CN103458923A - 用于产生蛋白复合物的方法和包含该蛋白复合物的疫苗组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及产生用于疫苗组合物的热休克蛋白复合物的方法。特别地，提供了用于通过使细胞经受特定的诱导应激的刺激增强在细胞中产生的热休克蛋白复合物的水平和免疫原性的方法。本发明还延及根据本发明的方法产生的热休克蛋白复合物在制备用于预防和治疗传染病和癌性病症的疫苗组合物中的用途。
Description
发明领域
本发明涉及用于产生热休克蛋白复合物的方法。本发明还延及根据本发明的方法产生的热休克蛋白复合物在制备用于预防和治疗传染病和癌性病症的疫苗组合物中的用途。
发明背景
热休克蛋白（hsp，HSP）是广泛分布遍及植物和动物界的高度保守的蛋白家族。基于它们的分子量，主要的热休克蛋白被分成6个不同的家族：小(hsp20-30kDa)；hsp40；hsp60；hsp70；hsp90和hsp100。热休克蛋白在原核和真核细胞二者中遍在表达，其中它们在多肽的折叠和去折叠中行使分子伴侣的功能。热休克蛋白的另外的作用是伴随肽从一个细胞区室至另一个细胞区室和，在病变细胞的情况下，热休克蛋白还已知伴随病毒或肿瘤相关肽至细胞表面用于呈递至免疫系统。
尽管热休克蛋白最初在经受热应激的细胞中被鉴定出，但它们的产生可由一些其他形式的应激，诸如感染、渗透应激、细胞因子应激和类似的应激造成。因此，基于它们的表达不单由热应激造成，热休克蛋白还通常被称为应激蛋白（SP）。然而，由不同应激刺激诱导的基因的转录分析显示细胞暴露于不同的诱导应激的刺激之后诱导不同组的基因（Bacon&Marsh(2007)Curr.Mol.Med.7:277-86)。此外，单个应激调节子是独立被诱导（vanBogelen等人(1987)J.Bact.169:26-32和Wilkes等人(2009)Appliedand Environmental Microbiol.75:981–990)并被调节的(Holmes等人(2010)Microbiology156:158-166)。特别地，vanBogelen显示了不同诱导应激的刺激引起不同的热休克蛋白基因被表达并当四种诱导应激的刺激被检测时，只有一种类型的诱导应激的刺激造成了这些基因的特异性表达。
尽管热休克蛋白本身可被用作疫苗组合物中的免疫原性决定簇，当施用至受试对象时，观察到热休克蛋白和肽、特别是抗原肽片段之间形成的复合物介导增强的免疫应答。此外，已知热休克蛋白可产生可被分类为组成型产生的热休克蛋白复合物或诱导型热休克蛋白复合物的复合物。组成型产生的热休克蛋白复合物是包含在正常稳态条件下产生的热休克蛋白的热休克蛋白复合物。诱导型热休克蛋白复合物是当细胞被暴露于应激条件时产生的。当处于应激状态时，细胞上调应激蛋白的产生，这些上调的热休克蛋白被称为诱导型热休克蛋白。此外，这些诱导型热休克蛋白与肽片段形成复合物，所述复合物被认为比细胞不处于应激条件下时形成的复合物更具免疫原性。此类诱导型热休克蛋白复合物高出组成型热休克蛋白复合物的增强的免疫原性在WO01/13943中被例证。不希望被理论束缚，本发明人预测在诱导型热休克蛋白复合物中观察到的增强的免疫原性不是由于复合物的实际的应激蛋白组分的不同，而是由于引起细胞内的蛋白去折叠或变性的应激条件。热休克蛋白因此与蛋白或蛋白片段复合以阻止它们去折叠，或再折叠它们，并与蛋白片段复合作为细胞抗原加工通路的部分。
包含热休克蛋白复合物（其还可被称为应激蛋白复合物）的疫苗组合物作为免疫原性决定簇是广为人知的。由于它们显示了给予抗感染和疾病的广泛的、保护性免疫的前景，此类疫苗具有显著的潜力。热休克蛋白复合物作为抗特定癌症的疫苗是有效的也已被广泛证明。已显示从热-休克BCG细胞中分离的源自病原体的应激蛋白复合物在被接种的宿主中诱导T-辅助性1（Th1）淋巴细胞介导的免疫应答，其在小鼠肺结核的气溶胶攻击模型中给予抗活的攻击的保护性免疫（国际PCT专利申请号WO01/13944）。此外，已在WO02/20045、WO00/10597和WO01/13943中显示了从病原体或被病原体感染的细胞中分离的应激蛋白复合物作为抗传染病的疫苗中的免疫原性决定簇是有效的。
有多种途径产生用于治疗和预防传染病的包含应激蛋白复合物的疫苗组合物。WO95/24923公开了包含源自宿主真核细胞的热休克蛋白和源自病原体的抗原肽片段的组成型热休克蛋白复合物。WO01/13943公开了在使用诱导应激的刺激诸如热或细胞因子诸如肿瘤坏死因子（TNF）之后被诱导的热休克蛋白复合物。所述应激蛋白可包含源自宿主细胞的应激蛋白，或可选地，源自入侵病原体的应激蛋白，所述应激蛋白被复合至源自入侵病原体的肽。WO01/13944公开了在经受诱导应激的刺激的病原体之后产生的应激蛋白复合物，其中该应激蛋白和相关肽片段直接源自该病原体。
发明概述
在大量的实验之后，本发明人惊人地观察到，使用多种诱导应激的刺激，典型地热应激和呼吸应激或热应激和基于酸的应激产生的诱导型热休克蛋白复合物，当与暴露于单一类型的诱导应激的刺激之后产生的诱导型应激蛋白复合物相比，增强了细胞中产生的诱导型应激蛋白复合物的量。特别地，本发明人已观察到，在将一个或多个细胞暴露于多种应激刺激之后产生的热休克蛋白-肽复合物（HspC）的量可导致所产生的热休克蛋白-肽复合物的数量的4倍增加。由于预防性或治疗性疫苗的大规模生产将需要大量的热休克蛋白复合物，较高产量的热休克蛋白-肽复合物的产生具有显著的商业相关性。此外，本发明人还惊人地鉴定了，使用多种诱导应激的刺激诸如热应激和呼吸应激或热应激和基于酸的应激产生的诱导型热休克蛋白-肽复合物，比仅使用单一的诱导应激的刺激诸如单独的热休克产生的诱导型热休克蛋白复合物更具免疫原性。
根据本发明的第一方面，提供了用于产生在应激蛋白和肽之间形成的应激蛋白复合物的方法，所述方法包括以下的步骤、由以下的步骤组成、或基本上由以下的步骤组成：
-培养细胞，
-将所述细胞暴露于多种诱导应激的刺激，和
-从该细胞中纯化应激蛋白复合物。
在某些实施方案中，肽为肽片段。在某些实施方案中，肽为抗原肽或抗原肽片段。在某些实施方案中，肽源自典型造成传染病的病原生物体，例如原核生物（例如，革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌）、原生动物、病毒、寄生物或真菌。
在某些实施方案中，其中肽源自细菌，该细菌选自以下组成的组：埃希氏菌属（Escherichia）、链球菌属（Streptococcus）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、博代氏菌属（Bordetella）、棒状杆菌属（Corynebacterium）、分枝杆菌属（Mycobacterium）、奈瑟氏菌属（Neisseria）、嗜血杆菌属（Haemophilus）、放线菌属（Actinomycetes）、链霉菌属（Streptomycetes）、诺卡菌属（Nocardia）、肠杆菌属（Enterobacter）、耶尔森氏菌属（Yersinia）、弗朗西斯氏菌属（Fancisella）、巴氏杆菌属（Pasturella）、莫拉克斯氏菌属（Moraxella）、不动杆菌属（Acinetobacter）、丹毒丝菌属（Erysipelothrix）、布兰汉氏球菌属（Branhamella）、放线杆菌属（Actinobacillus）、链杆菌属（Streptobacillus）、李斯特菌属（Listeria）、鞘杆菌属（Calymmatobacterium）、布鲁氏菌属（Brucella）、芽胞杆菌属（Bacillus）、梭状芽胞杆菌属（Clostridium）、密螺旋体属（Treponema）、沙门氏菌属（Salmonella）、克雷伯菌属（Kleibsiella）、弧菌属（Vibrio）、变形菌属（Proteus）、欧文氏菌属（Erwinia）、包柔螺旋体属（Borrelia）、钩端螺旋体属（Leptospira）、螺菌属（Spirillum）、弯曲杆菌属（Campylobacter）、志贺菌属（Shigella）、军团杆菌属（Legionella）、假单胞菌属（Pseudomonas）、气单胞菌属（Aeromonas）、立克次体属（Rickettsia）、衣原体属（Chlamydia）、包柔螺旋体属（Borrelia）和支原体属（Mycoplasma）。
在某些实施方案中，其中肽源自病毒，该病毒选自以下组成的组：人类免疫缺陷病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎、丙型肝炎、人乳头瘤病毒、卡波济氏肉瘤相关疱疹病毒、单纯性疱疹病毒、呼吸道合胞体病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、西尼罗病毒、圣路易斯脑炎病毒、裂谷热病毒、流感病毒、冠状病毒、鼻病毒、腺病毒、SIV、轮状病毒、人乳头瘤病毒、虫媒病毒、麻疹病毒、脊髓灰质炎病毒、风疹病毒、腮腺炎病毒、乳多泡病毒、水痘带状疱疹病毒、水痘病毒、汉坦病毒和巨细胞病毒。
在某些实施方案中，肽为肿瘤特异性抗原。
在某些实施方案中，将细胞暴露于多种诱导应激的刺激包括将细胞暴露于至少两种诱导应激的刺激。典型地，细胞被暴露于两种不同类型的诱导应激的刺激，但可被暴露于三种或多种不同类型的诱导应激的刺激。在某些实施方案中，诱导应激的刺激可选自但不限于以下组成的组：热应激、呼吸应激（氧饥饿或增加）、氧化应激（H2O2、Fe）、基于酸的应激诸如pH改变、重金属应激、渗透应激、代谢物限制和养分饥饿诸如碳或铁限制。在某些优选的实施方案中，诱导应激的刺激为热应激和以下的至少一种应激：呼吸应激、氧化应激（H2O2、Fe）、基于酸的应激（pH4）、重金属应激、渗透应激、代谢物限制和养分饥饿诸如碳或铁限制，且特别地可以是热应激和呼吸应激或热应激和基于酸的应激。典型地至少两种诱导应激的刺激被顺序地施加至细胞。在某些实施方案中，至少两种诱导应激的刺激被顺序地施加。
在某些实施方案中，本发明因此提供了用于产生在应激蛋白和抗原肽之间形成的复合物的方法，所述方法包括以下的步骤、由以下的步骤组成、或基本上由以下的步骤组成：
-培养细胞，
-将所述细胞暴露于热应激，
-将所述细胞暴露于呼吸应激，和
-从该细胞中纯化热休克蛋白复合物。
典型地，所述细胞被同时暴露于热应激和呼吸应激。
在可选的实施方案中，本发明提供了一种用于产生在应激蛋白和抗原肽之间形成的复合物的方法，所述方法包括以下的步骤、由以下的步骤组成、或基本上由以下的步骤组成：
-培养细胞，
-将所述细胞暴露于热应激，
-将所述细胞暴露于基于酸的应激，和
-从该细胞中纯化热休克蛋白复合物。
典型地，将所述细胞同时暴露于热应激和基于酸的应激，即，将该细胞暴露于热应激并同时暴露于基于酸的应激。
在某些实施方案中，热应激或热休克包括将培养的细胞所暴露的热增加至细胞正常生长温度之上约5℃至10℃的温度。因此，如果细胞典型在37℃生长，那么热应激可包括将细胞所暴露的温度增加至约44℃。在某些实施方案中，通过升高发酵罐内的温度获得所述温度的增加，例如其可被用于在约42℃至44℃培养所培养的细胞。在某些实施方案中，通过以在0.25℃至0.5℃每分钟或约0.25℃至0.5℃每分钟的速率（0.25-0.5℃/min）从正常生长温度增加温度获得温度的增加。在某些实施方案中，使细胞经受从约30分钟至2.5小时范围的时间段的热应激。在某些实施方案中，典型可持续1至2小时之间发生热应激。
在某些实施方案中，呼吸应激指的是减少培养的细胞所暴露的氧的量。典型地，这包括限制引起所培养的细胞正常生理生长或稳态的对所培养的细胞的氧供给。在某些实施方案中，随着培养温度的增加，这可通过去除溶氧张力（DOT）的级联控制获得。在优选的实施方案中，可进一步通过手动减少搅拌速率限制溶氧张力，例如，减少至约320至350rpm。Clark等人，（1985）Biotechnology and Bioengineering,27:1507-1511中描述了如何能够通过搅拌速率控制发酵罐中的溶氧张力。在另外的实施方案中，通过用二氧化碳或氮部分或全部替代获得氧限制。在某些优选的实施方案中，将呼吸应激施加至发酵罐中的细胞。在某些实施方案中，呼吸应激指的是增加被培养的细胞所暴露的氧的量。
在某些实施方案中，基于酸的应激或酸应激包含减少所培养的细胞的pH至培养细胞所处的正常pH之下的pH，正常pH是引起细胞的正常生理生长或稳态的pH。在某些实施方案中，pH被降低至5.5、5、4.5或4。可通过添加酸，例如盐酸至细胞降低pH。在某些实施方案中，将基于酸的应激施加至发酵罐中的细胞。
可同时或顺序地将细胞暴露于多种诱导应激的刺激。因此，在某些实施方案中，在暴露于第二应激，诸如呼吸应激或基于酸的应激之前使细胞经受热应激。在另外的实施方案中，使细胞同时经受热应激和第二应激，诸如呼吸应激或基于酸的应激。在另外的实施方案中，可首先使细胞经受另外的应激诸如呼吸应激或基于酸的应激并随后经受热应激。
可通过使用施加诱导应激的刺激的标准方法确定优选的应激组合并随后定量诱导的应激蛋白，诸如GroEL和DnaK。典型地，优选的应激组合增加诱导GroEL和DnaK二者。可被用于定量诱导的应激蛋白的标准方法包括蛋白凝胶分析、光密度测定法、免疫印迹和ELISA。
病原细胞
在某些实施方案中，细胞为病原细胞。在某些实施方案中，病原细胞为非哺乳动物细胞，特别是可以为革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌的原核细胞。在某些另外的实施方案中，病原细胞为微生物细胞、原生动物细胞或寄生虫细胞。
在某些实施方案中，原核细胞是选自但不限于以下组成的组的细菌：埃希氏菌属、链球菌属、葡萄球菌属、博代氏菌属、棒状杆菌属、分枝杆菌属、奈瑟氏菌属、嗜血杆菌属、放线菌属、链霉菌属、诺卡菌属、肠杆菌属、耶尔森氏菌属、弗朗西斯氏菌属、巴氏杆菌属、莫拉克斯氏菌属、不动杆菌属、丹毒丝菌属、布兰汉氏球菌属、放线杆菌属、链杆菌属、李斯特菌属、鞘杆菌属、布鲁氏菌属、芽胞杆菌属、梭状芽胞杆菌属、密螺旋体属、沙门氏菌属、克雷伯菌属、弧菌属、变形菌属、欧文氏菌属、包柔螺旋体属、钩端螺旋体属、螺菌属、弯曲杆菌属、志贺菌属、军团杆菌属、假单胞菌属、气单胞菌属、立克次体属、衣原体属、包柔螺旋体属和支原体属。
在某些实施方案中，细菌选自以下组成的组：奈瑟氏菌属（例如脑膜炎奈瑟氏菌（N.meningitidis）MC58）、分枝杆菌（Mycobacteria）、梭状芽胞杆菌属（例如艰难梭状芽胞杆菌（Clostridium difficile））、酵母属（Saccharomyces）（例如酿酒酵母（S.cerevisiae））和链球菌属，例如肺炎链球菌（S.pneumoniae）。当与从被暴露于仅一种类型的诱导应激的刺激的细胞中获得的应激蛋白复合物相比，热应激和呼吸应激的组合已显示在奈瑟氏菌属、分枝杆菌、酵母属和梭状芽胞杆菌属中导致较高水平的应激蛋白复合物的产生。因此，在某些实施方案中，细胞是奈瑟氏菌属（例如脑膜炎奈瑟氏菌MC58）、分枝杆菌、酵母属（例如酿酒酵母）或梭状芽胞杆菌属（例如艰难梭状芽胞杆菌），且多种诱导应激的刺激包括热应激和呼吸应激。当与从被暴露于仅一种类型的诱导应激的刺激的细胞中获得的应激蛋白复合物相比，热应激和基于酸的应激的组合已显示在肺炎链球菌中导致较高水平的应激蛋白复合物的产生。因此，在某些实施方案中，细胞是链球菌属，例如肺炎链球菌，且多种诱导应激的刺激包括热应激和基于酸的应激。当与从被暴露于仅一种类型的诱导应激的刺激的细胞中获得的应激蛋白复合物相比时，从被暴露于两种不同类型的诱导应激的刺激的细胞中获得的应激蛋白复合物还显示了改进的免疫原性。
需氧细胞
在某些实施方案中，细胞是需氧细胞，例如病原需氧细胞。在细胞培养中的正常生长期间，细胞将具有对氧的最佳需求。例如，需氧细胞将需要氧用于生长和存活。氧水平的消耗将限制需氧细胞生长的能力。生长培养基中不存在氧时将最可能导致细胞的死亡。任何特定的细胞都将具有优选的溶氧张力（DOT），这是被提供用于培养中的细胞的生长与稳态的氧供给。例如，细胞培养物可在具有>10%至50%之间范围的溶氧张力（DOT）下生长。在某些优选的实施方案中，溶氧张力（DOT）可以以或约>20%或约>30%的水平被提供。
兼性厌氧细胞
在某些实施方案中，细胞是兼性厌氧细胞，例如病原厌氧细胞。兼性厌氧生物体是通常通过需氧呼吸产生ATP的生物体。然而，当不存在氧时，兼性厌氧菌可转向发酵。兼性厌氧菌因此在存在氧时存活，而专性厌氧菌则死亡。此外，生长环境中的氧浓度和可发酵的物质将影响兼性厌氧菌使用需氧呼吸还是发酵以获得能量。氧水平的消耗将因此限制兼性厌氧菌生长的能力。然而，在生长培养基或环境中不存在氧可导致向厌氧生长的转变。因此，将兼性厌氧细胞暴露于呼吸应激将包括小心管理细胞所暴露的溶氧张力（DOT）以诱导呼吸应激。呼吸应激的施加还可包括将可发酵物质从生长环境中去除。
厌氧细胞
在某些实施方案中，细胞是厌氧细胞，例如病原厌氧细胞。在本发明的某些实施方案中，应激蛋白复合物可源自厌氧病原体（专性厌氧菌），特别是在氧存在时不能生长的厌氧细菌。因此，将呼吸应激施加至专性厌氧菌则需要将氧添加至培养基而不是去除，以给予氧化应激相关的诱导应激的刺激。因此，可通过将厌氧细胞培养物生长在以>10%至50%之间的范围的溶氧张力（DOT）存在下使厌氧细胞培养物暴露于呼吸应激。在某些优选的实施方案中，可以以或约>20%或约>30%的水平提供溶氧张力（DOT）。
因此，在某些实施方案中，本方法包括用于产生在源自厌氧病原体的应激蛋白和抗原肽或抗原肽片段之间形成的复合物的方法，所述方法包括以下的步骤、由以下的步骤组成、或基本上由以下的步骤组成：
-在不存在氧的环境中培养厌氧病原细胞，
-将所述细胞暴露于热应激，
-进一步将所述细胞暴露于呼吸应激，所述应激包括增加培养的细胞所暴露的氧的量，和
-从厌氧病原细胞中纯化应激蛋白复合物。
在某些实施方案中，将所述细胞同时暴露于热应激和呼吸应激，即，将该细胞暴露于热应激并同时暴露于基于酸的应激。
在某些实施方案中，氮可存在于培养基中以补偿氧的缺乏。
癌性细胞
在某些实施方案中，细胞为癌性细胞。因此，在某些实施方案中，本发明提供了一种用于产生在应激蛋白和抗原肽之间形成的复合物的方法，所述方法包括以下的步骤、由以下的步骤组成、或基本上由以下的步骤组成：
-培养癌性细胞，
-将所述细胞暴露于热应激，
-将所述细胞暴露于呼吸应激或基于酸的应激，和
-从癌性细胞中纯化热休克蛋白复合物。
典型地，将所述细胞同时暴露于热应激和基于酸的应激或呼吸应激，即，将该细胞暴露于热应激并同时暴露于基于酸的应激。
被遗传修饰的细胞
在某些实施方案中，本发明延及已例如通过缺失hspR和/或hrcA被遗传修饰以组成型表达热休克蛋白的一个或多个细胞。根据本发明可使所述细胞进一步经受一种或多种另外的诱导应激的刺激。典型的另外的诱导应激的刺激包括呼吸应激诸如氧限制、pH应激（例如pH4的酸应激）和代谢物限制诸如碳或铁限制。
原核热休克蛋白家族DnaJ、DnaK、GroEL和GroES在操纵子中被编码，操纵子中的初始基因为抑制被包含在操纵子中的热休克蛋白基因的表达的控制基因。例如在链霉菌属（Streptomyces）和螺杆菌属（Helicobacter）中，hspR基因的表达抑制DnaJ和DnaK的表达。缺失hspR基因因此导致被遗传修饰的组成型表达热休克蛋白的微生物（见Bucca等人(2003)Mol.Microbiol50(1)153-166)。然而，应该注意的是两个主要的热休克蛋白家族DnaK和GroEL被两个不同的调节子hspR和hrcA调节。在这些热休克调节子中，hsp70/DnaK调节子在hspR的控制下，而hsp60/groEL调节子则在hrcA的控制下。最大上调Dnak和GroEL热休克蛋白表达将需要缺失这两个基因（Holmes等人(2010)Microbiology156:158-166和AravindhanV.等人(2009)FEMS Microbial Lett.29242-49)。同源操纵子已在最近被测序的一些微生物包括链霉菌属的其他菌株和结核分枝杆菌和常用的相关疫苗菌株BCG中被鉴定出。
其他抑制子基因也可控制其他应激蛋白的表达，且这些也可被遗传修饰以提供组成型表达应激蛋白的被修饰的微生物。这些包括，但不限于，转录控制基因sigma和rho和应激基因调节蛋白基因hrcA、MerR和HmrR。
因此，本发明可进一步延及已被遗传修饰以敲除控制热休克蛋白表达的至少一个抑制子基因或使其失能的被遗传修饰的病原体的用途，其中在分离和/或纯化诱导型热休克蛋白复合物用于在疫苗组合物中用作免疫原性决定簇之前使所述被遗传修饰的病原体经受呼吸应激或酸应激。
在某些实施方案中，细胞是被遗传修饰以致它们表达源自癌性细胞的异源蛋白的细胞。在可选的实施方案中，细胞是被遗传修饰以致它们表达源自在宿主中引起传染病的病原体的异源蛋白的细胞。
被感染的细胞
在某些实施方案中，细胞是被病原生物体感染的宿主细胞。复合物可从源自宿主细胞的热休克蛋白复合至源自入侵病原体的肽片段、或从都源自入侵病原体的热休克蛋白和肽片段形成。
因此，在某些实施方案中，本发明提供了一种用于产生在热休克蛋白和肽片段之间形成的复合物的方法，所述方法包括以下的步骤、由以下的步骤组成、或基本上由以下的步骤组成：
-培养被病原体感染的细胞，
-将所述细胞暴露于多种诱导应激的刺激，和
-从所培养的细胞中纯化热休克蛋白复合物。
在某些实施方案中，多种诱导应激的刺激包括至少2种被同时施加至细胞的诱导应激的刺激，并可包括热应激和呼吸应激或热应激和基于酸的应激。
本发明的方法有利地提供了被纯化的热休克蛋白复合物的混合物，其中该热休克蛋白复合物的混合物包含热休克蛋白的不同亚型。即，热休克蛋白复合物的热休克蛋白组分可以是不同热休克亚型家族的热休克蛋白。例如，可存在源自选自但不限于以下的类的热休克蛋白的混合物：HSP60、HSP70和/或HSP90、或存在于真核细胞或病原细胞的任何其他热休克蛋白类。在某些实施方案中，热休克蛋白复合物包含或由GroEL（相当于哺乳动物细胞中HSP60的原核热休克蛋白）和/或DnaK（相当于哺乳动物细胞中HSP70的原核热休克蛋白）热休克蛋白家族的热休克蛋白组成是优选的。因此，在本发明的某些实施方案中，本文所使用的纯化方法被用于纯化蛋白复合物，其中热休克蛋白组分包含DnaK和GroEL。
诱导和纯化热休克蛋白复合物
在某些实施方案中，从已经受诱导应激的刺激的细胞获得的细胞裂解物中纯化或分离热休克蛋白复合物，所述细胞例如，病原细胞、癌性细胞或被病原体感染的细胞。
典型地，应激蛋白复合物包含不同热休克蛋白类的热休克蛋白。在某些实施方案中，热休克蛋白为亚型DnaK和/或GroEL。所述纯化和/或分离的热休克蛋白复合物，或包含该热休克蛋白复合物的制品或混合物，可随后典型被用作疫苗组合物中的免疫原性决定簇以引起抗应激蛋白复合物源自其中的病原体或癌性细胞、或抗感染应激蛋白复合物源自其中的细胞的病原体的免疫应答和相关的保护性免疫。
在某些实施方案中，纯化热休克蛋白复合物包括：
（i）提供来自培养物细胞的澄清的细胞裂解物，其中该细胞裂解物包含应激蛋白复合物，
（ii）使细胞裂解物经受使用离子交换的纯化，其中将该细胞裂解物缓冲到目的热休克蛋白复合物的pI的2个单位以内的pH，且其中使用盐梯度洗脱热休克蛋白复合物，和
（iii）获得包含热休克蛋白复合物的富集的制品。
在某些实施方案中，缓冲液包含可以以约0.1mM至100mM的浓度提供的二价阳离子。在某些实施方案中，二价阳离子为镁盐和/或锰盐。在某些实施方案中，缓冲液还包含可以以约0.1mM至100mM的浓度提供的ADP（二磷酸腺苷）。
在某些实施方案中，热休克蛋白复合物包含DnaK和/或GroEL类的热休克蛋白。
疫苗组合物
典型地，通过本发明上述方面获得的所述纯化的热休克蛋白复合物可被用作用于介导抗应激蛋白复合物源自其中的病原体的免疫应答的疫苗复合物中的免疫原性决定簇。
在多个另外的方面，本发明因此延及疫苗组合物、或介导或引起免疫应答的组合物，其包含通过本发明方法获得的热休克蛋白复合物。所述疫苗组合物典型被施用至哺乳动物，特别是人，以给予抗病原体的保护性免疫。然而，由于来自不同物种的应激蛋白的公认的高水平的同源性，疫苗组合物可被用于接种很多种动物。
如此，本发明另外的方面提供了疫苗组合物，包含通过本发明方法获得的纯化的热休克蛋白复合物作为免疫原性决定簇。
在某些另外的方面，本发明提供了根据本发明的疫苗组合物、或使用本发明的方法获得的纯化的和/或分离的热休克蛋白复合物的混合物，用于在药物中使用。
在本发明某些另外的方面，提供了根据本发明任何前述方面产生的热休克蛋白复合物在制备用于预防或治疗传染病或癌性或恶性病症的药剂中的用途。
在某些另外的方面，本发明提供了用于在治疗或预防传染病或癌性或恶性病症的疫苗组合物中使用的热休克蛋白复合物。
在某些实施方案中，热休克蛋白复合物或包含该热休克蛋白复合物的疫苗组合物被作为预防性疫苗施用。在某些另外的实施方案中，纯化的应激蛋白复合物或包含该纯化的应激蛋白复合物的疫苗组合物被作为治疗性疫苗施用。
在多个另外的方面，本发明延及热休克蛋白复合物或包含该热休克蛋白复合物的制品或混合物、或包含该热休克蛋白复合物的疫苗组合物，用作加强疫苗以增强宿主中产生的抗受试对象典型通过感染的方式或由于先前施用初次疫苗而暴露的病原体或癌抗原的免疫应答。
本发明的组合物可以被冻干或以含水的形式，即溶液或悬浮液。该类型的液体制剂允许组合物直接从它们的包装形式施用，不需要在含水介质中重构，并因此用于注射是理想的。可将组合物存放在小瓶中，或将它们存放在现成的被充满的注射器中。可提供具有或不具有注射针的注射器。注射器将包含组合物的单个剂量，而小瓶可包含单个剂量或多个剂量（例如，2个剂量）。
在多个另外的方面，本发明提供了用于产生疫苗组合物的方法，所述方法包括将本发明的纯化的热休克蛋白复合物、或包含该纯化的热休克蛋白复合物的制品或混合物与至少一种药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂一起混合的步骤。
在本发明的一个实施方案中，提供了用于在治疗或预防病原性疾病的药剂中使用的疫苗组合物，所述病原性疾病诸如由选自包括但不限于以下的组的病原细菌的感染造成的疾病：百日咳杆菌（Bordetella pertussis）、破伤风梭状芽胞杆菌（Clostridium tetani）、艰难梭状芽胞杆菌、白喉棒状杆菌（Corynebacterium diphtheriae）、b型流感嗜血杆菌（Haemophilusinfluenzae b）、结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）和麻风分枝杆菌（Mycobacterium leprae）、伤寒沙门氏菌（Salmonella typhi）、肺炎链球菌（Streptococcus pneumonia）、霍乱弧菌（Vibrio Cholerae）和脑膜炎奈瑟氏菌（Neisseria meningitides）。在本发明另外的实施方案中，提供了用于在治疗或预防病原性疾病的药剂中使用的疫苗组合物，所述病原性疾病诸如由选自包含但不限于以下的组的病原性或致癌病毒的感染引起的疾病：流感、肝炎、疱疹、人类免疫缺陷病毒（HIV）、人类乳头瘤病毒（HPV）、呼吸道合胞体病毒（RSV）、多瘤病毒、巨细胞病毒（CMV）、埃-巴二氏病毒（EBV）、轮状病毒、诺如病毒、冠状病毒、甲型肝炎病毒（HAV）、乙型肝炎（HBV）、丙型肝炎（HCV）、人乳头瘤病毒（HPV）、卡波济氏肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）、单纯性疱疹病毒（HSV）、呼吸道合胞体病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、西尼罗病毒（WNV）、圣路易斯脑炎病毒（SLEV）、裂谷热病毒（RVFV）、流感病毒、冠状病毒、鼻病毒、腺病毒、SIV、轮状病毒、虫媒病毒、麻疹病毒、脊髓灰质炎病毒、风疹病毒、腮腺炎病毒、乳多泡病毒、水痘带状疱疹病毒、水痘病毒、汉坦病毒和巨细胞病毒。
在本发明又另外的实施方案中，提供了用于在治疗或预防癌症和肿瘤疾病的药剂中使用的疫苗组合物。
另外，本发明又另外的方面延及使受试对象典型地人对由以下造成的疾病免疫的方法：百日咳杆菌、破伤风梭状芽胞杆菌、艰难梭状芽胞杆菌、白喉棒状杆菌、b型流感嗜血杆菌、结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌、伤寒沙门氏菌、霍乱弧菌、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟氏菌和病原性和致癌病毒，该方法包含对宿主施用本发明疫苗的免疫保护剂量。
在每个疫苗剂量中抗原（即，免疫原性决定簇）的量被选择为在被接种疫苗的受试对象中诱导免疫保护应答而不具有显著不良副作用的量。抗原的量将取决于所采用的特定的免疫原和其呈递的方式而不同。然而，当与包含使用本领域已知的生产方法获得的蛋白复合物的相似量的疫苗组合物相比时，将被理解的是抗本发明的纯化的复合物介导的增强的免疫应答将意味着，抗使用本方法产生的复合物将介导增强的免疫应答。
本发明还提供了本发明的热休克蛋白复合物在接种受试对象以诱导抗源自病原体的传染病或癌性或恶性病症的免疫的方法中的用途。
因此，本发明又另外的方面提供了接种受试对象抗源自病原体的传染病或癌性病症的方法，所述方法包括步骤：
-提供包含根据本发明的任一方法提供的热休克蛋白复合物作为免疫原性决定簇的疫苗组合物，所述热休克蛋白复合物源自期望对其产生保护性免疫的已经受诱导热休克和呼吸或基于酸的应激的刺激的癌性细胞、病原细胞或被病原体感染的细胞或表达异源抗原的细胞，且包含不同的热休克蛋白类型作为混合物，和
-以足够在受试对象中引起抗热休克蛋白复合物的免疫应答的治疗有效的或预防有效的量将包含热休克蛋白复合物的疫苗组合物施用至受试对象。
如本文所用的，术语“疫苗组合物”指包含以可以更好的应对随后的攻击、病原性感染或肿瘤发生这样的方式刺激免疫系统的免疫原性决定簇的任何组合物。将被领会的是疫苗通常包含免疫原性决定簇和任选地佐剂，该佐剂用于非特异性地增强针对免疫原性决定簇的免疫应答。
在某些实施方案中，受试对象是动物，典型是人。还可将本发明的方法用于纯化应激蛋白复合物，用于在治疗其他动物诸如马、牛、山羊、绵羊、猪和禽的疫苗组合物中使用。
在某些实施方案中，本发明的诱导型热休克蛋白复合物源自其的微生物病原体可根据其造成的疾病或感染被选择。可预防性地或治疗性地使用本发明提供的疫苗组合物。然而，由于它们的生产经济性和它们引起抗一种或多种肽和热休克蛋白源自其的病原体的保护性免疫应答的能力，本发明人认识到组合物作为预防性疫苗可特别有用。
本发明人还惊人地鉴定出使用本发明的方法获得的热休克蛋白复合物可被用作“加强”接种，所述加强接种增强了在受试对象中提供的抗病原体或癌性病症的免疫，其中通过用活的或减毒的疫苗接种、或通过其中免疫原性决定簇为应激蛋白-肽复合物的疫苗组合物接种给予初次免疫。
因此，本发明又另外的方面提供了用于在受试对象中加强抗源自病原体的传染病或癌性病症的保护性免疫应答的方法，其中所述保护性免疫应答通过先前施用活的或减毒的疫苗或包含源自期望对其产生免疫的病原体的肽的应激蛋白复合物引起，所述方法包括步骤：
-提供包含根据本发明任何前述方法制备的一种或多种热休克蛋白复合物的组合物，所述纯化的一种或多种热休克蛋白复合物源自期望对其产生保护性免疫的癌性细胞、病原体感染的细胞或病原体且包含不同的应激蛋白类型作为混合物，和
-以足够在受试对象中引起抗一种或多种应激蛋白复合物的免疫应答的量将组合物施用至受试对象。
在某些另外的实施方案中，本发明的包含热休克蛋白复合物的疫苗可被用于加强先前已用其他亚单位、多-亚单位、碳水化合物或缀合物疫苗免疫的动物中的免疫应答。在又另外的实施方案中，本发明的热休克蛋白复合物疫苗可被用于加强先前已用核酸或活疫苗免疫的动物中的抗目的抗原的免疫应答。在又另外的实施方案中，本发明的包含热休克蛋白复合物的疫苗组合物提供了用于加强先前已被免疫抗病原体或癌症特异性抗原的受试对象中所介导的免疫应答。
在某些另外的方面，本发明延及用于加强动物中免疫应答的包含通过本发明的方法诱导的热休克蛋白复合物的疫苗组合物，其中动物先前已被接种包含至少一种源自病原体的抗原、病原体、特别是减毒病原体或癌症特异性抗原的疫苗组合物。
在某些另外的方面，本发明延及用于加强动物中免疫应答的包含通过本发明产生的热休克蛋白复合物的疫苗组合物，其中动物先前已被暴露于源自与热休克蛋白复合物源自的细胞相同或相关细胞的病原体或癌症抗原。
在某些另外的实施方案中，本发明提供了用于制备已用本发明的纯化的应激蛋白复合物脉冲的细胞疫苗诸如树突状细胞（DC）的组合物。施用此被脉冲的树突状细胞至受试对象将导致T-细胞介导的针对热休克蛋白复合物的应答。当治疗患有癌性或恶性病症的受试对象时，此疗法可以是特别有效的。在此类实施方案中，热休克蛋白复合物典型地源自癌性细胞。
在某些实施方案中，本发明的疫苗组合物可用诱导免疫应答的组合物、或被用于引起免疫应答的组合物替代，所述组合物典型地包含与本文描述的疫苗组合物中提供的免疫原性决定簇相同的免疫原性决定簇。
附图简述
图1A显示从用热休克和氧限制（呼吸应激）二者应激的细胞中诱导热休克蛋白的时间进程。泳道2显示诱导前的蛋白水平且泳道3-7显示30分钟的时间间隔的0-2小时应激诱导。从泳道3至7中的60和70KD条带处可以看出蛋白（GroEL和DnaK）的递增的量，这些表示GroEL(70kDa)和DnaK(60kDa)的量的增加。泳道8和9显示hsp60和hsp70标准品的递增的量，这些是被诱导的主要的热休克蛋白。泳道1和11包含分子量（MW）标志物。
图1B显示单独的热休克（泳道1）与热休克和呼吸应激（氧限制）（泳道2）之后热休克蛋白产量的比较。泳道MW显示分子量标志物且标记了“Hsp标准品（Hsp stds）”的泳道显示纯化的hsp60和hsp70蛋白。泳道1和2的比较显示泳道2中具有显著较高的热休克蛋白诱导水平，这通过存在对应于在hsp60和hsp70标志物泳道（Hsp标准品）中看到的条带的显著较暗的条带被描绘。
图2（A-F）显示对从仅经受热休克（组1和2）和经受热休克和呼吸应激的组合（组3）的细胞制成的热休克蛋白复合物的免疫应答，如通过荧光标记的临床相关的奈瑟氏菌属的菌株的抗体依赖性的调理吞噬（OPA）测定的（图A-F）。阳性对照（柱1）显示使用来自接种同源菌株的外膜囊泡（OMV）制品的动物的血清的结果。组1显示使用来自接种仅使用诱导刺激的热应激产生的、使用基于HEPES的缓冲液通过离子交换纯化的复合物的动物的血清的结果。组2显示使用来自接种仅使用诱导刺激的热应激产生的、使用基于Tris的缓冲液通过离子交换纯化的复合物的动物的血清的结果。图3显示使用来自接种使用热休克和呼吸应激刺激的组合产生的、使用与组2中所用的相同的Tris缓冲液纯化的复合物的动物的血清的结果。
图3显示从用一些不同的应激刺激即氧化、渗透、重金属和酸应激进行应激的肺炎链球菌细胞诱导应激蛋白的时间进程。在使用抗GroEL和DnaK的抗体分析用于与热休克组合中使用的诱导应激的刺激或热和呼吸应激的组合的蛋白印迹中可以看出热休克蛋白（hsp60和hsp70）的递增的量。
图4显示从被热和酸应激的组合应激5或15分钟的肺炎链球菌细胞中应激蛋白的诱导。热休克恒定在42℃且酸休克是在pH4.5、5和5.5。从泳道7和8中使用抗hsp60和hsp70抗体的蛋白印迹的比较可以确定热休克和pH5的最优组合，其与显示仅经受单一的诱导应激的刺激的细胞的泳道1至4相比，显示了GroEL和DnaK二者明显被改善的诱导。
图5显示对从经受单独的热应激（HS疫苗）或热和酸应激的双重应激组合（DS疫苗）的细胞制成的应激蛋白复合物的免疫应答，如通过荧光标记的肺炎链球菌菌株Rx1的抗体依赖性的调理吞噬测定（OPA）测定的。阳性对照是来自用来自同源菌株（Rx1）的完整杀死的细胞免疫的小鼠的血清，且从单一应激（仅热休克）中分离的应激蛋白复合物另外以比双重应激疫苗（50μg）高的剂量（68μg）被检测。
图6显示对从经受单独的热应激（HS疫苗）或热和酸的双重应激组合（DS疫苗）的细胞制成的应激蛋白复合物的免疫应答的宽度，如通过针对不同的、异源的血清型的临床相关的肺炎链球菌菌株的酶联免疫测定（ELISA）测定的。阳性对照是来自用来自菌株Rx1的完整杀死的细胞免疫的小鼠的血清，且来自单一应激（仅热休克）的应激蛋白复合物另外以比双重应激疫苗（50μg）高的剂量（68μg）被检测。
发明详述
本发明提供了应激蛋白-肽复合物，其中该应激蛋白在细胞经受多种诱导应激的刺激、典型为热休克和呼吸应激或热休克和基于酸的应激之后被诱导产生。
本发明人已鉴定，用至少两种诱导应激的刺激应激细胞导致诱导显著较高的水平的热休克蛋白，由本发明人评价的产量的这一增加包括超过暴露于单一的诱导应激的刺激后产生的蛋白水平的至少2倍增加、优选3或4倍。这对于不同的诱导应激的刺激诸如热应激和呼吸应激是特别令人惊讶的，由于它们通常被认为被不同的遗传和转录元件进行控制。因此，将原核细胞暴露于热应激之后，对该诱导应激的刺激的响应中产生的热休克蛋白的量可进一步通过将细胞暴露于第二诱导应激的刺激被（并显著）增强是完全出人意料的。
此外，本发明人还惊人地鉴定了，使用本发明方法产生的热休克蛋白复合物比在单一诱导应激的刺激之后获得的相似的复合物，或当与组成型产生的热休克蛋白复合物相比时，更具免疫原性。因此，通过本发明的方法产生的热休克蛋白复合物比使用本领域已知的标准生产方法产生的热休克蛋白复合物更具免疫原性并可被用于产生改进的疫苗制品。
热休克蛋白复合物
在某些实施方案中，热休克蛋白复合物可以是包含复合至肽或肽片段的热休克蛋白的热休克蛋白复合物（HspC）。在某些实施方案中，热休克蛋白可以是源自将被纯化的细胞裂解物的任何合适的热休克蛋白。在某些实施方案中，热休克蛋白可选自包含但不限于以下的组的任一家族：hsp20-30kD；hsp40；hsp60；hsp70；hsp90；和hsp100。在某些另外的实施方案中，应激蛋白可以是被分类作为分子伴侣蛋白的蛋白。此蛋白可包括，但不限于选自以下组成的组的蛋白：DnaK、DnaJ、GroEL、GroES、hspX、acr2、AAA+、clpA/B、HtpG、TRIC、CCT、IbpA、IbpB、钙网蛋白、hsp40、hsp70、hsp72、hsp90、grp94、grp75、BiP/grp78、grp75/mt、gp96和小热休克蛋白（hsp）。在某些实施方案中，热休克蛋白是GroEL和/或DnaK是优选的。
在某些实施方案中，当提供了复合物的混合物时，这可包含一个特定家族的热休克蛋白，例如，hsp70或hsp60家族，尽管混合物包含源自不同家族的不同的热休克蛋白复合物是优选的。本发明的方法提供了用于纯化包含复合至（抗原）肽的热休克蛋白的所有复合物的方法，不论肽的身份、分子量或大小。
在某些实施方案中，目的热休克蛋白复合物包含源自被遗传修饰以组成型表达应激蛋白基因、和/或表达异源蛋白诸如抗原肽或肽片段的宿主细胞的热休克蛋白复合物。在某些另外的实施方案中，细胞可以是表达异源基因的宿主细胞，例如，携带包含感兴趣的抗原基因的表达载体构建体的酵母细胞。在又另外的实施方案中，细胞可以是源自人或动物受试对象的癌性细胞。
在某些另外的实施方案中，富集热休克蛋白复合物（HspC）的制品（HEP）包含来自不同应激蛋白家族或类的热休克蛋白，诸如DnaK、GroEL、hsp60、hsp65、hsp70和hsp90，使用本发明的方法将所述家族共纯化作为混合物。
在某些另外的实施方案中，富集热休克蛋白复合物（HspC）的制品（HEP）可以是具有特定分子量的热休克蛋白复合物。在某些实施方案中，应激蛋白复合物具有50KDa至900KDa范围的分子量。
疫苗组合物的施用
在某些实施方案中，本发明的疫苗组合物还可包含至少一种佐剂。在某些实施方案中，佐剂选自但不限于以下组成的组：弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、Quil A、Detox、ISCOM和角鲨烯。另外的适合的佐剂包括矿物凝胶或铝盐诸如氢氧化铝或磷酸铝，但也可以是钙、铁或锌盐，或可以是酰化酪氨酸、或酰化糖的不溶性悬浮液，或可以是阳离子或阴离子衍生糖类、聚磷腈、生物可降解的微米球、单磷酰脂A(MPL）、脂质A衍生物（例如，具有减弱毒性的）、3-0-脱酰基MPL、quil A、皂苷、QS21、弗氏不完全佐剂（Difco Laboratories,Detroit,MI）、Merck Adjuvant65（Merckand Company,Inc.,USA）、AS-2、AS01、AS03、AS04、AS15(GSK,USA)、MF59(Chiron,Sienna,Italy)、CpG寡核苷酸、生物粘合剂和粘膜粘附剂、微米粒子、脂质体、外膜囊泡、聚氧乙烯醚制剂、聚氧乙烯酯制剂、胞壁酰肽或咪唑喹啉化合物。
本发明的疫苗组合物或应激蛋白复合物可通过任何合适的途径被施用至需要治疗的受试对象。典型地，胃肠外施用组合物。其他可能的胃肠外施用途径的示例包括，但不限于，静脉内的、心脏内的、动脉内的、腹膜内的、肌内的、腔内的、皮下的、经粘膜、吸入或经皮。施用的途径还可包括局部和肠内，例如，粘膜的（包括肺的）、口的、鼻的或直肠的。制剂可以为液态，例如，生理盐溶液，包括pH6.8-7.6的非磷酸盐缓冲液，或冻干的或冷冻干燥的粉末。
在某些实施方案中，组合物可作为可注射的组合物递送。对于静脉注射，应激蛋白复合物将以胃肠外可接受的水溶液的形式，其是无热源的并具有适合的pH、等渗性和稳定性。具有本领域相关技术的人员将充分能够使用例如等渗的载运体（vehicle）诸如氯化钠注射液、林格注射液或乳酸钠林格注射液制备合适的溶液。根据需要，可包含防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。
在某些实施方案中，注射方法可以是无针的或可使用穿透真皮的针。在某些另外的实施方案中，疫苗适于口服施用，或可被经皮施用、或通过肺部递送。在某些实施方案中，疫苗组合物作为预防性疫苗被施用。在某些实施方案中，疫苗组合物作为治疗性疫苗被施用。在又另外的实施方案中，疫苗组合物被施用作为初次免疫计划介导的任何先前施用的疫苗的加强疫苗。
以上提及的技术和方案和根据本发明可被使用的其他技术和方案的示例可在Remington’s Pharmaceutical Sciences,第18版，Gennaro,A.R.,Lippincott Williams&Wilkins；第20版ISBN0-912734-04-3和Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems;Ansel,H.C.等人第7版，ISBN0-683305-72-7中找到，其完整公开内容通过引用并入本文。
本发明的疫苗组合物或热休克蛋白复合物还可通过微米球、脂质体、其他微米粒子递送系统或放置在某些组织包括血液中的缓释制剂被施用。
剂量方案可包括本发明的组合物的单次施用，或组合物的多次施用剂量。组合物还可与用于本发明组合物被施用以治疗的病症的治疗的其他疗法和药剂顺序地或分别地被施用。
施用的实际量、和施用的速率和时间进程，将取决于被治疗的问题的性质和严重程度。治疗的处方，例如，剂量等的决定，最终在全科医师和其他医生的职责之内并听凭全科医师和其他医生的处理，并通常考虑到待被治疗的疾患、个体患者的状况、递送的部位、施用的方法和从业者已知的其他因素。
定义
如本文定义的，术语“诱导应激的刺激”意思是能够在经受刺激的一个或多个细胞内诱导应激应答的刺激。如本文定义的，术语“多种（plurality of）诱导应激的刺激”或“多种（multiple）诱导应激的刺激”指的是至少两种诱导应激的刺激并指两种、三种或更多种诱导应激的刺激。诱导应激的刺激可包括，但不限于，呼吸应激、在有限的养分水平下的培养、暴露于细胞因子（诸如肿瘤坏死因子（TNF）或干扰素γ（IFN-γ））、病原体的渗透休克（特别地，一旦其通过添加高浓度的电解质诸如氯化钠至培养基中被培养至稳定生长期）、基于酸的应激、pH变化、代谢物限制或养分饥饿诸如铁或碳限制、在高压下的培养、暴露于重金属和暴露于氧化剂。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明领域技术人员通常理解的含义。
除非上下文另外要求，否则遍及说明书的术语“包含（comprise）”或“包括（include）”或诸如“包含（comprises）”或“包含（comprising）”、“包括（includes）”或“包括（including）”的变化形式将被理解为暗示包括所陈述的整体（integer）或整体的组，但不排除任何其他整体或整体的组。
如本文使用的，除非上下文另外清楚要求，否则术语诸如“一（a）”、“一（an）”和“该（the）”包括单数和复数指代对象。因此，例如，提及“一种活性剂”或“一种药物活性剂”包括单个活性剂和两种或多种不同的活性剂组合，而提及“一种载体”包括两种或多种载体的混合物和单个载体，和类似的载体。
如本文使用的，术语“治疗（treatment）”和相关术语诸如“治疗（treat）”和“治疗（treating）”是指引起抗免疫原性决定簇的保护性免疫应答以给予抗疫苗组合物的免疫原性决定簇源自其的病原体或癌细胞的长期保护性免疫。术语“治疗（treatment）”因此指的是能够有益于受试对象的任何方案。治疗可以涉及现存的病症或可以是预防性的（预防性治疗）。治疗可包括有疗效的、减轻的或预防性效果。
如本文使用的，术语“治疗有效量”是指诱导抗传染病或癌性病症的保护性免疫应答所需的本发明的应激蛋白复合物或疫苗组合物的量。如本文使用的，术语“预防有效量”指的是阻止传染病或癌性病症的首次发作、进展或复发所需的多种应激蛋白复合物或疫苗组合物的量。术语“治疗”不必然暗示受试对象被治疗直至完全痊愈。相似地，“预防”不必然是指受试对象将最终不感染疾病状况。
本发明上下文中的“受试对象”包括并包含哺乳动物诸如人、灵长类动物和家畜（例如，绵羊、猪、牛、马、驴）；实验室试验动物诸如小鼠、兔、大鼠和豚鼠；和陪伴动物诸如狗和猫。为了本发明的目的，哺乳动物是人是优选的。如本文使用的，术语“受试对象”可与术语“患者”互换。
如本文使用的，当涉及免疫应答所使用的术语“建立（mount）”、“建立（mounted）”、“引起（elicit）”或“引起（elicited）”是指抗被施用至受试对象的疫苗组合物的免疫原性决定簇产生的免疫应答。通常疫苗组合物的免疫原性决定簇包含使用本发明的方法获得的分离的和/或纯化的应激蛋白复合物。
如本文使用的，术语“免疫应答”包括由T细胞共刺激的调制影响的T细胞介导的和/或B细胞介导的免疫应答。术语免疫应答还包括由T细胞激活诸如抗体产生（体液应答）和细胞因子应答细胞诸如巨噬细胞的激活间接实现的免疫应答。
本说明书中涉及的所有文件通过引用并入本文。本发明描述的实施方案的多种修改和变化形式对本领域技术人员将是明显的，而不偏离本发明的范围。尽管本发明已结合特定的优选的实施方案被描述，应该理解的是请求保护的本发明不应被不适当地限制于此特定的实施方案。事实上，对本领域技术人员明显的实施本发明的描述方式的多种修改预期被本发明覆盖。在本说明书中提及的任何现有技术不被认为，且不应被认为承认或任何形式的暗示该现有技术在任何国家形成公知常识的部分。
实施例
现在将参考下面的实施例描述本发明，实施例被提供用于阐述的目的且不意在被解释为限制本发明。
实施例1-受到多种应激刺激的革兰氏阴性生物体中应激蛋白的改进的诱
导和免疫原性
于37℃在180rpm摇动下将奈瑟氏菌属的菌株（乳糖奈瑟氏球菌（N.lactamica）和MC58）最初生长在含有100mL的Frantz培养基的500mL不带有挡板的Erlenmeyer烧瓶中12小时，并随后接种至包含补充必需氨基酸的54L Frantz培养基的60L发酵罐中。于37℃在具有通过最大500rpm搅拌级联保持在>30%的溶氧张力（DOT）的情况下生长培养物。使用电偶溶解氧探头（New Brunswick Scientific）或氧化还原传感器（MettlerToledo）测量DOT。通过以0.25–0.5℃/min的速率升高发酵罐的温度至44℃热应激最终的发酵培养物。在一些培养物中，通过氧限制（呼吸应激）施加热休克以外的另外的应激。这通过当培养物的温度升至44℃时去除溶氧张力（DOT）级联控制并手动降低搅拌速率至约320-350rpm实现。将用于产物分析的样品在应激前、应激后0、1和2小时移出，并通过使用标准设备和操作说明（Invitrogen）由SDS-PAGE分析和蛋白印迹分析热休克蛋白的诱导。
图1中显示所获得的典型的结果，其清楚地显示了通过使用呼吸应激作为热应激的补充，GroEL和DnaK的时间依赖性的诱导（图1A，泳道2-7），如通过与重组的标准品（图1A，泳道8-10）共迁移可以鉴定的并如通过蛋白印迹可以确认的。通过经受仅热休克（泳道1）及热和呼吸应激的组合（泳道2）的培养物的直接比较（图1B）清楚地显示了不同应激刺激的出人意料的累加效应，泳道2显示了主要的热休克蛋白家族hsp60和hsp70的明显的增强。
如PCT专利申请号WO2010/026432中描述的，还将被应激的细胞沉淀物重悬在PBS中，使用Emulsiflex C5匀浆器裂解细胞并被用于通过离子交换色谱分析法制备富集热休克蛋白复合物（HspC）的疫苗组合物。如WO2010/026432中描述的将疫苗用于免疫8只小鼠的组并使用补体结合和调理吞噬测定定量抗体应答的功能性。图2中显示所获得的典型的结果，其清楚地显示了与包含源自经受单独的热休克的培养物（组2）的热休克蛋白复合物作为免疫原性决定簇的疫苗组合物相比，由包含源自经受热应激和呼吸应激二者的培养物（组3）的热休克蛋白复合物作为免疫原性决定簇的疫苗组合物引起的改进的免疫应答，如通过调理吞噬测定的（图2）。测定了针对一些荧光标记的异源奈瑟氏菌属菌株的被诱导的交叉反应的免疫原性并对作为阳性对照的同源OMV疫苗归一化。图2A-F阐述了针对一些临床相关的奈瑟氏菌属菌株，即M01-240013、M01-240101、M01-240149、M01-240185和M01-240355和H44/76-SL引起的改进的交叉反应的免疫原性，覆盖了广泛的异源循环血清型。
实施例2-受到多种应激刺激的革兰氏阳性生物体中应激蛋白的改进的诱
导和免疫原性
将分枝杆菌疫苗菌株BCG Danish(Statens Serum Institute)生长在补充有0.1%吐温80和消泡剂乳液C（Sigma）的Sauton培养基中。使用生长在37℃具有360rpm振动并具有通过最大500rpm的搅拌级联保持在>20%的溶氧张力（DOT）的条件下的2l培养物在3L生物反应器（Braun）中实施发酵。通过以0.25–0.5℃/min的速率升高发酵罐的温度至44℃热应激（热休克）最终的发酵培养物1小时。在一些培养物中，通过当培养物的温度升至44℃时去除溶氧张力（DOT）级联控制并手动降低搅拌速率至约320-350rpm实现氧限制（氧化应激）。
获得的结果显示了通过使用除热应激之外的呼吸应激，主要的热休克蛋白GroEL和DnaK的清楚的累加诱导。如WO2001/026432中描述的使用离子交换色谱分析法制备富集热休克蛋白的疫苗组合物并免疫小鼠和兔的组。抗体应答再次显示了由疫苗组合物引起的改进的免疫应答，其中免疫原性决定簇包含源自经受热应激和呼吸应激二者的培养物的热休克蛋白复合物，如通过使用被免疫的动物的血清的蛋白印迹和ELISA所测定的。改进的免疫原性导致增加的抗活H37Rv的气雾剂攻击的保护，与单个应激的BCG相比，用来自双重应激的疫苗组合物免疫的小鼠中肺菌落形成单位还具有0.8log的下降。
实施例3-受到多种应激刺激的兼性厌氧菌中应激蛋白的改进的诱导和免
疫原性
于37℃，将肺炎链球菌的实验室菌株Rx1生长在振荡培养箱中5%CO2气氛中的pH7.5的Hoeprich培养基中。使用0.5ml的原种(OD0.3)将培养物接种在40ml培养基中并在50rpm下生长5-6小时（OD0.2）。随后，使培养物经受多种诱导应激的刺激，包括在40℃热休克30-60分钟、通过去除CO2源的呼吸休克、通过添加HCl以调节培养物至pH5的pH应激和铁限制。通过使用标准设备和操作说明（Invitrogen）由SDS-PAGE分析和蛋白印迹分析培养物样品的热休克蛋白的诱导。使用由不同应激刺激诱导的GroEL(hsp60)和DnaK(hsp70)的比较（图3）选择最有前景的组合。图4显示使用所选择的热休克和酸应激的组合（泳道8、9和12、13）获得的结果，其显示了GroEL和DnaK二者的诱导超过由单独的热休克（泳道3）或酸应激（泳道4-6）诱导的明显的改进。
如WO2001/026432中描述的使用离子交换色谱分析法从经受热休克或热应激和酸应激的双重应激组合的Rx1培养物中制备富集热休克蛋白的疫苗组合物（HEP）并用于免疫小鼠的组。所引起的抗体应答清楚显示了由来自多种刺激的疫苗组合物介导的改进的免疫应答，如使用来自被免疫的动物的血清通过蛋白印迹、ELISA（图5）和OPA（图6）测定的。
从经受仅在42℃的热休克或热休克和酸休克（pH5）的双重应激组合的肺炎链球菌中分离HEP并用于免疫小鼠。还以高于来自双重应激的疫苗（50μg）的剂量（68μg和50μg）使用了来自单一应激的HEP疫苗，并与作为阳性对照的完整杀死的病原体的疫苗比较。来自由双重应激诱导的肺炎链球菌细胞的HEP疫苗（DS疫苗）清楚显示了超过单一应激的疫苗（HS疫苗）的改进的免疫原性，即使当后者以显著较高的剂量使用时（图5&6)。该改进的免疫原性不仅在通过OPA测定评价所引起的抗体的亲和力和亲合力中被观察到（图5），而且还在通过ELISA评价所产生的抗体抗临床相关的不同血清型的肺炎链球菌菌株的交叉反应性宽度中被观察到（图6）。用于说明由从经受双重应激的细胞中分离出的HEP疫苗诱导的改进的免疫宽度的异源菌株，覆盖了肺炎球菌疾病中存在于目前商业13价而非7价疫苗中的血清型（血清型19A）和未被这些疫苗覆盖的逃逸变体并具有新兴的临床重要性的血清型（血清型8和22F）。由双重应激HEP疫苗诱导的保护性免疫的宽度还显著好于使用完整细胞杀死疫苗观察到的。
实施例4-受到多种应激刺激的专性厌氧菌中应激蛋白的改进的诱导和免
疫原性
于37℃并在50rpm下，将艰难梭状芽胞杆菌的双毒素突变体的实验室菌株生长在振荡培养箱中H2:CO2:N2(比例10:10:80)气氛中的pH6.8的TY培养基中以获得OD0.5-0.7，并随后于44℃通过在环境空气中孵育2小时使培养物经受热应激和呼吸应激的组合。通过使用标准设备和操作说明（Invitrogen）由SDS-PAGE分析和蛋白印迹分析培养物样品的热休克蛋白的诱导。如WO2001/026432中描述的使用离子交换色谱分析法制备富集热休克蛋白的疫苗组合物并免疫小鼠的组。抗体应答再次显示了由疫苗组合物介导的改进的免疫应答，其中免疫原性决定簇包含源自经受热应激和呼吸应激二者的培养物的热休克蛋白复合物，如通过蛋白印迹和阻断细菌粘附至上皮细胞培养物的滴定法所测定的。
实施例5-真菌微生物中多种应激对应激蛋白的改进的诱导
于30℃，在5l的台式BioFlo310发酵罐（New Brunswick Scientific）中，将酿酒酵母菌株ATCC20602生长在以通过2-800rpm的搅拌速度获得的30%的溶解氧浓度的pH5的Difco YM生长培养基中。24小时之后，通过停止氧供给并升高温度至40℃1小时使培养物经受热应激和呼吸应激的组合。通过使用标准设备和操作说明（Invitrogen）由SDS-PAGE分析和蛋白印迹分析培养物样品的热休克蛋白的诱导。
Claims (32)
1.一种用于产生在应激蛋白和肽之间形成的应激蛋白复合物的方法，所述方法包含步骤：
(i)培养细胞，
(ii)将所述细胞暴露于多种诱导应激的刺激，和
(iii)从所述细胞中纯化所述应激蛋白复合物。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述多种诱导应激的刺激包含选自以下组成的组的至少两种诱导应激的刺激：热应激、呼吸应激、氧化应激、基于酸的应激、重金属应激、渗透应激、代谢物限制和养分饥饿。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述多种诱导应激的刺激包括热应激。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述热应激包含将所述被培养的细胞所暴露的热增加至大于所述细胞的正常生长温度约5℃-10℃的温度。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述多种诱导应激的刺激包括呼吸应激。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述呼吸应激包含从引起所述被培养的细胞正常生理生长或稳态的氧的量降低所述细胞所暴露的氧的量。
7.如权利要求5或6所述的方法，其中所述细胞在被暴露于所述呼吸应激之前被暴露于所述热应激。
8.如权利要求5或6所述的方法，其中所述细胞被同时暴露于所述热应激和所述呼吸应激。
9.如权利要求5或6所述的方法，其中所述细胞在被暴露于所述热应激之前被暴露于所述呼吸应激。
10.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述多种诱导应激的刺激包括基于酸的应激。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述基于酸的应激包含从引起所述被培养的细胞正常生理生长或稳态的pH降低所述细胞所暴露的pH。
12.如权利要求10或11所述的方法，其中所述细胞在被暴露于所述基于酸的应激之前被暴露于所述热应激。
13.如权利要求10或11所述的方法，其中所述细胞被同时暴露于所述热应激和所述基于酸的应激。
14.如权利要求10或11所述的方法，其中所述细胞在被暴露于所述热应激之前被暴露于所述基于酸的应激。
15.如权利要求2至14中任一项所述的方法，其中使所述细胞经受1至2小时范围时间段的所述热应激。
16.如任何前述权利要求所述的方法，其中所述细胞选自以下组成的组：病原细胞、癌性细胞、被病原生物体感染的细胞、被遗传修饰以组成型表达热休克蛋白的细胞、被遗传修饰以致它们表达源自癌性细胞的异源蛋白的细胞和被遗传修饰以致它们表达源自在宿主中造成传染病的病原体的异源蛋白的细胞。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述细胞是病原细胞。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述病原细胞选自以下组成的组：革兰氏阳性原核细胞、革兰氏阴性原核细胞、微生物细胞、原生动物细胞、病毒、真菌和寄生虫细胞。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述原核细胞选自以下组成的组：埃希氏菌属（Escherichia）、链球菌属（Streptococcus）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、博代氏菌属（Bordetella）、棒状杆菌属（Corynebacterium）、分枝杆菌属（Mycobacterium）、奈瑟氏菌属（Neisseria）、嗜血杆菌属（Haemophilus）、放线菌属（Actinomycetes）、链霉菌属（Streptomycetes）、诺卡菌属（Nocardia）、肠杆菌属（Enterobacter）、耶尔森氏菌属（Yersinia）、弗朗西斯氏菌属（Fancisella）、巴氏杆菌属（Pasturella）、莫拉克斯氏菌属（Moraxella）、不动杆菌属（Acinetobacter）、丹毒丝菌属（Erysipelothrix）、布兰汉氏球菌属（Branhamella）、放线杆菌属（Actinobacillus）、链杆菌属（Streptobacillus）、李斯特菌属（Listeria）、鞘杆菌属（Calymmatobacterium）、布鲁氏菌属（Brucella）、芽胞杆菌属（Bacillus）、梭状芽胞杆菌属（Clostridium）、密螺旋体属（Treponema）、沙门氏菌属（Salmonella）、克雷伯菌属（Kleibsiella）、弧菌属（Vibrio）、变形菌属（Proteus）、欧文氏菌属（Erwinia）、包柔螺旋体属（Borrelia）、钩端螺旋体属（Leptospira）、螺菌属（Spirillum）、弯曲杆菌属（Campylobacter）、志贺菌属（Shigella）、军团杆菌属（Legionella）、假单胞菌属（Pseudomonas）、气单胞菌属（Aeromonas）、立克次体属（Rickettsia）、衣原体属（Chlamydia）、包柔螺旋体属（Borrelia）和支原体属（Mycoplasma）。
20.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述细胞选自以下组成的组：奈瑟氏菌属、分枝杆菌属、酵母属和梭状芽胞杆菌属。
21.如权利要求10至15中任一项所述的方法，其中所述细胞是链球菌属。
22.如任何前述权利要求所述的方法，其中所述肽是肿瘤特异性抗原。
23.如权利要求3或4所述的方法，其中所述细胞是厌氧病原细胞且所述多种诱导应激的刺激包括将所述细胞暴露于氧化应激，所述氧化应激包含增加所述被培养的细胞所暴露的氧的量。
24.如任何前述权利要求所述的方法，其中所述纯化所述应激蛋白复合物的步骤包含步骤：
-提供包含所述应激蛋白复合物的澄清的细胞裂解物，
-使所述细胞裂解物经受使用离子交换的纯化，其中将所述细胞裂解物缓冲至目的应激蛋白复合物的pI的2个单位以内的pH，且其中使用盐梯度洗脱所述应激蛋白复合物，和
-获得包含所述热休克蛋白复合物的富集的制品。
25.如任何前述权利要求所述的方法，其中所述热休克蛋白复合物包含选自以下组成的组的一种或多种热休克蛋白：hsp20-30kD、hsp40、hsp60、hsp70、hsp90、hsp100、钙网蛋白、hsp72、grp94、grp75BiP/grp78、grp75/mt和gp96。
26.如任何前述权利要求所述的方法，其中所述热休克蛋白复合物包含GroEl和DnaK。
27.如任何前述权利要求所述的方法，其中所述应激蛋白复合物具有50KDa至900KDa范围的分子量。
28.一种疫苗组合物，包含通过权利要求1至27中任一项所述的方法获得的应激蛋白复合物。
29.通过权利要求1至27中任一项所述的方法产生的纯化的应激蛋白复合物在制备用于治疗传染病或癌性或恶性病症的药剂中的用途。
30.通过权利要求1至27中任一项所述的方法产生的应激蛋白复合物，所述应激蛋白复合物用于治疗传染病或癌性或恶性病症。
31.一种接种受试对象抗源自病原体的传染病或癌性病症的方法，所述方法包括步骤：
-提供包含根据权利要求1至27中任一项所述的方法产生的纯化的应激蛋白复合物作为免疫原性决定簇的疫苗组合物，和
-以足够在受试对象中引起抗所述应激蛋白复合物的免疫应答的量将治疗有效量或预防有效量的所述疫苗组合物施用至受试对象。
32.一种加强受试对象中由初次免疫接种程序介导的抗源自病原体的传染病或癌性病症的保护性免疫应答的方法，其中所述保护性免疫应答通过先前暴露于所述病原体或癌性病症或通过先前施用疫苗所引起，所述疫苗选自以下组成的组：活疫苗、减毒疫苗、如权利要求28中所述的疫苗组合物、核酸疫苗和蛋白疫苗，所述方法包含步骤：
-提供包含根据权利要求1至27中任一项所述的方法产生的纯化的应激蛋白复合物作为免疫原性决定簇的组合物，和
-以足够在受试对象中增强抗所述应激蛋白复合物的免疫应答的量将治疗有效量或预防有效量的所述组合物施用至受试对象。
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