DE69233687T2

DE69233687T2 - Impfstoff gegen Humanes Papillomavirus (Typ 18)

Info

Publication number: DE69233687T2
Application number: DE69233687T
Authority: DE
Inventors: Ian St Lucia Frazer; Jian Jindalee Zhou
Original assignee: University of Queensland UQ; CSL Ltd
Current assignee: University of Queensland UQ; CSL Ltd
Priority date: 1991-07-19
Filing date: 1992-07-20
Publication date: 2007-10-18
Anticipated expiration: 2012-07-21
Also published as: SG48769A1; NL300260I1; LU91316I2; US7169585B2; US7939082B2; LU91318I2; NL300262I1; LU91315I2; LU91317I2; LU91385I2; NL300261I1; DE69232967T2; CY2007030I2; DK1359156T3; EP0595935A4; CY2007030I1; GEP20084431B; JP2006115849A; US20070154902A1; CY2007015I1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung bezieht sich auf Papillomaviren und insbesondere auf Antigene und Impfstoffe, die bei der Behandlung von durch solche Viren verursachten Infektionen wirksam sein können.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Papillomavirusinfektionen sind nicht nur beim Menschen bekannt, sondern auch bei Tieren, wie z.B. Schafen, Hunden, Rindern, Kojoten, Wölfen, Opossums, Rotwild, Antilopen, Bibern, Schildkröten, Bären, Eidechsen, Affen, Schimpansen, Giraffen, Impalas, Elefanten, Walen, Katzen, Schweinen, Wüstenspringmäusen, Elchen, Yaks, Delfinen, Papageien, Ziegen, Nashörnern, Kamelen, Lemmingen, Gemsen, Stinktieren, Beutelteufeln, Dachsen, Lemuren, Karibus, Gürteltieren, Molchen und Schlangen (siehe beispielsweise „Papilloma Virus Infections in Animals" von J.P. Sundberg, beschrieben in „Papilloma Viruses and Human Disease", herausgegeben von K. Syrjanen, L. Gissman und L.G. Koss, Springer Verlag 1987).
Es ist auch bekannt (z.B. bei „Papilloma Viruses and Human Cancer", herausgegeben von H. Pfister und veröffentlicht von CRC Press Inc 1990), dass Papillomaviren in mehreren unterschiedlichen Gruppen zusammengefasst sind, wie z.B. den Papillomaviren des Menschen (HPV), die in Abhängigkeit von der DNA-Sequenzhomologie in die Typen 1-56 untergliedert sind. Eine klinisch-pathologische Gruppierung der HPV und des bösartigen Potentials der Läsionen, mit denen sie am häufigsten in Zusammenhang gebracht werden, kann wie folgt aufgetrennt werden.
In einer ersten Gruppe können die Typen 1 und 4, die gutartige Fußsohlenwarzen hervorrufen, die Typen 2, 26, 28 und 29, die gutartige gewöhnliche Warzen hervorrufen, die Typen 3, 10 und 27, die gutartige Flachwarzen hervorrufen, und Typ 7, der Butcher-Warzen hervorruft, aufgelistet sein. Diese erste Gruppe von Infektionen tritt bei normalen oder immunkompetenten Individuen auf.
In einer zweiten Gruppe, die sich auf immunkompromittierte Individuen bezieht, können die Typen 5 und 8, die hochmaligne fleckige Läsionen hervorrufen, und die Typen 9, 12, 14, 15, 17, 19-25, 36 und 46-50, die gutartige oder selten bösartige fleckige oder flache Läsionen hervorrufen, aufgelistet sein. Diese fleckigen Läsionen sind ansonsten als Epidermodyplasia verruci formis (EV) bekannt.
In einer dritten Gruppe, welche insbesondere den Genitaltrakt infiziert, können die Typen 6, 11, 34 und 39, 41-44 und 51-55, die selten bösartige Kondylome hervorrufen, die Typen 13 und 32, die eine gutartige fokale Epithelhyperplasie hervorrufen, die Typen 16 und 18, die eine Epitheldysplasie und andere Läsionen mit beträchtlichem Potential, einschließlich der bowenoiden Papulose, hervorrufen, und die Typen 30, 31, 33, 35, 45 und 56, die Kondylome mit mittlerem malignem Potential hervorrufen, aufgelistet sein. Die Kondylome treten zumeist im Anogenitaltrakt und insbesondere im Gebärmutterhals auf. Die Typen 16 und 18 stehen mit dem Großteil der in situ-Karzinome und der invasiven Karzinome des Gebärmutterhalses, der Vagina, der Vulva und des Analkanals in Zusammenhang. Die Kondylome können auch im Aerodigestivtrakt auftreten.
Insbesondere HPV16 steht mit prämalignen und malignen Erkrankungen des Urogenitaltrakts und insbesondere mit Karzinomen des Gebärmutterhalses in Zusammenhang (Durst et al., PNAS 80 3812-3815, 1983; Gissmann et al., J. Invest. Dermatol 83 265-285, 1984). Derzeit existieren keine Informationen über die Rolle von humoralen Reaktionen bei der Neutralisierung von HPV16.
Der Nachweis von Antikörpern gegen HPV16-Fusionsproteine (Jenison et al., J. Virol. 65 1208-1218, 1990; Köchel et al., Int. J Cancer 48 682-688, 1991) und synthetische HPV16L1-Peptide (Dillner et al., Int. J Cancer 45 529-535, 1990) im Serum von Patienten mit HPV16-Infektion bestätigt, dass es in den HPV-Capsidproteinen B-Epitope gibt, obwohl wenige Patienten HPV16L1-spezifische Antikörper aufweisen, die durch diese Techniken identifiziert werden. Es gibt kein System für eine in vitro erfolgende HPV16-Vermehrung, und Genitalläsionen beim Menschen erzeugen wenige HPV16-Virione; daher waren keine HPV16-Partikel für immunologische Studien verfügbar.
Die Papillomaviren beim Tier können auch das Papillomavirus des Rindes (BPV) und insbesondere die Typen BPV1, BPV2, BPV3, BPV4, BPV5 und BPV6 umfassen, welche ebenfalls durch eine DNA-Sequenzhomologie differenziert werden. Im Allgemeinen infizieren die anderen Tier-Papillomaviren Rotwild, Pferde, Kaninchen, Hunde, Nagetiere und Vögel. Papillomaviren sind kleine DNA-Viren, welche bis zu acht frühe und zwei späte Gene codieren (hinsichtlich eines Überblicks siehe Lancaster und Jenson 1987, Cancer Metast. Rev. S. 6653-6664; und Pfister 1987 Adv. Cancer Res. 48, 113-147). Die Organisation der späten Gene ist einfacher als jene der frühen Gene. Die späten Gene L1 und L2 überlappen einander leicht in den meisten Fällen. Unter den verschiedenen Papillomaviren sind die mutmaßlichen L2-Proteine hochkonserviert, und zwar insbesondere die Sequenz von 10 basischen Aminosäuren am C-terminalen Ende. Die breite Domäne in der Mitte enthüllt nur geringe, dicht zusammenliegende Ähnlichkeiten. Das L1 ORF scheint jedoch in allen bekannten Fällen monoton konserviert zu sein (Syrjanen et al., siehe oben).
Die Aminosäuresequenzhomologie erreicht beim Vergleich zwischen HPV1a, HPV6b, BPV1 und CRPV (Papillomavirus des Baumwollschwanzkaninchens) 50%.
Hinsichtlich der Immuntherapie betreffend Papillomavirusinfektionen umfassten frühere Verfahren zur Behandlung von Warzen und epithelialen Hautläsionen die Anwendung eines chirurgischen Eingriffs, der schmerzhaft und traumatisch sein kann, wobei das Ergebnis oft eine Vernarbung ist, welche das Risiko des Auftretens einer Reinfektion in sich birgt. Eine Behandlung mit Chemikalien wurde ebenfalls angewandt. Ein übliches Behandlungsmittel ist Salicylsäure, die in Stärken von 10% bis 40% den Hauptbestandteil in Tinkturen und Pilaster bildet. Ebenfalls vorgeschlagen wurde Formalin in Stärken von 3% bis 20%. Zur Behandlung von Hautwarzen wurde die Kältetherapie angewandt. Als Behandlungsmittel wurde auch Glutaraldehyd eingesetzt. Auch Podophyllin wurde mit unterschiedlichem Erfolg sowohl fair Hautwarzen als auch für Anogenitalkondylome eingesetzt. Die Arten der chirurgischen Eingriffe, die bei Anogenitalkondylomen angewandt wurden, umfassten die chirurgische Entfernung, die Kryochirurgie und die Laserchirurgie. Die Verwendung von Interferonen wurde ebenfalls vorgeschlagen (Syrjanen et al., siehe oben).
Antikörper gegen das L1-Protein des Rinder-Papillomavirus (BPV) besitzen eine virusneutralisierende Wirkung (Pilacinski et al., 1986), und HPV11-Virione können durch spezifische Antiseren in einem in vitro-Modell inaktiviert werden (Christensen und Kreider, J. Virol 64 3151-3156, 1990). Es gibt auch einen gewissen Hinweis darauf, dass eine spontane Regression von HPV1-induzierten Hautwarzen mit gesteigerten humoralen Immunreaktionen auf das Warzenprotein zusammenhängt (Kirchner, Prog. Med. Virol. 33 1-41, 1986).
Mit durchschnittlichem Erfolg wurden auch Impfstoffe vorgeschlagen. Es wurde vorgeschlagen, Impfstoffe zu verwenden, die autogene Tumorhomogenate enthalten [Abcarian et al. J. Surg Res 22:231-236 (1977) Dis Colon Rectum 25:648-51 (1982), Dis Colon Rectum 19:237-244 (1976)]. Jüngst wurde jedoch empfohlen, dass Patienten aufgrund der möglichen geschwulstbildenden Wirkung der viralen DNA nicht mehr mit autogenen Impfstoffen behandelt werden sollten (Bunney 1986 Br Med J 293 1045-1047).
Dieser Punkt wurde in Bezug auf die Herstellung genetisch veränderter Impfstoffe bei Pfister (190), siehe oben, besprochen, und es scheint, dass aufgrund der Plethora verschiedener Papillomavirustypen beim Erhalten eines wirksamen Impfstoffs Schwierigkeiten auftraten. Pfister weist jedoch darauf hin, dass das Augenmerk auf die sogenannten frühen Proteine (d.h. E1, E2, E3, E4, E5, E6, E7 oder E8) gerichtet werden sollte, da diese Proteine am wahrscheinlichsten in den wuchernden Basalzellen einer Warzeninfektion synthetisiert werden, und zwar im Gegensatz zu den Strukturproteinen, die in den oberen Epidermisschichten exprimiert werden. Daher scheint gemäß Pfister (1990) dem Viruscapsidprotein hinsichtlich der Verwendung in einem Impfstoff Grenzen gesetzt zu sein. Die Verwendung von rekombinierten Vacciniaviren in in vitro-Testsystemen für frühe Papillomavirusproteine in Eukaryontenzellen wurde ebenfalls bei Pfister (1990) besprochen. Dies kann die Form eines lebenden Impfstoffs annehmen, der aus einem genetisch modifizierten, Papillomavirusproteine exprimierenden Vacciniavirus besteht, oder von Paraformaldehyd-fixierten autologen Zellen an der Oberfläche, die in vitro mit Vaccinia-Rekombinanten infiziert oder mit anderen Expressionsvektoren transfiziert wurden. Eine weitere Strategie zur Impfstoffentwicklung, wie sie bei Pfister (1990) besprochen wird, besteht in der Verwendung eines immunstimulierenden Komplexes des Glycosids Quil A.
Daten über eine erfolgreiche vorbeugende Impfung existieren nur hinsichtlich des durch Rinder-Fibropapillome homogenisierten Homogenats von Rinder-Fibropapillomen, von dem sich zeigte, dass es eine beschränkte Immunität verleiht (Olson et al., J Am Vet Med Assoc 135, 499 (1959) Cancer Res 22 463 (1962)). Ein Impfstoff, der ein verändertes L1-Fusionsprotein umfasst (Pilacinski et al., UCLA Symp. Molecular and Cellular Biology New Series, Band 32, Papilloma Viruses Molecular and Clinical Aspects, Alan R. Liss, New York 1985 257), wurde auch bei Kälbern eingesetzt, erwies sich bei Menschen jedoch als wirkungslos (Barthold et al., J. Am Vet Med Assoc. 165, 276, 1974). Bei Pfister (1990) wird festgehalten, dass es zur Zeit keinen Hinweis auf eine mögliche Verhinderung einer HPV-Infektion durch Anwendung eines Capsidproteinimpfstoffs gibt, die Herbeiführung einer Antitumor-Zellimmunität erscheint jedoch möglich.
Die L1- und L2-Gene bildeten die Grundlage für Impfstoffe zur Verhinderung und Behandlung von Papillomavirusinfektionen und für Immunogene, die bei Diagnose und Nachweis von Papillomaviren eingesetzt werden (internationale Patentdokumente WO86/05816 und WO83/0623). Es scheint jedoch, dass es zu keiner kommerziellen Verwendung dieser Impfstoffe gekommen ist.
KURZFASSUNG DER ERFINDUNG
Daher besteht ein Ziel der Erfindung darin, virusartige Partikel (VLPs) bereitzustellen, die sowohl als diagnostische Mittel verwendbar sein können als auch einen Bestandteil eines Impfstoffs zur Verwendung bei Papillomavirusinfektionen bilden.
Die Erfindung wird in den beigefügten Ansprüchen definiert. Die Erfindung umfasst in einem Aspekt daher ein Verfahren zum Herstellen papillomavirusartiger Partikel (VLPs) von HPV11 oder HPV6, umfassend den folgenden Schritt:

(i) Herstellen von VLPs in einer geeigneten Wirtszelle, die mit einem oder mehreren rekombinanten DNA-Molekülen transfiziert worden ist, von denen jedes für ein Papillomavirus L1-Protein oder eine Kombination von Papillomavirus L1-Protein und Papillomavirus L2-Protein kodiert, indem das L1-Protein oder die Kombination von L1- und L2-Proteinen exprimiert wird; wobei das Papillomavirus HPV18 ist.

Die Erfindung umfasst in einem weiteren Aspekt einen Impfstoff, welcher die Papillomavirus-VLPs in Kombination mit einem geeigneten Adjuvans enthält.
In Bezug auf Schritt (i) ist zu erkennen, dass die L1- und L2-Gene im selben DNA-rekombinanten Molekül oder in verschiedenen DNA-rekombinanten Molekülen enthalten sein können.
Vorzugsweise sind die rekombinierten DNA-Moleküle in einem rekombinierten Virus enthalten, welches die Wirtszelle transfizieren kann. Geeignete Viren, die zu diesem Zweck verwendet werden können, umfassen das Baculovirus, das Vaccinia, das Sindbis-Virus, SV40, das Sendaivirus, das Adenovirus, das Retrovirus oder Pockenviren. Geeignete Wirtszellen können Wirtszellen umfassen, die mit den obenstehenden Viren kompatibel sind, und diese umfassen Insektenzellen, wie z.B. von Spodoptera frugiperda, CHO-Zellen, Hühnerembryonenfibroblasten, BHK-Zellen, menschliche SW13-Zellen, Drosophila, vom Aedes albopictus gewonnene Moskitozellen oder Affen-Epithelzellen. Es ist auch zu erkennen, dass andere Eukaryontenzellen Hefepilzzellen oder weitere Säugetierzellen umfassen können.
Das DNA-rekombinierte Molekül wird zweckmäßigerweise von einer Papillomavirusgenomquelle erhalten, wobei das L1-Protein oder das L2-Protein mittels einer PCR-Amplifikation amplifiziert werden kann, und zwar unter Verwendung von passend entworfenen Primern, welche nachstehend besprochen werden. Vorzugsweise wird ein das L1-Protein codierendes Gen in ein einen passenden Promotor enthaltendes Plasmid eingefügt und wird ein das L1-Protein und den Promotor enthaltendes DNA-Fragment in ein primäres Plasmid eingebaut, welches das rekombinierte DNA-Molekül bilden kann, das, wie obenstehend beschrieben, in einen rekombinierten Virusvektor eingefügt werden kann.
Ein das L2-Protein codierendes Gen kann ebenfalls an einen passenden Promotor gekoppelt werden, und vorzugsweise wird ein das L2-Gen und den Promotor umfassendes DNA-Fragment in das primäre Plasmid eingefügt, um ein doppelt rekombiniertes Plasmid oder sekundäres Plasmid zu schaffen, welches Plasmid, wie obenstehend beschrieben, auch in einen rekombinierten Virusvektor eingefügt werden kann, um einen doppelt rekombinierten Virusvektor zu bilden.
Die Erfindung umfasst allerdings auch jene Ausführungsform, bei der das primäre Plasmid und/oder das sekundäre Plasmid eine geeignete Wirtszelle infizieren kann bzw. können, um unter passenden Versuchsbedingungen VLPs, die das L1-Protein enthalten, oder VLPs, die das L1- und das L2-Protein enthalten, herzustellen. Letztere VLPs sind das ideale Immunogen für einen Papillomavirus-spezifischen Impfstoff, da das L2-Protein bei einer natürlichen Infektion immundominant ist.
Andere geeignete DNA-rekombinierte Moleküle umfassen sowohl Cosmide als auch rekombinierte Viren. Geeignete Expressionssysteme umfassen Prokaryonten-Expressionssysteme, einschließlich E. coli und jeglichen Plasmid- oder Cosmid-Expressionsvektors, oder Eukaryontensysteme, einschließlich Wirtszellen, die obenstehend in Kombination mit einem rekombinierten Virusvektor beschrieben wurden, oder wahlweise Hefepilzzellen und Hefepilzplasmide.
In der Situation, bei der Plasmide verwendet werden, die Gene umfassen, welche L1 oder sowohl L1 als auch L2 codieren, und bei der derartige Plasmide eine zur Produktion von VLPs geeignete Wirtszelle infizieren können, sollten solche Plasmide zur Verstärkung der Expression der VLP-Strukturproteine auch einen geeigneten Promotor umfassen und kann auch eine Polymerase eingesetzt werden, die mit dem relevanten Promotor zusammenhängt. In dieser Situation können VLPs jedoch nur unter spezifischen Versuchsbedingungen erhalten werden.
Die L1- und L2-Gene können aus jedem Säugetier- oder Virus-Promotor mit einem Säugetier- oder Virus-Polyadenylierungssignal ausgetrieben werden. Vorzugsweise werden die L1- und L2-Gene aus irgendeinem Vacciniavirus-Promotor, der, je nachdem, was als passend betrachtet wird, ein früher Promotor oder ein später Promotor sein kann, transcribiert. Eine Liste derartiger Promotoren ist bei Davision und Moss (1989) J. Mol. Biol 210 749-769 und (1989) J. Mol. Biol 210 771-784, angeführt.
In der Versuchsarbeit, die stattgefunden hat, befindet sich das L1-Gen stromabwärts von einem Vaccinia-4b-Promotor und befindet sich das L2-Gen stromabwärts von einem synthetischen späten Vaccinia-28k-Promotor. Affen-Epithelzellen bilden die Wirtszelle.
Die VLPs können durch jedwedes geeignete Reinigungsmittel aus den transfizierten Zellen erhalten werden. Die VLPs können mit irgendeinem geeigneten Adjuvans, wie z.B. ISCOMS, Alaun, dem unvollständigen oder vollständigen Freundschen Adjuvans, Quil A und anderen Saponinen, oder irgendeinem anderen Adjuvans, wie beispielsweise bei Vanselow (1987) S. Vet. Bull. 57 881-896, beschrieben, kombiniert werden.
Nunmehr kann auf die angeschlossenen Zeichnungen Bezug genommen werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine schematische Darstellung von Plasmiden, die zur Konstruktion von rekombinierten HPV16-Vacciniaviren verwendet werden.
2A zeigt eine Western-Blot-Analyse eines rekombinierten HPV16 L1 in mit dem Vacciniavirus infizierten CV-1-Zellen.
3 zeigt eine Northern-Blot-Analyse von mit dem rekombinierten Vacciniavirus infizierten CV-1-Zellen.
4A und 4B sind Elektronenmikrogramme virusartiger HPV-Partikel von mit dem rekombinierten Vacciniavirus infizierten CV-1-Zellen.
5 veranschaulicht eine CsCl-Gleichgewichtsdichtegradienten-Sedimentation eines HPV16-leeren Capsids.
6 veranschaulicht die Glycosylierung von L1-Proteinen in gereinigten Viruspartikeln.
7 ist ein Flussdiagramm der Konstruktionen des L1-codierenden Plasmids pLC200 und des L1- und L2-codierenden pLC201.
8 zeigt eine Western-Blot-Analyse der Reaktivität von Mausseren mit einem rekombinierten Baculovirus-L1-Protein.
9 und 10 veranschaulichen Kartierungsergebnisse für Seren von BLAB/c-, C57B1/6- und CBA-Mäusen, die mit synthetischen HPV16-Capsiden immunisiert wurden, und für gepoolte CFA-immunisierte Kontrollseren.
11 und 11A veranschaulichen die Reaktivität zweier, für L1 spezifischer MAbs mit der Reihe überlappender Peptide des HPV16 L1-Moleküls.
11B veranschaulicht die antigenische Indexvorhersage des HPV16 L1.
12 zeigt eine Epitopenkarte des HPV16 L1.
13A veranschaulicht synthetische HPV16VLPs, wie sie für die Immunisierung verwendet werden.
13B zeigt die Reaktivität der gereinigten VLPs mit einem Anti-HPV16 L2-Antiserum mittels eines Western-Blots.
13C veranschaulicht Plasmide, die zur Konstruktion rekombinierter Vacciniaviren in Bezug auf BPV1 verwendet werden.
14A und 14B zeigen eine Analyse der BPV1 L1- und L2-Expression in CV-1-Zellen, die mit Wildtyp- und rekombinierten Vacciniaviren infiziert sind; und
15A und 15B zeigen Elektronenmikrogramme von BPV1-Capsiden, die aus mit dem rekombinierten Vacciniavirus infizierten Zellen erhalten wurden.
REFERENZBEISPIEL 1: VON HPV16 ABGELEITETE VLPS
Das HPV-16 L1-Gen vom zweiten ATG (nt5637) wurde durch eine Polymerase-Kettenreaktion aus (von Dr. L. Gissmann bereitgestelltem) pHPV16 amplifiziert, wobei folgende Primer verwendet wurden:

1/ 5'-CAGATCTATGTCTCTTTGGCTGCCTAGTGAGGCC-3'
2/ 5'-CAGATCTAATCAGCTTACGTTTTTTGCGTTTAGC-3'

Das erste Methionin-Codon und das Stopcodon sind durch Unterstreichungen angedeutet, und die BglII-Stellen wurden zur Ermöglichung einer Subklonierung inkludiert. Das amplifizierte 1527 bp-Fragment wurde mit Phenol extrahiert und durch eine Elektrophorese mit 1%igem Agarosegel gereinigt. Nach dem Aufschluss mit BglII wurde das L1-Gen in die BamHI-Stelle des RK19-Plasmids subkloniert (Kent 1988 Ph.D.-Doktorarbeit, University of Cambridge), das einen starken Vacciniavirus-Promotor (4b) enthält. Das resultierende Plasmid wurde sequenziert (Sanger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74,5463-5467) und zur Herstellung eines Fragments, welches das an den 4b-Promotor gekoppelte HPV16 L1-Gen enthält, durch Aufschluss mit MluI und Sst1 verwendet. Dieses Fragment wurde mit T4 DNA-Polymerase stumpf gemacht und in die BamHI-Stelle des Vaccinia-Zwischenvektors pLC1 kloniert, welcher das B24R-Gen des Vacciniavirus (Kotwal und Moss, 1989, J. Virol. 63, 600-606; Smith et al., 1989, J. Gen. Virol. 70, 2333-2343), ein E. coli gpt-Gen (Falkner und Moss, 1988, J. Virol. 64, 1849-1854; Boyle und Coupar, 1988, Gene 65, 123-128) und multiple Klonierungsstellen zur Herstellung des Plasmids pLC200 enthält.
Das HPV16 L2-Gen wurde durch teilweisen Aufschluss von pHPV16 mit Accl hergestellt, um ein Fragment (4138nt-5668nt) herzustellen, das mit Klenow gefüllt und an synthetische BamHI-Linker gekoppelt wurde. Dieses L2-Fragment wurde mit einigen Modifikationen in die BamHI-Stelle eines von pUC abgeleiteten Plasmids, das als p480 bezeichnet wird und einen synthetischen späten Vaccinia-28K-Promotor aufweist, kloniert (Davison und Moss, 1989, J. Mol. Biol. 210, 771-784). Die Promotorsequenz ist wie folgt:
5'-GAGCTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGCATATAAATGGAGGTACCC-3';
das Motiv des späten Promotors ist unterstrichen. Ein Fragment, welches das an den 28K-Promotor gekoppelte L2-Gen enthielt, wurde durch Aufschluss mit SstI/SalI isoliert, durch eine T4 DNA-Polymerase stumpf gemacht und danach zwecks Herstellung von pLC201 in die SstI- und SalI-Stellen von pLC200 kloniert (1).
In 1 befinden sich HPV16 L1, L2 (leere Kästen) unter der Kontrolle später Vaccinia-Promotoren (ausgefüllte Kästen). Das E. coli gpt-Gen (schattierter Kasten) wird als Selektionsmarker eingesetzt. Eine flankierende Sequenz für die homologe Rekombination. Die Richtung der Transcription ist durch Pfeile angedeutet.
Das pLC201-Plasmid wurde danach zur Konstruktion eines rekombinierten Vacciniavirus verwendet, wie zuvor beschrieben (Mackett et al., 1984, J. Virol. 49, 857-864). Das rekombinierte Virus pLC201VV und das rekombinierte Virus pLC202VV wurden in Gegenwart von Mycophenolsäure, Xanthin und Hypoxanthin durch einen Plaque-Test ausgewählt (Falkner und Moss, 1988). Ein rekombiniertes Vacciniavirus (VV), das HPV16L1 und HPV16L2 exprimiert, wurde hergestellt und eingesetzt wie zuvor beschrieben (Zhou et al., 1990, J. Gen. Virol. 71, 2185-2190).
Das rekombinierte Plasmid pLC201 wurde am 27. März 1992 bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklaven Drive, Rockville, MD 20852, U.S.A., hinterlegt und bekam die Bezeichnung 75226.
Das rekombinierte Vacciniavirus pLC201VV wurde am 3. April 1992 bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklaven Drive, Rockville, MD 20852, U.S.A., hinterlegt und erhielt die Bezeichnung VR2371.
REINIGUNG VIRUSARTIGER PARTIKEL
Mit rekombinierten pLC201VV-Viren infizierte CV-1-Zellen wurden 32 Stunden nach der Infizierung in 10 mM Tris (pH 9,0) geerntet und mit einem Dounce-Homogenisator homogenisiert. Die Homogenate wurden zwecks Entfernung der Zellbruchstücke durch eine Zentrifugation bei 2000 g geklärt und auf einen 30 (Gew./Vol.)%igen Sucrosepolster geschichtet. Das Pellet, das sich durch eine in einem SW38-Rotor erfolgende, 90-minütige Zentrifugation bei 110.000 g gebildet hatte, wurde in 10 mM Tris, pH 9,0, suspendiert und auf einen 20-60%igen diskontinuierlichen Sucrosegradienten geschichtet. Nach einer 18-stündigen Zentrifugation bei 100.000 g wurden 10 gleiche Fraktionen zu 0,25 ml gesammelt. Die Proben wurden mit 0,6 ml Ethanol vermischt. Das nach einer 20-minütigen Zentrifugation bei 4°C und 12.000 g erhaltene Pellet wurde zum Zweck einer weiteren Analyse gesammelt. Zur Bestimmung der Dichte der virusartigen Partikel wurde eine Gleichgewichtsdichtegradienten-Sedimentation in CsCl ausgeführt (1,30 g/ml). Nach einer 20-stündigen Zentrifugation bei 125.000 × g wurden 11 Fraktionen zu 0,25 ml gesammelt. Die Dichte jeder Fraktion wurde bestimmt, und jede wurde mittels der Transmissions-Elektronenmikroskopie auf virusartige Partikel untersucht.
In 2A wurden Zellen bei 10 pfu/Zelle mit wt VV (Bahn 1) und pLC201VV (Bahn 2) infiziert und 48 Stunden nach der Infizierung geerntet. Das L1-Protein wurde mit dem HPV16 L1-spezifischen MAb Camvir 1 nachgewiesen. Das 57kDa L1-Protein ist durch den Pfeil angedeutet. Die Bindung von Camviri an das 35 kDa-Protein ist in allen drei Bahnen unspezifisch.
In 3 wurden RNAs, die aus Zellen extrahiert wurden, die mit pLC201VV (Bahn 2), pLC202VV (Bahn 3), welche auch die die HPV16-Proteine E1 und E4 codierenden Gene sowie die HPV16 L1- und L2-codierenden Gene umfassen, oder mit wt VV (Bahn 4) infiziert waren, in einem 1.2%igen Formaldehyd-Agarosegel aufgelöst. Die RNA wurde auf eine Nylonmembran übertragen und mit einer ³²P-markierten L2-Sonde hybridisiert. Formaldehyd-behandelte, Lambda-DNA-Hind III-geschnittene Marker sind dargestellt (Bahn 1).
ELEKTRONENMIKROSKOPIE
Mit dem rekombinierten Vacciniavirus infizierte CV-1-Zellen wurden in 3 (Vol./Vol.)%igem Glutaraldehyd in 0,1 M Natriumkakodylatpuffer fixiert und in 1%igem Osmiumtetroxid nachfixiert, in sortierten Alkoholen entwässert und in ein Epoxyharz eingebettet. Dünne Schnitte wurden abgeteilt und mit Uranylacetat und Bleicitrat gefärbt. Fraktionen des Sucrosegradienten wurden auf EM-Gittern getrocknet und mit 1 (Gew./Vol.)%iger Phosphorwolframsäure (pH 7,0) negativ gefürbt. Unter Verwendung eines JEOL 1200Ex-Transmissions-Elektronenmikroskops wurden die Fraktionen untersucht.
In 4A sind CV-1-Zellen dargestellt, die 32 Stunden lang mit pLC201VV infiziert wurden. In den CV-1-Zellkernen wurden häufig Partikel mit Durchmessern von ungefähr 40 nm (durch Pfeile angedeutet) vorgefunden. Der Balken entspricht 100 nm.
In 4B ist die Fraktion 5 des Sucrosegradienten dargestellt. Papillomavirusartige Partikel, die offensichtlich aus regelmäßigen Capsomerreihen bestehen, wurden beobachtet (durch Pfeile angedeutet). Der Balken entspricht 50 nm.
ANALYSE VON HPV ORF-PRODUKTEN
Die HPV16 L1-Expression wurde mittels Immunpräzipitation und Immunoblot analysiert. Für die Immunpräzipitation wurden metabolisch ³⁵S-markierte, rekombinierte, VV-infizierte CV-1-Zellen in einem RIPA-Puffer (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 1% Natriumdesoxycholat, 150 mM NaCl, 0,5 µg/ml Aprotinin, 10 mM Tris-HCl, pH 7,4) lysiert. Unter Verwendung des L1-spezifischen MAb Camvir 1 (Mclean et al., 1990, J.Clin. Pathol. 43, 488-492) und des ¹²⁵I-Anti-Maus-IgG (Amersham) wurde eine Immunoblotanalyse von teilweise gereinigten virusartigen Partikeln durchgeführt, wie zuvor beschrieben, wobei Proben verwendet wurden, die in einem 2-Mercaptoethanol enthaltenden 2 × SDS-Gel-Beladungspuffer gelöst wurden. Eine Analyse der HPV16 L2-Genexpression ist in 13B dargestellt. Zur Analyse der N-Glycosylierung wurden teilweise gereinigte virusartige Partikel von 100 µl Puffer (0,25 M Natriumacetat, pH 6,5, 20 mM EDTA und 10 mM 2-Mercaptoethanol) aufgenommen und vor dem Immunoblotting 18 Stunden lang bei 37°C mit 0,5 u Endoglycosidase F (Boehringer Mannheim) umgesetzt.
Mycophenolsäure wurde eingesetzt, um einen Vacciniavirus-Rekombinanten für das gpt-Plasmid pLC201 auszuwählen, und dieser wurde als pLC201VV bezeichnet. Die Synthese von L1 in mit pLC201VV infizierten Zellen wurde durch Immunoblotting und Immunpräzipitation bestätigt. Das L1-Protein erwies sich als Autoradiographie-Band von ungefähr 57 kDa. Ein Northern-Blot einer RNA, die aus mit diesen rekombinierten Viren infizierten CV-1-Zellen extrahiert wurde, bestätigte hohe Levels einer L2 mRNA-Transcription in mit einem dieser Viren infizierten Zellen (3). Eine L2-Transcription aus einem synthetischen späten Vacciniavirus-Promotor ergab ein heterogenes Northern-Blot-Muster, da späte VV RNAs kein spezifisches Transcriptions-Terminationssignal einsetzen.
CV-1-Zellen wurden mit pLC201VV infiziert und auf virusartige Partikel untersucht. Die Elektronenmikrogramme dünner Abschnitte von mit pLC201VV infizierten Zellen, jedoch nicht jene von nur mit Wildtyp-Vaccinia infizierten Kontrollzellen, zeigten ungefähr 40 nm lange virusartige Partikel in den Zellkernen. In den meisten Fällen waren diese Partikel in Ketten verkoppelt, und zwar in der Nähe der Kernmembran (4a). Zellen, die mit rekombinierten Vacciniaviren infiziert waren, welche nur HPV16 L1 oder nur L2 exprimierten und das entsprechende Protein (L1) oder mRNA (L2) produzierten, enthielten keine virusartigen Partikel. Zellen, die gleichzeitig mit zwei verschiedenen rekombinierten Vacciniaviren infiziert waren, welche HPV16 L1 bzw. HPV16 L2 exprimierten, produzierten ebenfalls keinerlei virusartigen HPV-Partikel; obwohl das L1-Protein und L2 mRNA in Pools dieser doppelt infizierten Zellen identifiziert werden konnten, wurde in den einzelnen Zellen keine gleichzeitige Synthese von L1 und L2 nachgewiesen.
In 5 wurden virusartige HPV16-Partikel, die aus pLC201VV-infizierten CV-1-Zellen erhalten wurden, über einem Sucrosepolster zentrifugiert und danach einer isopyknischen CsCl-Sedimentation unterzogen. In den Fraktionen 8 und 9 wurden virusartige Partikel (+) vorgefunden. Das Transmissions-Elektronenmikrogramm eines negativ gefärbten Partikels von Fraktion 8 ist in der Einfügung dargestellt. Die Dichte (g/ml) jeder Gradientenfraktion ist angegeben.
In 6 wurden CV-1-Zellen 32 Stunden lang mit pLC201VV infiziert, und die virusartigen Partikel wurden mit einem Sucrosegradienten gereinigt. Die Proben wurden mit Ethanol ausgefällt und mit Endoglycosidase F behandelt, und zwar vor der Analyse durch Immunoblotting mit einem Anti-HPV16 L1-Antikörper Camvir I. Bahn 1: gereinigte virusartige Partikel; Bahnen 2 und 3: nach einer über Nacht erfolgten Behandlung mit Endoglycosidase F. Die L1-Doublette ist durch (=) angedeutet, und das entyglycosylierte L1 ist durch den Pfeil angedeutet. Auf der linken Seite sind Molekülmassenmarker dargestellt.
Um zu bestätigen, dass die mittels Elektronenmikroskopie beobachteten, virusartigen Partikel das HPV16 L1-Protein enthielten, wurden Zellextrakte aus pLC201VV-infizierten Zellen einer teilweisen Reinigung in einem 20 bis 60%igen Sucrosegradienten unterzogen. Zehn Fraktionen wurden gesammelt und auf das L1-Protein untersucht. In den Fraktionen 3 bis 7 konnte L1 nachgewiesen werden, und in der Fraktion 5 wurde der höchste L1-Spiegel festgestellt. Außerdem wurde jede Fraktion mit EM auf virusartige Partikel untersucht; diese wurden in der Fraktion 5 beobachtet. Ein typisches, mit Natriumphosphorwolframat negativ gefärbtes Papillomavirus besitzt 72 regelmäßige, dicht gedrängte Capsomere (Finch und Klug, 1965, J. Mol. Biol. 13, 1-12; Rowson und Mahy, 1967, Bacteriol. Rev. 31, 110-131) und einen Durchmesser von etwa 50 nm. Der Durchmesser der aus den infizierten CV-1-Zellen herausgesäuberten, virusartigen Partikel schwankte zwischen 35 nm und 40 nm. Diese virusartigen Partikel besaßen jedoch ein ähnliches EM-Erscheinungsbild wie Papillomaviren, und eine regelmäßige Capsomerreihe war zu erkennen (4b). Es wurde daher angenommen, dass die in Fraktion 5 des Sucrosegradienten identifizierten, virusartigen Partikel leer waren und in falsch zusammengesetzten Reihen von HPV-Capsomeren bestanden. In CsCl lagerten sich die virusartigen HPV16-Partikel bei etwa 1,31 g/ml ab (5) und zeigten unter dem Transmissions-Elektronenmikroskop das typische Erscheinungsbild eines leeren Papillomavirus-Capsids (5, Einfügung).
Camvir-1 identifizierte eine Proteindoublette in den Western-Blots virusartiger Partikel, die aus pLC201VV-infizierten CV-1-Zellen herausgesäubert wurden (6). HPV16 L1 enthält vier potentielle N-Glycosylierungsstellen (Asparagin 157, 242, 367 und 421). Um zu testen, ob die Doublette Glycosylierungsvarianten des L1-Polypeptids darstellte, wurden teilweise gereinigte virusartige Partikel vor der SDS-PAGE und dem Immunoblotting einer Behandlung mit Endoglycosidase F unterzogen. Dies führte zum Ersetzen der Doublette durch ein einzelnes Band von offensichtlich etwas geringerer Molekülmasse, und zwar bei der erwarteten Molekülmasse von etwa 57 kDa (6, Bahnen 2, 3).
Die virusartigen Partikel, die aus Fraktionen des CsCl-Gradienten mit einer Schwimmdichte von 1,29-1,30 g/ml gesammelt wurden, wurden in einer ELISA-Analyse als Antigene eingesetzt. Alle Antiseren von mit VLPs immunisierten Mäusen waren positiv (Tabelle 2). Kontrollseren von Mäusen, die mit ähnlichen Fraktionen eines Dichtegradienten immunisiert waren, welcher mit einem Lysat von mit Wildtyp-Vaccinia infizierten CV-1-Zellen hergestellt wurde, waren hinsichtlich der virusartigen Partikel nicht reaktionsfähig. Unter Verwendung zweier verschiedener Protokolle zum Auftragen virusartiger Partikel auf ELISA-Platten (Dillner et al., 1991, J Virol 65, 6862-6871) wurden Versuche unternommen, die Reaktivität mit nativen virusartigen HPV-Partikeln von der Reaktivität mit den teilweise denaturierten Proteinen zerstörter Partikel zu unterscheiden. Die auf die VLPs angewandten Maus-Antiseren waren gleichermaßen reaktionsfähig hinsichtlich der nativen (OD 1,00±0,20) und der denaturierten (OD 1,60±0,45) Partikel. Eine Tafel mit 6 monoklonalen Antikörpern, die für die definierten L1-Epitopen spezifisch sind, umfasste nur 1 (Camvir 1), das hinsichtlich nativer VLPs schwach reaktionsfähig war (OD 0,064), und dieses erwies sich als reaktionsfähiger hinsichtlich denaturierter Partikel (OD 0,107) als hinsichtlich nativer Partikel, was nahe legt, dass bei der Produktion nativer VLPs die Reaktivität hinsichtlich des denaturierten L1-Proteins bestand.
In 8 wurde als zweiter Antikörper ¹²⁵I-markiertes Anti-Maus-IgG verwendet. Das 57-kDa L1-Band ist durch den Pfeil angedeutet. Schlüssel: Seren von einzelnen, mit VLPs immunisierten Mäusen: Bahnen 1-5, BALB/c; Bahnen 6-10, C57B1/6; Bahnen 11-15, B10A; Seren von einzelnen, mit CFA immunisierten Mäusen; Bahn 16, BALB/c; Bahn 17, C57B1/6; Bahn 18, B10A; Anti-HPV 16L1 MAb Camvir 1, Bahn 19. Auf der linken Seite sind die Molekülmassen angegeben.
Die Reaktivität der Anti-VLP-Antiseren mit den L1- und L2-Proteinen von HPV16 wurde mittels Immunoblot bestätigt, wobei die Baculovirus-rekombinierten HPV16 L1- und L2-Proteine verwendet wurden. Die Seren von allen Mäusen, die mit den virusartigen Partikeln und jedem der monoklonalen Anti-HPV 16 L1-Antikörper immunisiert waren, erkannten ein 57-kDa-Protein (8) in den Li-rekombinierten, Baculovirus-infizierten S. frugiperda-Zelllysaten, und keine vergleichbare Reaktivität wurde bei den Lysaten von S. frugiperda-Zellen beobachtet, die mit dem Wildtyp-Baculovirus infiziert waren. Die Intensität der Reaktivität mit dem L1-Protein war von Maus zu Maus verschieden, alle Seren waren jedoch bei einem anhaltenden Ausgesetztsein der Immunoblots reaktionsfähig. Ähnliche Ergebnisse wurden mit den L2-rekombinierten, Baculovirus-infizierten Zelllysaten erzielt: sowohl Maus-Anti-VLP-Antiseren als auch ein Kaninchen-Antiserum gegen das L2-Protein reagierten mit einem einzelnen Protein im Lysat. Seren von Mäusen, die nur mit CFA immunisiert waren, reagierten nicht mit einem Protein aus den Lysaten des L1- oder L2-rekombinierten, Baculovirus-infizierten S. frugiperda.
REFERENZBEISPIEL 2: DEFINITION LINEARER ANTIGENISCHER BEREICHE DES HPV16L1
PROTEIN, DAS VLPS EINSETZT
In einer weiteren Versuchsreihe wurden die linearen antigenischen Bereiche des HPV16 L1-Capsidproteins, das synthetische VLPs einsetzt, bestimmt. Bei solchen Versuchen wurden Mäuse dreier Haplotypen (H-2^d, H-2^b und H-2^d/b) mit synthetischen virusartigen HPV16-Partikeln (VLPs) immunisiert, welche unter Verwendung eines hinsichtlich der L1- und L2- Proteine von HPV16 doppelt rekombinierten Vacciniavirus hergestellt wurden. Die resultierenden Anti-VLP-Antiseren erkannten die HPV16-Capside durch eine ELISA-Analyse sowie das Baculovirus-rekombinierte HPV16 L1- und L2-Protein mittels Immunoblot. Überlappende Peptide, die mit der HPV16L1-Aminosäuresequenz übereinstimmten, wurden zur Definition der immunreaktiven Bereiche des Li-Proteins eingesetzt. Der Großteil der L1-Peptide war hinsichtlich des IgG von den mit den synthetischen HPV16-Capsiden immunisierten Mäusen reaktionsfähig. Ein Computeralgorithmus sagte sieben B-Epitopen in HPV16L1 voraus, von denen fünf in Peiltiden liegen, die hinsichtlich der Maus-Antiseren stark reaktionsfähig sind. Die Maus-Anti-VLP-Antiseren reagierten nicht mit den beiden Peiltiden, die von monoklonalen Anti-HPV16L1-Antikörpern erkannt wurden, welche von anderen gegen das rekombinierte L1-Fusionsprotein geschaffen wurden. Wir ziehen die Schlussfolgerung, dass sich die immunreaktiven HPV16-Epitopen, die unter Verwendung virusartiger Partikel definiert werden, beträchtlich von jenen unterscheiden, die unter Verwendung rekombinierter HPV16L1-Fusionsproteine definiert werden, was impliziert, dass solche Fusionsproteine nicht jene Antigene sein können, die bei HPV-infizierten Patienten nach HPV16L1-spezifischen Immunreaktionen suchen.
Herstellung von HPV16-Capsiden. Das Plasmid pLC201, das offene HPV16L1 und L2-Leseraster (ORFs) enthielt, wurde unter der Kontrolle der Vacciniavirus-Promotoren 4b (natürlich) und p480 (synthetisch) zur Konstruktion des rekombinierten Vacciniavirus (rVV) pLC201VV eingesetzt, wie zuvor beschrieben, allerdings mit den untenstehend erwähnten Ausnahmen. Virusartige HPV16-Partikel wurden aus pLC201VV-infizierten CV-1-Zellen hergestellt, wie zuvor erwähnt, die Zellen wurden jedoch in einem Rifampicin enthaltenden Medium bei 100 µg/ml kultiviert, um die Zusammenfügung und Reifung des Vacciniavirus zu verhindern (Moss, „Virology", S. 685-703 Raven, New York, 1985; Karacostas et al., PNAS 86, 8964-8967, 1989). Die infizierten Zellen wurden geerntet und nach einer Dounce-Homogenisierung durch Einfrieren und Auftauen in 10 mM Tris-HCl (pH 9,0) lysiert. Die Lysate wurden durch Zentrifugation bei 2000 g geklärt und danach 2 Stunden lang bei 100.000 g über einem 20%igen Sucrosepolster in einem PBS-Puffer geschleudert. Das Pellet wurde bis zu einer Ausgangsdichte von 1,30 g/ml mit CsCl vermischt und bei 18° 18 Stunden lang bei 100.000 g zentrifugiert. Fraktionen wurden gesammelt, und auf mit Ethanol ausgefällten Proteinen wurden Immunoblots durchgeführt. Jene Fraktionen, deren L1-Proteintests positiv waren, wurden gepoolt, und das Vorhandensein virusartiger Partikel wurde mittels Elektronenmikroskopie bestätigt, wie obenstehend beschrieben.
Herstellung von Antiseren. Gruppen zu fünf Mäusen BALB/c (H-2^d), C57B1/6 (H-2^b) und B10A (H-2^b/d) wurden mit CsCl-Gradienten-gereinigten, virusartigen HPV16-Partikeln immunisiert. Die Tiere wurden mittels subkutaner Injektion mit 5 µg Capsidprotein geimpft. Die erste Injektion wurde mit vollständigem Freundschem Adjuvans verabreicht, und drei weitere Injektionen wurden im Abstand von drei Wochen in einer Salzlösung verabreicht. Vierzehn Tage nach der vierten Injektion wurden die Seren gesammelt und bei –20° gelagert. Material, das aus mit dem Wildtyp-Vacciniavirus infizierten CV-1-Zellen hergestellt und genau wie im Fall der pLC201VV-infizierten Zellen verarbeitet wurde, wurde zur Immunisierung von Mäusekontrollgruppen gemäß demselben Protokoll eingesetzt.
Peptide. Eine Reihe von 15-mer Peptiden, die sich mit fünf Resten überlappte und sich über die abgeleitete Aminosäuresequenz des HPV16L1-Proteins erstreckte (Seedorf et al., 1985, Virology 145, 181-185; Parton, 1990, Nucleic Acids Res 18 363), wurde unter Anwendung der Fmoc-Chemie gemäß den Standardprotokollen mit dem DuPont RaMPS-Mehrfachpeptidsynthesesystem synthetisiert (Fields und Noble, 1990 Int. J. Pept. Protein Res 35 161-214) und danach mit Glutaraldehyd an Rinderserumalbumin (BSA) konjugiert. Um die Position der Aminosäuren (aas) im L1-Protein zu kennzeichnen, wurde das mutmaßliche erste Start-Codon als Aminosäure Nummer 1 bezeichnet (Tabelle 1). Aus technischen Gründen wurde das C-terminale Peptid, das mit aas 521-531 übereinstimmte, nicht verwendet. Die Reinheit aller verwendeten Peptide übertraf 85%, wie durch eine HPLC-Analyse beurteilt.
Rekombinierte L1 + L2-Proteine. Rekombinierte Baculoviren, welche den HPV16L1 oder den HPV16L2 ORF exprimierten, wurden zur Infizierung von SF9-Insektenzellen eingesetzt. Nach 3-tägiger Inkubation bei 25° wurden die Zellen durch 5-minütige Zentrifugation bei 14.000 g pelletiert. Das Pellet wurde in einem RIPA-Puffer aufgelöst (20 mM Tris-HCl, pH 7,6; 2 mM EDTA; 50 mM NaCl; 1% Desoxycholat; 1% Triton X-100; 0,25% SDS; 1% Aprotinin; 1 mM PMSF).
Western-Blotting. Virusartige Partikel oder ein rekombiniertes L1- oder L2-Protein wurden mit 2x-Beladungspuffer, enthaltend 2% SDS/DTT, vermischt und 5 Minuten lang gekocht. Die Proteine wurden in 10%igen Polyacrylamidgels abgetrennt und auf Nitrocellulose geblottet (Towbin et al., 1979, Virology 175 1-9). Die Filter wurden in Streifen geschnitten, 1 Stunde lang bei 37° in 3%igem BSA in PBS inkubiert. Die neutralisierten Streifen wurden bei 4° über Nacht den verschiedenen Maus-Antiseren (1:200) oder monoklonalen Antikörpern ausgesetzt. Die reaktionsfähigen Proteine wurden nach der Reaktion mit dem ¹²⁵I-konjugierten Anti-Maus-IgG (0,2 µCi/ml) (Amersham) mittels Autoradiographie sichtbar gemacht.
ELISA-Analyse. Polyklonale Antiseren wurden durch einen Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) hinsichtlich der Reaktivität mit synthetischen HPV16-Capsiden untersucht, wie zuvor beschrieben (Christensen et al., 1990, PNAS 76 4350-4354, Cowsert et al., 1987, JNCl 79 1053-1057). Für Analysen mit „nativen" synthetischen HPV16-Capsiden wurden 100 ng Protein in PBS (pH 7,5) durch eine 1-stündige Inkubation bei 37° in jeder ELISA-Plattenmulde (Flow Labs) angebracht. Für Analysen mit „denaturierten" Partikeln wurden die Partikel in einem Carbonatpuffer, pH 9,6, suspendiert und bei 37° über Nacht an die Platte adsorbiert. Alle nachfolgenden Inkubationen wurden bei Raumtemperatur ausgeführt. Die Platten wurden mit PBS gewaschen, und ungebundene Stellen wurden durch eine 1-stündige Inkubation in einem Blockierungspuffer (5% Milchpulver in PBS, pH 7,5) blockiert. Die Maus-Antiseren (1:200), die zuvor mit einem Wildtyp VV-infizierten CV-1-Zeilextrakt adsorbiert wurden, wurden hinzugefügt und 1 Stunde lang inkubiert, und die Platten wurden mit PBS gewaschen. Meerrettichperoxidasekonjugiertes Anti-Maus-IgG (Sigma), das in einer 1:1000-Verdünnung in einem Blockierungspuffer vorlag, wurde hinzugefügt und 1 Stunde lang inkubiert, gefolgt von 10 Waschungen mit PBS. Ein Substratpuffer (pH 4,6), enthaltend ABTS (Boehringer) und H₂O₂, wurde hinzugefügt, und nach 15 Minuten wurde der OD415 abgelesen.
Lineare B-Epitopenkartierung. B-Epitope wurden identifiziert, indem Antiseren von immunisierten Tieren mittels ELISA gegen den Satz überlappender HPV16L1-Peptide gescreent wurden. An BSA gekoppelte, synthetische Peptide wurden in 10 mM Natriumcarbonatpuffer (pH 9,3) verdünnt und bei 4° über Nacht an ELISA-Platten adsorbiert. Das Blockieren der restlichen Bindungsstellen auf den Platten wurde bei 37° durch 2-stündige Anwendung von 3%igem BSA in PBS durchgeführt. Verdünnte Maus-Antiseren (1:500) wurden bei Raumtemperatur 2 Stunden lang mit beschichteten Platten inkubiert. Die Platten wurden mit PBS, enthaltend Tween 20 (0,1%), gewaschen und mit Peroxidase-konjugiertem Anti-Maus IgG (1:1000) (Sigma) oder IgA (1:2000) (Sigma) 2 Stunden lang inkubiert. Die Platten wurden mit 0,5 mg/ml ABTS in Substratpuffer (pH 4,6) 15 Minuten lang gewaschen und entwickelt, bevor Extinktionswerte von 415 nm aufgezeichnet wurden. Ein Peptid wurde als reaktionsfähig betrachtet, wenn der OD 415-Wert beim Testserum um 3 SDs höher war als der Durchschnitt für das Kontrollserum: dies ergab einen Kürzungswert von 0,260. Ein OD 415, welcher fünf Mal der mit den Kontrollseren (0,55) erhaltene, mittlere OD 415 war, wurde willkürlich zur Definierung eines bedeutenden reaktionsfähigen Epitops in Betracht gezogen.
Monoklonale Antikörper und Antiseren. Fünf monoklonale Antikörper (MAb), die gegen das HPV16L1-Fusionsprotein geschaffen wurden, wurden eingesetzt. MAb 5A4, 1D6, 3D1 und 8C4 (Cason et al., 1989, J. Gen Virol 70 2973-2987) wurden von Dr. Phil Shepherd aus London, Großbritannien, zur Verfügung gestellt, und MAb Camvir 1 (McLean et al., 1990, J. Clin. Pathol. 43 488-492) wurde von Dr. C. McLean (Department of Pathology, University of Cambridge) erhalten. Ein Kaninchen-Antiserum gegen das HPV16 L2-Trp-E-Fusionsprotein wurde von Dr. Denise Galloway (University of Washington, Seattle) zur Verfügung gestellt.
Aminosäuresequenzanalyse und antigenische Indexvorhersage. Der antigenische Index (AI) (Jameson und Wolf, 1988, Corp. Appl., Biosci 4 181-186) ist ein Maß der Wahrscheinlichkeit, dass eine Peptidsequenz antigenisch ist. Er wird durch das Summieren mehrerer abgewogener Maßeinheiten einer sekundären Struktur berechnet. Unter Verwendung einer PLOTSTRUCTURE-Software wurden die Werte für die vorhergesagte HPV16L1-Sequenz berechnet.
In den 9 und 10 ist die Reaktivität (OD 415) der Seren in ELISA mit einer der HPV16L1-Sequenz entsprechenden Reihe überlappender Peptide dargestellt. Die Peptidnummern, welche der HPV16L1-Sequenz entsprechen (siehe Tabelle 1), sind angegeben.
In den 11 und 11A entspricht das Nummerierungssystem für die Aminosäuren dem HPV16L1 vom ersten mutmaßlichen Start-Codon. Die Bereiche, die einen AI-Wert über 1,5 aufweisen, sind angegeben.
In 12 sind jene Bereiche des HPV16L1 dargestellt, bei denen sich zeigte, dass B-Epitope im Bereich der Kartiersysteme liegen. Unter Verwendung von überlappenden Peptiden wurden mit Seren von Mäusen, die mit den VLPs (Partikeln) immunisiert waren, und mit IgA- und IgG-Antikörpern in Seren von Menschen mit Gebärmutterhalskrebs (Menschliches IgA und menschliches IgG) (Dillner et al., 1990 Int. J Cancer 45 529-535), Ergebnisse erzielt. Es wurde angenommen, dass die Maus-Anti-VLP-Antiseren im wesentlichen Maß reaktionsfähig hinsichtlich eines Peptids waren, wenn der OD größer als 0,55 war. Die von mit einem L1-Fusionsprotein (Kaninchenserum) immunisierten Kaninchen erhaltenen Ergebnisse (Muller et al. 1990 J Gen Virol 71 2709-2717) sind eingezeichnet: diese wurden unter Verwendung einer Reihe von Expressionsklonen mit partieller Länge bestimmt, und die gesamte Länge der Sequenz, in der das Epitop/die Epitope liegt bzw. liegen, ist dargestellt. Auch die durch einen Algorithmus vorhergesagten B-Epitope (Computer) (Jameson und Wolf Corp. Appl. Biosci 4 181-186 1988) und die von den veröffentlichten monoklonalen Anti-HPV16L1-Antikörpern (Monoklonalen) erkannten Epitope (Cason et al. J. Gen Virol. 70 2973-2987 1989; McLean et al. J. Clin Pathol. 43 488-492 1990) sind angezeigt. Die Skala zeigt die Position der Epitope entlang des 531 aa L1-Proteins und ist ab dem N-terminalen Methionin (Rest 1) nummeriert. Für jedes ein Epitop enthaltende Peptid ist auch die genaue Stelle bezüglich des N-terminalen Methionins angegeben.
Eine Reihe von synthetischen 15-mer Peptiden des HPV16 Li-Proteins, welche die gesamte Länge des Proteins mit fünf aa-Überlappungen bedeckte, wurde zur Definierung der Epitopen in L1, das von den verschiedenen Immunseren erkannte wurde, eingesetzt. Jedes der 16 Antiseren von den drei untersuchten, durch Inzucht erzeugten Mausstämmen BALB/c (H-2^d), C57B1/6 (H-2^b) und B10A (H-2^b/d) erkannte mehrere lineare Peptide des L1-Proteins, und von allen untersuchten Stämmen wurden im Wesentlichen dieselben Peptide von HPV16 L1 erkannt (10). Fünf einzelne Seren aus jedem Stamm wurden untersucht. Ein Peptid wurde als reaktionsfähig bezeichnet, wenn der OD bei einem Serum höher war als der Durchschnitt + 3SD der ODs der negativen Kontrollseren; dies ergab einen Kürzungswert für die Reaktivität von 0,260. Seren von mir mit CFA immunisierten Mäusen hatten bei allen L1-Peptiden eine OD 415-Reaktivität von weniger als 0,260. Obwohl bei der Intensität der Reaktivität jedes Anti-VLP-Serums aus einem bestimmten Stamm mit jedem Peptid eine gewisse Schwankung zu beobachten war, war jedes Peptid entweder hinsichtlich aller Anti-VLP-Seren aus jedem Mausstamm oder hinsichtlich keinem reaktionsfähig (OD > 0,260). Der Isotyp des Peptid-spezifischen Antikörpers in den Anti-VLP-Seren wurde unter Verwendung der IgG- und IgA-spezifischen Anti-Maus-Immunglobulinantikörper untersucht. Die IgG-Reaktion war so wie dargestellt (9 und 10), und für kein Peptid (OD > 0,050) konnte eine signifikante IgA-Reaktivität nachgewiesen werden. Da die meisten Peptide hinsichtlich der Anti-VLP-Seren reaktionsfähig waren, wurde ein beliebiger OD-Wert, welcher fünf Mal der mittlere Negativwert war, zur Definierung bedeutender reaktionsfähiger Bereiche des L1-Proteins eingesetzt: die wichtigsten immunreaktiven L1-Peptide waren entlang der Länge des L1-Proteins gleichmäßig verteilt, wobei sieben im aminoterminalen Drittel des Moleküls, sieben im mittleren Drittel und acht im carboxyterminalen Drittel lagen. Im Gegensatz dazu erkannten die HPV16 L1-spezifischen monoklonalen Antikörper wichtige einzelne lineare Epitope, wie zuvor beschrieben (Cason et al., siehe oben, McLean et al., 1990, siehe oben). Vier der fünf reaktionsfähigen monoklonalen Anti-HPV16L1-Antikörper (5A4, 1D6, 3D1, 8C4) waren hinsichtlich des Peptids 30 (291-305) reaktionsfähig, während Camvir 1 das Peptid 24 (231-245) erkannte (11 und 11A). Seren von mit den virusartigen Partikeln immunisierten Mäusen reagierten mit keinem dieser Peptide.
Auf Basis der vorhergesagten sekundären Proteinstruktur wurde ein Algorithmus eingesetzt, um wahrscheinliche B-Epitope des HPV16L1 abzuleiten. Auf Basis der Kettenflexibilität, der leichten Erreichbarkeit und des hohen Hydrophilizitätsgrads wurden mögliche antigenische Bereiche als antigenischer Index (AI) (Jameson und Wolf, 1988, siehe oben) berechnet (11). Ein Bereich, der einen AI-Wert über 1,5 aufwies, wurde als vorhergesagtes B-Epitop betrachtet. Sieben solche Bereiche wurden vorgefunden (Aminosäuren 79-84, 105-108, 120-122, 134-135, 267, 269, 298-299, 363-367), und fünf dieser sieben Bereiche lagen in den 22 Peptiden, bei denen eine erhebliche Reaktivität mit Antiseren von mit synthetischen HPV16-Capsiden immunisierten Mäusen beobachtet wurde. Die Zusammenfassung der B-Epitopenspezifizität von Antiseren aus verschiedenen Quellen ist in 12 dargestellt.
Bei einer weiteren Betrachtung der Beispiele 1-2 ist festzustellen, dass Papillomaviren in infizierten Keratinozyten im Allgemeinen Virione erzeugen, welche mittels der Elektronenmikroskopie leicht identifizierbar sind (Almeida et al, 1962, J. Invest, Dermatol 38, 337-345) und in manchen Fällen gereinigt werden und als infektiös nachgewiesen werden können (Rowson und Mahy, 1967, Bacterial. Reo. 31, 110-131). HPV 16-Virione sind jedoch im HPV16-infizierten Gebärmutterhalsepithelgewebe nicht zu finden, obwohl im differenzierten Genitalepithel eine Transcription des späten HPV16 L1- und L2-Gens auftritt (Crum et al., 1988, J. Virol. 62, 84-90) und die L1-Translation in diesen Geweben ein immunreaktives Li-Protein erzeugt (Stanley et al., 1989, Int. J. Cancer 43, 672-676). In dieser Beschreibung zeigten wir, dass eine Expression von HPV16 L1- und L2-Genen in Epithelzellen sowohl notwendig als auch ausreichend ist, um einen Verband von virionartigen HPV16-Partikeln zu ermöglichen, und folglich sind die L1- und L2-Proteine von HPV16 hinsichtlich eines Virionenverbands nicht fehlerhaft. Die Expression der späten HPV16-Gene in Gewebeteilen scheint durch die Epithelumgebung streng reguliert zu sein (Taichman et al, 1983, J. Invest. Dermatol 1, 137-140). Der Umstand, dass trotz L1- und L2-Transcription und Li-Translation in vivo keine HPV16-Virione nachgewiesen werden, legt nahe, dass es entweder eine posttranscriptionelle Blockade gegen eine L2-Produktion im Gebärmutterhalsepithel oder einen Virionenverband-Hemmstoff gibt. In der HPV16-hältigen Zelllinie W12, die aus Gebärmutterhalsgewebe gewonnen wird, wurden virusartige Partikel beobachtet, als die Zellen in einer Mäuse-Mikroumwelt in vivo einer terminalen Differenzierung unterzogen wurden (Sterling et al. 1990, J. Virol 64, 6305-6307), wodurch nahe gelegt wird, dass solche Zellen keine Blockade gegen einen Virionenverband besitzen und dass eine ungenügende L2-Translation oder andere unbekannte Gründe das Unvermögen, HPV16-Virione in Gebärmutterhalsgewebeteilen nachzuweisen, erklären könnten.
Unsere EM-Studien zeigen, dass das leere HPV16-Virion eine durchschnittliche Größe von etwa 40 nm besitzt, was geringer ist als bei anderen Papillomaviren, im Vergleich zu anderen Papillomaviren, wie z.B. dem Kaninchen-Papillomavirus, (Finch und Klug, 1965 J. Mol. Biol 13 1-12) oder dem Warzenvirus des Menschen (Rowson und Mahy 1967, siehe oben), jedoch eine ähnliche Oberflächenstruktur aufweist. Die Sedimentation zeigte eine Dichte des leeren Capsids von etwa 1,31 g/ml, jene Dichte, die beim leeren Papillomavirus-Capsid zu erwarten ist, im Vergleich zu etwa 1,36 g/ml bei intakten HPV1a-Virionen (Doorbar und Gallimore, 1987, J. Virol. 61, 2793-2799).
Das L1-Protein von HPV besitzt potentielle Glycosylierungsstellen, und gereinigte BPV-Partikel haben kleinere elektrophoretische L1-Formen, deren Mobilität auf eine Endoglycosidasebehandlung empfindlich reagiert (Larsen et al., 1987, J. Virol 61, 3596-3601). Es wurde beobachtet, dass das L2 von HPV 1a und HPV 11 eine Doublette ist (Rose et al., 1990, J. Gen. Virol, 71, 2725-2729; Doorbar und Gallimore, 1987, siehe oben; Jin et al., 1989, J. Gen. Virol. 70, 1133-1140), und dies wurde Unterschieden bei der Glycosylierung zugeschrieben. Unsere Daten zeigen, dass das L1-Protein in HPV16-Capsomeren ebenfalls glycosyliert ist und dass zwei verschiedene Glycosylierungszustände existieren.
Bei dieser Beschreibung verwendeten wir synthetische virusartige Partikel, um die immunitätserzeugende Wirkung der in einem Eukaryontensystem erzeugten HPV16-Capsidproteine zu studieren. In Eukaryontenzellen erzeugte Capsidproteine wurden verwendet, da in Eukaryontenzellen erzeugte Papillomavirus-Capsidproteine eine posttranslationelle Modifikation durchmachen (Browne et al., 1988 J. Gen. Virol. 69 1263-1273; Zhou et al., 1991 Virology 185 625-632), was eine wichtige Determinante bei der Antigendarstellung sein kann. Ein rekombinierter Vaccinia-Expressionsvektor wurde gewählt, da von klinischen Läsionen oder einer Virusausbreitung in einer Zellkultur keine nativen HPV16-Partikel zu erhalten sind. Wir verwendeten die HPV16 VLPs zur Produktion polyklonaler Anti-VLP-Antiseren bei Mäusen, und diese Seren reagierten mittels ELISA stark mit den HPV16-Capsiden. Wir zeigten durch ein Immunoblotting, dass die Anti-VLP-Antiseren Epitopen in denaturiertem L1 (2) und L2 erkannten. Überdies definierten Anti-VLP-Seren 22 wichtige reaktionsfähige Peptide in einer Reihe aus einundfünfzig 15-mer L1-Peptiden. Diese Daten weisen daraufhin, dass auf Viruspartikel angewandte Antiseren dennoch häufig lineare Determinanten erkennen. Das Profil der humoralen Reaktivität mit dem Satz von L1-Peptiden war über zwei ungleichartige MHC-Mausstämme hinweg beinahe identisch, was nahe legt, dass es in L1 genügend T-Epitope gibt, so dass die MHC-Restriktion bei der Bestimmung der humoralen Reaktion auf das HPV16 L1-Protein in den hier untersuchten Mausstämmen nicht einschränkend wirkt.
Die Daten der mit unseren Maus-Anti-VLP-Antiseren erhaltenen B-Epitopenspezifität können mit einer ähnlichen Studie über ein „Immun"serum von Frauen mit Gebärmutterhalsdysplasie verglichen werden (12) (Dillner et al., 1990 Int. J. Cancer 45 529-535). Mehrere Peptide wurden von sowohl den menschlichen Immunseren als auch den Anti-VLP-Antiseren erkannt, aber der Großteil der hinsichtlich der Maus-Anti-VLP-Antiseren reaktionsfähigen Peptide war hinsichtlich der menschlichen Immunseren nicht reaktionsfähig (12). Keiner der L1-Bereiche (221-235, 291-305), die von L1-spezifischen monoklonalen Antikörpern erkannt wurden (Cason et al., 1989; McLean et al., 1990), wurde von unseren Maus-Anti-VLP-Antiseren erkannt. Da L1-Fusionsproteine zur Züchtung dieser MAbs und auch zum Screenen nach einem Antikörper gegen L1 in menschlichem Serum verwendet wurden, kann die mangelnde Reaktivität von menschlichen Seren mit dem L1-Fusionsprotein (Jenison et al., 1990 J. Infect. Dis 162 60-69; Köchel et al., 1991 Int. J. Cancer 48 682-688) durch das Unvermögen der L1-Fusionsproteine, die dem menschlichen Immunsystem vom nativen L1-Protein gebotenen L1-Epitope zu entwickeln, erklärt werden.
Durch das Screenen mit Peptiden nach Antikörpern gegen das L1-Protein können nur lineare Epitope nachgewiesen werden. Beim Versuch zu bestimmen, ob die Reaktivität in den Mausseren sowohl gegen lineare als auch gegen konformationelle Determinanten gerichtet war, führten wir mit den behandelten Partikeln auf zwei Arten ELISA-Analysen durch: bei der einen sollen native Partikel erhalten bleiben und bei der anderen ein denaturiertes Protein erzeugt werden (Dillner et al., 1991 J. Virol. 65 6862-6871). Wir fanden kein Serum bzw. keinen monoklonalen Antikörper, das bzw. der ausschließlich hinsichtlich Partikel reaktionsfähig war, die in der einen oder in der anderen Weise behandelt wurden, obwohl ein MAB (Camvir 1) stärker mit den denaturierten als mit den „nativen" Partikeln reagierte. Die mangelnde Reaktivität des Großteils der MAbs mit den denaturierten Partikeln legt nahe, dass diese nur zum Teil denaturiert waren, da dieselben Antikörper in einem Western-Blot mit einem denaturierten Protein reagieren. Umgekehrt ist die Reaktivität von Camvir 1 mit den nativen Partikeln kein Beweis, dass das von diesem Antikörper erkannte lineare Epitop ein denaturiertes L1-Protein erkennt, das im nativen Partikelpräparat in einer gewissen Menge vorhanden ist, und wir haben keinen Beweis, dass unter unseren ELISA-Bedingungen intakte VLPs erhalten bleiben.
Da die meisten Antikörper konformationsabhängige Determinanten erkennen (Benjamin et al., 1984 Ann. Rev. Immunol. 2, 67-101), welche mehrere nicht benachbarte Polypeptidsequenzen umfassen können (Amit et al., 1986 Science 233 747-753), ist es unwahrscheinlich, dass für Virione hervorgebrachte Antikörper fusionierte oder denaturierte Proteine sowie das native Protein erkennen, wie hinsichtlich HPV1-Antiseren gezeigt wurde (Steele und Gallimore, 1990, Virology 174 388-398). Die Virione mancher, mit Hautwarzen in Verbindung stehender HPVs sind in für serologische Analysen ausreichenden Mengen vorhanden (Almeida und Goffe, 1965 Lancet 2 1205-1207; Kienzler et al., 1983 Br J. Dermatol. 108 665-672; Pfister und Zur Hausen, 1978 Int. J. Cancer 21 161-165; Pyrhsonen et al., 1980 Br. J. Dermatol 102 247-254; Pass und Maizel, 1973 J. Invest. Dermatol. 60 307-311), und zwar zum Abschälen von Warzen. Das Vorherrschen von Antikörpern gegenüber gereinigten Virionen im menschlichen Immunserum schwankt in Abhängigkeit vom Nachweissystem, das eingesetzt wird, von 20 (Genner, 1971 Acta. Derm. Venereol (Stockh) 51 365-373) bis 88% (Morison, 1975 Br J Dermatol 93 545-552). Bis vor kurzem waren Virione der Genital-HPV-Typen für serologische Studien jedoch nicht erhältlich. Das Nacktmaus-Heterotransplantatsystem (Kreider et al., 1987 J Virol 61 590-593) ermöglichte die Produktion von HPV11-Partikeln für den Nachweis menschlicher Antikörper (Bonnez et al., 1991 J. Gen Virol 72 1343-1347). Wir rechnen damit, dass die hier beschriebenen HPV16 VLPs die Entwicklung ähnlicher Studien zur Seroreaktivität gegenüber nativen HPV16-Partikeln ermöglichen und die beobachtete mangelnde Reaktivität im menschlichen Serum gegenüber HPV15L1-Fusionsproteinen (Jenison et al., 1991 J Virol 65 1208-1218; Köchel et al., 1991, siehe oben) einfach mit ähnlichen Beobachtungen hinsichtlich HPV1 (Stelle and Gallimore, 1990 Virology 174 388-398) vergleichbar sein kann.
Antikörper gegen BPV-Strukturproteine besitzen eine virusneutralisierende Wirkung (Pilacinski et al., 1986 Ciba Found. Symp. 120 136-156), und auf gereinigte HPV11-Virione angewandte Antiseren könnten infektiöses HPV11 in einem athymischen Maus-Heterotransplantatsystem ebenfalls neutralisieren (Christensen und Kreider, 1990 J Virol 64 3151-3156). Unsere Ergebnisse wiesen darauf hin, dass die gereinigten synthetischen HPV16-Capside immunitätserzeugend sind und zur Herstellung und Bewertung virusneutralisierender Antikörper, die für diesen geschwulstbildenden Virus spezifisch sind, eingesetzt werden könnten. Sowohl das in Escherichia coli exprimierte BPV1 L1-Protein als auch BPV-Partikel schützten Rinder vor Warzenbildung (Pilacinski et al., 1986; Jarrett et al., 1990 Vet. Rec. 126 449-452). Eine ähnliche Immunreaktion auf virusartige HPV16-Partikel wäre die Basis eines potentiellen Impfstoffs zur Verhinderung des mit HPV16 in Zusammenhang stehenden Gebärmutterhalskrebses.
In 13A wurden CVl-Zelllysate nach einer Infizierung mit pLC201VV einer Gleichgewichtsgradienten-Sedimentation unterzogen. Die gereinigten virusartigen Partikel wurden nach einer negativen Einfärbung mit Phosphorwolframsäure mittels Transmissions-Elektronenmikroskopie untersucht. [Balken = 100 nm].
In 13B, Bahn 1, das Lysat von mit dem Wildtyp-Virus infizierten CV1-Zellen; Bahn 2, das Lysat vom L1- und L2-exprimierenden Virus pLC201VV: Bahn 3, gereinigte virusartige Partikel. Das L2-Protein wurde mit einem Kaninchen-Anti-HPV16 L2-Antikörper untersucht, gefolgt vom ¹²⁵I-Protein A. Die Molekülmassen sind auf der linken Seite angegeben, und die L2-Banden sind durch Pfeile angedeutet.
Auf die 13A und 13B kann ebenfalls Bezug genommen werden, welche zeigen, dass der doppelt rekombinierte HPV16 L1- und L2-VV das L2-Protein enthält, wie mittels Western-Blot aufgezeigt, wobei gereinigte VLPs und ein gegen das VV-rekombinierte L2-Protein geschaffenes Kaninchen-Antiserum eingesetzt wurden.
REFERENZBEISPIEL 3: BPV1 VLPS
Es wurde auch festgestellt, dass Rinder-Papillomavirus (BPV) 1-Virione, die unter Verwendung eines VV-Rekombinanten für die BPV1-Capsidproteine gleichermaßen in vitro hergestellt werden, BPV1 DNA verpacken können. Vollständige Virione können eine zulässige Maus-Fibroblastenzelllinie infizieren, wie durch die Transcription des offenen E1-Virusleserasters angezeigt, und die Infektion wird durch die Inkubation der Virione mit Antikörpern gegen das BPV1-Capsidprotein gehemmt. Im Gegensatz zu den Beobachtungen hinsichtlich HPV16 sammeln sich virusartige Partikel in Zellen, die mit dem VV- Rekombinanten für das BPV1 L1-Capsidprotein allein infiziert sind, zur Verpackung von BPV1 DNA zwecks Herstellung infektiöser Virione wird jedoch das L2-Protein benötigt.
Hinsichtlich der HPV16 VLPs, auf die obenstehend Bezug genommen wurde, schienen diese Partikel aus Capsomeren zu bestehen, welche typisch sind für jene, die in aus klinischen Läsionen herausgesäuberten HPV1- und BPV1-Partikeln zu sehen sind (Bakar et al, J.C. Biphys J 60 1445-1456-1991, Staquet et al., J. Dermatologica 162 213-219, 1981), obwohl die allgemeine Morphologie der HPV16-Partikel einigermaßen anders war als jene natürlich vorkommender HPV1- und BPV1-Partikel. Da keine natürlichen HPV16-Virione aus klinischen Läsionen herausgesäubert wurden, wurde es als wünschenswert erachtet festzustellen, ob dieser morphologische Unterschied eine Eigenschaft von HPV16 oder des zur Herstellung der Virionen eingesetzten, rekombinierten Vacciniavirus (rVV)-Systems war. Daher wurde eine Reihe von VVs hergestellt, wobei jeder hinsichtlich der L1- und L2-Capsidproteine von HPV6, HPV11 und BPV1 doppelt rekombiniert war. Eine Infizierung der CV-1-Zellen mit jedem dieser doppelt rekombinierten VVs erzeugte virusartige Partikel, und diese ähnelten den authentischen HPV1- und BPV1-Virionen mehr als den HPV16-Partikeln. Wir entschieden uns dafür, die BPV-1-Partikel zu untersuchen, da natürliche BPV-1-Partikel morphologisch und immunologisch besser gekennzeichnet sind (Chef et al., Baker et al. 1991, Cowsert et al., J. Natl. Cancer Inst. 79 1053-1057) und Zelllinien verfügbar sind, die für die Episomen-Replikation von BPV-1 DNA zulässig sind (Law et al. 1981 DNAS 78 2727-2731).
In 13C wird aus dem natürlichen späten p4b-Vaccinia-Promotor BPV1L1 exprimiert und aus dem synthetischen späten p480-Vaccinia-Promotor L2 exprimiert. Das E. coli-gpt-Gen wird als Selektionsmarker eingesetzt. Flankierende Sequenzen sind das Vaccinia-B24R-Gen, welches eine Vacciniasequenz für eine homologe Rekombination bereitstellt. Die BPV1 L1- und L2-Gene wurden durch eine PCR aus Plasmid pml-1 kloniert. Da das BPV1-Genom linearisiert und an einer BamHI-Stelle im BPV1 L2 ORF in dieses Plasmid kloniert wird, wurde das BPV1-Genom zuerst durch einen BamHI-Aufschluss aus pml-1 isoliert und zirkulieren gelassen, und die zirkulieren gelassene BPV-1 DNA wurde als PCR-Matrize verwendet. Die für die L1-Amplifikation eingesetzten Oligonucleotid-Primer waren die Folgenden:
5'-CGGGATCCATGGCGTTGTGGCAACAAGGCCAGAAGCTG.
5'-CGGGGATCCTTATTTTTTTTTTTTTTTTGCAGGCTTACTGG.
Die BamHI-Stelle ist unterstrichen, und das erste Methionin- und das Stopcodon sind fettgedruckt. Die Oligonucleotid-Primer für die L2-Amplifikation waren die Folgenden:
5'-GCAGATCTATGAGTGCACGAAAAAGAGTAAAACGTGCCAGTGC.
5'-GCAGATCTTTAGGCATGTTTCCGTTTTTTTCGTTTCC.
Die BglII-Stellen sind unterstrichen, und das erste Methionin- und das Stopcodon sind fettgedruckt. Das amplifizierte 1478 bp L1-Fragment wurde zwecks Erzeugung von RK19BPVL1 in die BamHI-Stelle im Plasmid RK19 kloniert. Das L1-Gen und der Vaccinia-4b-Promotor wurden durch Aufschluss mit MluI und SmaI aus diesem Plasmid isoliert und zwecks Erzeugung von pSXBPVL1 in das Plasmid pSX3 übertragen. Das 1409 bp L2-Fragment wurde mit BglII aufgeschlossen und zwecks Erzeugung von p480BPVL2 in die BamHI-Stelle im Plasmid p480 kloniert. Der synthetische späte Vaccinia-Promotor und das BPV L2-Gen wurden aus diesem Plasmid in die SmaI-Stelle in pSXBPVL1 kloniert, um das doppelt rekombinierte Plasmid pSXBPVL1L2 zu produzieren. Eine Transfektion von pSXBPVL1- oder pSXBPVL1 L2-DNA in Einzelzellschichten von CV-1, die mit dem Wildtyp (wt)-VV WR-Stamm infiziert waren, führte zu den rVVs pSXBPVL1VV (L1-exprimierend) und pSXBPVL1L2VV (L1- und L2-exprimierend). Rekombinierte Vacciniaviren wurden dreimal in Gegenwart von Mycophenolsäure gereinigt. Nach der Reinigung wurden in großem Umfang Rekombinanten hergestellt und für diese Versuche verwendet.
In 14A ist eine Immunpräzipitationsanalyse von rekombiniertem BPV1 L1 in Vaccinia-infizierten Zellen dargestellt. Die CV-1-Zellen wurden bei 10 pfu/Zelle mit dem wt-Vacciniavirus (Bahn 1); pSXBPVL1VV (Bahn 2); pSXBPVL1L2VV (Bahn 3) infiziert und 48 Stunden nach der Infizierung geerntet. Das BPV1L1-Protein wurde mit einem BPV1-spezifischen Kaninchen-Antiserum nachgewiesen. Das 58 kDa-L1-Protein ist durch einen Pfeil angedeutet.
In 14B ist die Northern-Blot-Analyse einer BPV1 L2-Expression dargestellt. RNA, die aus mit wt VV (Bahn 1), pSXBPVL1L2VV (Bahn 2) infizierten CV-1-Zellen extrahiert wurde, wurde mit dem BPV1 L2-Gen untersucht. Die variable Länge der homologen L2-Transcripte ist typisch für Transcripte, die aus VV-Promotoren exprimiert werden. Für die Immunpräzipitation wurden mit rVVs infizierte Zellen mit einem RIPA-Puffer (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 1% Natriumdesoxycholat, 150 mM NaCl, 0,5 µg/ml Aprotinin, 10 mM Tris-HCl, pH 7,4) lysiert. Lösliche Proteine wurden in einer Verdünnung von 1:1000 mit einem Kaninchen-Anti-BPV1-Antikörper (DAKO, Glostrup) immunpräzipitiert. Die präzipitierten Proteine wurden mit einer Protein-A-Sepharose gesammelt, auf 10%igen SDS-Polyacrylamidgels abgetrennt und auf Nitrocellulosefilter geblottet. Nach dem Blockieren mit Magermilch wurden die Filter dem Anti-BPV1-Serum ausgesetzt (1:1000), gefolgt vom ¹²⁵I-Protein A (0,1 µCi/ml), und mittels Autoradiographie sichtbar gemacht. Die gesamte RNA wurde aus den Zellen extrahiert und mittels Zentrifugation durch CsCl gereinigt, wie obenstehend beschrieben. Die gesamte RNA, 30 µg pro Spur, wurde über 1,2%ige Formaldehyd-Agarosegels gezogen, auf Nylonmembrane übertragen und mit einem ³²P-markierten BPV1 L1-Gen untersucht.
In 15A wird auf pSXBPVL1L2VV Bezug genommen. Einige Partikel von mit pSXBPVL1L2VV infizierten CON/BPV-Zellen haben dichte Elektronenkerne (Einfügung).
In 15B wird auf pSXBPVL1VV Bezug genommen. Ein kontaminierendes Vacciniavirus ist in (A) mit „V" bezeichnet. Die Skalenbalken stellen 50 nm dar. Die Zellen wurden zwei Tage nach der Infizierung geerntet, mit PBS gewaschen, durch Einfrieren und Auftauen dreimal lysiert und in PBS beschallt. Mittels einer langsamen Zentrifugation wurden Zellbruchstücke entfernt, und die Überstände wurden auf einen 20 (Gew.)%igen Sucrosepolster geschichtet und 2 Stunden lang bei 100.000 × g zentrifugiert. Die Pellets wurden in PBS resuspendiert und nach negativer Einfärbung mit 1 (Gew.)%iger Phosphorwolframsäure (pH 7,0) unter einem JEOL 1200EX-Elektronenmikroskop analysiert.
Da das Verhältnis zwischen L1- und L2-Proteinen in authentischen BPV1-Partikeln ungefähr 5:1 ist (Pfister, H. & Fuchs, E., in „Papillomaviruses and Human Disease" (Hgb. Syrjanen, K. Gissman, L & Koss, L.G.) Band 1-18 (Springer-Verlag, Berlin, 1987)), verwendeten wir für unser doppelt rekombiniertes VV einen starken natürlichen Promotor für das L1-Gen und einen schwachen synthetischen Promotor für das L2-Gen (13C), und das resultierende Verhältnis zwischen L1 mRNA und L2 mRNA war bei einem Northern-Blot aus rVV-infizierten CV-1-Zellen ungefähr 10:1. Mit diesem rVV infizierte CV-1-Zellen exprimierten das BPV L1-Protein (14A) und L2 mRNA (14B), und viele ikosaederförmige virusartige 50 nm-Partikel von augenscheinlich authentischer Morphologie (15a) konnten aus den infizierten Zellen herausgesäubert werden. Unsere vorhergehende Arbeit mit HPV16 hatte gezeigt, dass sowohl L1- als auch L2-Proteine für den Zusammenschluss virusartiger HPV16-Partikel erforderlich waren, wie obenstehend beschrieben, was der Beobachtung widerspricht, dass sich virusartige Partikel hinsichtlich des Parvovirus (Kajigaya et al., 1991 DNAS 4646-4650), des Blauzungenvirus (Loudon et al., 1991 Virology 182, 793-801) und des Polyomavirus (Salunke et al., 1986, Cell 46, 895-904) in Zellen zusammenschließen, wenn das Hauptcapsidprotein allein als rekombiniertes Protein exprimiert wird. Wir stellten daher einen VV-Rekombinanten für BPV1 L1 her (13C) und beobachteten, dass bei Infizierung von CV-1-Zellen mit diesem VV virusartige Partikel herausgesäubert werden konnten, die eine ähnliche Morphologie hatten wie jene, die mit dem doppelt rekombinierten L1- und L2-VV erhalten wurden (15b). Ähnliche leere ikosaederförmige Virione wurden nach der Infizierung von CV-1-Zellen mit der VV-Rekombinanten für die L1-Proteine von HPV6 oder HPV11 erzielt. Das Fehlen eines morphologisch authentischen PV-Virions in mit HPV16L1 und L2rVV infizierten Zellen und das Fehlen von PV-Virionen, wie bei HPV16-infiziertem Gewebe mit Hilfe der Elektronenmikroskopie zu sehen (Schneider (1987) „Papillomaviruses and Human Disease", Band 19-39, Springer Verlag Berlin), legen nahe, dass HPV16 im Gegensatz zu anderen PVs bezüglich der Viruscapsidformation fehlerhaft sein kann.
In der Einfügung der 15a ist eine geringe Anzahl virusartiger Partikel von mit VPV1 L1/L2 rVV infizierten Zellen dargestellt.
Die Klonierungsstrategie für HPV11L1/L2 und HPV6bL1/L2 doppelt exprimierende, rekombinierte Vacciniaviren ist untenstehend beschrieben:
Für HPV11L1:
5'CAGATCTCAGATGTGGCGGCCTAGCGACAGCACAGTATATGTGCC
5'CGGGAATTCGTGTAACAGGACACACATAATAATTGTTTATTGCACAAAA
Das PCR-Produkt wurde durch BgIII/EcoRI aufgeschlossen und unter der Kontrolle eines 4b-Promotors in RK19 kloniert. Die Promotor/11L1-Sequenz wurde danach in die durch Klenow stumpf gemachte pSX3 BamHI-Stelle kloniert. Das resultierende Plasmid war pSX11L1.
Für HPV11L2:
5'GCGGATCCATGAAACCTAGGGCACGCAGACGTAAACGTGCG
5'CGCCCGGGCTAGGCCGCCACATCTGTAAAAAATAAGGG
Das Bam/HI/Smal-aufgeschlossene PCR-Fragment wurde unter einem synthetischen späten 28k-Promotor in p480 kloniert. Danach wurde das Promotor/11L2-Fragment auf pSX11L1 übertragen. Das doppelt rekombinierte, 11L1/L2-exprimierende Plasmid wurde pSX11L1/L2 genannt.
Für HPV 6-b L1:
5'CGCCCGGGTTACCTTTTAGTTTTGGCGCGCTTACGTTTAGG
5'GCGGATCCAGATGTGGCGGCCTAGFCGACAGCACAGTATATG
Das PCR-Produkt wurde durch BamHI/SmaI geschnitten und unter der Kontrolle eines 4b-Promotors in RK19 kloniert. Der Promotor/6L1 wurde danach zwecks Erzeugung von pSX6L1 in pSX3 kloniert.
Für HPV6L2:
Das HPV6L2 wurde durch AccI/XbaI (4422-5903) aus dem 6b-Genom isoliert. Das Fragment wurde durch Klenow stumpf gemacht und in p480 eingefügt. Der synthetische 28k-Promotor plus 6bL2 wurde in pSX6L1 kloniert, um das doppelt rekombinierte Plasmid pSX6L1/L2 zu bilden.
Danach infizierten die Plasmide pSX11L1 und pSX11L1/L2 eine Wirtszelle (z.B. CV1-Zellen oder C127-Zellen), um VV pSX11Ll und VV pSX11L1/L2 zu erzeugen, die nach der Transfektion einer mit dem Wildtyp-Vacciniavirus infizierten Wirtszelle VLPs bildeten, welche das L1-Protein (abgeleitet von VV pSX11L1) und das L1- und das L2-Protein (abgeleitet von VV pSX11L1/L2) enthielten. In ähnlicher Weise produzierten VV pSX6L1 und VV pSX6L1/L2 nach der Transfektion einer Wirtszelle VLPs, die HPV6b L1 enthielten, und VLPs, die HPV6b L1 und HPV6b L2 enthielten.
Es ist auch zu erkennen, dass die Erfindung in ihrem Umfang Viren einschließt, welche für die Papillomavirus-Capsidproteine L1 und L2 doppelt rekombiniert sind, sowie rekombinierte Viren, welche das Papillomavirus-Capsidprotein L1 enthalten.
Weiters ist zu erkennen, dass die Erfindung in ihrem Umfang ein Verfahren zur Diagnose einer Papillomavirusinfektion mittels ELISA einschließt, und zwar einschließlich des Schritts der Detektion von VLP-Partikeln, welche die Proteine L1 und L2 enthalten.
TABELLE 1 Überlappende 15 AA-Peptide aus der vorhergesagten Sequenz des HPV16 L1-Proteines
Die Sequenz jedes L1-Peptids ist unter Anwendung des Einzelbuchstabencodes angegeben. Die Position jedes Peptids innerhalb des HPV16 L1-Proteins ist angegeben, wobei die Position 1 dem N-terminalen Methionin zugeordnet ist. Das kurze C-terminale Peptid (Nr. 53) wurde für diese Versuche nicht eingesetzt. Tabelle 2

* Die Werte sind OD 415-Einheiten und sind als mittlere ± 1-Standardabweichung angegeben.

Claims

Verfahren zum Herstellen von Papillomavirus-virusartigen Partikeln (VLPs), umfassend den Schritt: (i) Herstellen von VLPs in einer geeigneten Wirtszelle, die mit einem oder Mehreren rekombinaten DNA-Molekülen transfiziert worden ist, von denen jedes für Papillomavirus L1-Protein oder eine Kombination von Papillomavirus L1-Protein und Papillomavirus L2-Protein kodiert, indem das L1-Protein oder die Kombination von L1- und L2-Protein exprimiert wird: wobei das Papillomavirus HPV18 ist.
Verfahren nach Anspruch 1, weiterhin umfassend den Schritt: (ii) Erhalten von VLPs aus den transfizierten Zellen.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die DNA-Moleküle, die für das L1- und L2-Protein kodieren, in demselben DNA-Molekül enthalten sind.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die DNA-Moleküle, die für das L1- und L2-Protein kodieren, in verschiedenen rekombinanten DNA-Molekülen enthalten sind.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Wirtszelle in Schritt (i) unter Verwendung eines rekombinanten Virus transfiziert wurde, enthaltend besagtes eine oder mehrere rekombinante DNA-Moleküle.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das rekombinante Virus durch Infizieren einer Wirtszelle, die bereits mit einem Wildtyp-Virus infiziert war, unter Verwendung eines primären Plasmids produziert wurde, enthaltend das (die) rekombinante(n) DNA-Molekül(e).
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das primäre Plasmid das (die) rekombinante(n) DNA-Molekül(e) enthält, verknüpft mit einem Promoter, um die Expression der L1- oder L1- und L2-Proteine in Schritt (i) zu verstärken.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei vor der Bildung des primären Plasmids ein Gen, das für das L1- oder L2-Protein kodiert, in ein sekundäres Plasmid eingebaut wurde, enthaltend den Promoter, vor der Bildung des primären Plasmids.
Verfahren nach einem der Ansprüche 6-8, wobei die Wirtszelle, die mit dem Wildtyp-Virus infiziert war, mit sowohl dem primären Plasmid, das das rekombinante DNA-Molekül enthält, das für L1-Protein kodiert, als auch dem primären Plasmid transfiziert wurde, das darin ein weiteres rekombinantes DNA-Molekül eingebaut hat, das für L2-Protein kodiert, um ein doppelt rekombinantes Expressionsplasmid zu bilden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5-9, wobei das rekombinante Virus aus Baculovirus stammt, welches eine Insektenzelle infiziert, wie etwa Spodoptera frugiperda.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5-9, wobei das rekombinante Virus aus Vacciniavirus stammt.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei das rekombinante DNA-Molekül ein L1-Gen enthält, das sich stromab von einem Vaccinia 4b-Promoter befindet.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Wirtszelle eine eukaryotische Zelle ist.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die eukaryotische Zelle ausgewählt ist aus einer Hefezelle, Insektenzelle oder Säugetierzelle.
VLPs, erhältlich durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1-14.
Vakzin, umfassend VLPs, erhältlich durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1-14.
Vakzin nach Anspruch 16, weiterhin umfassend in Adjuvans.