CN111529701A - 一种口服后产生新型冠状病毒抗体的制剂及其制备方法 - Google Patents

一种口服后产生新型冠状病毒抗体的制剂及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111529701A
CN111529701A CN202010408158.8A CN202010408158A CN111529701A CN 111529701 A CN111529701 A CN 111529701A CN 202010408158 A CN202010408158 A CN 202010408158A CN 111529701 A CN111529701 A CN 111529701A
Authority
CN
China
Prior art keywords
covid
preparation
pcmv
strain
novel coronavirus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010408158.8A
Other languages
English (en)
Inventor
杨德志
毕力格
特格喜白音
特木其乐
陈沙娜
斯钦
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Inner Mongolia Autonomous Region International Mongolian Medical Hospital (institute Of Mongolian Medicine Inner Mongolia Autonomous Region)
Original Assignee
Inner Mongolia Autonomous Region International Mongolian Medical Hospital (institute Of Mongolian Medicine Inner Mongolia Autonomous Region)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Inner Mongolia Autonomous Region International Mongolian Medical Hospital (institute Of Mongolian Medicine Inner Mongolia Autonomous Region) filed Critical Inner Mongolia Autonomous Region International Mongolian Medical Hospital (institute Of Mongolian Medicine Inner Mongolia Autonomous Region)
Priority to CN202010408158.8A priority Critical patent/CN111529701A/zh
Publication of CN111529701A publication Critical patent/CN111529701A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/4841—Filling excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/4858—Organic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/522—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/523—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A61K2039/541—Mucosal route
    • A61K2039/542—Mucosal route oral/gastrointestinal
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20051—Methods of production or purification of viral material

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种口服后产生新型冠状病毒抗体的制剂及其制备方法。本发明以减毒沙门氏菌为载体传送DNA疫苗，通过口服肠溶胶囊有效到达肠道低毒感染送DNA疫苗到肠道内皮细胞，通过巨噬细胞吞噬细菌，表达特异性分子COVID‑19‑S，被免疫细胞识别，从而在哺乳动物(老鼠、人等哺乳动物体内)达到产生特异性的抗体中和COVID‑19‑S蛋白从而达到，免疫的效果。

Description

一种口服后产生新型冠状病毒抗体的制剂及其制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种口服后产生新型冠状病毒抗体的制剂及其制备方法。
背景技术
目前市场没有任何新型冠状病毒COVID-19的疫苗，目前防止感染的方法就是隔离，不能有效防止第二次、第三次等感染的爆发。疫苗是唯一可以防止大规模爆发的工具。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种口服后产生新型冠状病毒抗体的制剂及其制备方法。本发明以减毒沙门氏菌为载体传送DNA疫苗，通过口服肠溶胶囊有效到达肠道低毒感染送DNA 疫苗到肠道内皮细胞，通过巨噬细胞吞噬细菌，表达特异性分子COVID-19-S，被免疫细胞识别，从而在哺乳动物(老鼠、人等哺乳动物体内)达到产生特异性的抗体中和COVID-19-S蛋白从而达到，免疫的效果。
为达到上述技术效果，本发明的技术方案是：
一种口服后产生新型冠状病毒抗体的制剂，包括减毒菌体，减毒菌体内含有表达特异性分子COVID-19-S的DNA序列，DNA序列如SEQ NO.3所示。
进一步的改进，所述减毒菌体为减毒沙门氏菌，所述DNA序列负载在pCMV载体上。
进一步的改进，所述减毒菌体处于0号肠溶胶囊内，0号肠溶胶囊内填充有200μl30％甘油的PBS悬液。
进一步的改进，0号肠溶胶囊内的减毒菌体数为(0.1-10)×107个。
一种口服后产生新型冠状病毒抗体的制剂的制作方法，包括如下步骤：
步骤一、SEQ NO.1和SEQ NO.2所示的DNA序列作为引物，以pKD3为模板进行PCR获得片段,片段的序列如SEQ NO.4所示；片段用于进行同源交换；
步骤二、将带有pKD46质粒的野生型鼠伤寒沙门氏菌扩繁培养并制作L感受态细胞；
步骤三、将步骤一中的获得的片段导入L感受态细菌形成转化体；然后将转化体在含有浓度为50μg/mL的氯霉素的LB琼脂培养板上生长过夜，然后PCR检测得到阳性克隆的转化体，阳性克隆的转化体在42℃划单菌落培养去掉野生型鼠伤寒沙门氏菌内的pKD46质粒，然后向去掉pKD46质粒的野生型鼠伤寒沙门氏菌内的导入pCP20质粒获得无抗性ΔSTM1231基因突变菌株SD1231，即获得减毒菌体；
步骤四、将表达特异性分子COVID-19-S的DNA序列负载在pCMV质粒上，得到pCMV-COVID-19-S转化到菌株SD1231内获得阳性菌株即制得口服后产生新型冠状病毒抗体的菌株。
进一步的改进，所述步骤四中，将pCMV-COVID-19-S转化到菌株SD1231内，然后在加有浓度为12.5μg/mL的氨苄青霉素的LB液体培养基培养并筛选出pCMV-COVID-19-S转化到菌株SD1231内的阳性菌株。
进一步的改进，所述pCMV-COVID-19-S购自南京金斯瑞生物科技有限公司。
附图说明
图1为P1+P2的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。
图2为WISTA大鼠口服疫苗SVD1231-19-S后的血清抗体胶体金检测结果图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式并且结合附图对本发明的技术方案作具体说明。
实施例1
1.用引物P1，如SEQ No.1
(CGCTAGACTGTTCTTATTGTTAACACAAGGGAGAAGAGCATATGAATATCCTCCTTAG)和引物P2
(GCAGCGACAGCGGCAGAAAATGGCGAGCAAATTTATTCAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC)以pKD3为模板进行 PCR，获得长度为1091bp的PCR片段(图1)。用天根生化科技(北京)有限公司普通产物纯化试剂盒(货号DP204)进行纯化，用NanoDrop2000分光光度计测DNA浓度。
野生型鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium,LT2)带有pKD46质粒，在1mL的LB培。养基加终浓度为50μg/mL的氨苄青霉素培养过夜，30℃摇床，150r/min。第二天把过夜的培养产物1:100接种在50mL的SOB培养基带有终浓度为10mM阿拉伯糖和50μg/mL 的氨苄青霉素，接着在30℃摇床上150r/min，培养4小时。之后，12,000rpm离心收集细菌，丢弃上清；细菌用25mL的4℃预冷的灭菌去离子水重悬，12,000rpm离心收集细菌，丢弃上清，用20mL的15％甘油重悬，12,000rpm离心收集细菌，弃掉上清，细菌用0.6mL15％甘油重新悬浮，形成了感受态细菌，置于冰上(实验方法参考(Datsenko and Wanner 2000))。
2.第1步来源的PCR产物取3μg与第二步的80μL感受态细菌混合，在1mm电冲击杯子，用SCIENTZ-2C基因导入仪在1250V，25μF，800Ω导入。在37℃培养箱，在含有氯霉素的LB琼脂培养板上生长过夜。第二天看到了细菌克隆。细菌克隆用菌落PCR的方法检测到了阳性克隆(方法参考(Jarvinen,Laakso et al.2009))。每一个阳性的克隆在42℃划单菌落培养以便去掉细菌内残留的pKD46质粒。突变的细菌通过转化pCP20质粒，获得无抗性ΔSTM1231基因突变菌株命名为SD1231。
3.野生型鼠伤寒沙门氏菌和SD1231的口服毒力检测，分别给8只WISTA大鼠灌胃后观察30天。结果显示SD1231在108和109浓度为下都没有毒性(如表1)。
表1菌株SD1231对WISTA大鼠的口服毒性检测结果表(实验方法参考(Galan andCurtiss 1989))。
菌株 基因型 菌量 生存率 状态
野生型 Wild type 1×10<sup>8</sup> 0/8 全部死亡
SD1231 ΔSTM1231 1×10<sup>8</sup> 8/8 健康
野生型 Wild type 1×10<sup>9</sup> 0/8 全部死亡
SD1231 ΔSTM1231 1×10<sup>9</sup> 8/8 健康
4.pCMV-COVID-19-S(购买自南京金斯瑞生物科技有限公司)和对照质粒pCMV(购买自丰辉生物)转化到减毒突变体SD1231，获得ΔSTM1231带有pCMV-COVID-19-S的菌株我们命名为SVD1231-19-S，和带有对照质粒pCMV的菌株SDPCMV。
5.菌株SVD1231-19-S和菌株SDPCMV，10mLLB培养基加氨苄青霉素过夜培养，第二天 1:50接到500mL的LB培养基加氨苄青霉素(50μg/mL)继续培养4h，用30％甘油的PBS 悬浮，细菌浓度为0.5x107个。对照组，灌胃菌株SDPCMV，1x107菌，体积200μL，疫苗组，灌胃菌株SVD1231-19-S，1x107菌，体积200μL。分别灌胃后的第7天，第14天取血检测抗体。阳性率分别是66.7％和88.9％。(如表2)，我们用广州万孚生物技术股份有限公司出品的新型冠状病毒胶体金检测试剂盒检测(检测COVID-19的特异性总抗体IgM/IgG，只有C显示阴性，同时显示C和T阳性，显示T或者没有条带无效)(实验方法参考(Liu,Wu et al. 2005))。
表2疫苗SVD1231-19-S对WISTA大鼠的口服后抗体检测结果表。
Figure RE-GDA0002529187690000031
上述仅为本发明的一个具体导向实施方式，但本发明的设计构思并不局限于此，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应属于侵犯本发明的保护范围的行为。
序列表
<110> 内蒙古自治区国际蒙医医院（内蒙古自治区蒙医药研究所）
<120> 一种口服后产生新型冠状病毒抗体的制剂及其制备方法
<130> 2019.04.26
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
cgctagactg ttcttattgt taacacaagg gagaagagca tatgaatatc ctccttag 58
<210> 2
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
gcagcgacag cggcagaaaa tggcgagcaa atttattcag tgtaggctgg agctgcttc 59
<210> 3
<211> 3849
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
gaattctcta gagccaccat gttcgtgttt ctggtgctgc tgcctctggt gagctcccag 60
tgcgtgaacc tgaccacacg gacacagctg ccccctgcct acaccaacag cttcacaagg 120
ggcgtgtact accccgacaa ggtgtttaga tctagcgtgc tgcactccac acaggatctg 180
tttctgcctt tcttttctaa cgtgacctgg ttccacgcta tccacgtgtc cggcaccaac 240
ggaacaaaga ggttcgacaa cccagtgctg ccctttaacg atggcgtgta cttcgcctcc 300
accgagaagt ctaacatcat cagaggctgg atctttggaa ccacactgga cagcaagaca 360
cagtccctgc tgatcgtgaa caacgccacc aacgtggtca tcaaggtgtg cgagttccag 420
ttttgtaacg atccattcct gggcgtgtac taccacaaga acaacaagtc ttggatggag 480
agcgagtttc gcgtgtactc ctctgccaac aactgtacat ttgagtacgt gtcccagccc 540
ttcctgatgg acctggaggg caagcaggga aacttcaaga acctgcggga gttcgtgttt 600
aagaacatcg atggctactt taagatctac tccaagcaca ccccaatcaa cctggtgcgc 660
gacctgccac agggcttctc tgccctggag ccactggtgg atctgcccat cggaatcaac 720
atcaccaggt ttcagacact gctggccctg cacagaagct acctgacacc aggcgacagc 780
tcctctggat ggaccgctgg agctgctgcc tactacgtgg gctacctgca gccccggacc 840
ttcctgctga agtacaacga gaacggaacc atcacagacg ctgtggattg cgccctggac 900
cccctgtctg agaccaagtg tacactgaag agctttaccg tggagaaggg catctaccag 960
acaagcaact tccgggtgca gcctaccgag tccatcgtgc gctttcccaa catcacaaac 1020
ctgtgccctt ttggagaggt gttcaacgct acccgcttcg cctccgtgta cgcttggaac 1080
cggaagcgca tctccaactg cgtggccgac tactctgtgc tgtacaacag cgccagcttc 1140
agcaccttca agtgctacgg cgtgagccca acaaagctga acgacctgtg ctttaccaac 1200
gtgtacgctg attccttcgt gatcagggga gacgaggtgc gccagatcgc tcccggccag 1260
acaggaaaga tcgctgacta caactacaag ctgcctgacg atttcaccgg ctgcgtgatc 1320
gcctggaact ctaacaacct ggatagcaaa gtgggcggaa actacaacta cctgtacagg 1380
ctgtttagaa agtctaacct gaagccattc gagcgggaca tctccacaga gatctaccag 1440
gctggctcta ccccatgcaa cggagtggag ggcttcaact gttacttccc tctgcagagc 1500
tacggattcc agccaacaaa cggcgtggga taccagccct accgcgtggt ggtgctgtct 1560
tttgagctgc tgcacgctcc tgctacagtg tgcggaccaa agaagagcac caacctggtg 1620
aagaacaagt gcgtgaactt caactttaac ggactgaccg gcacaggagt gctgaccgag 1680
tctaacaaga agttcctgcc ttttcagcag ttcggccggg acatcgccga taccacagac 1740
gctgtgcgcg accctcagac cctggagatc ctggatatca caccatgctc cttcggcgga 1800
gtgtctgtga tcacaccagg aaccaacaca agcaaccagg tggccgtgct gtaccaggac 1860
gtgaactgta ccgaggtgcc cgtggctatc cacgccgatc agctgacccc tacatggagg 1920
gtgtactcta ccggcagcaa cgtgttccag acaagagccg gctgtctgat cggagctgag 1980
cacgtgaaca acagctacga gtgcgacatc cctatcggcg ccggaatctg tgcttcctac 2040
cagacccaga caaactcccc aaggagagcc aggtctgtgg ctagccagtc catcatcgcc 2100
tacaccatga gcctgggcgc cgagaactcc gtggcttact ccaacaactc tatcgctatc 2160
cctaccaact tcacaatctc cgtgaccaca gagatcctgc cagtgagcat gaccaagaca 2220
tccgtggact gcacaatgta catctgtgga gattccaccg agtgctctaa cctgctgctg 2280
cagtacggct ctttctgtac ccagctgaac agagccctga caggaatcgc tgtggagcag 2340
gacaagaaca cacaggaggt gttcgcccag gtgaagcaga tctacaagac cccacccatc 2400
aaggactttg gcggattcaa ctttagccag atcctgcccg atcctagcaa gccatccaag 2460
aggtctttta tcgaggacct gctgttcaac aaggtgaccc tggctgatgc cggcttcatc 2520
aagcagtacg gcgattgcct gggagacatc gctgccagag acctgatctg tgcccagaag 2580
tttaacggac tgaccgtgct gcctccactg ctgacagatg agatgatcgc tcagtacaca 2640
tctgctctgc tggccggcac catcacaagc ggatggacct tcggcgctgg agctgccctg 2700
cagatcccct ttgccatgca gatggcttac agattcaacg gcatcggagt gacccagaac 2760
gtgctgtacg agaaccagaa gctgatcgcc aaccagttta actccgctat cggcaagatc 2820
caggactctc tgagctccac agctagcgcc ctgggaaagc tgcaggatgt ggtgaaccag 2880
aacgctcagg ccctgaacac cctggtgaag cagctgtcta gcaacttcgg cgccatctcc 2940
tctgtgctga acgatatcct gagcaggctg gacaaggtgg aggctgaggt gcagatcgac 3000
aggctgatca caggaagact gcagtccctg cagacctacg tgacacagca gctgatcagg 3060
gctgctgaga tcagggcttc tgccaacctg gctgccacca agatgagcga gtgcgtgctg 3120
ggccagtcca agagagtgga cttttgtggc aagggatacc acctgatgag cttcccacag 3180
tccgcccctc acggagtggt gtttctgcac gtgacctacg tgccagctca ggagaagaac 3240
ttcaccacag ctcccgccat ctgccacgat ggcaaggccc actttcctcg ggagggcgtg 3300
ttcgtgagca acggaaccca ctggtttgtg acacagcgca acttctacga gccacagatc 3360
atcaccacag acaacacatt cgtgtccggc aactgtgacg tggtcatcgg aatcgtgaac 3420
aacaccgtgt acgatcctct gcagccagag ctggactctt ttaaggagga gctggataag 3480
tacttcaaga accacaccag ccctgacgtg gatctgggcg acatctctgg aatcaacgcc 3540
agcgtggtga acatccagaa ggagatcgac cggctgaacg aggtggctaa gaacctgaac 3600
gagtccctga tcgatctgca ggagctgggc aagtacgagc agtacatcaa gtggccctgg 3660
tacatctggc tgggcttcat cgccggactg atcgctatcg tgatggtgac catcatgctg 3720
tgctgtatga caagctgctg ttcctgcctg aagggctgct gttcttgtgg aagctgctgt 3780
aagtttgacg aggacgatag cgagcctgtg ctgaagggcg tgaagctgca ctacaccaag 3840
cttggatcc 3849
<210> 4
<211> 1091
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 4
gcagcgacag cggcagaaaa tggcgagcaa atttattcag tgtaggctgg agctgcttcg 60
aagttcctat actttctaga gaataggaac ttcggaatag gaacttcatt taaatggcgc 120
gccttacgcc ccgccctgcc actcatcgca gtactgttgt attcattaag catctgccga 180
catggaagcc atcacaaacg gcatgatgaa cctgaatcgc cagcggcatc agcaccttgt 240
cgccttgcgt ataatatttg cccatggtga aaacgggggc gaagaagttg tccatattgg 300
ccacgtttaa atcaaaactg gtgaaactca cccagggatt ggctgagacg aaaaacatat 360
tctcaataaa ccctttaggg aaataggcca ggttttcacc gtaacacgcc acatcttgcg 420
aatatatgtg tagaaactgc cggaaatcgt cgtggtattc actccagagc gatgaaaacg 480
tttcagtttg ctcatggaaa acggtgtaac aagggtgaac actatcccat atcaccagct 540
caccgtcttt cattgccata cgtaattccg gatgagcatt catcaggcgg gcaagaatgt 600
gaataaaggc cggataaaac ttgtgcttat ttttctttac ggtctttaaa aaggccgtaa 660
tatccagctg aacggtctgg ttataggtac attgagcaac tgactgaaat gcctcaaaat 720
gttctttacg atgccattgg gatatatcaa cggtggtata tccagtgatt tttttctcca 780
ttttagcttc cttagctcct gaaaatctcg acaactcaaa aaatacgccc ggtagtgatc 840
ttatttcatt atggtgaaag ttggaacctc ttacgtgccg atcaacgtct cattttcgcc 900
aaaagttggc ccagggcttc ccggtatcaa cagggacacc aggatttatt tattctgcga 960
agtgatcttc cgtcacaggt aggcgcgccg aagttcctat actttctaga gaataggaac 1020
ttcggaatag gaactaagga ggatattcat atgctcttct cccttgtgtt aacaataaga 1080
acagtctagc g 1091

Claims (7)

1.一种口服后产生新型冠状病毒抗体的制剂，其特征在于，包括减毒菌体，减毒菌体内含有表达特异性分子COVID-19-S的DNA序列，DNA序列如SEQ NO.3所示。
2.如权利要求1所述的口服后产生新型冠状病毒抗体的制剂，其特征在于，所述减毒菌体为减毒沙门氏菌，所述DNA序列负载在pCMV载体上。
3.如权利要求1所述的口服后产生新型冠状病毒抗体的制剂，其特征在于，所述减毒菌体处于0号肠溶胶囊内，0号肠溶胶囊内填充有200μl 30％甘油的PBS悬液。
4.如权利要求2所述的口服后产生新型冠状病毒抗体的制剂，其特征在于，0号肠溶胶囊内的减毒菌体数为(0.1-10)×107个。
5.一种口服后产生新型冠状病毒抗体的制剂的制作方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、SEQ NO.1和SEQ NO.2所示的DNA序列作为引物，以pKD3为模板进行PCR获得片段,片段的序列如SEQ NO.4所示；
步骤二、将带有pKD46质粒的野生型鼠伤寒沙门氏菌扩繁培养并制作L感受态细胞；
步骤三、将步骤一中的获得的片段导入L感受态细菌形成转化体；然后将转化体在含有浓度为50μg/mL的氯霉素的LB琼脂培养板上生长过夜，然后PCR检测得到阳性克隆的转化体，阳性克隆的转化体在42℃划单菌落培养去掉野生型鼠伤寒沙门氏菌内的pKD46质粒，然后向去掉pKD46质粒的野生型鼠伤寒沙门氏菌内的导入pCP20质粒获得无抗性ΔSTM1231基因突变菌株SD1231，即获得减毒菌体；
步骤四、将表达特异性分子COVID-19-S的DNA序列负载在pCMV质粒上，得到pCMV-COVID-19-S转化到菌株SD1231内获得阳性菌株即制得口服后产生新型冠状病毒抗体的菌株。
6.如权利要求5所述的口服后产生新型冠状病毒抗体的制剂的制作方法，其特征在于，所述步骤四中，将pCMV-COVID-19-S转化到菌株SD1231内，然后在加有浓度为12.5μg/mL的氨苄青霉素的LB液体培养基培养并筛选出pCMV-COVID-19-S转化到菌株SD1231内的阳性菌株。
7.如权利要求5所述的口服后产生新型冠状病毒抗体的制剂的制作方法，其特征在于，所述pCMV-COVID-19-S购自南京金斯瑞生物科技有限公司。
CN202010408158.8A 2020-05-14 2020-05-14 一种口服后产生新型冠状病毒抗体的制剂及其制备方法 Pending CN111529701A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010408158.8A CN111529701A (zh) 2020-05-14 2020-05-14 一种口服后产生新型冠状病毒抗体的制剂及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010408158.8A CN111529701A (zh) 2020-05-14 2020-05-14 一种口服后产生新型冠状病毒抗体的制剂及其制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111529701A true CN111529701A (zh) 2020-08-14

Family

ID=71970907

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010408158.8A Pending CN111529701A (zh) 2020-05-14 2020-05-14 一种口服后产生新型冠状病毒抗体的制剂及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111529701A (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112245578A (zh) * 2020-10-20 2021-01-22 王立良 一种covid-19病毒预防性疫苗及其制备方法
WO2022087855A1 (zh) * 2020-10-26 2022-05-05 江苏靶标生物医药研究所有限公司 一种基于减毒沙门氏菌可控分泌表达的新型冠状病毒疫苗及其制备方法和应用
WO2022087854A1 (zh) * 2020-10-26 2022-05-05 南京吉芮康生物科技研究院有限公司 一种减毒沙门氏菌分泌表达ntd结构域蛋白的新型冠状病毒疫苗抗原递呈系统及其应用
WO2022087856A1 (zh) * 2020-10-26 2022-05-05 南京吉芮康生物科技研究院有限公司 一种减毒沙门氏菌分泌表达rbd结构域蛋白的新型冠状病毒疫苗抗原递呈系统及其应用
CN114478715A (zh) * 2020-10-26 2022-05-13 南京吉芮康生物科技研究院有限公司 一种减毒沙门氏菌分泌表达s2结构域蛋白的新型冠状病毒疫苗递呈系统及其应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006028214A1 (ja) * 2004-09-10 2006-03-16 Asahi Glass Company, Limited 経口投与ワクチン
CN102154184A (zh) * 2011-03-15 2011-08-17 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 减毒沙门氏菌及其应用
CN102233131A (zh) * 2011-07-07 2011-11-09 贵州大学 基于减毒沙门氏菌为载体山羊痘口服疫苗及制备方法
CN106497855A (zh) * 2016-11-03 2017-03-15 扬州大学 一种肠炎沙门菌基因敲除减毒突变株及其制备与应用
CN110974950A (zh) * 2020-03-05 2020-04-10 广州恩宝生物医药科技有限公司 一种用于预防SARS-CoV-2感染的腺病毒载体疫苗
CN111088283A (zh) * 2020-03-20 2020-05-01 苏州奥特铭医药科技有限公司 mVSV病毒载体及其病毒载体疫苗、一种基于mVSV介导的新冠肺炎疫苗

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006028214A1 (ja) * 2004-09-10 2006-03-16 Asahi Glass Company, Limited 経口投与ワクチン
CN102154184A (zh) * 2011-03-15 2011-08-17 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 减毒沙门氏菌及其应用
CN102233131A (zh) * 2011-07-07 2011-11-09 贵州大学 基于减毒沙门氏菌为载体山羊痘口服疫苗及制备方法
CN106497855A (zh) * 2016-11-03 2017-03-15 扬州大学 一种肠炎沙门菌基因敲除减毒突变株及其制备与应用
CN110974950A (zh) * 2020-03-05 2020-04-10 广州恩宝生物医药科技有限公司 一种用于预防SARS-CoV-2感染的腺病毒载体疫苗
CN111088283A (zh) * 2020-03-20 2020-05-01 苏州奥特铭医药科技有限公司 mVSV病毒载体及其病毒载体疫苗、一种基于mVSV介导的新冠肺炎疫苗

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DAN ZHU等: "Oral delivery of SARS-CoV-2 DNA vaccines using attenuated Salmonella typhimurium as a carrier in rat", 《BIORXIV》 *
MADHUSUDANA GIRIJA SANAL等: "An oral live attenuated vaccine strategy against", 《RESEARCH IDEAS AND OUTCOMES》 *
MOHAMED I. HUSSEINY AND MICHAEL HENSEL*: "Rapid Method for the Construction of Salmonella enterica Serovar", 《INFECTION AND IMMUNITY》 *
姜平，李祥瑞编: "《现代疫苗设计原理》", 31 December 1999, 中国农业出版社 *
马全英等: "减毒沙门氏菌作为口服活疫苗载体的研究进展", 《贵州畜牧兽医》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112245578A (zh) * 2020-10-20 2021-01-22 王立良 一种covid-19病毒预防性疫苗及其制备方法
CN112245578B (zh) * 2020-10-20 2022-07-19 王立良 一种covid-19病毒预防性疫苗及其制备方法
WO2022087855A1 (zh) * 2020-10-26 2022-05-05 江苏靶标生物医药研究所有限公司 一种基于减毒沙门氏菌可控分泌表达的新型冠状病毒疫苗及其制备方法和应用
WO2022087854A1 (zh) * 2020-10-26 2022-05-05 南京吉芮康生物科技研究院有限公司 一种减毒沙门氏菌分泌表达ntd结构域蛋白的新型冠状病毒疫苗抗原递呈系统及其应用
WO2022087856A1 (zh) * 2020-10-26 2022-05-05 南京吉芮康生物科技研究院有限公司 一种减毒沙门氏菌分泌表达rbd结构域蛋白的新型冠状病毒疫苗抗原递呈系统及其应用
CN114480463A (zh) * 2020-10-26 2022-05-13 南京吉芮康生物科技研究院有限公司 一种减毒沙门氏菌分泌表达rbd结构域蛋白的新型冠状病毒疫苗抗原递呈系统及其应用
CN114478715A (zh) * 2020-10-26 2022-05-13 南京吉芮康生物科技研究院有限公司 一种减毒沙门氏菌分泌表达s2结构域蛋白的新型冠状病毒疫苗递呈系统及其应用
CN114478715B (zh) * 2020-10-26 2023-12-22 南京吉芮康生物科技研究院有限公司 一种减毒沙门氏菌分泌表达s2结构域蛋白的新型冠状病毒疫苗递呈系统及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111529701A (zh) 一种口服后产生新型冠状病毒抗体的制剂及其制备方法
Zinder et al. Genetic exchange in Salmonella
CA1339412C (en) Method for screening an expression cdna clone bank for the detection of polynucleotides
FI100945B (fi) Menetelmä valmistaa Shigella-rokotekanta
KR0139950B1 (ko) 무병원성 미생물 및 이의 용도
EP1108034A2 (en) Attenuated salmonella spi2 mutants as antigen carriers
CN109750054A (zh) 一种牛支原体蛋白基因MbovGdpP及其应用
CN110184241B (zh) 耐高温溶藻弧菌噬菌体及其组合物、试剂盒和应用
JP2001500003A (ja) タンパク質の過剰発現
Edmondson et al. Long-term in vitro culture of the syphilis spirochete Treponema pallidum subsp. pallidum. mBio 9: e01153-18
Burdett tRNA modification activity is necessary for Tet (M)-mediated tetracycline resistance
CN109536427B (zh) 一种酸胁迫抗性提高的乳酸菌工程菌
CN108774628B (zh) 合成致新生儿脑膜炎大肠杆菌糖蛋白结合疫苗的大肠杆菌工程菌及用途
US20140199372A1 (en) Microbial growth factors
CN109486735B (zh) 一种酸胁迫抗性提高的乳酸菌工程菌及其应用
CN113699088B (zh) 一株溶藻弧菌pstS基因稳定沉默菌株及其应用
CN115120712A (zh) 肺炎链球菌糖蛋白生物结合疫苗及其制备方法和应用
CN109666618B (zh) 一种在酸胁迫环境下生存能力提高的乳酸菌工程菌
CN110527655B (zh) 一种鸭源大肠杆菌益生菌菌株及其筛选制备方法与用途
CN108795832B (zh) 一种内源l-门冬酰胺酶ii基因敲除的宿主菌、其制备方法及其应用
CN112501096A (zh) 一组肠道外致病大肠杆菌糖蛋白结合疫苗的基因工程大肠杆菌的构建及应用
Soto Perez Plasmids, Immunity, and Phages of Gut Bacterium Eggerthella Lenta
CN117487836B (zh) 一种大肠杆菌无抗生素表达系统及其在高效表达目的基因中的应用
CN105820972B (zh) 水貂绿脓杆菌血清c型菌株及其灭活疫苗和应用
RU2689903C1 (ru) Свежевыделенный штамм бактерий Bordetella pertussis - продуцент комплекса протективных антигенов для производства бесклеточной коклюшной вакцины

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination