ES2239321T3 - Un metodo de cultivo de bacterias que producen proteinas que se expresan de manera regulada por la temperatura. - Google Patents
Un metodo de cultivo de bacterias que producen proteinas que se expresan de manera regulada por la temperatura.Info
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Abstract
SE DESCRIBE UN METODO PARA CULTIVAR BACTERIAS CON GENES EN PLASMIDOS QUE CODIFICAN ANTIGENOS U OTRAS PROTEINAS DE UNION DE SUPERFICIE O DE MEMBRANA Y QUE SON EXPRESADAS DE MANERA REGULADA POR LA TEMPERATURA PARA LA PRODUCCION DE PRODUCTOS BACTERIALES DESADOS. LAS BACTERIAS SE CULTIVAN EN PRIMER LUGAR EN UN MEDIO DE CULTIVO A UN INOCULO BAJO CONDICIONES DE TEMPERATURA TALES QUE LAS BACTERIAS RETIENEN SUS PLASMIDOS Y NO TIENE LUGAR LA EXPRESION, POR EJEMPLO, 20 C; DESPUES EN UN MEDIO DE CULTIVO BAJO TALES CONDICIONES TIENE LUGAR LA EXPRESION Y ANTES DE QUE LA BACTERIA PIERDA SUS PLASMIDOS, ESTOS SON RECOLECTADOS Y EL PRODUCTO DESEADO ES AISLADO.
Description
Un método de cultivo de bacterias que producen
proteínas que se expresan de manera regulada por la
temperatura.
La presente invención se refiere a un método de
cultivo de bacterias. Más precisamente, el método se refiere a
cultivar bacterias que tienen genes en plásmidos que codifican
antígenos de superficie o unidos a membrana u otras proteínas que se
expresan de manera regulada por la temperatura para la producción de
productos bacterianos desea-
dos.
dos.
Las bacterias y virus expresan a menudo sobre o
dentro de su membrana proteínas que en un cierto entorno funcionan
como soporte del organismo para asociarse de un modo específico o
adherirse a una superficie. Dicha superficie puede ser la pared
interna del tracto gastrointestinal, el esófago o cualquier otra
superficie biológica o membrana en un cuerpo humano o animal en la
que un organismo puede encontrar un entorno óptimo para el
crecimiento. Las proteínas de membrana de este tipo se denominan a
menudo antígenos de factor de colonización (AFC) o fimbrias. En la
bibliografía, se utilizan otras palabras tales como pili,
hemaglutininas, proteínas filamentosas o fibrilares para el mismo
tipo de sustancias. Por conveniencia, se utilizará "AFC" en la
presente memoria para cubrir todos estos tipos de proteína de
membrana que pueden tener también un carácter antigénico.
Se ha mostrado que una serie de bacterias que son
de interés médico producen AFC asociados a su membrana. Entre éstas,
las que son más importantes para seres humanos son organismos que
colonizan el tracto gastrointestinal y las vías respiratorias
humanos. Son ejemplos de organismos que colonizan el tracto
gastrointestinal Escherichia coli enterotoxigénica, Vibrio
cholerae, Helicobacter pylori, Campylobacter, Shigellae,
Salmonellae y Yersinia.
Es de interés médico particular la Escherichia
coli enterotoxigénica (ECET), puesto que es una de las causas
principales de diarrea entre los niños en los países en desarrollo y
da cuenta de más de mil millones de episodios de diarrea y al menos
un millón de muertes al año, principalmente entre niños. Del mismo
modo, Vibrio cholerae y Campylobacter causan diarrea
entre la gente de los países en desarrollo. ECET y
Campylobacter son también la causa principal de diarrea entre
los viajeros a estas regiones. Ha cobrado importancia recientemente
Helicobacter pylori debido a su conexión con úlceras de
estómago.
Para la mayoría de estos organismos, la
producción de sus AFC está controlada por diversos factores en el
entorno, que a su vez pueden activar los genes reguladores en el ADN
de plásmido.
Por tanto, para una bacteria que tiene su entorno
de crecimiento natural en el intestino humano, es ventajoso
optimizar su crecimiento y su posibilidad de supervivencia en las
condiciones del intestino. En otras palabras, existe una estrategia
óptima de supervivencia que implica la producción de proteínas
adhesivas en el entorno cuando hay condiciones adecuadas para la
supervivencia.
Como es conocido por la bibliografía, uno de
dichos parámetros que activa los genes de plásmido reguladores es la
temperatura, implicando que la producción de AFC en una serie de
bacterias está regulada por la temperatura. Se ha mostradoque
diversos organismos patogénicos humanos producen AFC sólo a
temperaturas por encima de la temperatura ambiente, y no a
temperatura ambiente. Algunos de estos organismos son de interés
comercial específico, puesto que se ha mostrado que es posible
producir vacunas orales contra estos organismos o bacterias.
En el documento WO 92/14487, se da a conocer un
método para la producción y uso de una vacuna de ECET oral. Las
bacterias ECET se hacen crecer a 37ºC en placas de agar en medio
líquido para obtener cantidades comerciales de bacterias ECET con
AFC y sus subcomponentes (antígenos CS). Estas bacterias destruidas
posteriormente con formalina pueden utilizarse después como vacuna
oral contra las bacterias ECET. Los antígenos AFC y CS funcionarán
por tanto como antígenos en el procesamiento inmunológico que tendrá
lugar en el intestino.
En el escalado de la producción de bacterias ECET
que tienen AFC, se encontró sorprendentemente que las bacterias
perdían su capacidad de producir AFC cada vez más en cada nueva
generación. Al estudiar la razón para esto, se observó que la
pérdida de la capacidad de las bacterias de producir AFC a
temperaturas por encima de la temperatura ambiente estaba acompañada
por una pérdida del gen regulador localizado en un plásmido en la
bacteria.
La presente invención está dirigida a un método
de cultivo de bacterias Escherichia coli enterotoxigénicas
(ECET) que tienen genes en plásmidos que codifican al menos un tipo
de antígeno de factor de colonización seleccionado del grupo
constituido por CFA/I, CS1, CS2, CS3, CS4, CS5 y CS6, y que se
expresan de manera regulada por la temperatura, para la producción
de dicho(s) antígeno(s) de factor de colonización,
comprendiendo dicho méto-
do:
do:
cultivar dichas bacterias ECET en un medio de
cultivo a temperatura ambiente de modo que las bacterias retengan
sus plásmidos y no ocurra expresión de dicho(s)
antígeno(s) de factor de colonización;
cultivar adicionalmente dichas bacterias ETEC en
un medio de cultivo a 34-39ºC, de modo que ocurra la
expresión de dicho(s) antígeno(s) de factor de
colonización; y
recoger las bacterias ECET antes de que pierdan
sus plásmidos.
Los antígenos de factor de colonización pueden
aislarse después a partir de las bacterias ECET preparadas
utilizando dicho método.
En una realización preferida, la temperatura
ambiente es de aproximadamente 20ºC.
En otra realización preferida, el primer cultivo
se realiza en dos etapas, primero en una placa de cultivo y después
en un medio de cultivo líquido.
En aún otra realización preferida de la
invención, el cultivo adicional se realiza en un medio de cultivo
líquido.
Estas realizaciones preferidas de la invención
hacen posible cultivar bacterias ECET que tienen genes en plásmidos
que codifican al menos un tipo de antígeno de factor de colonización
seleccionado del grupo constituido por CFA/1, CS1, CS2, CS3, CS4,
CS5 y CS6, y que se expresan de manera regulada por la temperatura,
en fermentadores a gran escala para la producción a gran escala de
los productos bacterianos deseados.
Las bacterias ECET utilizadas en los ejemplos de
la invención pueden ser capaces de expresar CS2 y CS3, CS4, CS1 o
CS5. El cultivo adicional de estas bacterias se lleva a cabo a 37ºC
en los ejemplos.
La Figura 1 ilustra el cultivo de una cepa de
ECET que expresa antígenos CS2+CS3 a 20ºC, 20ºC + 37ºC y 37ºC.
En los siguientes ejemplos, se ha utilizado medio
AFC como medio de cultivo. La composición del medio AFC líquido es
la siguiente: casaminoácidos al 1% (p/v), extracto de levadura al
0,078% (p/v), MgSO_{4} 0,4 mM, MnCl_{2} 0,04 mM, H_{2}O
desionizada, pH 7,4. Como placas de cultivo, se han utilizado placas
de agar AFC. Éstas incluyen medio AFC con 20 g/l de agar
añadidos.
Se tomó una cepa ECET que expresa antígenos
CS2+CS3 a -70ºC y se evaluó respecto a la expresión de los
componentes de membrana del modo siguiente.
Se inocularon placas de agar AFC con la cepa
CS2+CS3 y se incubaron a 20ºC ó 37ºC durante 24 horas. Se recogieron
las bacterias de las placas y se inocularon adicionalmente muestras
que contenían 40 x 10^{6} bacterias de cada una en un cultivo
agitado de 800 ml (medio AFC) a 20ºC ó 37ºC durante otras 24 horas.
A las 70 horas, se tomó una muestra de 4,5 ml del cultivo a 20ºC y
se cultivó adicionalmente a 37ºC en un cultivo agitado de 800 ml
(medio AFC). Se analizó a diversos intervalos la expresión de CS2
con una técnica ELISA que utiliza un anticuerpo monoclonal que se ha
mostrado que tiene especificidad por el antígeno CS2. Todos los
resultados de ELISA se han ajustado a la cantidad estandarizada de
bacterias medida por su densidad óptica. Los resultados medidos en
unidades arbitrarias ELISA se presentan en la Tabla 1.
| Tiempo (horas) | Unidades ELISA a 20ºC | Unidades ELISA a 20ºC + 37ºC | Unidades ELISA a 37ºC |
| 0 | 8 | 8 | 8 |
| 24 | 8 | 8 | 643 |
| 48 | 8 | 8 | 762 |
| 54 | 8 | 8 | 897 |
| 70 | 25 | 25 | 1127 |
| 74 | 58 | 361 | 814 |
| 79 | 64 | 736 | 537 |
| 96 | 85 | 850 | 214 |
Los datos en la Tabla 1 se ilustran también en la
Fig. 1
En las mismas condiciones que en el ejemplo 1, se
hicieron crecer bacterias ECET con antígeno CS4 en medio AFC
líquido. Después de muestrear a las 31 horas, se elevó la
temperatura a 37ºC.
Los resultados medidos en unidades ELISA
arbitrarias pueden observarse en la Tabla 2.
| Tiempo (horas) | Unidades ELISA a 20ºC | Unidades ELISA a 20ºC + 37ºC |
| 0 | 0 | 0 |
| 24 | 0 | 0 |
| 26 | 0 | 0 |
| 29 | 0 | 0 |
| 31 | 0 | 0 |
| 48 | 0 | 8 |
| 52 | 1 | 9 |
| 54 | 1 | 10 |
En las mismas condiciones del ejemplo 1, se
hicieron crecer bacterias ECET con antígeno CS5 en medio AFC
líquido. Después de muestrear a las 31 horas, se elevó la
temperatura a 37ºC.
El resultado medido en unidades ELISA arbitrarias
puede observarse en la Tabla 3.
| Tiempo (horas) | Unidades ELISA a 20ºC | Unidades ELISA a 20ºC + 37ºC |
| 0 | 0 | 0 |
| 24 | 0 | 0 |
| 26 | 0 | 0 |
| 29 | 0 | 0 |
| 31 | 0 | 0 |
| 48 | 1 | 5 |
| 52 | 1 | 8 |
| 54 | 1 | 8 |
Se hizo crecer durante una noche un cultivo de
bacterias ECET que expresan el antígeno CS1 en medio AFC líquido en
un agitador a 37ºC. Se sembraron las colonias en agar AFC y se
incubaron a 37ºC durante una noche. Al día siguiente, se detectaron
colonias que expresaban fimbrias CS1 mediante un método de
transferencia de colonia que utiliza un anticuerpo monoclonal de
ratón específico de CS1 como segundo anticuerpo. Se desarrollaron
las inmunotransferencias mediante una tinción con sal de tetrasodio
de azul nitro. Se recogieron y cultivaron las colonias positivas y
negativas de fimbrias CS1 individuales, y se extendieron en placas
de agar AFC como se describen anteriormente.
Esta vez, se sondeó cada placa con un filtro del
anticuerpo monoclonal específico de CS1 como se describe
anteriormente, y también con un filtro que se utilizó para
hibridación de colonia con una de las dos sondas marcadas
radiactivamente (32P): una sonda específica del gen estructural de
CS1 (cooA) y una sonda específica de la proteína reguladora RNS
(rns).
Colonias positivas: Todas las colonias con
calificación positiva con el ensayo de anticuerpo tuvieron también
calificación positiva con la sonda rns y la sonda CS1.
Colonias negativas: Ninguna colonia que con
calificación negativa con el anticuerpo tuvo reacción con la sonda
rns, unas pocas colonias negativas habían perdido también su
reactividad con la sonda CS1, pero la mayoría de ellas habían
retenido sus genes estructurales CS1.
En conclusión, hay una pérdida concomitante de
reactividad de anticuerpo CS1 (expresión de fimbrias CS1) y pérdida
de reactividad con la sonda rns (pérdida del plásmido que codifica
el gen rns).
Claims (10)
1. Un método de cultivo de bacterias
Escherichia coli enterotoxigénicas (ECET) que tienen genes en
plásmidos que codifican al menos un tipo de antígeno de factor de
colonización seleccionado del grupo constituido por CFA/I, CS1, CS2,
CS3, CS4, CS5 y CS6, y que se expresan de manera regulada por la
temperatura, para la producción de dicho(s)
antígeno(s) de factor de colonización, comprendiendo dicho
método:
cultivar dichas bacterias ECET en un medio de
cultivo a temperatura ambiente de modo que las bacterias retengan
sus plásmidos y no ocurra expresión de dicho(s)
antígeno(s) de factor de colonización;
cultivar adicionalmente dichas bacterias ETEC en
un medio de cultivo a 34-39ºC, de modo que ocurra la
expresión de dicho(s) antígeno(s) de factor de
colonización; y
recoger las bacterias ECET antes de que pierdan
sus plásmidos.
2. Un método según la reivindicación 1, que
comprende además aislar dicho(s) antígeno(s) de factor
de colonización a partir de dichas bacterias ECET.
3. Un método según la reivindicación 1 ó 2, en el
que dicha temperatura ambiente es de aproximadamente 20ºC.
4. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el primer cultivo se realiza
en dos etapas, primero en una placa de cultivo y después en un medio
de cultivo líquido.
5. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el cultivo adicional se
realiza en un medio de cultivo líquido.
6. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que las bacterias ECET son
capaces de expresar CS2 y CS3.
7. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que las bacterias ECET son capaces de
expresar CS4.
8. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que las bacterias ECET son capaces de
expresar CS1.
9. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que las bacterias ECET son capaces de
expresar CS5.
10. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 9, en el que el cultivo adicional se lleva a
cabo a 37ºC.
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