RU2689903C1 - Свежевыделенный штамм бактерий Bordetella pertussis - продуцент комплекса протективных антигенов для производства бесклеточной коклюшной вакцины - Google Patents
Свежевыделенный штамм бактерий Bordetella pertussis - продуцент комплекса протективных антигенов для производства бесклеточной коклюшной вакцины Download PDFInfo
- Publication number
- RU2689903C1 RU2689903C1 RU2018140078A RU2018140078A RU2689903C1 RU 2689903 C1 RU2689903 C1 RU 2689903C1 RU 2018140078 A RU2018140078 A RU 2018140078A RU 2018140078 A RU2018140078 A RU 2018140078A RU 2689903 C1 RU2689903 C1 RU 2689903C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- pertussis
- vaccine
- strain
- production
- freshly isolated
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой свежевыделенный от больного коклюшем штамм бактерий Bordetella pertussis 211-03, депонированный в ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России (ФГБУ "НЦЭСМП" Минздрава России) под номером 317 как кандидатный вакцинный штамм, соответствующий по генетическим характеристикам сиквенс-типу 322MAST2, доминирующему с 2005 года на территории Российской Федерации. Полученный штамм обладает высокими протективными свойствами и может быть использован для производства бесклеточной коклюшной вакцины (БКВ). 1 табл.
Description
Область техники.
Изобретение относится к области медицинской микробиологии и может быть использовано для получения бесклеточной коклюшной вакцины.
Уровень техники.
Проблема получения высокоэффективных бесклеточных коклюшных вакцин является актуальной, поскольку, несмотря на высокий уровень вакцинации населения в странах, использующих БКВ, количество вспышек коклюшной инфекции не снижается, что является следствием недостаточного уровня создаваемого ими иммунитета.
Так, известны штаммы бактерий В. pertussis №475, серовариант 1.2.3 и №305, серовариант 1.2.0, используемые для производства коклюшных вакцин. Недостатком известных штаммов является недостаточно высокий уровень протективных свойств получаемых на их основе вакцин.(1)
Сиквенс-анализ генома В. pertussis, проведенный в ряде стран мира, показал наличие изменений в аллельных вариантах основных протективных антигенов коклюшного микроба: КТ, ФГА, пертактина и фимбрий у современных циркулирующих штаммов В. pertussis, как следствие адаптации их к условиям существования (4). Получение новых свежевыделенных штаммов В. pertussis, обладающих повышенной протективной активностью, для производства коклюшной бесклеточной вакцины, является одним из важных условий совершенствования этих препаратов.
Задачей изобретения является получение нового свежевыделенного штамма Bordetella pertussis, который может быть использован для получения бесклеточной коклюшной вакцины, обладающей повышенной протективной активностью.
Для решения данной задачи предлагается свежевыделенный штамм бактерий Bordetella pertussis №211-03, который депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов III-IV групп патогенности ФГБУ "Научный центр экспертизы средств медицинского применения" Минздрава России под №317 - продуцент комплекса протективных антигенов для производства бесклеточной коклюшной вакцины.
Раскрытие изобретения.
Сущность изобретения состоит в том, что для получения комплекса протективных антигенов, применяемого для производства бесклеточной коклюшной вакцины, используют новый свежевыделенный штамм Bordetella pertussis, депонированный в ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России (ФГБУ "НЦЭСМП" Минздрава России) под №317 - продуцент комплекса протективных антигенов для производства бесклеточной коклюшной вакцины.
Штамм культивируют в жидкой синтетической питательной среде с добавлением анионообменной смолы в статических условиях в течение 70-122 часов при температуре (36±1)°C. Концентрация бактерий в конце культивирования составляет 60±10 международных оптических единиц (МОЕ) в мл, лейкоцитозстимулирующая активность супернатанта - 10,2±2,4 лейкоцитозстимулирующих единиц (ЛСЕд) в 0,1 мл; количество коклюшного токсина, определенного иммуноферментным методом, составляло - 18±3,8 нг/МОЕ/мл, филаментозного гемагглютинина - 28,8±5,4 нг/МОЕ/мл, агглютиногена 1 - 11,4±1,8 нг/МОЕ/мл, агглютиногена 2 - 8,4±1,3 нг/МОЕ/мл, агглютиногена 3 - 1,9±0,3 нг/МОЕ/мл.
Молекулярно-генетические исследования вакцинных штаммов №305 и 475 и свежевыделенного штамма В. pertussis показали, что ген субъединицы А коклюшного токсина, ptxA вакцинных штаммов №305 и 475 характеризуется аллельными вариантами ptxA2(AJ245367) и ptxA4(AJ245368) соответственно; ген пертактина (белка наружной мембраны) характеризуется аллельным вариантом prn1(A)011091.1); ген фимбрий 2 - аллельным вариантом 2-1 и фимбрий 3 вакцинных штаммов 305 и 475 - аллельным вариантом 3А(Х51543), в то время как ген субъединицы А коклюшного токсина свежевыделенного штамма №317 характеризуется аллельным вариантом ptxA1(AJ245366), ген пертактина - аллельным вариантом prn2(А)011092.1), ген фимбрий 2 - аллельным вариантом 1 и ген фимбрий 3 - аллельным вариантом 3B(AY464180). Генотипирование с помощью мультилокусного секвенирования ДНК определило принадлежность штамма к сиквенс-типу 322MAST2, который с 2005 г является одним из доминирующих на территории Российской Федерации.
Техническим результатом заявленного изобретения является получение нового свежевыделенного штамма В. pertussis для производства коклюшной бесклеточной вакцины, обладающей повышенной протективной активностью.
Краткое описание чертежей и иных поясняющих материалов.
Таблица 1 Протективная активность БКВ1 и БКВ2, где
ЛД50=27 клеток (ЛД50 - доза заражающей культуры В. pertussis шт. 18323, вызывающая гибель 50% мышей)
Заражающая доза - 1852 ЛД50
* МЗЕ - Международная защитная единица.
**ОСО - Отраслевой стандартный образец иммуногенности коклюшной вакцины ОСО 42-28-89-01П.
Осуществление изобретения.
Свежевыделенный штамм В. pertussis, полученный от 8-и летнего больного ребенка в г. Москва в 2003 г, был адаптирован к жидкой синтетической питательной среде культивирования вакцинных штаммов.
Штамм имеет следующие характеристики:
Морфологические и культуральные свойства. Грамотрицательные коккобактерии - мелкие типичные палочки овоидной формы, располагающиеся в мазках отдельно или парами, образующие на среде Борде-Жангу с добавлением 20-25% дефибринированной крови человека мелкие колонии, диаметром 0,5-1,0 мм, круглые, выпуклые, с ровными краями, блестящие (с характерным «жемчужным» блеском), полупрозрачные, сероватого цвета, в тонком слое среды (1,5-2 мм) окружены нерезко ограниченной зоной гемолиза. Культура агглютинируется коклюшной антибактериальной сывороткой в титре не ниже 1:10240 и адсорбированными типоспецифическими сыворотками к агглютиногенам 1, 2 и 3 в титрах 1:2560; 1:2560; 1:1280, соответственно.
Молекулярно-генетическая характеристика штамма. Ген субъединицы А коклюшного токсина характеризуется как аллельный вариант ptxA1(AJ245366), ген пертактина как аллельный вариант prn2(А)011092.1), ген фимбрий 2 как аллельный вариант 1 и ген фимбрий 3 - аллельный вариант 3B(AY464180).
Пример 1. Для культивирования Bordetella pertussis используют жидкую синтетическую питательную среду, содержащую аминокислоты (цистеин, глутаминовую кислоту, пролин), соли (КН2РО4; KCl, MgSO4; CaCl2; NaCl) и витамины (аскорбиновая и никотиновая кислоты).
Лиофилизированный штамм №317 восстанавливают из сухого состояния на чашках Петри со средой Борде-Жангу с 20-25% крови человека. Чашки инкубируют при температуре (36±1)°C в течение 47-73 часов. Морфологию и чистоту культуры контролируют микроскопированием мазков, окрашенных по Граму. Затем 10-15 типичных колоний пересевают с чашек на пробирки со средой Борде-Жангу или с казеиново-угольным агаром и инкубируют в течение 48-72 часов. После 2-3 пассажей на плотных средах смывы культуры с пробирок используют в качестве посевного материала для выращивания штамма в жидкой полусинтетической питательной среде в колбах Эрленмейера (110 мл среды + анионообменная смола). Колбы встряхивают на шуттель аппарате при температуре (36±1)°C в течение 16-18 часов. После микроскопического контроля морфологических свойств культуру В. pertussis из колб пересевают в матрацы с жидкой синтетической питательной средой, содержащей анионообменную смолу. Выращивание проводят в статических условиях в течение 70-122 часов при температуре (36±1)°C.
В конце культивирования концентрация бактерий составляет 60±10 Международных оптических единиц (МОЕ), лейкоцитозстимулирующая активность супернатанта 10,2±2,4 ЛСЕд в 0,1 мл, количество коклюшного токсина при определении иммуноферментным методом 18±3,8 нг/МОЕ/мл, серовариант штамма 1.2.3.
Пример 2. Получение из заявляемого штамма бесклеточной коклюшной вакцины БКВ1.
По окончании культивирования от микробных клеток отделяют надосадочную жидкость центрифугированием при 12500 об/мин в течение 60 минут. Из центрифугата осаждают токсин путем добавления 3-7% раствора гексаметафосфата натрия, 2н. серной, 2н. соляной, 2н. трихлоруксусной кислот в изоэлектрической зоне рН=3,4-3,6. Образовавшийся осадок отделяют центрифугированием при 12500 об/мин в течение одного часа, осторожно промывают дистиллированной водой, растворяют в 1/15М фосфатном буфере, гомогенизируют на электрическом гомогенизаторе в течение 12 секунд. Полученный токсин переводят в анатоксин путем добавления сахарозы до концентрации 10% с последующим выдерживанием в холодильнике в течение одного часа при периодическом осторожном перемешивании и последующего добавления к смеси формалина до концентрации 0,4%, после чего смесь помещают в термостат при 36,5°C на 19-20 суток, периодически осторожно перемешивая смесь. Сорбируют полученный анатоксин на геле гидроокиси алюминия (добавляют 1 мг геля гидроксида алюминия в 1 мл смеси). Смесь шуттелируют на холоду в течение одного часа и переносят в холодильник (2,3).
Пример 3. Сравнительное изучение протективных свойств БКВ1 из заявляемого штамма и БКВ2 из двух известных вакцинных штаммов В. pertussis (№305 и 475).
Было показано, что БКВ1 из заявляемого штамма обладала более высокой протективной активностью, чем БКВ2 из известных штаммов. Результаты представлены в таблице 1.
Результаты исследований показали, что протективная активность БКВ1 из заявляемого штамма составляла 17,1 МЗЕ/мл и в 1,9 раз превышала таковую БКВ2 из известных штаммов, составляющую 9,0 МЗЕ/мл. Это свидетельствует о высоких протективных свойствах заявляемого штамма в сравнении с известными вакцинными штаммами.
Исследования безвредности БКВ1 и БКВ2 показали их безопасность в 1 иммунизирующей дозе для человека - 25 мкг и отсутствие сенсибилизации к гистамину в дозах, более 100 мкг (4 иммунизирующие дозы для человека).
Таким образом, получен новый свежевыделенный штамм Bordetella pertussis, продуцент комплекса протективных антигенов для производства бесклеточной коклюшной вакцины, депонированный в ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России (ФГБУ "НЦЭСМП" Минздрава России) под №317, обладающий высокими протективными свойствами, который может быть использован для производства бесклеточной коклюшной вакцины.
Литература.
1. Е.М. Зайцев, И.Г. Бажанова, М.В. Брицина и др. Протективная активность и безопасность бесклеточной коклюшной вакцины из вакцинных и свежевыделенного штамма. Эпидемиология и вакцинопрофилактика, 2017, 2(93), том 16, с. 31-35.
2. Захарова Н.С., Брицина М.В., Бажанова И.Г. и др. Отечественная бесклеточная коклюшная вакцина. ЖМЭИ, 2008, 1, с. 35-41.
3. Патент №1369042 «Способ получения анатоксина Bordetella pertussis». 14 июля 1993 г.
4. A.J. King, Т. van Gorkom, J/LA Pennings, et all. Comparative genomic profiling of Dutch clinical Bordetella pertussis isolates using DNA microarrays: Identification of genes absent from epidemic strains. BMC Genomics 2008, 9:311/
Claims (1)
- Свежевыделенный штамм бактерий Bordetella pertussis, депонированный в Коллекции штаммов бактерий ФГБУ "Научный центр экспертизы средств медицинского применения" Минздрава России под №317, - продуцент комплекса протективных антигенов для производства бесклеточной коклюшной вакцины.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018140078A RU2689903C1 (ru) | 2018-11-14 | 2018-11-14 | Свежевыделенный штамм бактерий Bordetella pertussis - продуцент комплекса протективных антигенов для производства бесклеточной коклюшной вакцины |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018140078A RU2689903C1 (ru) | 2018-11-14 | 2018-11-14 | Свежевыделенный штамм бактерий Bordetella pertussis - продуцент комплекса протективных антигенов для производства бесклеточной коклюшной вакцины |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2689903C1 true RU2689903C1 (ru) | 2019-05-29 |
Family
ID=67037579
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2018140078A RU2689903C1 (ru) | 2018-11-14 | 2018-11-14 | Свежевыделенный штамм бактерий Bordetella pertussis - продуцент комплекса протективных антигенов для производства бесклеточной коклюшной вакцины |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2689903C1 (ru) |
-
2018
- 2018-11-14 RU RU2018140078A patent/RU2689903C1/ru active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ЗАЙЦЕВ Е.М. и др., Протективная активность и безопасность бесклеточной коклюшной вакцины из вакцинных и свежевыделенного штамма Bordetella pertussis, Эпидемиология и Вакцинопрофилактика N2(93), 2017, с.31-34. БОРИСОВА О.Ю. и др., Чувствительность штаммов Bordetella pertussis к антибактериальным препаратам, Детские инфекции, N2, 2013, с.46-50. БОРИСОВА О.Ю. и др., Генетическая характеристика штаммов Bordetella pertussis, выделенных от больных коклюшем в России, Медицинский альманах, N2 (2) апрель, с.30-34. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2689903C1 (ru) | Свежевыделенный штамм бактерий Bordetella pertussis - продуцент комплекса протективных антигенов для производства бесклеточной коклюшной вакцины | |
| CN111744003A (zh) | 趋化因子cx3cl1在制备疫苗中的应用和幽门螺旋杆菌疫苗 | |
| Rahman et al. | Development of experimental oil based inactivated HS vaccine from field Isolates of Pasteurella multocida from Cattle in Bangladesh | |
| US3401219A (en) | Moraxella bovis infectious bovine keratoconjunctivitis steam-killed bacterin | |
| JPH07502174A (ja) | 家禽病を発症させる新規バクテリアとそれから誘導されたワクチン | |
| KR100649286B1 (ko) | 감독화톡신을 포함하는 백신제제 | |
| RU2311197C1 (ru) | Способ получения протективной белоксодержащей фракции бактерий | |
| RU2538158C1 (ru) | Способ изготовления вакцины, ассоциированной против эшерихиоза, стрептококкоза и стафилококкоза крупного рогатого скота | |
| CN103458923A (zh) | 用于产生蛋白复合物的方法和包含该蛋白复合物的疫苗组合物 | |
| ES2239321T3 (es) | Un metodo de cultivo de bacterias que producen proteinas que se expresan de manera regulada por la temperatura. | |
| CN108939060B (zh) | 一种中华鳖细菌性腮腺炎口服疫苗 | |
| RU2658606C1 (ru) | Штамм streptococcus pyogenes n b-7612, продуцент комплекса биологически активных соединений, обладающих иммуностимулирующими свойствами | |
| RU2288002C1 (ru) | Способ изготовления вакцины против энтерококковой инфекции нутрий | |
| RU2407788C1 (ru) | Свежевыделенный штамм бактерий bordetella pertussis - продуцент коклюшного токсина | |
| CN106497855B (zh) | 一种肠炎沙门菌基因敲除减毒突变株及其制备与应用 | |
| RU2521651C1 (ru) | ШТАММ БАКТЕРИЙ, Moraxella bovoculi "СХ-Ч6 N-ДЕП" ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ДИАГНОСТИКУМОВ И ВАКЦИН ПРОТИВ ИНФЕКЦИОННОГО КЕРАТОКОНЪЮКТИВИТА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА | |
| RU2316345C1 (ru) | Способ изготовления вакцины ассоциированной против колибактериоза, сальмонеллеза, стрептококкоза и энтерококковой инфекции нутрий | |
| Thammapalerd et al. | Axenic cultivation of Entamoeba histolytica from liver abscess and its zymodeme | |
| CN111944838B (zh) | 革兰氏阳性菌表达系统在表达腐败梭菌毒素中的应用、腐败梭菌α毒素的制备方法和疫苗 | |
| CN112159479B (zh) | 一种鸡毒支原体多抗原表位融合蛋白pMG-mEA及其应用 | |
| SU492094A3 (ru) | Способ получени живой брюшнотифозной вакцины | |
| RU2406532C1 (ru) | Способ изготовления вакцины ассоциированной против стрептококкоза и стафилококкоза крупного рогатого скота | |
| RU2098127C1 (ru) | Ассоциированная вакцина "нековак" против некробактериоза крупного рогатого скота | |
| RU2727258C1 (ru) | Способ повышения иммуногенности вакционного штамма чумного микроба | |
| RU2707289C1 (ru) | Способ изготовления вакцины, ассоциированной против эшерихиоза, стрептококкоза и псевдомоноза крупного рогатого скота |