JPH05219963A - 温度誘導分泌発現ベクターおよびその原核細胞での使用 - Google Patents

温度誘導分泌発現ベクターおよびその原核細胞での使用

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JPH05219963A
JPH05219963A JP3178516A JP17851691A JPH05219963A JP H05219963 A JPH05219963 A JP H05219963A JP 3178516 A JP3178516 A JP 3178516A JP 17851691 A JP17851691 A JP 17851691A JP H05219963 A JPH05219963 A JP H05219963A
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temperature
region
secretion
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Nancy Beerman
ビアマン ナンシー
Sohel Talib
タリブ ソーエル
Thomas B Okarma
ビー． オカーマ トーマス
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Applied Immune Sciences Inc
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    • C07K2319/705—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a protein-A fusion

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【構成】 原核細胞内で異種タンパクを発現させるため
の温度誘導分泌発現ベクター。このベクターは、作動可
能にインビトロで連結された要素を含み、該要素は、転
写の５’−３’方向に、ＣIレプレッサーに結合し得る
ヌクレオチド配列を有する転写開始領域と、原核細胞か
ら目的とするポリペプチドを分泌するよう指示し得るシ
グナル配列をコードする第１のＤＮＡ配列と、該転写開
始領域によって発現される目的とするポリペプチドをコ
ードする第２のＤＮＡ配列と、必要に応じて転写終結領
域とを有する。その分泌発現ベクターで宿主細胞を形質
転換し、次いで増殖させ、次いで誘導して異種タンパク
を発現させる。 【効果】 上記ベクターは、同位相でシグナル配列を有
する適切な遺伝子を挿入することによって、温度感受性
変異を欠いている原核細胞内に目的とするタンパクを発
現・分泌させるのに使用できる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ポリペプチド、特に異
種ポリペプチドの組成物、および該ポリペプチドを、組
換えＤＮＡ法を用いて微生物内で製造する方法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】分子生物学の技術が急速に発展して、目
的とする遺伝子のクローン化の可能性が増大し続けてい
る。その結果、研究、治療もしくは産業上の目的のため
に大量の異種タンパクを製造する方法に関する要望も増
大している。外来タンパクを発現する宿主としてイー・
コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）を使用することは比較的ありふれ
たことになっており、イー・コリ内で外来タンパクを高
レベルで発現するいくつかのベクターが開発されてい
る。
【０００３】温度感受性ベクターには、培養温度を３０
℃から４２℃に単に変えるだけで発現を容易に誘導する
ことができる利点がある。また温度誘導発現法によれば
異種タンパクを異化抑制もしくはフィードバック阻害を
受けることなく得るために、増殖培地を最適化すること
ができる。さらに加わる利点は、温度感受性ベクターを
使用すると、イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド
（ＩＰＴＧ）の必要がなくなるということである。この
ＩＰＴＧはｌａｃもしくはｔａｃプロモーターを使うベ
クターから発現を誘導するのに普通用いられるものであ
るが、タンパクの大規模生産を行う場合には費用が増大
する。しかしイー・コリ内で使用する発現ベクターで現
在入手できるものには著しい欠点がある。すなわち、得
られるタンパクが、細胞の細胞質内で不溶性で不活性の
形態で見出されることが多い。得られるタンパクが精製
中もしくは精製後に可溶化することができるならば活性
を回復させることができるが、これは困難でしかも不成
功に終わることが多い工程である。
【０００４】シグナルペプチドを用いて、発現されたタ
ンパクをイー・コリの細胞周辺腔に送る分泌発現ベクタ
ーが開発されており、この周辺腔ではタンパクは可溶性
の活性型で見出されることが多い。分泌発現ベクターを
使用すると次のような追加の利点がある。すなわち、異
種タンパクの分解に対する保護、宿主細胞に対して有害
なタンパクの発現に対する耐性、天然に存在するタンパ
クと同一のアミノ末端を有するタンパクの産生、および
細胞周辺腔内に存在する汚染タンパクが少数であるため
精製が簡単なことである。それ故に、温度誘導発現の利
点と、イー・コリ内で異種タンパクの生産において分泌
を行うという利点を兼ね備えた分泌発現ベクターを開発
することは興味あることである。
【０００５】（関連文献）温度感受性ベクターｐＨＥ６
は、Ｍｉｌｍａｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ、１５３巻、４８２〜４９１頁、１９８７
年、に開示されている。イー・コリ内で異種タンパクを
高レベルで発現するように設計されたその他のベクター
も開示されている（Ｄｕｆｆａｒｄ等、Ｍｅｔｈｏｄ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１５３巻、４９２〜５０
７頁、１９８７年；Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ等、Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、４巻、１００６〜１０１１頁、１
９８６年；ＴａｂｏｒおよびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ、Ｐ
ｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．（ＵＳ
Ａ）、８２巻、１０７４〜１０７８頁、１９８８年；Ｃ
ｒｏｗｌ等、Ｇｅｎｅ、３８巻、３１〜３８頁、１９８
５年）。
【０００６】分泌発現ベクターは、Ｇｈｒａｙｅｂ等、
ＥＭＢＯ Ｊ．、３巻、２４３７〜２４４２頁、１９８
４年、およびＭｉｙａｋｅ等、Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．、９７巻、１４２９〜１４３６頁、１９８５年に記
載されている。ジスフィルド結合の適正な生成（Ｄｏｌ
ｌｉｔｔおよびＺａｌｋｉｎ、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ．、２７〜３２頁、１９８３年、およびＨｓｉｕｎｇ
等、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、４巻、９９１〜９９
５頁、１９８６年）；および細胞周辺腔における活性二
量体の適正な生成（ＳｋｅｒｒａおよびＰｌｕｃｋｔｈ
ｕｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０巻、１０３８〜１０４１
頁、１９８８年）も報告されている。分泌ベクターの総
説についてはＭａｒｓｔｏｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｊ．、２４０巻、１〜１２頁、１９８６年を参照のこ
と。
【０００７】
【発明の要約】原核宿主細胞からの活性遺伝子産物の発
現および分泌の温度感受性誘導を行う分泌発現ベクター
とその製造方法と使用について述べる。その発現ベクタ
ーは、温度感受性レプレッサーに結合しうるヌクレオチ
ド配列を有する転写開始領域、目的とするポリペプチド
の宿主細胞からの分泌を指示し得るシグナル配列をコー
ドするＤＮＡ配列、および必要に応じて転写終結領域を
備えている。さらに分泌ベクターは、温度感受性レプレ
ッサーをコードする遺伝子をもっている。
【０００８】本発明の分泌発現プラスミド（ベクター）
は、作動可能にインビトロで連結された要素を含む分泌
発現プラスミドであって、該要素が、転写の５’−３’
方向に、ＣIレプレッサーに結合し得るヌクレオチド配
列を有する転写開始領域と、原核細胞から目的とするポ
リペプチドを分泌するよう指示し得るシグナル配列をコ
ードする第１のＤＮＡ配列と、該転写開始領域によって
発現される目的とするポリペプチドをコードする第２の
ＤＮＡ配列を挿入するための少なくとも１つの制限部位
と、必要に応じて転写終結領域とを有する。
【０００９】本発明の分泌発現ベクターは、作動可能に
インビトロで連結された要素を含む分泌発現ベクターで
あって、該要素が、転写の５’−３’方向に、ＣIレプ
レッサーに結合し得るヌクレオチド配列を有する転写開
始領域と、原核細胞から目的とするポリペプチドを分泌
するよう指示し得るシグナル配列をコードする第１のＤ
ＮＡ配列と、該転写開始領域によって発現される目的と
するポリペプチドをコードする第２のＤＮＡ配列と、必
要に応じて転写終結領域とを有する。
【００１０】好適な実施態様においては、上記許容温度
は約３０℃〜３２℃であり、そして前記誘導温度が約４
２℃〜４４℃である。
【００１１】宿主細胞は次のようにして利用される。す
なわち宿主細胞は発現ベクターで形質転換され、次いで
所望の細胞密度に到達するまで許容温度で栄養培地内で
増殖される。次にレプレッサーを不活性にするのに充分
な温度まで昇温し、目的とする該ポリペプチドの転写を
誘導する。
【００１２】原核宿主細胞から目的とするポリペプチド
の温度誘導分泌を行わせる本発明の方法は、次の工程を
包含する：転写の５’−３’方向に、ＣIレプレッサー
に結合し得るヌクレオチド配列を有する転写開始領域
と、シグナル配列をコードする第１のＤＮＡ配列と、該
転写開始領域によって発現される目的とするポリペプチ
ドをコードする第２のＤＮＡ配列と、必要に応じて転写
終結領域とを有する、作動可能にインビトロで連結され
た要素を含む分泌発現ベクターを有するが、温度感受性
の変異を欠いている原核宿主細胞を、栄養培地内で許容
温度で増殖させて、該細胞を複数得る工程；および該栄
養培地の温度を、前記転写開始領域からの転写を誘導す
るのに充分な温度にまで上昇させて、該目的とするポリ
ペプチドを発現させて該宿主細胞から分泌させる工程。
【００１３】好適な実施態様においては、上記発現ベク
ターは、ｐＮＢ１もしくはｐＮＢ２である。
【００１４】
【発明の構成】本発明にしたがって、温度誘導分泌ベク
ター、その製造方法およびその使用を述べる。その分泌
ベクターは温度誘導発現と、活性遺伝子産物の分泌を与
える。その発現ベクターは、プロモーターからの発現を
制限して所望のポリペプチドの温度誘導発現を行う温度
感受性レプレッサーを含有し、さらに、目的とするポリ
ペプチドを分泌するためのシグナル配列を含有してい
る。この分泌発現ベクターは、生成した形質転換細胞が
安定して分泌発現ベクターを維持する条件下で、宿主細
胞に導入される。天然に存在するＤＮＡもしくは合成Ｄ
ＮＡが、そのＤＮＡでコードされる目的とするポリペプ
チドの産生に用いられる。分泌発現ベクターは、シグナ
ルペプチドと目的とするポリペプチドとを含有する融合
発現産物を提供する。
【００１５】この発現の発現ベクターは下記の基本構造
を持っている。
【００１６】Ｐ−−Ｓ．Ｄ．−−Ｍｅｔ−−Ｓ−−Ｇ−
−（Ｔ）0もしくは1 ここで、Ｐは、翻訳開始部位から上流の約−３５位およ
び−１０位にあるヌクレオチドの位置にある調節領域を
コードするプロモーター配列と、ＣIレプレッサーに結
合し得る配列を有している。
【００１７】Ｓ．Ｄ．はシャイン・ダルガルノ配列を含
有している。
【００１８】Ｍｅｔは、目的とするシグナルペプチドの
開始メチオニンコドンを、有している。
【００１９】Ｓは、宿主細胞から目的とするポリペプチ
ドを分泌させかつ目的とするポリペプチドからシグナル
配列を切断させる、シグナル配列をコードするＤＮＡを
有している。
【００２０】Ｇは目的とするポリペプチドをコードする
ＤＮＡ配列を有している。
【００２１】Ｔは必要に応じて転写終結領域を有してい
る。
【００２２】原核細胞のプロモーターすなわち転写調節
領域は、転写の効率に作用するヌクレオチド配列を有し
ている。この配列は、翻訳開始部位から約−３５位から
−１０位のヌクレオチドに調節領域を備えている。この
転写調節領域は、さらに、目的とするポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ配列の発現時間を、増殖培地の温度によ
って調節できる調節配列をもっている。温度感受性の転
写を行う転写調節領域すなわちプロモーターの例は、Ｃ
I８５７レプレッサーに結合するプロモーター（例えば
λ左およびλ右のプロモーターなど）をもっている。こ
れらの配列と少なくともほぼ同じヌクレオチド配列を有
する合成プロモーターも使用できる。
【００２３】好ましい転写調節領域はバクテリオファー
ジλＰLプロモーターである。このλＰLプロモーターを
用いると、その転写調節領域はさらにバクテリオファー
ジＯLオペレーターを含有している。温度感受性ＣIレプ
レッサーをコードするＣI８５７遺伝子は、分泌発現ベ
クターに含有されている。これによって、低温（例えば
約３０℃）においてレプレッサーとオペレーター間の相
互作用によってプロモーターを調節することができる。
温度を約４２℃まで上昇させるとレプレッサーが不活性
化され、目的とする遺伝子を発現することができる。
【００２４】その転写調節領域は、転写を終結し、ｍＲ
ＮＡの分解を阻止してｍＲＮＡ種の安定性を増大させか
つ高い発現をさせる配列もしくは構造を有する調節配列
を必要に応じて有する。原核配列のいくつもの例が知ら
れている（例えば、Ｔｒｐターミネーター、３２（Ｔ
４）遺伝子ターミネーター、または配列が遺伝子３２に
類似している合成ターミネーター）。
【００２５】目的とするポリペプチドの分泌はシグナル
配列を用いて達成することができる。シグナル配列をコ
ードするＤＮＡ配列は、目的とするポリペプチドをコー
ドするＤＮＡ配列の上流で該ＤＮＡ配列の読取り枠内に
連結されている。典型的には、シグナル配列は、シグナ
ル配列ペプチダーゼによって認識される切断部位を含有
している。したがってシグナル配列切断部位のすぐ後に
目的とするポリペプチドを置けば、目的とするポリペプ
チドをシグナル配列から特異的に切断して成熟ポリペプ
チドとして分泌させることができる。
【００２６】シグナル配列をコードするＤＮＡ配列は、
通常分泌されるポリペプチドをコードする遺伝子から得
られうるシグナル配列をコードするＤＮＡ配列であ
る。”から得られうる”という用語は、天然の起源から
得ることができるＤＮＡ配列を意味する。シグナル配列
をコードするＤＮＡ配列は、天然に存在する配列と同一
でもよく、または目的とするポリペプチドを直接分泌で
きる生成シグナル配列の性能に影響しない限り配列に変
化があってもよい。シグナル配列の例としては、次のよ
うな遺伝子由来のシグナル配列がある。即ちｏｍｐＡ遺
伝子（Ｍｏｖｖａ等、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ、２５５巻、２７〜２９頁、１９８０
年）；ｐｈｏＡ遺伝子（Ｉｎｏｕｙｅ等、Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１４９巻、４３
４〜４３９頁、１９８２年）；ｏｍｐＦ遺伝子（Ｉｔｅ
ｂｇｂｅｐｈ等、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、７７巻、２６２１〜２６２５頁、
１９８０年）；ｏｍｐＣ遺伝子（Ｍｉｚｕｎｏ等、ＦＥ
ＢＳ Ｌｅｔｔ．、１５１巻、１５９〜１６４頁、１９
８３年）；ｐｈｏＥ遺伝子（Ｏｖｅｒｂｅｃｋ等、Ｊ．
Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、１６３巻、５１３〜５３２
頁、１９８３年）；ｏｍｐＦ遺伝子（ＭｕｔｕｈＦＥＢ
Ｓ Ｌｅｔｔ．、１３７巻、１７１〜１７２頁、１９８
２年）由来のシグナル配列である。
【００２７】本発明で使用されるその他のシグナル配列
は、以下の特性に基づいて決定することができる。シグ
ナル配列は一般にほぼ同じ長さ、すなわち約２０〜３０
のアミノ酸である。その上、シグナル配列のアミノ酸配
列は、約１〜７の親水性アミノ酸のセグメントで始ま
り、そのセグメントはプラスの電荷を有する約１〜３個
のアミノ酸残基を有する短いアミノ酸配列で終結してい
る。一般に、シグナル配列のその他の結合は、通常、疎
水性コアと呼ばれている約１５〜２０のアミノ酸残基を
有する疎水性領域で構成されている。このような配列
は、例えば、読取り枠によってコードされるアミノ酸配
列についての疎水性曲線を決定するコンピュータ走査に
よって決定される。
【００２８】一般に、シグナル配列は、上記のような所
望の配列を有するオリゴマーを合成することによって作
製することができる。いくつかの例では、シグナル配列
をコードするＤＮＡ配列に制限部位を導入することが必
要か、もしくは望ましい。可能であれば、その変化は天
然に存在するシグナル配列のアミノ酸配列に関して影響
がない。必要に応じて、制限部位は、目的とするポリペ
プチドをコードするＤＮＡ配列と連結している適切な発
現プラスミドに、合成シグナル配列を挿入し易いよう
に、合成シグナル配列の５’末端および／または３’末
端に含有されている。
【００２９】目的とするポリペプチドは、発現が望まれ
るポリペプチドであり、かつ宿主細胞に対し、同種のポ
リペプチド（宿主細胞由来のＤＮＡによってコードされ
ている）か、または異種ポリペプチド（外来起源由来の
ＤＮＡ、または全体もしくは部分的に合成のＤＮＡ配列
によってコードされている）である。ポリペプチドが、
宿主細胞に対して同種である場合は、宿主細胞に対して
自生もしくは内生である。ポリペプチドは原核起源もし
くは真核起源から誘導されるが、後者には、真菌類、原
生動物、脊椎動物、無脊椎動物などが含まれる。目的と
するポリペプチドとしては抗トリプシンαおよびＤＨＦ
Ｒのような酵素；いずれかのインターフェロン（α、
β、γ）ＩＬ−２などのような哺乳類ペプチドが含ま
れ、あるいは１種を越える種類のポリペプチド由来のキ
メラポリペプチドであってもよい。
【００３０】目的とする遺伝子が、目的とする所望の遺
伝子の天然の転写調節領域と天然の翻訳調節領域を認識
する宿主内で発現される場合は、その５’と３’の天然
の調節領域を有する遺伝子の全体が適切な分泌発現ベク
ターに導入される。しかし遺伝子が、目的とする遺伝子
に関連する天然の転写調節領域と天然の翻訳調節領域と
を認識しない宿主内で発現させる場合は、別の操作が必
要である。目的とする遺伝子の上流に位置する非コード
領域もしくは５’領域は、エンドヌクレアーゼ制限、Ｂ
ａｌ３１消化などの方法によって除去することができ
る。あるいは、便利な制限部位が目的とする遺伝子の
５’末端の近傍に存在している場合は、目的とする遺伝
子が切断され、目的とする遺伝子をプロモーター領域に
連結するためにアダプターが用いられ、このアダプター
が目的とする遺伝子の失われたヌクレオチドを提供す
る。各種の３’転写調節領域が知られており、終始コド
ンの下流に挿入される。
【００３１】目的とするポリペプチドをコードするＤＮ
Ａ配列は、重複する一本鎖を与える通常の方法を用いて
合成することができ、この一本鎖はアニールされ所望の
コード領域が形成される。末端は制限部位を与えるよう
に設計されるか、または１つの末端もしくは両末端は、
発現ベクターの相補的な末端に連結するために、平滑末
端にする。発現ベクターは、広く入手できることがで
き、文献に十分に記載されている。
【００３２】目的とするポリペプチドをコードするＤＮ
Ａを合成する代わりに、ＤＮＡを各種の方法で単離する
ことができる。これらの方法には、目的とするポリペプ
チドをコードする宿主生物からｍＲＮＡを単離するこ
と、得られたｍＲＮＡで逆転写すること、得られた一本
鎖（ｓｓ）ＤＮＡを鋳型として用いて二本鎖（ｄｓ）Ｄ
ＮＡを調製すること、およびそのｄｓＤＮＡを単離する
こと、が含まれる。別の方法は、宿主細胞のゲノムＤＮ
Ａの１片を単離し（目的とするポリペプチドをコードす
る遺伝子の最も保存的な配列を有する領域を含む、適切
に縮重したプローブを用いて）、そして、宿主ゲノム中
の目的とするポリペプチドをコードする配列を同定する
方法である。このプローブは全体の配列よりかなり短く
てもよいが、長さは少なくとも１０、好ましくは少なく
とも１４、より好ましくは少なくとも２０のヌクレオチ
ドの長さでなければならない。またオリゴヌクレオチド
も、目的とするポリペプチドをコードする遺伝子の全長
まで長い程有用である。ＤＮＡプローブとＲＮＡプロー
ブの両方を用いることができる。プローブは、容易に識
別できる検出可能な標識を付けて通常用いられるが、標
識を付けていないオリゴヌクレオチドも、標識を付けた
プローブの前駆物質としておよびＤＮＡもしくはＤＮＡ
／ＲＮＡの検出を行う方法に用いるのに有用である。し
たがって、オリゴヌクレオチドという用語は標識形と無
標識形の両者を意味する。
【００３３】目的とするポリペプチドをコードするＤＮ
Ａ配列の起源と、所望のポリペプチドの長さとに対応し
て、便利な制限部位が、目的とするポリペプチドをコー
ドするＤＮＡの中に設計される。可能であれば、その制
限部位は、アミノ酸配列に対して影響せず、すなわちポ
リペプチドのアミノ酸配列を無変化のままに残す（例え
ばセリンのコドンをＡＧＣからＡＧＴに変えるかもしく
はイソロイシンのコドンをＡＴＴからＡＴＣに変え
る）。しかしいくつかの場合には、新しい制限部位が取
込まれ、タンパクの活性を著しく変えることなく、変化
したアミノ酸配列が生成する。
【００３４】分泌発現ベクターの構築中に、ＤＮＡの各
種断片は通常、適切なクローニングベクター中でクロー
ン化され、ＤＮＡの増幅、ＤＮＡの修飾、または配列、
リンカーなどの連結もしくは除去による操作をすること
ができる。通常、ベクターは細菌中で少なくとも比較的
高いコピー数で複製することができる。グラム陰性菌、
特に、イー・コリ中でクローン化する、例えばｐＢＲ３
２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ＳＰ６などのようなベ
クターが容易に入手できる。これらのクローニングベク
ターは、宿主細菌中で機能する効率的な複製系をもって
いるという特徴を有する。
【００３５】これらのクローニングベクターは、少なく
とも１つの非反復制限部位、通常は複数の非反復制限部
位をもっており、また多数の制限部位を有し得る。さら
にクローニングベクターは、形質転換細胞を選択するた
めのマーカーを１つ以上もっている。これらのマーカー
は通常、抗生物質、重金属、毒物などであり得る細胞物
質に対する耐性、栄養素要求性宿主の相補、もしくはフ
ァージに対する免疫を与える。ベクターとカセットを適
切に切断し、適切な場合には、チューイングバック（ｃ
ｈｅｗｉｎｇ ｂａｃｋ）もしくは突出部の充填によっ
て平滑末端を与えることによって、追加のリンカーによ
って、およびテーリングによって、末端を修飾すること
により、相補末端を、ベクターを分泌発現ベクターもし
くはその要素に連結することができる。
【００３６】カセットの構築中、ＤＮＡの各操作の後
に、得られたプラスミドはクローン化され単離され、そ
して必要に応じて、適正な配列が得られたことを確認す
るために、特定の分泌ベクターの成分がその配列につい
て分析される。操作の性質によっては、プラスミドが切
断できる場合には、所望の配列がプラスミドから切取ら
れ異なるベクターに導入され、適切な場合、分泌発現ベ
クターの成分が操作される。
【００３７】いくつかの例では、ベクターが、異なる複
製システムを必要とする異なる宿主内で複製できる場
合、シャトルベクターが用いられる。この場合、２つの
宿主内で機能する追加のマーカーが必要である場合もな
い場合もある。そのようなマーカーが必要である場合に
は、これらはベクターに入れることができる。そのベク
ター、２つの複製システムおよびそのマーカーを有する
プラスミドは、必要に応じて１つの宿主から別の宿主に
移すことができる。選択のために、有用なマーカーのい
ずれもが用いられる、ネオマイシンもしくはテトラサイ
クリンに対する耐性が重要である。しかし、選択のため
のマーカーは便利なため非常に望ましいが、形質転換細
胞をスクリーニングする他の方法が発表されている（例
えばＧ．Ｒｅｉｐｉｎ等、Ｃｕｒｒｅｔ Ｇｅｎｅｔｉ
ｃｓ、１８９〜１９３頁、１９８２年、参照）。形質転
換細胞も、彼が作った特異的生産物でスクリーニングさ
れ得る。例えば所望の生産物の合成は、免疫学的方法ま
たは酵素的方法で決定できる。
【００３８】目的とするポリペプチドをコードするＤＮ
Ａ配列を含有する分泌ベクターが、一旦、適切な宿主に
導入されたならば、その宿主は増殖して目的とするポリ
ペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現する。各種の原
核宿主を用いることができる。宿主細胞としては、温度
感受性の変異をもたないグラム陰性菌、例えばＪＭ１０
７、ＪＭ１０５、ＪＭ１０１もしくはＤＨ５αのイー・
コリが挙げられる。
【００３９】その宿主は、適切な栄養培地内で高密度と
なるまで増殖される。目的とするポリペプチドをコード
するＤＮＡ配列を発現したい場合は、栄養培地の温度を
変えることができる。例えば、調節配列が、バクテリオ
ファージλＰLプロモーター、バクテリオファージＯLオ
ペレーターおよびＣI８５７温度感受性レプレッサを有
している場合には、宿主細胞は、許容温度、一般に約３
０℃で増殖することができ、この温度では、ＰLプロモ
ーターからの温度転写が抑制され、宿主細胞は外来遺伝
子産物の合成の要求によって自由増殖することができる
が、その産物はさらに宿主細胞に対して毒性となり得
る、宿主細胞が適切な密度に到達したとき、温度を非許
容温度（例えば約４２℃）まで上昇させるが、その温度
でＣI８５７レプレッサーは不活性になるので、ＰLプロ
モーターからの転写を行うことができる。
【００４０】産生物が細胞周辺腔に分泌される場合は、
細胞を収穫し、細胞壁を破壊して（例えば低浸透圧ショ
ックなどによって）産生物を遊離させる。産生物が培地
中に分泌される場合は、その栄養培地を集め、産生物を
通常の手段（例えばアフィニティークロマトグラフィ
ー）によって単離する。活性タンパクを生産するには、
そのタンパクを再生（ｒｅｆｏｌｄ）させる必要があ
る。
【００４１】以下の実施例は本発明を例示するためのも
ので本発明を限定するものではない。
【００４２】
【実施例】
［酵素と試薬］制限酵素は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ，ＢＲＬ，およびＩＢＩから購入した。
バクテリオファージＴ４ ＤＮＡリガーゼおよびポリヌ
クレオチドキナーゼはＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ
ｌａｂｓから入手した。仔ウシ腸ホスファターゼはＢｏ
ｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ社から入手した。
〔35Ｓ〕−メチオニン、〔α−35Ｓ〕ＡＴＰ、〔32Ｐ〕
ＡＴＰおよび〔14Ｃ〕−メチオニンタンパク標準品はＡ
ｍｅｒｓｈａｍ社から購入した。〔125Ｉ〕−α−ブン
ガロトキシンはＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａ
ｒ社から購入した。レインボープロテインの標準品はＡ
ｍｅｒｓｈａｍ社から入手した。アクリルアミドと尿素
はＩＣＮ社から購入した。アガロースはＢｉｏ−Ｒａｄ
社とＦＭＣ社から購入した。１０〜２０％勾配ＳＤＳ−
ＰＡＧＥはＩＳＳ社から入手した。ニトロセルロースフ
ィルターとＥｌｕｔｉｐカラムはＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒ
ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ社から購入した。ＤＮＡ配列
決定キットはＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社から購
入した。Ｘ線フィルムはＫｏｄａｋ社から入手し、Ｃｓ
ＣｌとフェノールはＩＢＩ社から入手した。ＮｅｎＳｏ
ｒｂカラムはＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒか
ら購入した。
【００４３】［細菌菌株とプラスミド］イー・コリＫ１
２ ＪＭ１０７を全工程において宿主細胞として使用し
た。プラスミドｐＵＣ１８はＢＲＬから購入した。プラ
スミドｐＨＥ６はＧ．Ｍｉｌｍａｎ氏の寄贈であった
（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１５
３巻、４８２−４９１頁、１９８７年）。
【００４４】［オリゴマーの合成と精製］オリゴマー
は、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ ８６００ ＤＮＡ合成機およ
び、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ社の試薬を用いて合成した。オ
リゴマーは、２０％ポリアクリルアミド−尿素ゲルでゲ
ル精製を行い、ＮｅｎＳｏｒｂカラムで脱塩し、次いで
凍結乾燥した。
【００４５】［プラスミドＤＮＡの精製とＤＮＡクロー
ン化］細胞のアルカリ溶解を、すでに発表されているよ
うにして行った（Ｂｉｒｎｂｏｉｍら、Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄ Ｒｅｓ、７巻、１５１３−１５２３頁、１
９７９年）。プラスミドＤＮＡは、２段階ＣｓＣｌ勾配
遠心分離法を用いて精製した（Ｇａｒｇｅｒら、Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、１
１７巻、８３５−８４２頁、１９８３年）。標準的なＤ
ＮＡクローニングの技術はすでに発表されている方法に
従って実施した（Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ａ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、１９８２年）。
【００４６】［ＤＮＡの配列決定］ＤＮＡの配列決定
は、ＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ社の配列決定キット
と共に提供される手順を利用し、アルカリ変性プラスミ
ドＤＮＡで実施した。試料は、ＢＲＬ装置を用いて８％
ポリアクリルアミド−尿素ゲル上で電気泳動を行った。
【００４７】［タンパクの配列決定］タンパクの配列決
定は、Ｓｐｅｉｃｈｅｒ等が発表した方法（Ｔｅｃｈｎ
ｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ ２４−２５頁、１９８９年）にしたがって、Ａｐｐ
ｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ ４７７−Ａ タンパ
ク配列決定装置とＡｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍ
ｓ社の試薬を用いて行った。
【００４８】（実施例１） ［合成シグナル配列のクローン化］イー・コリのｏｍｐ
Ａ５遺伝子（Ｍｏｖｖａ等、前記文献、１９８０年）も
しくはｐｈｏＡ遺伝子（Ｉｎｏｕｙｅ等、前記文献、１
９８２年）由来の２つの異なるシグナル配列をこれらの
ベクターの構築に用いた。合成のｏｍｐＡおよびｐｈｏ
Ａのシグナル配列を構築するのに用いたオリゴマーを図
１のＡおよびＢに示す。以下の変化はすべて、アミノ酸
配列に対しては影響せず、天然の配列中に作製した。ｏ
ｍｐＡについては、１６位におけるイソロイシンのコド
ンＡＴＴをＡＴＣにかえて、ＰｖｕＩとＮｒｕＩに対す
る新しい制限部位を作製した。ｐｈｏＡについては、最
初のＧＴＧメチオニンコドンをＡＴＧに変化させ、１８
位のセリンのコドンをＡＧＣからＡＧＴに変えて新しい
ＳｃａＩ制限部位を作製した。目的とするどの遺伝子で
も挿入し易くするために、ポリリンカーを各シグナル配
列の３’末端に入れた。各配列の５’末端は、ｐＨＥ６
のλＮプロテイン遺伝子のコドン領域（Ｆｒａｎｋｌｉ
ｎおよびＢｅｎｎｅｔｔ、Ｇｅｎｅ、８巻、１０７−１
１９頁、１９７９年）を７ＨｉｎｆＩ制限部位で切除し
ていずれかのシグナル配列で置換することができるよう
に設計した。ＨｉｎｆＩ部位から最初のＡＴＧコドンま
でのオリゴマーの配列は、Ｎプロテイン遺伝子のそれと
同一であり、天然のリボソーム結合部位を維持してい
る。
【００４９】シグナル配列クローン化のダイアグラムを
図２に示す。以下のプロトコールを、ｏｍｐＡとｐｈｏ
Ａのシグナル配列の両方に用いた。キナーゼ処理をした
オリゴマーを、１＋２と３＋４の対どうしを、等モル量
で混合し、凍結乾燥した。１０Ｌの水に再懸濁した後、
オリゴマーの対を９０℃で５分間加熱し、ゆっくり４０
℃まで冷却した。生成したアニール化オリゴマーの対
（ＡおよびＢそれぞれについて）を混合し、３５℃で６
０分間インキュベートした。１０μＬの１０ｍＭＡＴＰ
と３９μＬの水の予め加温した混合物をオリゴマーの上
記セットに添加した。インキュベーション温度は、５分
毎に３℃ずつ１５℃まで下げた。リガーゼを添加し、オ
リゴマーのセットを１５℃で一夜インキュベートした。
７０℃で１０分間加熱してリガーゼを不活性化した後、
オリゴマーのセットをＨｉｎｄＩＩＩとＰｓｔＩの制限
酵素で消化した。得られた１０７ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ
−ＰｓｔＩ制限断片を適切に製造したｐＵＣ１８に連結
した。コンピテントＪＭ１０７細胞を前記凍結混合物で
形質転換し、６種の形質転換細胞をＤＮＡ配列分析用に
選択した。合成ｏｍｐＡシグナル配列中に変異部分がな
い形質転換細胞由来のプラスミドＤＮＡ、ｐＵＣ１８
ｏｍｐＡを次の構築に使った。この工程をｐｈｏＡシグ
ナル配列について繰り返してｐＵＣ１８ｐｈｏＡを作製
した。
【００５０】（実施例２） ［ｐＮＢ１とｐＮＢ２の構築］ｐＮＢ１とｐＮＢ２構築
のダイアグラムを図３に示す。ｏｍｐＡとｐｈｏＡの合
成シグナル配列を有するＨｉｎｆＩ−ＰｓｔＩ制限断片
をそれぞれｐＵＣ１８ｏｍｐＡとｐＵＣ１８ｐｈｏＡか
ら生成させた。１０μｇのｐＨＥ６をＨｉｎｆＩで部分
的に消化して、大部分が一ヶ所切断したプラスミド２５
ＤＮＡを生成させた。次にこのＤＮＡをＢｇｌＩＩで消
化して、λＰLプロモーター（ργＰL）を有する３４８
ｂｐのＨｉｎｆＩ−ＢｇｌＩＩ制限断片を得た。ｐＵＣ
１９ｏｍｐＡとｐＵＣ１８ｐｈｏＡの各々５μｇをＨｉ
ｎｆＩとＰｓｔＩで消化して、合成のｏｍｐＡとｐｈｏ
Ａのシグナル配列を有する１０１ｂｐのＨｉｎｆＩ−Ｂ
ｇｌＩＩ制限断片を生成させた。得られた制限断片類
を、１．８％の低融点アガロースゲルでゲル精製し、フ
ェノールで抽出し、メーカーの指示にしたがってＳｃｈ
ｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ社のＥｌｕｔ
ｉｐカラムに通過させた。ｐＨＥ６の別の１μｇをＰｓ
ｔＩとＢｇｌＩＩで消化し、仔ウシアルカリホスファタ
ーゼ（ＣＡＰ）で脱リン酸し、０．８％の低融点アガロ
ースで同様にゲル精製した。得られたｏｍｐＡとｐｈｏ
ＡのＨｉｎｆＩ−ＰｓｔＩ制限断片を各々、λＰLＢｇ
ｌＩＩ−ＨｉｎｆＩ制限断片およびすでに製造したｐＨ
Ｅ６ベクターＤＮＡと混合した。得られたＤＮＡ混合物
を７０℃で５分間加熱し、ゆっくり１６℃まで冷却し、
一夜１６℃で連結させた。連結された混合物を次にコン
ピテントＪＭ１０７細胞を形質転換するのに用いた。各
構築物から得たいくつかの形質転換細胞を、制限断片の
的確な集団であることを確かめるためのＤＮＡ配列分析
用に選択した。完成された温度誘導分泌ベクターｐＮＢ
１とｐＮＢ２の地図を図４に示す。
【００５１】（実施例３） ［ヒトアセチルコリンレセプターのαサブユニットをコ
ードする遺伝子の発現］発現ベクターｐＮＢ１とｐＮＢ
２が設計どおりに機能するか否かを確認するために、ヒ
トアセチルコリンレセプターのαサブユニットαａｃｒ
の理論的アミノ末端細胞外部分をコードする合成遺伝子
〔係属中の同種出願（代理人の整理番号ＡＩＳＩ−０１
５）参照〕を、各ベクターのポリリンカーのＥｃｏＲＩ
とＢａｍＨＩとの制限部位の間に挿入して（図５）ｐＮ
Ｂ１αａｃｒおよびｐＮＢ２αａｃｒを作製した。ｐＮ
Ｂ１とｐＮＢ２をＥｃｏＲＩで消化し、次いでＢａｍＨ
Ｉで消化し、ＣＡＰで脱リン酸を行い、１．０％の低融
点アガロースゲルでゲル精製した。各ベクターをαａｃ
ｒを有する、ゲル精製したＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ制限
断片と混合して連結した。この融点で得られたヌクレオ
チド配列と、各構築による領域の対応するアミノ酸配列
をダイヤグラム線図の拡大部分に示す。矢印（図５）は
シグナルペプチドの開裂部位を示し、星印は、タンパク
のαａｃｒの開始部を示す。αａｃｒが、各ベクターの
シグナル配列と同位相で挿入されたことを確かめるため
にＤＮＡの配列決定が行われた。
【００５２】プラスミドのｐＮＢ１αａｃｒとｐＮＢ２
αａｃｒを、インビトロでαａｃｒタンパクを発現する
性能について、35Ｓ−メチオニンを取り込むＤＮＡ依存
性結合転写翻訳システム（ＤＮＡ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ
ｃｏｕｐｌｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｔｒ
ａｎｓｌａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）で、最初に試験し
た。各構築物の試料をＡｍｅｒｃｈａｍ社から購入した
キットとともに使用した。35Ｓ−メチオニンを使用する
メーカー推奨の方法にしたがった。試料を１０分間沸騰
させ、次に１０〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で電気泳動
させた。そのゲルをＮＥＮ社から購入したＥｎｌｉｇｈ
ｔｅｎｉｎｇで処理し、乾燥し、次いでＸ線フィルムに
ゲルをのせて１０分間露光した。翻訳産物をＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥで分析し、結果を図６に示す。レイン１はｐＮＢ
１、レイン２はｐＮＢ２、レイン４はｐＮＢ１αａｃ
ｒ：レイン５はｐＮＢ２αａｃｒである。矢印は、ｏｍ
ｐＡαａｃｒとｐｈｏＡαａｃｒに対応する独特の２８
ｋＤのタンパクを示す。遺伝子を挿入することなしに、
ｐＮＢ１とｐＮＢ２は各々約７ｋＤの独特のタンパク
（レイン１と２）を得た。これらのタンパクは、恐ら
く、プラスミドＤＮＡの３’ポリリンカー領域におけ
る、シグナル配列の開始部位からランダム終止コドンま
での追加翻訳産物である。ｐＮＢ１とｐＮＢ２のポリリ
ンカーに挿入されたαａｃｒ遺伝子によって、その７ｋ
Ｄのタンパクはもはや産生されなくなった。代わりに、
各ベクターは、αａｃｒタンパクにいずれかのシグナル
ペプチドを加えた追加のアミノ酸の予想される分子量に
対応して２８ｋＤの独特のタンパク（レイン４と５）を
得た。そしてこのタンパクは、インビトロでは切断され
ない。αａｃｒタンパクは、ｐＮＢ１αａｃｒもしくは
ｐＮＢ２αａｃｒから同じ効率で、インビトロで産生さ
れた。
【００５３】次に発現ベクターは、インビボでのαａｃ
ｒタンパクの産生について試験された。ｐＮＢαａｃｒ
もしくはｐＮＢ２αａｃｒを有するＪＭ１０７の培養物
を、ＬＢもしくはＭ９ＣＡ中で３０℃にてＡ600＝０．
６−０．８ Ｏ．Ｄ．になるまで増殖させた。誘導につ
いては、培養物を迅速に４２℃にして４５分間保持し、
残りの増殖期間を３７℃に保持した。１ｍＬの試料を誘
導を行って３時間後に取り出した。細胞をペレット状に
して、２０μＬのタンパク試料緩衝液に再懸濁させた。
１０分間沸騰させた後、その１０μｌを１０〜２０％Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動させ、クーマシーブルーで染
色した。結果を図７に示す。レイン１は標準のタンパ
ク、レイン２はｐＮＢ１αａｃｒ−３０℃、レイン３は
ｐＮＢ１αａｃｒ−４２℃、レイン４はｐＮＢ２αａｃ
ｒ−３０℃、レイン５はｐＮＢ２αａｃｒ−４２℃であ
る。矢印はそれぞれ、ｏｍｐＡαａｃｒとαａｃｒに相
当する２８ｋＤと２５ｋＤのタンパクを示す。２８ｋＤ
と２４ｋＤとの２つのタンパクは誘導後に出現した（レ
イン２と３）。これらのタンパクの分子量は、ｏｍｐＡ
−αａｃｒ（未処理）とαａｃｒ（処理済）について予
想された分子量と一致している。
【００５４】ｐＮＢ２αａｃｒを有する細胞におけるα
ａｃｒタンパクの発現を、染色したゲルから評価するこ
とは困難であった。それ故に、いずれかのプラスミドを
有する培養物を、前記のように増殖させて誘導し、次に
誘導後種々の時点で35Ｓ−メチオニンを用いてパルス標
識試験を行った。ｐＮＢ１αａｃｒもしくはｐＮＢ２α
ａｃｒを有するＪＭ１０７の培養物を、図７において説
明したようにして増殖させて誘導した。誘導後の種々の
時点で、５０Ｃｉの35Ｓ−メチオニンを１ｍｌずつ細胞
に添加し、増殖を１０分間続けた。総細胞抽出物を作製
してＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、次いで図６で述べたの
と同様に蛍光光度法に付した。ｐＮＢ１αａｃｒとｐＮ
Ｂ２αａｃｒのインビトロ結合転写翻訳法（ｉｎ ｖｉ
ｔｒｏ−ｃｏｕｐｌｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ
−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）由来の試料を、比較のため
に用いた。レイン１はｐＮＢ１αａｃｒ−３０℃、レイ
ン２、３および４はそれぞれｐＮＢ１αａｃｒ−４２℃
の３０分間、１時間および２時間の結果、レイン５はｐ
ＮＢ１αａｃｒインビトロ、レイン６はｐＮＢ２αａｃ
ｒ−３０℃、レイン７、８および９はそれぞれｐＮＢ２
αａｃｒ−４２℃の３０分間、１時間および２時間の結
果、レイン１０はｐＮＢ２αａｃｒ−インビトロ、レイ
ン１１は14Ｃ−メチオニン標識タンパク標準品である。
矢印はαａｃｒタンパクである。総細胞抽出物をＳＤＳ
−ＰＡＧＥ法、次いで蛍光光度法に付した。結果を図８
に示したが、ｐＮＢ１αａｃｒとｐＮＢ２αａｃｒが、
１０分間のパルスで、ほぼ等量のαａｃｒタンパクを生
成したことを示している。しかしｐＮＢ１αａｃｒを有
する細胞は、誘導後の増殖中に非常に高レベルのαａｃ
ｒを蓄積するようであったので、この試験の残りではα
ａｃｒのｐＮＢ１αａｃｒからの発現について集中的に
試験した。
【００５５】２８ｋＤと２５ｋＤの誘導されたタンパク
のαａｃｒタンパクとしての特性を確認し、その生物活
性を評価するために、α−ブンガロトキシン結合検定法
を実施した。このヘビ毒液の毒素は、アセチルコリンレ
セプターのαサブユニットの活性部位の近傍に特異的に
結合する（ＨａｇｇｅｒｔｙおよびＦｒｏｅｈｎｅｒ、
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５６巻、８２９４−８２
９７頁、１９８１年；Ｗｉｌｓｏｎ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、８２巻、８７９
０〜８７９４頁、１９８５年）。またこの毒素は、ｐＫ
Ｋ２２３−３から発現されたαａｃｒタンパクにも結合
する［係属中の同種出願（代理人整理番号ＡＩＳＩ−０
１５）参照］。ｐＮＢ１αａｃｒを有する、誘導された
培養物もしくは未誘導の培養物由来の総細胞抽出物をＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥに付してブロット（Ｂｌｏｔｔｏ）に移
し、一夜４℃でインキュベートした。そのフィルターを
新しいブロットに移し、２０μＣｉの125Ｉ−α−ブン
ガロトキシンとともに、室温で５時間インキュベートし
た。ブロット中で１×３０分間４℃で洗浄し、ＴＢＳ中
で３×１５分間４℃で洗浄した後、フィルターを完全に
乾燥し、Ｘ線フィルムに３日間−７０℃で露光した。結
果を図９に示す。パネルＡはクマーシーブルーで染色し
た１０〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示し、レイン１はタ
ンパク標準品：レイン２はｐＮＢ１αａｃｒ−３０℃：
レイン３はｐＮＢ１αａｃｒ−４２℃である。パネルＢ
は同じゲルのウエスターンブロットのオートラジオグラ
ムを示し、レイン１はｐＮＢ１αａｃｒ−３０℃、レイ
ン２はｐＮＢ１αａｃｒ−４２℃である。125Ｉ−α−
ブンガロトキシンが特異的に２つの誘導タンパクに結合
したが、これはこれらのタンパクが２つの実態のαａｃ
ｒであり、各形態が生物活性を有することを確証してい
る。
【００５６】２４ｋＤのαａｃｒタンパクのアミノ末端
の微細配列決定から得た予備データは、シグナルペプチ
ドの適正な処理がなされたことを示している。切断は、
１位のアラニン残基すなわちｏｍｐＡシグナルペプチド
の最後の残基の後で起こった。αａｃｒタンパクは、リ
ンカー配列でコードされるグルタミン酸とフェニルアラ
ニン残基を保持している。このことは、タンパクの発現
が成功し、これに続くシグナルペプチドの切断がベクタ
ーｐＮＢ１を用いて得られたことを示している。
【００５７】同時に、ｏｍｐＡ−αａｃｒとαａｃｒの
タンパクは、誘導された細胞の総タンパクの５〜１０％
であることが測定された。これは、すでにλＰLプロモ
ーターによって認められた他のタンパクの発現レベルと
一致している（Ｍｉｌｍａｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１５３巻、４８２−４９１頁、
１９８７年：Ｐｉａｔａｋ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．、２６３巻、４８３７−４８４３頁、１９８８
年）。ｏｍｐＡ−αａｃｒとαａｃｒのバンド強度を染
色したＳＤＳ−ＰＡＧＥで比較すると、発現されたαａ
ｃｒタンパクの約１／２が未処理の前駆物質として蓄積
されたことを示している。Ｂｏｌｌａ等（Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ、４巻、９９１−９９５頁、１９８７
年）は、ＩＰＴＧ誘導の後にｏｍｐＡ−ｈＧＨの前駆物
質の蓄積が増加することを見出した。前駆物質の蓄積
は、タンパクの高レベルの発現の機能のようであり、分
泌のためにｏｍｐＡシグナル配列を用いたことが原因で
はない（Ｂｏｌｌａ等、前出、１９８７年）。
【００５８】他の因子が未処理タンパクの蓄積に影響す
ることがある。Ｈｕｓｓａｉｎ等（前出、１９８９年）
は、ｏｍｐＡ−リシンＢ鎖のプロセッシングの程度は宿
主菌株依存性である報告した。Ｉｋｅｍｕｒａ等（Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６２巻、７８５９−７８６４
頁、１９８７年）は、ｏｍｐＡ−プロズブチリシンの５
０％が、３７℃での誘導後に未処理の前駆物質として蓄
積したが、２３℃の低温での誘導では前駆物質の蓄積が
減少する結果になったと報告した。それ故に、ＪＭ１０
７よりもより“許容的”な宿主菌株を使用し、および／
または４２℃での誘導を行った後、増殖温度を３７℃よ
りさらに下げることによって、処理タンパクの全収率を
改善することができる。また誘導を行った後の増殖温度
を低下させると、細胞周辺腔におけるタンパク分解活性
が減少して収率が改善される（Ｏｋａ等、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２巻、７２１２
−７２１６頁、１９８５年）、または、イー・コリの新
しいペリプラズムプロテアーゼを欠く変異体（Ｓｔｒａ
ｕｃｈおよびＢｅｃｋｗｉｔｈ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５巻、１５７６−１５８
０頁、１９８８年）が分泌タンパクの産生により適切な
宿主になり得る。
【００５９】ｐＮＢ１αａｃｒを有する誘導された細胞
を、浸透ショック法（ＮｅｕおよびＨｅｐｐｅ１、Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２４０巻、３６８５−３６９２
頁、１９６５年）に付することによって、細胞周辺腔か
ら可溶性αａｃｒを回収しようとする努力は成功しなか
った。周辺細胞質、細胞質および膜の画分に存在するタ
ンパクのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行った結果、αａｃｒ
タンパクが膜の画分に関連することが分かった。処理さ
れたαａｃｒが膜画分とともに残留している理由につい
ては２つの説明をすることができる。たとえシグナルペ
プチドが切断されているにしても、αａｃｒタンパクが
内膜を通って部分的に移動したに過ぎないという可能性
がある。Ｏｓｈｕｙｅ等は（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１１巻、１２８３−１２９４頁、
１９８３年）、シグナルペプチドの切断後のタンパクの
完全な移動はそのタンパクのカルボキシル末端に依存し
ていることを見出した。しかし細胞膜におけるこのよう
な“ジャミング”は、細胞に対して致命的であることは
すでにわかっており（ＢｉｅｋｅｒおよびＳｉｌｈａｖ
ｙ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳ
Ａ）、８６巻、９６８−９７２頁、１９８９年）、αａ
ｃｒ発現の誘導を行っても細胞死に至っていない。
【００６０】より適切な説明は、輸送されたαａｃｒタ
ンパクが細胞周辺腔で不溶性であることである。シグナ
ルペプチドによって細胞周辺腔に分泌された溶解型の外
来タンパクを得る多くの報告があるが（Ｈｓｉｕｎｇ
等、前記文献、１９８６年：Ｑｕａａｓ等、Ｅｕｒｏｐ
ｅａｎ Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１７３巻、６１７−６
２２頁、１９８８年：Ｐｉａｔａｋ等、前記文献、１９
８８年：Ｒａｙ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、９７巻、１４９
２−１４３６頁、１９８５年）、いくつかの分泌された
外来タンパクは、不溶性のままであるか（Ｉｋｅｍｕｒ
ａ等、前記文献、１９８７年）、または細胞周辺腔で可
溶性と不溶性の両方の形態で見出される（Ｈｕｓｓａｉ
ｎ等、前記文献、１９８９年）。外来タンパクが、イー
・コリの細胞周辺腔内で可溶性の形に再生する能力は、
目的の特定のタンパクの機能のようである。
【００６１】（実施例４） 温度誘導分泌ベクターｐＮＢ１およびｐＮＢ２を用いる
ＳＧおよびＳＢＧの発現 ［ＳＧおよびＳＢＧの発現］以下、ＳＧとは、連鎖状球
菌プロテインＧのＩｇＧ結合領域をコードする合成遺伝
子をさしていう。ＳＢＧとは、キメラプロテインＡ（Ｂ
断片）および連鎖状球菌プロテインＧのＩｇＧ結合領域
をコードする合成遺伝子をさしていう。
【００６２】合成のプロテインＧ（ＳＧ）およびキメラ
Ｂ−Ｇ（ＳＢＧ）を、ｐＮＢ１およびｐＮＢ２のポリリ
ンカー領域中でクローン化し、得られたプラスミド類、
ｐＮＢ１−Ｇ、ｐＮＢ１−ＢＧ、ｐＮＢ２−Ｇおよびｐ
ＮＢ２−ＢＧ（それぞれイー・コリ中）を３０℃で０．
６ Ｏ．Ｄ．／６００ｎｍになるまで増殖させ、次いで
４２℃で誘導した。これらのプラスミド由来の総細胞抽
出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した（図１０）。得られ
た結果は、タンパクＳＧとＳＢＧの両者（レイン１と
４、および６と８）が発現プラスミドのｐＮＢ１とｐＮ
Ｂ２内で発現されたことを示している。未誘導の試料は
対照として用いられている（レイン１、３、５および
７）。
【００６３】［ＳＧとＳＢＧの局在性］イー・コリ中で
発現されたＳＧとＳＢＧの局在性を示すために、ｐＮＢ
１−Ｇ、ｐＭＢ１−ＢＧ、ｐＮＢ２−ＧおよびｐＮＢ２
−ＢＧを有する細胞を３０℃にてＡ600＝０．６〜０．
８になるまで増殖させ、４２℃で誘導し、上記と同様に
して分画した。周辺細胞質、スフェロプラストおよび総
細胞の抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、ニトロセルロ
ースに移し、ヒトＩｇＧとともにインキュベートしてＦ
ａｂ26ＨＲＰ−コンジュゲートで検出した（図１１Ａお
よびＢ）。試験結果は、ＳＧタンパクとキメラＳＢＧタ
ンパクが合成され、処理された、可溶性型で、細胞周辺
腔に分泌されたことを示した。図１１において、未誘導
のＳＧとＳＢＧの周辺細胞質とスフェロプラストの画分
をそれぞれレイン１、２、６、および７に示す。
【００６４】また誘導されたＳＧとＳＢＧの周辺細胞
質、スフェロプラストおよび総細胞の抽出物をそれぞれ
レイン３、４、５および８、９、１０に示す。図１１Ｂ
に、ｐＮＢ２−ＧもしくはｐＮＢ２−ＢＧについて同様
の結果を示す。
【００６５】これらの試験はさらに、これらの発現プラ
スミド（ｐＮＢ１およびｐＮＢ２）が異種タンパクを細
胞周辺腔に輸送することができることを確証している。
【００６６】ＣIレプレッサーとシグナル配列に結合す
るプロモーターを有する分泌発現ベクターを構築した。
この分泌ベクターを用いて、異種タンパクを微生物内で
発現することに成功した。そのタンパクは正しく処理さ
れ、細胞周辺腔に分泌され、生物活性があることがわか
った。これらの温度誘導ベクターは、原核細胞内で外来
タンパクを高レベルで発現する新しい代替物を提供す
る。
【００６７】本願明細書に引用した刊行物と特許願はす
べて、本発明の技術分野の当業者のレベルを示すもので
ある。これらのすべての刊行物と特許願は、各々具体的
かつ個々に本願に援用されるのと同じ程度にまで本願に
援用するものとする。
【００６８】本願発明は、明確に理解するために、例示
と実施例によっていくらか詳細に説明しているが、本願
の特許請求の範囲内で変更もしくは改変を実施できるこ
とは明らかである。
【００６９】
【発明の要約】温度誘導分泌発現ベクターが構築され、
イー・コリ内で異種タンパクを発現するのに使用した。
このベクターは、ＣIレプレッサーに結合できるヌクレ
オチドを含有するプロモーターを利用して、このプロモ
ーターからの温度誘導発現を行う。天然の異種タンパク
の分泌が、プロモーターのシグナル配列に隣接するコド
ン領域を、異種タンパクをコードするＤＮＡ配列で置換
することによって達成される。その分泌発現ベクターで
宿主細胞を形質転換し、次いで増殖させ、次いで誘導し
て異種タンパクを発現させる。３０℃では発現は認めら
れないが、４２℃で誘導を行うと、タンパクが産生され
る。全タンパクの５〜１０％の発現レベルがみられる。
異種タンパクは適正に処理され生物活性を有することが
わかった。これらのベクターは、同位相でシグナル配列
を有する適切な遺伝子を挿入することによって、温度感
受性変異を欠いている原核細胞内に目的とするタンパク
を発現・分泌させるのに使用できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ｐＮＢ１およびｐＢＮ２の合成シグナル配列で
あるｏｍｐＡ（Ａ）とｐｈｏＡ（Ｂ）を構築するのに用
いるオリゴマーのヌクレオチド配列をそれぞれ示す。線
はオリゴマーの末端の重なり領域を示し、星印はヌクレ
オチドが天然に存在する配列に比べて変化しているのを
示し、矢印はシグナルペプチドの切断部位を示し、ボッ
クスは、λＮプロテイン遺伝子の７位の天然に存在する
ＨｉｎｆＩ部位に合成断片を連結するのに用いられるＨ
ｉｎｆＩ制限部位を示し、そして、括弧内の数字はそれ
ぞれオリゴマーの大きさを示す。
【図２】合成シグナル配列の組み立てとクローン化を示
すダイアグラムである。
【図３】ｐＮＢ１とｐＮＢ２の構築を示すダイアグラム
である。
【図４】ｐＮＢ１およびｐＮＢ２の地図を示す。
【図５】ｐＮＢ１（ｏｍｐＡ）およびｐＮＢ２（ｐｈｏ
Ａ）のシグナル配列と同位相にαａｃｒが挿入されてい
るのを示す。
【図６】インビトロで結合したｐＮＢ１αａｃｒおよび
ｐＮＢ２αａｃｒの転写−翻訳の結果を示す。
【図７】インビボでのαａｃｒの発現の結果を示す。
【図８】35Ｓ−メチオニンによるインビトロ標識化を示
す。
【図９】α−ブンガロトキシンによるタンパク同定の確
認と生物活性の立証とを示す。
【図１０】プロテインＡ結合領域をコードする遺伝子
（ＳＧ）、およびＢＧを含有するタンパクとプロテイン
Ａ結合領域とをコードするキメラ遺伝子を、ｐＮＢ１お
よびｐＮＢ２を用いて発現された結果を示す。
【図１１】ＡおよびＢは図１０に記載した宿主細胞（そ
れぞれｐＮＢ１およびｐＮＢ２を含む）の周辺細胞質、
スフェロプラストおよび細胞の全抽出物のＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ分析結果を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ソーエル タリブ アメリカ合衆国 カリフォルニア 94536, フリーモント，サイワード ドライブ 34666 (72)発明者 トーマス ビー． オカーマ アメリカ合衆国 カリフォルニア 94306, パロ アルト，ポートラ アベニュー 1651

Claims (13)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】作動可能にインビトロで連結された要素を
    含む分泌発現プラスミドであって、 該要素が、転写の５’−３’方向に、ＣIレプレッサー
    に結合し得るヌクレオチド配列を有する転写開始領域
    と、原核細胞から目的とするポリペプチドを分泌するよ
    う指示し得るシグナル配列をコードする第１のＤＮＡ配
    列と、該転写開始領域によって発現される目的とするポ
    リペプチドをコードする第２のＤＮＡ配列を挿入するた
    めの少なくとも１つの制限部位と、必要に応じて転写終
    結領域とを有する、 分泌発現プラスミド。
  2. 【請求項２】前記転写開始領域がバクテリオファージλ
    ＰLプロモーターである請求項１に記載の分泌発現プラ
    スミド。
  3. 【請求項３】前記第１のＤＮＡ配列がｏｍｐＡ遺伝子も
    しくはｐｈｏＡ遺伝子から得られうる請求項１に記載の
    分泌発現プラスミド。
  4. 【請求項４】作動可能にインビトロで連結された要素を
    含む分泌発現ベクターであって、 該要素が、転写の５’−３’方向に、ＣIレプレッサー
    に結合し得るヌクレオチド配列を有する転写開始領域
    と、原核細胞から目的とするポリペプチドを分泌するよ
    う指示し得るシグナル配列をコードする第１のＤＮＡ配
    列と、該転写開始領域によって発現される目的とするポ
    リペプチドをコードする第２のＤＮＡ配列と、必要に応
    じて転写終結領域とを有する、 分泌発現ベクター。
  5. 【請求項５】前記第１のＤＮＡ配列が合成の配列である
    請求項４記載の分泌発現ベクター。
  6. 【請求項６】前記合成配列が、ｏｍｐＡもしくはｐｈｏ
    Ａのシグナル配列と少なくとも実質的に同様である請求
    項５に記載の分泌発現ベクター。
  7. 【請求項７】原核宿主細胞から目的とするポリペプチド
    の温度誘導分泌を行わせる方法であって、次の工程を包
    含する方法：転写の５’−３’方向に、ＣIレプレッサ
    ーに結合し得るヌクレオチド配列を有する転写開始領域
    と、シグナル配列をコードする第１のＤＮＡ配列と、該
    転写開始領域によって発現される目的とするポリペプチ
    ドをコードする第２のＤＮＡ配列と、必要に応じて転写
    終結領域とを有する、作動可能にインビトロで連結され
    た要素を含む分泌発現ベクターを有するが、温度感受性
    の変異を欠いている原核宿主細胞を、栄養培地内で許容
    温度で増殖させて、該細胞を複数得る工程；および該栄
    養培地の温度を、前記転写開始領域からの転写を誘導す
    るのに充分な温度にまで上昇させて、該目的とするポリ
    ペプチドを発現させて該宿主細胞から分泌させる工程。
  8. 【請求項８】前記原核宿主細胞が、イー・コリである、
    請求項７に記載の方法。
  9. 【請求項９】前記の許容温度が約３０℃および３２℃で
    あり、そして前記誘導温度が約４２℃〜４４℃である請
    求項８に記載の方法。
  10. 【請求項１０】前記分泌が細胞周辺腔に行われる請求項
    ８に記載の方法。
  11. 【請求項１１】転写の５’−３’方向に、ＣIレプレッ
    サーに結合し得るヌクレオチド配列を有する転写開始領
    域と、シグナル配列をコードする第１のＤＮＡ配列と、
    該転写開始領域によって発現される目的とするポリペプ
    チドをコードする第２のＤＮＡ配列と、必要に応じて転
    写終結領域とを有する、作動可能にインビトロで連結さ
    れた要素を含む分泌発現ベクターを有するが、温度感受
    性の変異を欠いている原核宿主細胞。
  12. 【請求項１２】イー・コリ細胞である請求項１１に記載
    の細胞。
  13. 【請求項１３】プラスミドｐＮＢ１もしくはｐＮＢ２。
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