die epitheliale Umgebung reguliert zu sein (Taichman et al., 1983, J. Invest. Dermatol 1, 137-140). Das Versagen, HPV16 Virionen in vivo trotz der Transkription von L1 und L2 und der Translation von L1 nachzuweisen, liegt nahe, das es entweder eine posttranskriptionelle Blockierung der L2 Herstellung in zervikalem Epithel oder einen Inhibitor des Virionzusammenbaus gibt. In der HPV16 enthaltenden Zelllinie W12, die von zervikalem Gewebe abgeleitet ist, wurden virusähnliche Partikel beobachtet, wenn die Zellen eine terminale Differenzierung in vivo in einer murinen Mikroumgebung durchlaufen (Sterling et al., 1990 J. Virol 64, 6305-6307), was nahe liegt, dass solche Zellen keine Blockierung im Virionzusammenbau aufweisen, und dass ungenügende Translation von L2 oder andere unbekannte Gründe das Versagen, HPV16 Virionen in zervikalen Geweben nachzuweisen, erklären können.
Unsere EM Studien zeigen, dass das leere HPV16 Virion eine durchschnittliche Größe von ungefähr 40 nm aufweist, was kleiner ist als bei anderen Papillomviren, aber dass es eine ähnliche Oberflächenstruktur im Vergleich zu anderen Papillomviren, wie dem Kaninchen Papillomvirus (Finch und Klug, 1965 J. Mol Biol 13 1-12) oder dem humanen Warzenvirus (Rowson und Mahy 1968 oben) aufweist.
Die Sedimentation zeigte eine leere Kapsiddichte von ungefähr 1,32 g/ml, der erwarteten Dichte eines leeren Papillomviruskapsids im Vergleich zu ungefähr 1,36 g/ml für intakte HPV1 Virionen (Doorbar und Gallimore, 1987, J. Virol. 61, 2793-2799).
Das L1 Protein von HPV weist potenzielle Glykosylierungsstellen auf, und gereinigte BPV Partikel weisen kleinere elektrophoretische Formen von L1 auf, deren Mobilität gegenüber einer Endoglycosidase Behandlung sensitiv ist (Larsen et al., 1987, J. Virol 61, 3596-3601). L2 von HPV 1a und HPV 11 wurde als eine Doppelbande beobachtet (Rose et al., 1990, J. Gen. Virol, 71, 2725-2729; Doorbar und Gallimore, 1987 oben; Jin et al., 1989, J. Gen. Virol. 70, 1133-1140), und dies wurde den Unterschieden in der Glykosylierung zugeschrieben. Unsere Daten zeigen, dass das L1 Protein in HPV16 Kapsomeren auch glykosyliert ist, und dass zwei verschiedene Glykosylierungsstellen existieren.
In dieser Beschreibung haben wir synthetische virusähnliche Partikel verwendet, um Immunogenität der HPV16 Kapsidproteine zu untersuchen, die in einem eukaryonten System hergestellt werden. Die Kapsidproteine, die in eukaryonten Zellen hergestellt wurden, wurden verwendet, weil Papillomvirus Kapsidproteine, die in eukaryonten Zellen hergestellt wurden, eine posttranslationale Modifikation durchlaufen (Browne et al., 1988 J. Gen. Virol. 69 1263-1273; Zhou et al., 1991 Virology 185 625-632), was eine wichtige Determinante der Antigen Präsentation sein kann. Ein rekombinanter Vaccinia Expressionsvektor wurde gewählt, weil keine nativen HPV16 Partikel aus klinischen Läsionen oder aus der viralen Vermehrung in Zellkultur zur Verfügung stehen. Wir verwendeten die HPV16 VLPs, um polyklonale anti-VLP Antiseren in Mäusen herzustellen, und diese Seren reagierten stark mit den HPV16 Kapsiden im ELISA. Wir haben durch Immunblotten gezeigt, dass die anti-VLP Antiseren Epitope in denaturiertem L1 (2) und L2 erkannten. Darüber hinaus definierten die anti-VLP Seren 22 hauptreaktive Peptide in einer Serie von einundfünfzig 15-mer Peptiden von L1. Diese Daten zeigen, dass die Antiseren, die gegen virale Partikel gerichtet sind, dennoch häufig lineare Determinanten erkennen. Das Profil der humoralen Reaktivität in dem Satz von L1 Peptiden war nahezu identisch über zwei MHC ungleiche Mausstämme, was nahe legt, dass es ausreichend T Epitope in L1 gibt, dass die MHC Restriktion bei der Bestimmung der humoralen Antwort gegen das HPV16L1 Protein in den hier getesteten Mausstämmen nicht limitierend ist.
Die Daten für B Epitope Spezifität, die mit unseren murinen anti-VLP Antiseren erhalten wurden, können mit einer ähnlichen Studie von „Immun" Serum aus Frauen mit Zervixdysplasie (Dillner et al., 1990 Int. J Cancer 45 529-535) verglichen werden (12). Mehrere Peptide wurden durch sowohl die Immunhumanseren als auch die anti-VLP Antiseren erkannt, aber der Hauptteil der Peptide, der mit den murinen anti-VLP Antiseren reaktiv war, war nicht reaktiv mit den Immunhumanseren (12). Keine der Regionen von L1 (221-235, 291-305), die von L1 spezifischen monoklonalen Antikörpern erkannt wurden (Cason et al., 1989; Mc-Lean et al., 1990) wurden durch unsere murinen anti-VLP Antiseren erkannt. Weil L1 Fusionsproteine verwendet wurden, um diese MAbs herzustellen und auch verwendet wurden, um nach einem Antikörper gegen L1 in humanen Seren zu screenen, kann der Mangel an Reaktivität von humanen Seren mit L1 Fusionsprotein (Jenison et al., 1991 Int. J. Cancer 48 682-688) durch das Versagen der L1 Fusionsproteine, die Epitope von L1 zu zeigen, die dem humanen Immunsystem durch natives L1 Protein präsentiert werden, erklärt werden.
Screening nach Antikörpern gegen das L1 Protein mit Peptiden kann nur lineare Epitope nachweisen. In einem Versuch, zu bestimmen, ob die Reaktivität in den murinen Seren gegen sowohl lineare als auch konformationelle Determinanten gerichtet war, führten wir ELISA Assays mit Partikeln durch, die auf zwei Weisen behandelt wurden. Von der einen nahm man an, dass sie native Partikel bewahrte und von der anderen, dass sie denaturiertes Protein bildet (Dillner et al., 1991 J. Virol. 65 6862-6871). Wir haben kein Serum oder monoklonalen Antikörper gefunden, das/der ausschließlich mit Partikeln reaktiv ist, die auf die eine oder andere Weise behandelt wurden, obwohl ein MAb (Camvir 1) stärker mit den denaturierten als mit den „nativen" Partikeln reagierte. Der Mangel an Reaktivität des Hauptteils der MAbs mit den denaturierten Partikeln liegt nahe, das sie nur teilweise denaturiert waren, weil dieselben Antikörper mit denaturiertem Protein in einem Western Blot reagieren. Im Gegensatz dazu ist die Reaktivität von Camvir 1 mit den nativen Partikeln kein Beweis, dass das lineare Epitope, dass von diesem Antikörper erkannt wird, denaturiertes L1 Protein erkennt, das in einigen Mengen in der nativen Partikelpräparation anwesend ist, und wir haben keinen Beweis dafür, dass intakte VLPs unter unseren ELISA Bedingungen bewahrt werden.
Weil die meisten Antikörper konformationsabhängige Determinanten erkennen (Benjamin et al., 1984 Ann. Rev. Immunol. 2, 67-101) die mehrere nicht kontinuierliche Polypeptidsequenzen einschließen können (Amit et al., 1986 Science 233 747-753) ist es für Antikörper gegen Virionen unwahrscheinlich, dass sie fusionierte oder denaturierte Proteine ebenso wie natives Protein erkennen, wie für HPV1 Antiseren gezeigt wurde (Steele and Gallimore, 1990 Virology 174 388-398). Virionen von einigen Hautwarzen assoziierten HPV stehen in ausreichenden Mengen für serologische Assays (Almeida und Goffe, 1965 Lancet 2 1205-1207; Kienzler et al., 1983 Br J. Dermatol. 108 665-672; Pfister und zur Hausen, 1978 Int. J Cancer 21 161-165; Pyrhsonen et al., 1980 Br. J. Dermatol 102 247-254; Pass und Maizel, 1973 J. Invest. Dermatol 60 307-311) für den Warzenvergleich zur Verfügung. Die Prävalenz von Antikörpern gegenüber gereinigten Virionen in humanem Immunserum schwankt von 20 (Genner, 1971 Acta. Derm. Venereol (Stockh) 51 365-373) bis 88 % (Morison , 1975 Br J Dermatol 93 545-552) in Abhängigkeit von dem verwendeten Nachweissystem. Jedoch standen bis kürzlich Virionen der genitalen HPV Typen für eine serologische Studie nicht zur Verfügung. Das Nacktmäuse Xenograftsystem (Kreider et al., 1987 J Virol 61 590-593) hat die Herstellung von HPV11 Partikeln für den Nachweis von humanen Antikörpern erlaubt (Bonnez et al., 1991 J. Gen Virol 72 1343-1347). Wir folgern, dass die hier beschriebenen HPV16 VLPs die Entwicklung von ähnlichen Studien der Seronegativität gegenüber nativen HPV16 Partikeln erlauben, und der beobachtete Mangel an Reaktivität in humanem Serum gegen HPV15 L1 Fusionsproteine (Jenison et al., 1991 J Virol 65 1208-1218; Köchel et al., 1991 oben) kann einfach mit den ähnlichen Beobachtungen mit HPV1 (Steele und Gallimore, 1990 Virology 174 388-398) verglichen werden.
Antikörper gegen BPV Strukturproteine weisen eine Virus neutralisierende Aktivität auf (Pilacinski et al., 1986 Ciba Found. Symp. 120 136-156), und Antiseren gegen gereinigte HPV11 Virionen sollten auch infektiöses HPV11 in einem athymischen Maus Xenograftsystem (Christensen und Kreifer, 1990 J Virol 64 3151-3156) neutralisieren. Unsere Ergebnisse zeigten, dass die gereinigten synthetischen HPV16 Kapside immunogen sind und verwendet werden könnten, um Virus neutralisierende Antikörper herzustellen und zu bewerten, die für dieses oncogene Virus spezifisch sind. BPV1 L1 Protein, das in Escherichi coli exprimiert wurde und BPV Partikel haben beide Rinder vor der Entwicklung von Warzen geschützt (Pilacinski et al., 1986; Jarrett et al., 1990 Vet. Rec. 126 449-452). Eine ähnliche Immunantwort gegen HPV16 virusähnliche Partikel wäre die Basis eines möglichen Impfstoffs, um HPV16 assoziierten Zervixkrebs zu verhindern.
In 13A, nach Infektion mit pLC201VV, wurden CV-1 Zelllysate einer Äquilibrium Gradientensedimentation unterzogen. Gereinigte virusähnliche Partikel wurden durch Transmissionselektronenmikroskopie nach Negativfärbung mit Phosphorwolframsäure untersucht. [Balken = 100 nm].
In 13B, Spur 1, Lysat aus CV-1 Zellen, infiziert mit Wildtyp Virus; Spur 2 Lysat von L1 und L2 exprimierendem Virus pLC201VV; Spur 3, gereinigte virusähnliche Partikel. Das L2 Protein wurde mit einem Kaninchen anti-HPV16L2 Antikörper als Sonde inkubiert, gefolgt von ¹²⁵I-Protein A. Die Molekulargewichte sind auf der linken Seite angegeben, und L2 Banden sind mit einem Pfeil gekennzeichnet.
Es kann auch Bezug genommen werden auf die 13A und 13B, die zeigen, dass HPV16L1 und L2 doppelt rekombinantes VV L2 Protein enthält, wie durch Western Blot unter Verwendung von gereinigten VLPs und einem Kaninchen Antiserum gegen VV rekombinantes L2 Protein gezeigt wurde.
BEISPIEL 3: BPV1 VLPS
Es wurde auch bestätigt, dass Rinder Papillomvirus (BPV) 1 Virionen, die auf ähnliche Weise in vitro unter Verwendung der VV Rekombinante für die BPV Kapsidproteine hergestellt wurde, BPV1 DNA verpacken kann. Vollständige Virionen sind in der Lage, eine permissive Maus Fibroblasten Zelllinie zu infizieren, wie durch Transkription des E1 viralen offenen Leserahmens gezeigt wird, und die Infektion wird durch Inkubation von Virionen mit Antikörpern gegen das Kapsidprotein von BPV1 inhibiert. Im Gegensatz zu den Beobachtungen für HPV16, lagern sich virusähnliche Partikel in Zellen, die mit der VV Rekombinante für das BPV1 L1 Kapsidprotein infiziert sind, alleine zusammen, aber L2 Protein wird für die Verpackung von BPV1 DNA benötigt, um infektiöse Virionen herzustellen.
Unter Bezugnahme auf die HPV16 VLPs, auf die oben Bezug genommen wird, scheinen diese Partikel aus Kapsomeren zu bestehen, die typisch sind für jene, die in HPV1 und BPV1 Partikeln beobachtet werde, die aus klinischen Läsionen gereinigt wurden (Bakar et al., J.C. Biphys J 60 1445-1456 1991, Staquet et al., J. Dermatologica 162 213-219, 1981), obwohl die Gesamtmorphologie der HPV16 Partikel eher unterschiedlich zu den natürlich vorkommenden HPV1 und BPV1 Partikeln war. Weil natürliche HPV16 Virionen aus klinischen Läsionen nicht gereinigt wurden, wurde es als wünschenswert erachtet, zu bestätigen, ob diese morphologischer Unterschied eine Eigenschaft von HPV16 oder des rekombinanten Vacciniavirus (rVV) Systems war, das für die Herstellung von Virionen verwendet wurde. Eine Reihe von VVs wurde deshalb hergestellt, die jeweils doppelt rekombinant für die L1 und L2 Kapsidproteine von HPV6, HPV11 und von BPV1 waren. Die Infektion von CV-1 Zellen mit jeder dieser doppelt Rekombinanten VVs bildete virusähnliche Partikel, und diese waren den authentischen HPV1 und BPV1 Virionen ähnlicher als den HPV16 Partikeln. Wir haben beschlossen, die BPV-1 Partikel zu untersuchen, weil natürliche BPV-1 Partikel besser morphologisch und immonologisch charakterisiert sind (Chen et al., Baker et al., 1991, Cowsert et al., J. Natl Cancer Inst. 79 1053-1057) und Zelllinien zur Verfügung zu stehen, die für die episomale Replikation von BPV-1 DNA permissiv sind (Law et al., 1981 DNAS 78 2727-2731).
In 13C wird BPV1 L1 von dem p4b natürlichen Vaccinia späten Promotor und L2 von dem p480 synthetischen Vaccinia späten Promotor exprimiert. Das E.coli gpt Gen wird als der Selektionsmarker verwendet. Flankierende Sequenzen sind das Vaccinia B24R Gens, was eine Vacciniasequenz für homologe Rekombination bereitstellt. Die BPV1 L1 und L2 Gene wurden durch PCR aus dem Plasmid pml-1 kloniert. Weil das BPV1 Genom linearisiert und in dieses Plasmid an einer BamHI Stelle in dem BPV1 L2 ORF kloniert ist, wurde das BPV1 Genom zuerst aus pml-1 durch BamHI Spaltung isoliert und rezirkularisiert, und die zirkularisierte BPV-1 DNA wurde als die PCR Matrize verwendet. Die für die L1 Amplifikation verwendeten Oligonukleotid Primer waren:
5'-CGGGATCCATGGCGTTGTGGCAACAAGGCCAGAAGCTG.
5'-CGGGATCCTTATTTTTTTTTTTTTTTTGCAGGCTTACTGG.
Die BamHI Stelle ist unterstrichen, und das erste Methionin und die Stoppkodons sind in Fettschrift angegeben. Die Oligonukleotid Primer für die L2 Amplifikation waren:
5'-GCAGATCTATGAGTGCACGAAAAAGAGTAAAACGTGCCAGTGC.
5'-GCAGATCTTTAGGCATGTTTCCGTTTTTTTCGTTTCC.
Die BgIII Stellen sind unterstrichen, und das erste Methionin und die Stoppkodons sind in Fettschrift angegeben. Das amplifizierte 1478 bp L1 Fragment wurde in die BamHI Stelle in Plasmid RK19 kloniert, um RK19BPVL1 herzustellen. Das L1 Gen und Vaccinia 4b Promotor wurden aus diesem Plasmid durch Spaltung mit MluI und SmaI isoliert und in das Plasmid pSX3 transferiert, um pSXBPVL1 herzustellen. Das 1409 bp L2 Fragment wurde mit BgIII gespalten und in die BamHI Stelle in Plasmid p480 kloniert, um p480BPVL2 herzustellen. Der synthetische Vaccinia späte Promotor und das BPVL2 Gen wurden aus diesem Plasmid in die Sma1 Stelle im pSXBPVL1 kloniert um das doppelt rekombinante Plasmid pSXBPVL1 L2 herzustellen. Die Transfektion von pSXBPVL1 oder pSXBPVL1 L2 DNA in Monolayer von CV-1, die mit dem Wildtyp (wt) VV WR Stamm infiziert waren, führte zu den rVVs pSXBPVL1VV (L1 exprimierend) und pSXBPVL1 L2W (L1 und L2 exprimierend). Die rekombinanten Vacciaviren wurden dreimal in der Anwesenheit von Mycophenolsäure gereinigt. Nach der Reinigung wurden Präparationen der Rekombinanten im großen Maßstab hergestellt und in diesen Experimenten verwendet.
In 14A ist die Immunpräzipitationsanalyse von rekombinantem BPV1 L1 in Vaccinia infizierten Zellen gezeigt. Die CV-1 Zellen wurden bei 10 pfu/Zelle mit wt Vacciniavirus (Spur 1); pSXBPVL1VV (Spur 2); pSXBPVL1L2VV (Spur 3) infiziert und 48 hrs nach der Infektion geerntet. Das BPVL1 Protein wurde mit BPV1 spezifischem Kaninchen Antiserum nachgewiesen. Das 58 kDa L1 Protein ist durch einen Pfeil gekennzeichnet.
In 14B ist die Northern Blot Analyse der BPV1 L2 Expression gezeigt. RNA, extrahiert aus CV-1 Zellen, infiziert mit wt VV (Spur 1); pSXBPVL1 L2W (Spur 2) wurde mit dem BPV1 L2 Gen als Sonde inkubiert. Die variable Länge der L2 homologen Transkripte ist typisch für Transkripte, die von VV Promotoren exprimiert werden. Für die Immunpräzipitation wurden Zellen, die mit rVVs infiziert waren, mit RIPA Puffer (0,1 % SDS, 1 % Triton X-100, 1 % Natriumdesoxicholate, 150 mM NaCl, 0,5 μg/ml Aprotinin, 10 Mm Tris, pH 7,4) lysiert. Lösliche Proteine wurden mit Kaninchen anti-BPV1 Antikörper (DAKO, Glostrup) in einer 1:1.000 Verdünnung immunpräzipitiert. Präzipitierte Proteine wurden mit Protein-A Sepharose gesammelt, auf 10 % SDS Polyacrylamid Gelen getrennt und auf Nitrocellulose Filter geblottet. Nach dem Blockieren mit Magermilch wurden die Filter gegenüber dem anti-BPV1 Serum (1:1.000), gefolgt von ¹²⁵I-Protein A (auf 0,1 μCi/ml) exponiert und durch Autoradiografie sichtbar gemacht. Gesamt RNA wurde aus den Zellen extrahiert, und durch Zentrifugation durch CsCl, wir zuvor beschrieben, gereinigt. Gesamt RNA, 30 μg pro Spur, wurde auf 1,2 % Formaldehyd-Agarose Gellen gefahren, auf Nylonmembrane transferiert und mit einem ³²P-markierten BPV1 L1 Gen als Sonde inkubiert.
In 15A wird auf pSXBPVL1 L2W Bezug genommen. Einige Partikel aus CON/BPV Zellen, die mit pSXBPVL1 L2W infiziert wurden, weisen Elektronen dichte Kerne (Insert) auf.
In 15B wird auf pXSBPVL1VV Bezug genommen. Ein kontaminierendes Vacciniavirus (A) ist durch ein „V" angegeben. Die Maßstabsbalken stellen 50 nm dar. Die Zellen wurden zwei Tage nach der Infektion geerntet, mit PBS gewaschen, durch dreimaliges Einfreiren und Auftauen lysiert und in PBS sonifiziert.
Der Zelldebris wurde durch Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit entfernt, und die Überstände wurden auf ein 20 % (w/v) Sucrosekissen überschichtet und für zwei Stunden bei 100.000 × g zentrifugiert. Die Pellets wurden in PBS resuspendiert und in einem JOEL 1.200EX Elektronenmikroskop nach Negativfärbung mit 1 % (w/v) Phosphorwolframsäure (pH 7,0) analysiert.
Weil das Verhältnis der L1 zu L2 Proteine in authentischen BPV1 Partikeln ungefähr 5:1 beträgt (Pfister, H. & Fuchs, E. in Papillomaviruses and human disease (Hrsg. Syrianen, K., Gissmann, L & Koss, L.G.) Vol. 1-18 (Springer-Verlag, Berlin, 1987) verwendeten wir einen starken natürlichen Promotor für das L1 Gen und einen schwachen synthetischen Promotor für das L2 Gen für unser doppelt rekombinantes VV (13C), und das resultierende Verhältnis von L1 mRNA zu L2 mRNA auf einem Northern Blot aus rVV infizierten CV-1 Zellen betrug ungefähr 10:1. Die CV-1 Zellen, die mit dieser rVV infiziert wurden, exprimierten BPV1 L1 Protein (14A) und L2 mRNA (14B), und große Zahlen von 50 μm icosaedrischen virusähnlichen Partikeln von offensichtlich authentischer Morphologie (15A) konnten aus den infizierten Zellen gereinigt werden. Unsere vorherige Arbeit mit HPV16 hatte gezeigt, dass sowohl das L1 als auch das L2 Protein für den Zusammenbau von HPV16 virusähnlichen Partikeln, wie oben beschrieben, benötigt wurde, was im Gegensatz zu der Beobachtung steht, dass für Parvovirus (Kajigaya et al., 1991 DNAS 4646-4650), Bluetongue Virus (Loudon et al., 1991 Virology 182, 793-801) und Polyoma Virus (Salunke et al., 1986, Cell 46, 895-904) die virusähnlichen Partikel in Zellen zusammengebaut werden, wenn das Hauptkapsidprotein alleine als ein rekombinantes Protein exprimiert wird. Wir haben deshalb eine VV Rekombinante für BPV1 L1 (13C) hergestellt und beobachtet, dass wenn CV-1 Zellen mit dieser VV infiziert wurden, virusähnliche Partikel mit ähnlicher Homologie zu jener, die mit der L1 und L2 doppelt Rekombinanten VV erhalten wurden, gereinigt werden konnten (15B). Ähnliche leere icosaedrische Virionen wurden nach Infektion von CV-1 Zellen mit der VV Rekombinanten für die L1 Proteine von HPV6 oder HPV11 erhalten. Der Mangel an morphologisch authentischem PV Virion in Zellen, die mit dem HPV16L1 und L2 VV infiziert wurden, und der Mangel an PV Virionen, die in HPV16 infiziertem Gewebe durch Elektronenmikroskopie beobachtet wurden (Schneider (1987) Papillomaviruses and Human Disease Vol 19-39 Springer Verlag Berlin) legt nahe, dass HPV16, im Gegensatz zu anderen PVs, bezüglich der viralen Kapsidbildung defekt sein könnte.
Eine Minderheit von virusähnlichen Partikeln aus Zellen, die mit HPV1 L1/L2 rVV infiziert wurden, ist in dem 15A Insert gezeigt.
Die Klonierungsstrategie für HPV11L1/L2 und HPV6bL1/L2 doppelt exprimierende rekombinante Vacciniaviren ist unten beschrieben:
Für HPV11 L1:
5'CAGATCTCAGATGTGGCGGCCTAGCGACAGCACAGTATATGTGCC
5'CGGGAATTCGTGTAACAGGACACACATAATAATTGTTTATTGCA
Das PCR Produkt wurde mit BgIII/EcoRI gespalten und in RK19 unter die Kontrolle des 4b Promotors kloniert. Die Promotor/11L1 Sequenz wurde anschließend in die BamHI Stelle von pSX3 kloniert, die mit Klenow mit stumpfen Enden versehen wurde. Das resultierende Plasmid war pSX11L1.
Für 11L2
5'GCGGATCCATGAAACCTGGGGCACGCAGACGTAAACGTGCG
5'CGCCCGGGCTAGGCCGCCACATCTGTAAAAAATAAGGG
Das BamHI/SmaI gespaltene PCR Fragment wurde in p480 unter den synthetischen 28k späten Promotor kloniert. Anschließend wurde das Promotor/11 L2 Fragment im pSX11 L1 transferiert. Das 11 L1/L2 doppelt Rekombinante exprimierende Plasmid wurde als pSX11 L1/L2 bezeichnet.
Für HPV6bL1:
5'CGCCCGGGTTACCTTTTAGTTTTGGCGCGCTTACGTTTAGG
5'GCGGATCCAGATGTGGCGGCCTAGFCGACAGCACAGTATATG
Das PCR Produkt wurde durch BamHI/Sma1 geschnitten und in RK19 unter die Kontrolle des 4b Promotors kloniert. Der Promotor/6L1 wurde anschließend in pSX3 kloniert um pSX6L1 herzustellen.
Für HPV6L2:
Das HPV6L2 wurde aus dem 6b Genome durch AccI/XbaI (4422-5903) isoliert. Das Fragment wurde durch Klenow geblottet und in p480 eingebaut. Der synthetische 28k Promotor plus 6bL2 wurde in pSX6L1 kloniert, um das doppelt rekombinante Plasmid pSX6L1/L2 zu bilden.
Danach infizierten die Plasmide pSX11L1 und pSXL11L1/L2 eine Wirtszelle (z.B. CV-1 Zellen oder C127 Zellen), um VV pSX11 L1 und VV pSX11 L1/L2 herzustellen, die nach der Transfektion einer Wirtszelle, die mit Wildtyp Vacciniavirus infiziert war, VLPs mit L1 Protein (abgeleitet von VV pSX11 L1) und L1 und L2 Proteine (abgeleitet von VV pSX11L1/L2) bildeten. Auf ähnliche Weise bildete VV pSX6L1 und VV pSX6L1/L2 nach Transfektion einer Wirtszelle VLPs mit HPV6b L1 und VLPs mit HPV6b L1 und HPv6b L2.
Es wird auch davon ausgegangen, dass die Erfindung in ihren Schutzbereich Viren einschließt, die doppelt rekombinant für Papillomvirus Kapsidproteine L1 und L2 ebenso wie für rekombinante Viren mit Papillomvirus Kapsidprotein L1 sind.
Es wird weiter verstanden, dass die Erfindung in ihren Schutzbereich ein Verfahren zur Diagnose einer Papillomvirusinfektion durch ELISA einschließt, umfassend den Schritt des Nachweises von VLP Partikeln mit den Proteinen L1 und L2.
TABELLE 1 15 AA überlappende Peptide aus der vorhergesagten Sequenz des HPV16L1 Proteins
Die Sequenz für jedes L1 Peptid ist unter Verwendung des Einzelbuchstabenkodes angegeben. Die Lage jedes Peptids innerhalb des HPV16L1 Proteins ist angegeben, wobei die Position 1 dem N-terminalen Methionin zugewiesen wurde. Das kurze C-terminale Peptid (Nr. 53) wurde für diese Experimente nicht verwendet. TABELLE 2 Immunreaktivität gegenüber virusähnlichen Partikeln von Viren aus Mäusen, die mit synthetischen HPV16 Kapsiden immunisiert wurden.

* Die Werte sind OD 415 Einheiten, und sie sind als das Mittel ± 1 der Standardabweichung angegeben.

Claims

Polynukleotid, welches im Wesentlichen aus dem Polynukleotidabschnitt des HPV16-Genoms besteht, welcher bei nt5637 beginnt und der ebenso für HPV16L1 kodiert, welches ein Molekulargewicht von etwa 57 kDa aufweist.
Polynukleotid nach Anspruch 1, wobei das Polynukleotid DNA ist.
Rekombinantes DNA-Molekül, welches ein HPV16L1-Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 57 kDa kodiert, das mit HPV16L2-Protein virusartige Teilchen bildet, umfassend den Polynukleotidabschnitt des HPV16-Genoms, welcher bei nt5637 beginnt.
Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 3, wobei das Molekül aus einem Plasmid, einem Cosmid, einem Vektor, einem Baculovirus, einem Vacciniavirus, einem Adenovirus und einem Retrovirus ausgewählt ist.
Rekombinantes Molekül nach Anspruch 3 oder Anspruch 4, wobei das Polynukleotid funktionell an einen Promoter gebunden ist.
Rekombinantes Molekül nach Anspruch 5, wobei der Promoter ein viraler Promoter ist.
Rekombinantes Molekül nach Anspruch 6, wobei der virale Promoter ein Vacciniavirus-Promoter ist.
Rekombinantes Molekül nach Anspruch 7, wobei der Promoter der Vacciniavirus-4b-Promoter ist.
Rekombinantes Molekül nach Anspruch 5, wobei der Promoter ein Säuger-Promoter ist.
Rekombinantes Molekül nach einem der Ansprüche 3 bis 9, wobei das Polynukleotid funktionell an ein Polyadenylierungssignal gebunden ist.
Rekombinantes Molekül nach Anspruch 10, wobei das Polyadenylierungssignal viral ist.
Rekombinantes Molekül nach Anspruch 10, wobei das Polyadenylierungssignal ein Säuger-Polyadenylierungssignal ist.
Wirtszelle, welche ein Polynukleotid nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 umfasst.
Wirtszelle, welche ein rekombinantes Molekül nach einem der Ansprüche 3 bis 12 umfasst.
Wirtszelle nach Anspruch 13 oder Anspruch 14, wobei die Zelle aus einer prokaryotischen Zelle und einer eukaryotischen Zelle ausgewählt ist.
Wirtszelle nach Anspruch 15, wobei die prokaryotische Zelle E. coli ist.
Wirtszelle nach Anspruch 15, wobei die eukaryotische Zelle aus einer Hefezelle, einer Insektenzelle und einer Säugerzelle ausgewählt ist.
Wirtszelle nach Anspruch 17, wobei die Zelle eine CV1-Zelle ist.
Wirtszelle nach Anspruch 17, wobei die Zelle eine S. frugiperda-Zelle ist.
Polypeptid, welches durch i) das Polynukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 2 oder ii) das rekombinante DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 3 bis 12 kodiert ist.