CN101010099B - 口服疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明的课题是提供以低价能够大量供应的对人乳头状瘤病毒(HPV)16型有效的口服疫苗。所采用的口服用人乳头状瘤病毒疫苗的特征在于，由在菌体内蓄积了表达的人乳头状瘤病毒的抗原蛋白的转化体形成，所述转化体由将编码所述蛋白的基因导入至非病原性裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)宿主并培养所得转化体获得。

Description

口服疫苗

技术领域

本发明涉及对人乳头状瘤病毒(human papilloma virus：以下有时简称为“HPV”)有效的口服疫苗。

背景技术

HPV是小型、没有被膜的二十面体DNA病毒。该病毒基因组的开放读码框(ORF)被称为E1～E7以及L1和L2，这里的“E”表示早期，“L”表示晚期。L1和L2编码病毒衣壳蛋白。早期(E)基因与病毒复制和细胞转化等功能有关。L1蛋白是主要的衣壳蛋白，当用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行测定时，具有55～60kDa的分子量。L2蛋白是次要的衣壳蛋白，同样具有55～60kDa的推定分子量以及75～100kDa的表观分子量。

在发达国家，由宫颈癌造成的死亡率近年来已逐步减少，但宫颈癌是全世界女性第5大主要由恶性肿瘤致死的疾病，其发生率位于第2位。由性行为传染的HPV的某种特定类型是宫颈癌最重要的危险因子。最近的报道显示，30～50％的初次性交的年轻女性的宫颈部感染有HPV。令人震惊的是，宫颈部的HPV感染的大部分是可能诱发癌症的高危险型。HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、67以及68型被认为是高危险型，可能还包括其它的一些类型。

令年轻女性意外的HPV感染的高度流行表明为了对抗宫颈癌而致力于预防HPV感染症的教育以及社会的健康计划并不十分有效。特别是对不发达国家的女性和没有接受子宫癌检查的年轻女性，为了防止发生宫颈癌的发生，应该优先考虑高危险型HPV感染的预防。从费用效果的方面来考虑，目前采用的细胞学筛选法(子宫癌检查)以及癌症发生后进行的治疗并不能说为最佳选择。通过在全国使用针对高危险型HPV的预防疫苗，可以显著降低宫颈癌的发病率。据估计，仅通过HPV16的疫苗就可以使宫颈癌减半。

有报道称，在HPV疫苗的开发中，昆虫细胞系统可以高水平产生HPV11 L1蛋白，诱导了病毒样颗粒的装配(以下，有时简称为“VLPs”)(非专利文献1)。另外，也有报道称，在该昆虫细胞系统中成功合成了HPV16-VLPs(非专利文献2)。

之后，我们成功地在裂殖酵母的粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe，以下有时简称为“S.pombe”)中制造出由HPV6及HPV16诱导的VLPs(非专利文献3)。由裂殖酵母产生的VLPs虽然比由昆虫细胞系统产生的少，但是使用裂殖酵母的表达系统可以产生大规模的病毒样颗粒(以下，有时简称为“VLP”)，具有对人使用也安全的优点。

Koutsky等首先报道了，通过HPV16-VLP疫苗的非口服(注射)给药，可以100％预防女性的HPV16感染(非专利文献4)。

但是遗憾的是，注射用HPV16-VLP疫苗由于生产和保存需要高端技术以及特别的设备，因此成本高。另外，为了维持效果而必须反复注射给予疫苗，这成为实施的限制，再者，在受过训练的医疗人员的数量有限的不发达国家难以实施。另外，也有报道显示，注射给予VLP时，在粘膜免疫中起主要作用的分泌型IgA的诱导性缺乏(非专利文献5)。粘膜相关淋巴样组织(mucosa-associated lymphoid tissue：MALT)虽然是存在于呼吸器官及消化器官的器官系统中的免疫组织，但是通过免疫这些部位，可以预防HPV等感染阴道和子宫的粘膜上皮的病毒的感染。Balmelli等通过HPV16-VLP的鼻内给药，成功地在阴道内诱导出中和HPV16的粘膜抗体(非专利文献6)。

但是，鼻内给药用疫苗需要较大量的精制HPV-VLP制剂，在这方面存在与注射疫苗相同的问题。因此，尝试了通过口服用人乳头状瘤病毒疫苗(以下，有时简称为“口服HPV疫苗”)刺激与消化器官相关的淋巴样组织(肠相关的淋巴样组织(gut-associated lymphoid tissue：GALT))，诱导强的阴道粘膜免疫。两个课题组分别在烟草以及土豆中表达了各种HPV11(非专利文献7)及HPV16(非专利文献8)的L1基因，生产出口服HPV疫苗。

专利文献1中揭示了HPV的病毒样颗粒(HPV-VLP)的精制方法，专利文献2～4中揭示了作为HPV的疫苗制剂使用杆状病毒表达系统的技术方案，专利文献5中揭示了使用昆虫细胞表达系统的技术方案。另外，也揭示有与HPV相关的免疫疗法用的核酸疫苗(专利文献6)。

另外，还揭示有使用微生物作为非疫苗原性的治疗用递送系为有效成分的技术方案(专利文献7)。

【专利文献1】日本专利特表2003-520188号公报

【专利文献2】日本专利特表2001-519161号公报

【专利文献3】日本专利特表2002-516291号公报

【专利文献4】日本专利特表2002-510976号公报

【专利文献5】日本专利特开2004-269号公报

【专利文献6】日本专利特开2004-121263号公报

【专利文献7】日本专利特表平10-506791号公报

【非专利文献1】Rose RC等，J Virol.1993；67：1936-44.

【非专利文献2】Kirnbauer R等，J Virol.1993；67：6929-36.9

【非专利文献3】Sasagawa T等，Virology.1995；206：126-35.

【非专利文献4】Koutsky LA等，N Engl J Med.2002；347：1645-51.

【非专利文献5】Hagensee ME等，Virology 1995；206：174-82.

【非专利文献6】Balmelli C等，J Virol 1998；72：8220-9.

【非专利文献7】Warzecha H等，J Virol.2003；77：8702-11.

【非专利文献8】Biemelt S等，J Virol.2003；77：9211-20.

发明的揭示

本发明的课题是提供对HPV有效的，可以低价大量供应的口服HPV疫苗

为了解决上述课题，本发明人进行了研究，探讨了表达HPV相关蛋白的基因重组裂殖酵母是否可以作为疫苗使用，完成了本发明。

即，本发明具有以下特征。

1.口服HPV疫苗，其特征在于，由在菌体内蓄积了表达的HPV的抗原蛋白的转化体形成，所述转化体由将编码所述蛋白的基因导入至非病原性裂殖酵母宿主并培养所得转化体获得。

2.如上述1所述的疫苗，其特征在于，非病原性裂殖酵母宿主为S.pombe。

3.如上述1或2所述的疫苗，其特征在于，人乳头状瘤病毒为人乳头状瘤病毒16型(HPV16)。

4.如权利要求1～3中任一项所述的疫苗，其特征在于，编码人乳头状瘤病毒的抗原蛋白的基因为编码人乳头状瘤病毒衣壳蛋白的基因。

5.如上述4所述的基因，其特征在于，人乳头状瘤病毒衣壳蛋白为L1蛋白。

6.如上述4或5所述的疫苗，其特征在于，人乳头状瘤病毒衣壳蛋白为人乳头状瘤病毒16型的L1蛋白(HPV16-L1)。

7.如权利要求4～6中任一项所述的疫苗，其特征在于，在菌体内蓄积的蛋白形成由该蛋白构成的病毒样颗粒。

8.如上述1～7中任一项所述的疫苗，其特征在于，疫苗来自冷冻干燥菌体。

已经确认，通过给予本发明的口服HPV疫苗，特别是口服HPV16疫苗的给药以及HPV-VLP的经鼻给药，可以诱导小鼠的血清IgG、阴道IgG以及阴道IgA。也确认了所诱导的所有抗体均对HPV-VLP抗原有强反应性。由此可知，该口服HPV16疫苗可以作为针对HPV16的预防疫苗。

附图的简单说明

【图1A】显示冷冻干燥酵母在胃中的消化程度。(实验例1)

【图1B】显示冷冻干燥酵母在腹腔中的消化程度。(实验例1)

【图1C】显示冷冻干燥酵母在肠中的消化程度。(实验例1)

【图2】显示给予各种HPV16疫苗时的各种抗体的诱导。(实验例2)

【图3】显示给予各种HPV16疫苗之后，鼻内给予HPV16-VLP时的各种抗体的诱导。(实验例3)

【图4】显示给予各种HPV16疫苗以及鼻内给予HPV16-VLP之后被诱导的抗体的性状。(实验例5)

【图5】显示给予各种HPV16疫苗以及鼻内给予HPV16-VLP之后被诱导的抗体的性状。(实验例5)

【符号的说明】

□对变性HPV16-L1抗原的反应(图4及图5)

■对HPV16-VLP抗原的反应(图4及图5)

具体实施方式

本发明提供在菌体内蓄积了表达的HPV的抗原蛋白的转化体作为口服HPV疫苗，所述转化体通过培养导入了编码上述蛋白的基因所得的转化体获得。

本发明中，导入了编码HPV的抗原蛋白的基因的转化体的宿主为非病原性裂殖酵母，更具体为裂殖酵母S.pombe。

本发明的“HPV的抗原蛋白”特指HPV病毒衣壳蛋白，较好为L1。本发明的HPV优选对于宫颈癌为高危险型的HPV，更具体为HPV16。

本发明的以S.pombe作为宿主、用于导入编码HPV的抗原蛋白的基因的诱导表达载体，只要可以导入外源基因进行构建、适用S.pombe即可，没有特别的限定。可以使用例如在日本专利特开平7-163373或者日本专利特开平11-192094中记载的多克隆载体等。例如，如果在硫胺素抑制启动子控制下使用导入了HPV16-L1基因的载体，可以通过该基因重组技术合成病毒样片断(非专利文献3)。通过例如蛋白质印迹分析法可以确认所得病毒样断片含有55kDa的L1蛋白。

本发明的“在菌体内蓄积了HPV的抗原蛋白的转化体”只要是在非病原性裂殖酵母中将HPV的抗原蛋白蓄积至菌体内的转化体即可，没有特别的限定。具体来说，为了使通过上述转化体(以下，称为“基因重组S.pombe”)表达的HPV的抗原蛋白在菌体内蓄积，可以使用适合的公知的培养基及条件，优选使用YPD培养基、在23～37℃培养基因重组S.pombe 6～192小时。为了口服，可以在上述培养之后，将含有基因重组S.pombe的培养液在适当的条件下离心分离，收集沉淀而得到。离心分离，可以在0～50℃、1～60分钟、加速度500～30000g的条件下进行。

将上述经离心分离收集的基因重组S.pombe称为酵母颗粒，可以作为本发明的“在菌体内蓄积了HPV的抗原蛋白的转化体”使用。另外，可以根据需要对该酵母颗粒实施冷冻干燥处理等适当的处理，经这样的处理的酵母颗粒也可以称为本发明的“在菌体内蓄积了HPV的抗原蛋白的转化体”。冷冻干燥处理只要是通常可以使S.pombe细胞冷冻干燥的条件即可，没有特别的限定，可以例如最高架温(日文：最大棚温度)为-20℃的条件下处理一夜。本发明的口服HPV疫苗含有如此所得的在菌体内蓄积了HPV的抗原蛋白的转化体。

经口免疫与其它预防接种途径相比具有若干优点。例如，口服疫苗较容易给药，接种疫苗者比较容易接受。另外，与制成注射用制剂的疫苗相比，口服疫苗即使有效成分的纯度低也无妨，因此可以将制造成本控制在较低程度。

将本发明的口服HPV疫苗制成制剂使用时，可以包含医药上可以接受的载体、稀释剂、佐剂及/或缓冲液等的1种以上的附加成分。另外，可以使本发明的口服HPV疫苗含在所谓的食品等中进行使用。作为佐剂，可以使用公知的佐剂，例如可以使用从大肠菌中诱导的粘膜佐剂LT(R192G)。

本发明的口服HPV疫苗的给药可以在每次以酵母(湿重量)计10～500mg/kg、优选为20～200mg/kg的范围内进行选择。另外，如果用HPV16-L1蛋白量进行换算，可以在0.05～5mg/kg、优选为0.1～2mg/kg的范围内进行选择来给药。该口服HPV疫苗可以单次给药，也可以多次给药。

本发明的口服HPV疫苗被认为可以作为针对HPV16的预防疫苗。另外，本发明的口服HPV疫苗的给药也可以与以往公知的注射用HPV疫苗及/或鼻粘膜给药用HPV疫苗的通常使用方法结合，搭配本发明的口服HPV疫苗。例如，可以与以往公知的疫苗并用作为“并用疫苗”来使用。另外，也可以作为用于维持暂时诱导出的抗体价的“追加疫苗”来使用。

实施例

以下，说明本发明的实施例和比较例，本实施例是以辅助再现本发明为目的而显示其一实施方式的示例，本实施例并不限定本发明的范围或限制事项。

(实施例1)HPV16-L1蛋白表达基因重组S.pombe菌株的构建

根据非专利文献3的方法，制成基因重组S.pombe。为了增加L1基因的表达量，在新载体pTL2M(日本专利特开平7-163373)中导入HPV16-L1基因(B27；野生型HPV16)。在2L的YPD培养基中培养该基因重组S.pombe，使之表达HPV16-L1蛋白。通过蛋白质印迹分析法，确认该基因重组S.pombe(pTL2HPV16-L1)高水平表达55kDa的L1蛋白。用电子显微镜观察所得的蛋白，结果确认形成病毒样颗粒。

另外，每个酵母菌体的总蛋白表达量，相对单位酵母湿重为约10％，相对冷冻干燥酵母的重量为约50％。另外，L1蛋白的量相对表达的全部蛋白为5～10％。

(实施例2)用于疫苗的灭活冷冻干燥酵母制剂

在2L的YPD培养基中培养基因重组S.pombe之后，在4℃下以2000g离心分离10分钟来进行收集。将离心分离所得的颗粒用磷酸缓冲液(PBS)进行清洗，在PBS中再悬浮，使之呈150mg湿重/ml。将再悬浮的S.pombe在最高架温-20℃的条件下冷冻干燥一夜。为了将经冷冻干燥的基因重组S.pombe在后述的实验中用作口服疫苗，将其密封在塑料小管中，在4℃下保存直到使用。方便起见，将该口服疫苗称为“HPV16-L1酵母”。

将经冷冻干燥而得的HPV16-L1酵母作为口服疫苗使用时，为了将该HPV16-L1酵母灭活，将其在10倍量以上容量的70％乙醇溶液中再悬浮，在4℃加温30分钟，之后过滤干燥再使用。另外，口服的其它冷冻干燥S.pombe也在使用时进行同样的乙醇处理后再使用。另外，后述的没有进行冷冻干燥的“新鲜生酵母”在口服时也进行同样的乙醇处理后再使用。

(实施例3)用于考察酵母在小鼠消化器官中的消化的疫苗

与实施例1的方法同样操作，制成可以表达红的荧光发光蛋白(RFP)的基因重组S.pombe。通过与上述相同的方法培养该基因重组S.pombe，使之表达上述的2中蛋白。培养后，在4℃以2000g进行离心分离10分钟，收集酵母颗粒。

(实施例4)佐剂

将按照Curr Top Microbiol Immunol 1999；236：215-36中记载的方法提供的大肠杆菌(Escherichia coli)的热不稳定的毒素LT(R192G)作为粘膜佐剂使用。将粉末状的佐剂用PBS悬浮，在-30℃中保存直到使用。

(比较例1)鼻内免疫用HPV16-VLP的精制

由实施例1所得的pTL2-HPV16-L1表达基因重组S.pombe，通过采用改良法的氯化铯梯度(CsCl)超离心分离法(Giga-Hama Y等Biotechnology(N Y).1994；12：400-4.)，精制HPV16-VLP蛋白。

在4℃以2000g进行离心分离5分钟，将细胞在50mM的磷酸钾缓冲液[含有20mM乙二胺四乙酸(EDTA)的50mM的KH₂PO₄(pH6.5)]中再悬浮，进行冰冷。再次离心分离之后，将酵母颗粒在10ml的KKC缓冲液[含有5mg/ml Novozyme的20mM的KPO₄(pH6.5)，800mM的KCl，0.1mM的CaCl₂，1.5mM的MgCl₂]中再悬浮，在32℃加温30分钟，消化酵母的细胞壁之后，在60W下进行超声处理1分钟。在4℃以7000g进行离心分离10分钟，回收细胞提取物。将颗粒用10ml含有0.5％表面活性剂(NP-40)的VLP缓冲液(10mM的HEPES，10mM的KCl(pH7.0))再悬浮，再如上所述温和地进行超声处理。

将收集的上清浮于含有40％蔗糖(sucrose)的VLP缓冲液上，再使用Beckman SW28旋转器(Beckman Coulter公司制)，在4℃以27000g进行离心分离2小时。将颗粒在VLP缓冲液中再悬浮。在用27％(wt/wt)CsCl平衡的VLP缓冲液内，使用SW28旋转器，在4℃以27000g进行离心分离20小时。将适当的离分用VLP缓冲液稀释至1.29g/ml的密度，再使用SW28旋转器，在4℃以27000g进行离心分离2.5小时。

将颗粒用VLP缓冲液再悬浮，在-30℃中保存。

对于HPV16-VLP蛋白的装配，使用在结构上具有独立的抗原决定簇的2种HPV16-单克隆纳米抗体Camvir-5和Camvir-6(Cambridg大学的Margaret Stanley提供)，通过酶固相免疫测定法(ELISA)来确认。

该HPV16-VLP蛋白用于鼻内免疫。方便起见，将该经鼻给药疫苗称为“HPV16-VLP”。

(实验例1)酵母在小鼠消化器官中的消化

使出生9周的4只BALB/c小鼠禁食12小时，以1小时的间隔给予6次20mg(湿重量)由实施例3所得的表达荧光发光蛋白(RFP)的新鲜生酵母或者经冷冻干燥的酵母。末次给药后，解剖小鼠考察酵母的消化。截取小鼠的消化器官，放置在载玻片上制成标本。使用Axiovert S-100显微镜(Carl Zeiss公司制、德国)观察各载玻片上的荧光性酵母细胞，利用富士3CCD照相机(富士FILM公司制)进行拍摄。

结果，在大部分的消化管道可见新鲜生酵母细胞，并经粪便排泄，由此认为其没有被消化。

与此相对，冷冻干燥酵母细胞在胃(图1A)或空肠(图1B)中未被分解，酵母细胞的数量在从回肠至大肠之间减少，在直肠仅确认有极少数(图1C)。这提示，冷冻干燥酵母细胞在肠内的存在消化器官相关淋巴样组织(GALT)的小肠部位被分解消化。

(实验例2)口服疫苗“HPV16-L1酵母”的抗体生成能力

使用出生后9周的雌性BALB/c小鼠。使之禁食12小时之后，给予所有小鼠在PBS中悬浮的冷冻干燥酵母。之后，分成如表1所述的6个组，以4周为间隔给予下述疫苗，考察各小鼠的抗体生成能力。组1为阴性对照，组2为阳性对照。给药量为湿重。

表1

经各疫苗免疫后，从各小鼠得到血清样本和阴道样本。血清样本从小鼠的尾部采血获得，阴道样本利用微量吸管用100μl的PBS清洗阴道而获得。为了避免小鼠的发情周期对抗体生成的影响，间隔5日收集阴道样本2次，将2个样本混合用于分析。在最初的经口免疫的数日之前以及免疫后4周期间收集样本。为了避免将反复冻结融解，将所有样本分装，在-30℃保存至使用。

3种免疫后，通过ELISA评价HPV16特异抗体(IgG及IgA)的水平(图2)

1)ELISA

将通过Rose的方法(J Virol.1993；67：1936-44.，J Gen Virol 1994；75：2445-9.)从昆虫细胞得到的精制HPV16-VLP蛋白作为HPV16-VLP抗原，用于ELISA。

为了检测IgG及IgA，将各HPV16-VLP抗原贴覆至100ng和300ng ELISA用板(NUNC Immunoplate Maxisorp；Nalgene Nunc International社制)，在PBS中于4℃放置一夜。

将贴覆后的板用PBST(PBS、0.1％Tween-20)清洗一次，与封闭缓冲液(含有3％白蛋白、0.5％FCS的PBST)在室温(RT；20-24℃)下放置1小时。接着进行的所有清洗均用PBST进行。

在抗体反应中，将1μl的血清样本或20μl的阴道样本与反应用缓冲液(含有1.5％牛白蛋白、0.25％FCS的PBST)混合，加入至ELISA板中，在室温下加温3小时。

清洗3次之后，将生物素化的抗小鼠IgA或IgG抗体(使用反应用缓冲液稀释至IgA为1∶1500、IgG为1∶1000)加入至板中，在室温下放置1小时。

清洗3次之后，将用PBST稀释至1∶5000的100μl的链霉亲和素-辣根联合试剂盒(DAKO公司制、德国)加入至板中，加温30分种。

清洗3次之后，将含有1片ABT[2，2’-连氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)](Sigma社制)的50mM的枸橼酸缓冲液(pH5.0，0.0075％的过氧化氢)100μl加入至板中。在室温下使之显色1小时之后，使用自动化板读取器(IemsReader MS；Labsystems公司制)在405/540nm波长测定浊度(OD)。

540nm处的OD值减去405nm的OD值，计算出最终的OD值。

2)评价方法

ELISA所得的血清中IgA及IgG抗体价的截断值为10只非免疫小鼠所得的血清及阴道样本的平均OD值加上标准偏差值×2.5所得的值。ELISA对各样本重复2次以上，评价其平均OD值。在各实验中含有阳性及阴性对照各2套，监测各分析间的离差进行实验。

对于阳性对照的小鼠，均确认显示高的OD值的血清IgG、阴道IgG及阴道IgA，但是未发现血清IgA的应答。

最终，对18只小鼠中的2只小鼠(11％)(组3中的No.7和组5中的No.14)进行2次免疫后，分别确认有弱的一过性血清IgG应答(图2A)。

与此相对照，实施口服疫苗给药的小鼠均没有观察到阴道IgG或IgA反应(图2B及C)。

(实验例3)由精制HPV16-VLP的鼻内给药而提高的免疫应答

对于阳性对照、阴性对照以及口服HPV16-L1酵母的所有小鼠，在末次免疫12周之后，鼻内给予微量的HPV16-VLP 1μg作为加强剂量。

将其结果示于表2和图3。

【表2】

诱导了抗体的小鼠的血清IgG以及阴道IgA抗体价

a野生型酵母，b HPV16-L1酵母，c不能检测

在阳性对照的全部3只(100％)以及口服给予疫苗的小鼠中的9只(50％)中，4周后发现血清IgG的阳性反应，但是在阴性对照中未发现(图3A)。对于阴道IgG，阳性对照的全部3只(100％)以及口服给予疫苗的小鼠中的6只(33％)显示阳性，阴性对照均不为阳性(图3B)。关于阴道IgA，阳性对照的全部3只(100％)以及口服给予疫苗的小鼠中的7只(39％)显示阳性，阴性对照均不为阳性(图3C)。

经微量HPV16-VLP进行经鼻加强剂量之后，仅口服酵母的阴性对照没有诱导出免疫抗体，与此相对，经口给予HPV16-L1酵母的小鼠显示出阳性免疫抗体反应。这提示，通过给予口服疫苗，可能已经存在对HPV16的特异性免疫应答。

(实验例4)基于HPV16-L1酵母的口服给药量以及佐剂的免疫应答的效果

在低剂量(50mg)与高剂量(150mg)给予HPV16-L1酵母的小鼠之间，抗体的阳性率没有差别。

在口服HPV16-L1酵母的小鼠中，同时给予用于增强抗体应答的粘膜佐剂LT(R192G)。给予佐剂的小鼠中没有发现严重的副作用。对于口服给予HPV16-L1酵母的组，在有佐剂与没有佐剂的组之间没有发现血清IgG应答的差别。另一方面，有佐剂的组与没有佐剂的组比较，其阴道IgG的阳性率上升了2倍，阴道IgA的阳性率上升了2.5倍。但是，在统计学上没有显著性差别。口服添加了佐剂的HPV16-L1酵母的小鼠的阴道IgA的OD值，与口服没有添加佐剂的HPV16-L1酵母的小鼠的OD值相比较，有略高的趋势(P＝0.085；Mann-Whitney测验)。这提示具有一些佐剂效果。

(实验例5)通过经口或经鼻给予疫苗所诱导的抗体的性状

考察了由HPV16-VLP或变性HPV16-L1蛋白覆盖的ELISA的抗体的反应性差别。

将含有HPV16-VLP的碳酸氢盐缓冲液(IgG用100ng，IgA用300ng)煮沸10分钟，作为ELISA的变性HPV16-L1抗原蛋白使用。以OD值比较对HPV16-VLP抗原或者变性HPV16-L1抗原的反应性。另外，连续稀释血清以及阴道洗浄液，确定免疫抗体价。

在以往的研究中，报道了可以识别HPV-VLPs的立体结构抗原决定簇的抗体具有中和病毒的能力。因此，考察了对HPV16-VLP抗原的反应性是否较变性HPV16-L1抗原诱导更强的抗体。

对于经鼻给予HPV16-VLP的2只小鼠(No.4和No.6)，在最初的经鼻免疫中与变性HPV16-L1抗原强烈地反应。但是，2次给药之后，诱导的血清IgG抗体对HPV16-VLP抗原的反应更强(图4A)。这认为是2次免疫之后从对HPV16的非特异性反应到特异性反应的血清转换(seroconversion)的结果(图4A)。

对于口服了HPV16-L1酵母的小鼠，经鼻加剂量免疫(No.12及No.22)之后，对HPV16-VLP抗原诱导出更强的应答(图4B)。

与此相对，对于口服了HPV16-L1酵母，并显示一过性阳性的2只小鼠，在加强剂量之后最终成为阴性，其中1只小鼠(No.7)对变性HPV16-L1抗原的反应更强，另一只小鼠(No.14)在整个实验期间对两个类型的HPV16-VLP抗原均显示了同等的反应(图4B)。

对于口服了HPV16-L1酵母的小鼠的阴道样本，有6只确认诱导了阴道IgG抗体(图5A)，有7只确认有阴道IgA抗体(图5B)。这些所有的抗体均对HPV16-VLP抗原的反应更强。

这显示，与血清IgG同样，HPV16-L1酵母口服疫苗还诱导出HPV16特异性阴道IgA及IgG抗体。仅通过口服冷冻干燥HPV16-L1酵母未能诱导抗HPV16抗体，但是如果在口服之后通过经鼻途径追加给予微量的HPV16-VLP，将在50％、33％以及39％的小鼠中分别诱导出血清IgG、阴道IgG及阴道IgA。另一方面，在阴性对照小鼠中，即使通过同样的经鼻加强剂量也没有诱导出抗HPV16抗体。我们认为通过经鼻给予的HPV16-VLP，可能将识别HPV16的记忆B细胞活化，增强了抗体生成。另外，此时诱导的全部抗体，对HPV16-VLP抗原较对变性HPV16-L1抗原的反应更强。这意味着这些抗体识别HPV16抗原的立体结构抗原决定簇，提示可能具有中和能力。

产业上利用的可能性

如上述说明，确认了本发明的HPV16-L1酵母口服疫苗诱导中和抗体，可以发挥作为疫苗的功能。因此，可以提供较仅使用经鼻疫苗或者仅使用注射用疫苗，能够减轻患者痛苦的疫苗。另外，该口服疫苗不需要精制处理，因此能够以低价格提供大量的疫苗。本疫苗的利用方法有各种，最重要的目的是对没有抗体的人诱导HPV16抗体，也可以作为维持暂时诱导出的抗体价的追加疫苗来使用。

另外，在此引用在2004年9月10日提出申请的日本专利申请2004-263580号的说明书、权利要求书、附图以及摘要的全部内容，作为本发明的说明书的公开内容。

Claims (1)

1.口服用人乳头状瘤病毒疫苗，其特征在于，由在菌体内蓄积了表达的人乳头状瘤病毒的抗原蛋白的转化体形成，所述转化体由将编码所述蛋白的基因导入至非病原性裂殖酵母宿主并培养所得转化体获得，在菌体内蓄积的所述蛋白形成由该蛋白构成的病毒样颗粒，所述疫苗由冷冻干燥的菌体构成，

所述非病原性裂殖酵母宿主为粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)，所述人乳头状瘤病毒为人乳头状瘤病毒16型(HPV16)，编码人乳头状瘤病毒的抗原蛋白的基因为编码人乳头状瘤病毒衣壳蛋白的基因，所述人乳头状瘤病毒衣壳蛋白为L1蛋白。

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