JPH0813273B2 - タンパク質の発現方法およびそれに用いるクローニングベクター - Google Patents

タンパク質の発現方法およびそれに用いるクローニングベクター

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JPH0813273B2
JPH0813273B2 JP1059466A JP5946689A JPH0813273B2 JP H0813273 B2 JPH0813273 B2 JP H0813273B2 JP 1059466 A JP1059466 A JP 1059466A JP 5946689 A JP5946689 A JP 5946689A JP H0813273 B2 JPH0813273 B2 JP H0813273B2
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Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、微生物宿主中でタンパク質、とりわけ融合
タンパク質を製造する方法に関する。本発明はまた、微
生物宿主の形質転換のためのクローニングベクターに関
する。
（従来の技術および発明が解決しようとする課題） 微生物宿主中には通常は存在しない（すなわち、宿主
細胞に対して「異種」である）ような原核性タンパク質
または真核性タンパク質をそのような宿主中で発現させ
ることができることは充分確立されている。一般に、そ
のようなタンパク質の発現は、目的タンパク質をコード
するDNA配列をプラスミドDNA中の調節領域（たとえばla
cオペロン）の下流域に挿入し、そのプラスミドを細胞
中に挿入して細胞を「形質転換」して細胞が目的タンパ
ク質を生産（すなわち「発現」）することができるよう
にすることによって行なわれる。
これは概念的には簡単な手順ではあるが、異種タンパ
ク質を合成し、引き続き得られたタンパク質を検出し回
収するための細胞を得るには数多くの障害が存在する。
異種遺伝子はメッセンジャーRNA（mRNA）に効率よく転
写されないかもしれない。mRNAは不安定でタンパク質に
翻訳される前に分解してしまうかもしれない。mRNA上に
存在するリボソーム結合部位（RBS）は、翻訳を不十分
にしか開始しないかもしれない。生成された異種タンパ
ク質は、細胞中では不安定であるかまたは細胞に対して
毒性を有しているかもしれない。得られたタンパク質に
対する抗体が手に入らないかまたはそのタンパク質をア
ッセイする他の方法がない場合には、合成されたタンパ
ク質を検出することは困難であるかもしれない。最後
に、たとえタンパク質が生成されたとしても精製するの
は困難であるかもしれない。
融合系は、上記問題の多くを解決する手段を提供す
る。ハイブリッド遺伝子の「担体」部分は一般にハイブ
リッド遺伝子の５′末端上に見られるが、転写および翻
訳の制御領域を提供するとともに、検出［シューマン
（Shuman）らのJ.Biol.Chem.255、168（1980）］および
／または精製［モークス（Moks）らのBio/Technology
５、379（1987）］を容易にするペプチドの遺伝暗号を
提供する。しばしば潜在的タンパク質分解性開裂部位を
融合タンパク質中に取り入れることによって同種ペプチ
ド部分除去が行なわれる［デ・ゴイス（de Geus）らのN
ucleic Acids Res.15、3743（1987）；ナンビアー（Nam
biar）らのEur.J.Biochem.163、67（1987）；イマイ（I
mai）らのJ.Biochem.100、425（1986）］。
融合系のための担体遺伝子を選択するときには、検出
可能性および精製の容易さに加えて、高発現遺伝子から
始めるのが極めて有利であろう。発現は、効率的な転写
および翻訳の結果であるのみならず、タンパク質の安定
性および良性の結果でもある（タンパク質は細胞宿主を
損なうかまたは抑制してはならない）。
（課題を解決するための手段） 本発明は、タンパク質の製造方法に関する。本発明の
方法において、大腸菌酵素であるCKS（CTP:CMP−３−デ
オキシ−Ｄ−マンノーオクツロソネートシチジリルトラ
ンスフェラーゼまたはCMP−KDOシンセターゼ）と異種タ
ンパク質との融合タンパク質は、CKSおよび異種タンパ
ク質をコードする挿入DNAを有するクローニングベクタ
ーで形質転換された細胞中で発現される。そのようなク
ローニングベクターで形質転換された細胞中で発現され
るCKS融合細胞の発現レベルは極めて高く、ある場合に
は全細胞タンパク質の50％にも達する。
本発明には、調節領域、細菌酵素CKS（CMP−KDOシン
セターゼ）をコードする領域および目的タンパク質をコ
ードする領域を含むDANクローニングベクターを用いて
目的タンパク質をコードする遺伝子を発現させることが
含まれる。本発明のクローニングベクターは、融合タン
パク質（すなわちCKS−異種タンパク質の融合体）を高
レベルで発現させることができる。本発明は、第１図に
図解で示されている。第１図には、本発明のプラスミド
の特徴が一般的に示されている。本発明のプラスミドに
は調節領域（たとえば、合成リボソーム結合部位の配列
を伴ったlac−タイプのプロモーター）が含まれてお
り、これに続いてCKSをコードする遺伝子が含まれ、該C
KSをコードする遺伝子は目的とする異種タンパク質をコ
ードする遺伝子に結合している。
融合タンパク質それ自体は技術分野において充分確立
されているが、融合系としてCKSを使用することは新規
である。融合系としてCKSを用いた場合、他の融合系に
比べて以下のような利点を有する。すなわち、CKSの酵
素活性を検出することは、たとえばβ−ガラクトシダー
ゼなどの他の酵素の場合と比べて困難であるが、CKSが
予期せぬ抗原性を有することから高力価の抗CKS抗血清
を得ることが可能であり、それゆえ、CKSは優れた融合
マーカーであり、融合タンパク質を容易に検出すること
ができる。異種タンパク質の検出および精製を容易にす
ることに加えて、本発明の発現ベクターではkdsB遺伝子
（CKSをコード）を利用している。該kdsB遺伝子（CKSを
コード）は、適当な調節領域とともに、本発明者らの手
もとにある大腸菌中のいかなる遺伝子よりも高いレベル
で発現する。
調節領域 本発明の調節領域は、第４図に示してある。本発明の
調節領域には、修飾lacプロモーターが含まれ、これは
−73から＋21までの本質的に天然のlacPであるが、２つ
の修飾が加えられている。すなわち、（１）−24位でG/
C塩基対が１個欠失していること、および（２）−９位
でＴ−−Ａの置換が行なわれていること、である。調節
領域にはまた、大腸菌中の16S rRNA（リボソームリボ核
酸）の３′末端と相同な合成リボソーム結合部位（nt31
−39）が含まれる。リボソーム結合部位に続いて共通ス
ペーサー領域が含まれ、これに続いてATGの翻訳開始コ
ドンが、続いてCKSの構造遺伝子が含まれる。
CKS構造遺伝子 CKSをコードする構造遺伝子（kdsB遺伝子）の配列
は、コールドマン（Goldman）らのJ.Biol.Chem,261:158
31（1986）に出版されている。該DNA配列から導き出さ
れるCKSのアミノ酸配列も同じ論説に記載されている。
kdsB遺伝子は、ゴールドマンのプラスミドpRG1（J.Ba
cteriol.163:256）から得られる（第３図参照）。kdsB
遺伝子単離の第一の工程は、pRG1をHpa IIで消化するこ
とであった。Hpa IIでの消化により、該遺伝子の５′末
端から51塩基対が開裂される。
第４図におけるBamH I部位からHpa II部位までの塩基
対を含むDNA断片は、合成オリゴヌクレオチドをアニー
ルすることにより構築された（実施例１）。このDNA配
列には、リボソーム結合部位およびkdsB遺伝子の５′末
端からの51塩基対が含まれていた。ついでBamH I−Hpa
II断片を、実施例１に詳細に記載してあるようにHpa II
天然kdsB遺伝子含有断片と連結する。理解されるよう
に、この連結により、失われていた51塩基対がkdsBに置
換され、調節領域のためのリボソーム結合部位が加えら
れた。
CKS発現ベクターの構築 第4A図に示すようにEcoR I部位とBamH I部位との間に
修飾lacプロモーターを含むpWM145プラスミドをBamH I
およびHind IIIで消化して、CKS構造遺伝子を含有するB
amH I−Hind III断片のための挿入部位を得た（第３図
参照）。ついでkdsB含有断片をpWM145ベクター中に連結
し、この工程中に修飾lacプロモーターとリボソーム結
合部位を含む調節領域を組み立てた。こうしてプラスミ
ドpTB201が得られた（第２図および第３図参照）。
異種遺伝子をクローニングするためのリンカーの挿入 pTB201は異種遺伝子のための融合発現ベクターであ
り、該異種遺伝子はBgl IIまたはBgl II−Hind III部位
にクローニングしたときに適当な解読わくを有している
（第２図参照）。しかしながら、pTB201は、他の制限エ
ンドヌクレアーゼクローニング部位を導入することによ
ってその多様化がはかれる。このことは第７図に示され
ており、多数の制限部位を含むリンカーがpTB201のBgl
II−Hind III断片と置換されて新しいベクター、pTB210
が得られる。このリンカーにはまたAsp−Proをコードす
る配列が含まれているが、このAsp−ProはCKSタンパク
質に融合している異種タンパク質からのCKSタンパク質
の開裂を可能にするものである。
第７図のリンカーにはまた、制限部位の下流に３つの
すべての解読わくにおける停止コドンが含まれている。
従って、いかなる異種構造遺伝子またはその部分がリン
カー中に挿入されても、挿入遺伝子の直後に翻訳は停止
するであろう。
異種遺伝子のpTB210の中への挿入 本発明のプラスミド中への異種遺伝子の挿入は種々の
方法により行うことができ、たとえば「鎖切断のオリゴ
ヌクレオチドに基づく修復による突然変異誘発方法」の
標題で1986年７月８日に出願した米国特許出願第883,24
2号明細書、「遺伝子合成のFok I法」の標題で1987年12
月11日に出願した米国特許出願第131,973号明細書、お
よび「鎖切断のオリゴヌクレオチドに基づく修復による
突然変異誘発方法」の標題で1987年12月11日に出願した
米国特許出願第132,089号明細書にそれぞれ開示された
方法により行うことができる。
つぎに本発明を実施例に基づきさらに詳しく説明する
が、本発明はこれらに限られるものではない。なお各実
施例を簡単に説明すると以下のようになる。
実施例１には、修飾lacプロモーターおよびkdsB遺伝
子を含有するプラスミドpTB201の構築を記載する。実施
例２では、pTB201を含む細胞を用いてCKSタンパク質の
発現を行い、kdsB遺伝子が機能し得るものであることを
確立する。実施例３では、融合タンパク質、たとえば実
施例４で得られたものを検出するためにヤギ抗CKS血清
を産生させる。実施例４には、CKSとHIVI p41との融合
タンパク質を開示する。実施例５には、CKSと合成HIVI
p41およびp120の種々の変換体との融合タンパク質を開
示する。実施例６には、CKSとHSVI IgG2との融合タンパ
ク質を開示する。実施例７では、CKSとtPA（組織プラス
ミノーゲン活性化因子）の「クリングル（kringle）」
領域との融合タンパク質を調製する。実施例８では、CK
SとSPL（pVal）との２つの融合タンパク質を調製する。
実施例９では、CKSとSPL（phe）との融合タンパク質を
調製する。実施例10では、CKSとHIV−２との結合タンパ
ク質を調製する。
実施例１（CSK発現ベクターの調製） （Ａ）pWM145の構築および調製 プラスミドpWM145は、C5a発現ベクターpWM111の誘導
体である［マンデッキ（Mandecki）らのGene43:131（19
86）］。pWM111ベクターはlacP−UV5−D24プロモーター
を含んでいるが、pWM145ベクターはlacP−T9−D24プロ
モーターを含んでいる。この変更は、EcoR I−BamH I断
片中に含まれているpWM111のプロモーター／オペレータ
ー領域を該変更を含む合成断片（第4A図参照）と置き換
えることにより行った。手順は以下のようにして行っ
た。
プラスミドDNA（pWM111）の単離は、JM83（ara、（la
c−proAB）、rpsL、o80、lacZ M15）細胞から、標準的
なアルカリ抽出プロトコールを用い、ついで塩化セシウ
ム勾配上で精製し、−20℃の70％エタノール（３容量）
で２時間沈澱させ、遠心分離することにより行った。DN
Aを蒸留水中に濃度1mg/mlとなるように再懸濁させた。
pWM111 DNA（１μｇ）の消化を、50mMトリス（pH7.
5）、10mM MgCl2および100mM NaClよりなるバッファー
（20μｌ）中でEcoR I（10単位）およびBamH I（10単
位）で同時に２時間かけて行った。消化の後、３キロベ
ースプラスミドを、５％（50:1 アクリルアミド:BIS）
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）により精製し
た。断片を切り出し、500mM酢酸アンモニウム、10mM酢
酸マグネシウム、1mM EDTAおよび0.1％SDS（10容量）中
で一夜振盪することにより抽出した。100％エタノール
（2.5容量）とともに−20℃で２時間冷やすことによりD
ANを沈澱させ、ついで遠心分離した。
EcoR I−BamH Iプロモーター断片は４つのオリゴヌク
レオチド（第4A図に示すようにオリゴ１〜４）からなっ
ていた。これら４つの断片は、変性条件下で20％PAGEに
より精製し、またそのアニーリングは、等モル量の各オ
リゴヌクレオチドを連結バッファー（66mMトリス（pH7.
6）、6.6mM MgCl2、50μg/mlBSA、10mMジチオトレイト
ール、1mM ATP）中で一緒に混合し、混合物を80℃に５
分間保ち、混合物を25℃にゆっくりと冷却し、ついで１
時間冷凍することにより行った。アニーリングしたオリ
ゴヌクレオチドの10倍モル過剰量を、20μ容量のリガ
ーゼバッファー中、16℃で一夜、精製EcoR I−BamH I消
化ベクター（約50mg）およびT4リガーゼ（１単位）とと
もに連結させた。連結混合物の1/4を用い、コンピテン
トなJM103（supE、thi、（lac−proAB）、endA、rpsL、
sbcB15、［F'、traD36、proAB、lacIqZ M15）を標準プ
ロトコール［マンデル（Mandel）およびハイガ（Higa）
のJ.Mol.Biol.53:154（1970）］を用いて形質転換し
た。形質転換体からのプラスミドDNAの調製は、上記の
ようにして培養液（150ml）から行い、サンガー（Sange
r）の方法［Proc.Natl.Acad.Sci.USA24:5463（1977）］
を用いてDNAのシークエンシングを行った。
（Ｂ）pTB201の構築および調製 CTP:CMP−３−デオキシ−Ｄ−マンノオクツロソネー
トシチジリルトランスフェラーゼ（CMP−KDOシンセター
ゼ）をコードしている大腸菌Ｋ−12株からのkdsB遺伝子
をpRG1から単離した。この遺伝子はHpa II断片中にほぼ
全体が含まれていた（第３図参照）。kdsBのpWM145中へ
のクローニングを容易にするためにリンカーを構築し
た。リンカーは後のクローニングのためのBamH I部位を
提供するのみならず、強いリボソーム結合部位およびCK
Sのアミノ末端の17アミノ酸をコードするDNA配列を含ん
でいた。第３図に示す構築のための手順は以下のようで
あった。
（1a）プラスミドpRG1をHpa IIで消化し、細菌性アルカ
リホスファターゼ（BRL）で脱リン酸した。1.7kb kdsB
遺伝子断片を５％（50:1）アクリルアミド:BISゲル上で
単離し、溶出し、上記のようにして精製した。
（1b）オリゴヌクレオチド（第4B図に示す）を合成し、
精製し、標識し［BRL T4キナーゼを用い、２×モル過剰
のATP［ガンマ［32P］ATP1部に対して非放射性ATP9部］
およびBRL推薦のプロトコールにより］、アニールし
た。
（２）Hpa II断片と合成断片との連結は、16℃で一夜か
けて行った。リガーゼを熱により不活性化した（65℃で
15分間）。ついでDNAを脱リン酸し（上記のようにし
て）、フェノール抽出し（１×１容量のバッファー平衡
フェノール、１×１容量のクロロホルム：イソアミルア
ルコール）、エタノール沈澱し、中間（medium）塩バッ
ファー（50mMトリス（pH7.5）、10nM MgCl2および50mM
NaCl）中に再懸濁させた。Hind IIIおよびBamH Iで同時
に消化した後、DNAを５％アクリルアミドゲルから精製
した。
（３）pWM145ベクターをHind IIIおよびBamH Iで消化
し、脱リン酸し、上記のようにして５％（50:1）アクリ
ルアミドゲルから精製した。ベクター（15ng）および挿
入物（20ng）を16℃で一夜連結させた。全連結混合物の
1/2を用いてコンピテントなJM103細胞を形質転換させ
た。pTB201の構築は、DNAシークエンシングにより変化
させた。
実施例２（kdsB遺伝子の発現およびpTB201/JM103細胞か
らのCKSの精製） （Ａ）pTB201/JM103細胞の培養 アンピシリン（50μg/ml）を含むLBブロース（10ml）
を入れた50ml容フラスコに、凍結貯蔵pTB201/JM103細胞
（１白金耳）を接種した。225rpmで振盪しながら培養液
を37℃インキュベードした。培養液が濁ったときに、こ
の10mlを用いて４容フラスコ中のLB/Amp（１）に接
種した。OD600＝0.3においてIPTG（イソプロピル−チオ
−β−ガラクトシド）を最終濃度が1mMとなるように加
え、細胞を一夜インキュベートした。全細胞溶解物の典
型的なSDS−PAGEおよびゲルスキャンを第５図に示して
ある。CKSの全細胞タンパク質に対する相対的なパーセ
ンテージは50〜75％である。
（Ｂ）CKSの精製 精製手順は、ゴールドマン（Goldman）およびコール
ブレナー（Kohlbrenner）により記載された手順（J.Bac
teriol.163:256〜261）に若干変更を加えて行った。細
胞を遠心分離によりペレット化し、50mMリン酸カリウム
（pH7.6）中に再懸濁し、フレンチプレス（15,000psi）
に２回通すことにより溶解させた。溶解物を30,000×ｇ
で30分間回転させた。可溶性の画分を硫酸プロタミンお
よび硫酸アンモニウムで処理し、記載のようにして透析
した［レイ（Ray）らのMethod Enzyoml.83:535（198
2）］。最終の精製のために試料をBioRad DEAE−5PW HP
LC−イオン交換カラムに通し、50〜400mMリン酸カリウ
ム（10％アセトニトリル）勾配で溶出した。
実施例３（ヤギ抗CKS血清の生成） （Ａ）ヤギの免疫および採血 ヤギを毎月、３つの一般的な領域−すなわち鼠蹊部
（皮下）、背中（auxillary）（皮下）および後足筋肉
に免疫した。最初の接種は、完全フロイントアジュバン
ト中の精製CKS（1mg）からなっていた。その後のブース
ター投与の接種物は不完全フロイントアジュバント中の
精製CKS（0.5mg）からなっていた。第二のブースター投
与から２週間および３週間接種後のヤギから血液（500m
l）を採取した。血液を一夜放置して凝固させ、血清を
デカントし、2500rpmで30分間回転させて残留する赤血
球を除いた。
（Ｂ）イムノブロッティング ヤギ血清中の抗CKS抗体の存在をイムノブロッティン
グにより確認した（第６図参照）。pTB201/JM103の全細
胞溶解物（第６図における「ｂ」）およびJM103の全細
胞溶解物コントロール（第６図における「ａ」）を12.5
％SDS−ポリアクリルアミドゲルにかけ、タンパク質を
電気泳動的に［タウビン（Towbin）らのProc.Natl.Aca
d.Sci.USA76:4350］ニトロセルロースに移した。フィル
ターをストリップにカッティングし、イムノブロッティ
ングバッファー（５％インスタント粉乳、１×TBS［50m
Mトリス、pH8.1、150mM NaCl］、0.01％アンチフォーム
Ｃエマルジョン（Antifoam C Emulsion））を用い撹拌
しながら15分間プレブロッキング（pre−blocked）し
た。ストリップをイムノブロッティングバッファーを入
れた別々の容器中に置き、種々の量の血清（1:100から
1:3000）を加えた。撹拌１時間半後、バッファーを注い
で除き、ストリップを１×TBSで５分間３回洗浄した。
第二の抗体として西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ウサ
ギ抗ヤギ抗体（バイオラド）をイムノブロッティングバ
ッファー中に1:1500に希釈してストリップに加えた。１
時間半撹拌した後、バッファーを注いで除き、ストリッ
プを上記のようにして洗浄した。展開剤［3,3′−ジア
ミノベンジジンテトラヒドロクロライド２水和物（0.5
μg/ml）、H2O2（0.1μg/ml）、１×TBS中］を添加した
後、撹拌しながらブロットを５〜10分間展開させた。1:
3000の希釈が最適であり、強い陽性のバンドと無視し得
るバックグランドが得られた。
実施例４（融合タンパク質−CKS/HIVIp41Hae III−Hind
III） ハイブリッド遺伝子の発現の一例として、HIVI（ヒト
免疫不全ウイルスＩ）の一部、p41（エンベロープ）遺
伝子をCKS発現ベクター中にクローニングした。得られ
た遺伝子は融合タンパク質をコードしており、該融合タ
ンパク質はCKS（カルボキシル末端に９残基未満）、９
アミノ酸残基リンカーおよびHIVIウイルスの主要などエ
ピトープ［前駆体エンベロープタンパク質p160に基づい
て548〜646のアミノ酸位置、アミノ酸番号はラトナー
（Ratner）らのNature313:227（1985）による］からな
っていた（第８図参照）。遺伝子のHIVI部分の適当な解
読わくを確実なものとするために、リンカーを作製し、
pTB201プラスミド中にクローニングした。リンカーおよ
びHIVI遺伝子断片は、kdsB遺伝子の末端にできるだけ接
近するようにクローニングした。基本原理は、kdsB遺伝
子の量を最大にすれば異種遺伝子の高レベル発現に成功
する機会が最大となるであろうということであった。
（Ａ）pTB210プラスミドの構築 pTB210プラスミド（第７図参照）は、pTB201プラスミ
ド（上述）の誘導体であった。pTB201をBgl IIおよびHi
nd IIIで消化し、3.6kbベクター断片を５％（50:1）ア
クリルアミドゲルから精製した。Bgl IIおよびHind III
末端と両立し得る突起（overhangs）を有する２つの合
成オリゴヌクレオチドからなるリンカーをベクター中に
連結し、連結混合物を用いてコンピテントなJM109細胞
（recA1、endA96、thi、hsdR17、supE44、relA1、λ
−、Δ（lac−proAB）、［F'、traD36、proAB、lac IqZ
M15］）を形質転換した。DNAシークエンシングを用いて
構築を確認した。
（Ｂ）pTB211プラスミドの構築 pTB211プラスミドは、kdsB−HIVI p41主要エピトープ
遺伝子のハイブリッドの発現に用いるためのベクター構
築物であった。HIVI DNAの採取源は、Kpn I断片としてp
UC18中にクローニングされたHIVI（NIHからのHTLV IIIB
単離物）のp160遺伝子を含むプラスミドであった。プラ
スミドをHae IIIおよびHind IIIで消化し、296bp断片を
５％アクリルアミドゲルから単離した。この断片をPvu
II−Hind III消化したpTB210ベクター中に連結し、つい
でコンピテントなJM109細胞を形質転換した。
（Ｃ）形質転換体のスクリーニング 形質転換細胞をLB/AMPプレート上で培養した。37℃で
一夜インキュベートした後、プレートからコロニー数個
を拡い、LB/AMPブロス（2ml）に接種するのに用いた。
培養液をOD600が0.3〜0.5まで増殖させ、ついでIPTGを
最終濃度が1mMになるように加えた。培養液を37℃でさ
らに３時間振盪した。600nmにおける培養液の吸光度を
測定し、各培養液（1ml）から細胞を沈澱させ、ついで
処理バッファー（63mMトリス、pH6.8、２％SDS、10％グ
リセリン、５％ 2−メルカプトエタノール）中にOD600
が10当量まで再懸濁させた。沸騰水浴中で10分間インキ
ュベートした後、各溶解培養液のアリコート（１μ）
を12.5％SDS−ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動に
かけた融合タンパク質の適当な分子量に対応するタンパ
ク質バンドは、クーマシーブリリアントブルーで染色し
たゲル上で直接視覚で観察することができた。融合タン
パク質はまた、ヤギ抗CKS血清（実施例３（Ｂ）に記載
した方法）およびHIVI陽性のヒト血清（1:250に希釈し
たヒト血清およびHRP標識ヤギ抗ヒト抗体を1:1500で用
いる）を用いたイムノブロッティングにより検出するこ
ともできた。インキュベート後の細胞中の融合タンパク
質レベルは、全細胞タンパク質の５〜10％であった。
実施例５（融合タンパク質−CKS/合成HIVIエンベロープ
ペプチド） 本実施例では、kdsB遺伝子と合成p41遺伝子の部分と
のハイブリッドが全細胞タンパク質の20％レベルまで融
合タンパク質を発現し生成した。加えて本実施例では、
HIVI部分からタンパク質のCKS部分を開裂させるための
化学的開裂部位としてリンカー領域中のAsp−Proジペプ
チドを使用することを示す。さらに別の例も含まれ、そ
れらは多数の融合物（CKSペプチドとp41およびp120の部
分）を得ることができることを示す。これらは診断に有
用なペプチドである。
（Ａ）HIVI synp41d遺伝子の合成およびクローニング synp41d遺伝子はHIVI p41タンパク質の欠失変異体を
コードし、388aa疎水性領域の欠失（p160に基づくアミ
ノ酸番号でAla674からVal711、第８図のプラスミド、pT
B310Bを参照）を含んでいる。遺伝子の合成は、1986年
７月８日に出願した米国特許出願第883,242号、1987年1
2月11日に出願した米国特許出願第131,973号および1987
年12月11日に出願した米国特許出願第132,089号各明細
書に開示されたオリゴヌクレオチドによる２本鎖切断修
復法を用いて行った。特異的な配列は、第９図において
単線で示してある。pTB210中へのクローニングを容易に
するために、合成遺伝子はフランキング（flanking）Ba
mH IおよびKpn I部位を含んでいた。ベクターをBgl II
およびKpn Iで消化し、BamH I−Kpn I合成遺伝子断片を
ベクター中に連結した。JM109細胞中に形質転換した
後、クローンを培養し、誘導し、発現のためにスクリー
ニングした。
（Ｂ）pTB310Aによりコードされる融合タンパク質の特
徴付け 最初のスクリーニングの結果、クローンは、ヌクレオ
チドの813位（第９図による塩基番号）にA/T塩基の欠失
を有するプラスミド（pTB310A）を含むことがわかっ
た。この変異（合成p41d遺伝子をクローニングする際に
起こった）は融合タンパク質のp41部分の先端が切り取
られることになったが、生成されたタンパク質は診断的
な可能性があることで特徴付けられた。
生成および精製 100ml容フラスコ中のLB/Amp（10ml）にpTB310A/JM109
の一夜培養物（100μ）を接種した。37℃で１時間半
振盪した後、IPTGを濃度が1mMとなるように培養液に加
え、細胞をさらに４時間増殖させた。培養液のアリコー
ト（1ml）をペレット化し、１×処理バッファーの適当
な容量中で溶解して10OD600吸光度単位の細胞の最終濃
度を得た。この試料は「WCL」（全細胞溶解物）と称
し、全細胞タンパク質に関する融合タンパク質の量を測
定するために用いた。細胞培養液の残る9mlは遠心分離
し（5000rpmで５分間、リゾチーム（2mg/ml）を含む10m
Mトリス（400μ）、pH8.0、1mM EDTA中に細胞を再懸
濁させた。氷上に15分間保った後、20％トリトンＸ−10
0（10μ）を加え、細胞を超音波処理した（６×30
秒）。溶解物をエッペンドルフ遠心管中で５分間回転さ
せた。上清を集め、ペレットを8M尿素（400μ）中に
再懸濁させた。再懸濁ペレットフラクション中に存在す
る融合タンパク質の純度は、クーマシー染色ゲルに基づ
いて約75％である。
ウエスタンブロッティングおよびイムノブロッティング pTB310A/JM109 WCLの試料（10μ）を、前染色した
タンパク質分子量標準、プラスミドを含まないJM109か
らのWCL、およびpTB210を含むJM109（非融合CKS）から
のWCLとともに、厚さ0.7mmの12.5％SDS−ポリアクリル
アミドゲル上に負荷した。ゲル電気泳動を150ボルトで
行い、ブロモフェノールブルー試料負荷染色がゲルの底
部に達したときに終了させた。ついでタンパク質を電気
泳動的にニトロセルロースに移した。イムノブロッティ
ングは実施例３（Ｂ）に記載のようにして行った。染色
ゲルおよびイムノブロット上のpTB310A/JM109 WCLの例
を第10図に示す。
融合タンパク質の化学的開裂 尿素可溶性フラクションのアリコート（30μ）を水
（10容量）で希釈し、不溶性融合タンパク質を遠心分離
によりペレット化した。ついでタンパク質を6Mグアニジ
ン塩酸塩（30μ）に溶解し、98％ギ酸（70μ）を加
えた（消化１）。これと平行した実験において、98％ギ
酸（70μ）を尿素フラクションのアリコート（30μ
）に直接加えた（消化２）。42℃で２日間インキュベ
ートした後、水（10容量）を加え、不溶性タンパク質を
遠心分離によりペレット化した。ペレットを１×処理バ
ッファー（100μ）中に再懸濁し、12.5％SDS−ポリア
クリルアミドゲル上のウエル当たり10μを用いた。第
10図は、クーマシー染色ゲルおよびイムノブロット（第
一の抗体としてHIVI陽性ヒト血清を用いた）の両方での
開裂生成物（消化１および消化２）の試料を示す。クー
マシー染色ゲル上では、わずかに２つの主要バンドが見
えるのみである。これらは独特のAsp−Pro結合での開裂
生成物であるCKS部分（MW＝26.5kDa）およびp41部分（M
W＝23.5kDa）を表す。ペプチドシークエンシングにより
低分子量バンドが確かにp41ペプチドであり、アミノ末
端残基がプロリンであることが確認された。アミノ末端
プロリンであることは、Aspとプロリンとの間での開裂
から期待される結果である。
（Ｃ）pTB310A/JM109クローンの特徴付け CKS−p41d融合物の正しい遺伝子を含むクローンを培
養し、発現についてアッセイした。融合タンパク質は、
（増殖および誘導条件に依存して）前細胞タンパク質の
10〜20％を表す。
（Ｄ）p120カルボキシル末端領域の付加 HIVIp120カルボキシル末端42アミノ酸（第９図の挿入
１）をコードする合成DNA断片を、nt（ヌクレオチド）1
5でpTB310AおよびpTB310BのNar I部位に挿入した。得ら
れたpTB319/JM109およびpTB321/JM109クローンは、それ
ぞれ三重融合タンパク質を全細胞タンパク質の20％まで
のレベルで発現した。
実施例６（融合タンパク質−CKS/HSVI IgG2） 単純ヘルペスウイルスII（HSVI I）gG2遺伝子（主要
エンベロープ糖タンパク質をコード）を含む1.1kb断片
を単離し、ついでAat IIおよびXba Iで消化した。合成
リンカーをXba I末端に連結させてAat II末端を生じさ
せた。ついで３′突起（overhangs）をT4ポリメラーゼ
で処理することにより両末端を平滑末端にした。
本実施例におけるベクターはpTB260であった（第11図
参照）。これは多数の制限部位を有する合成断片をpTB2
01のBgl II部位に連結することにより構築した。この合
成断片のクローニングにおいてpTB201からの元々のBgl
II部位は不活性化されていたのでリンカー８断片におけ
るBgl II部位は独特のものである。
gG2遺伝子を含む平滑末端DNA断片のクローニングを容
易にし、該遺伝子をkdsBの適当な解読わく中に置くため
に、クレノー断片およびdNTP'sを用いて突起（overhang
s）を充填することによりBgl II消化pTB260を平滑末端
化した。gG2DNAをpTB260に連結した後、このDNAを用い
てコンピテントなTB−１細胞を形質転換した。形質転換
体からの全細胞溶解物をゲル上の電気泳動にかけ、HSVI
Iタンパク質に対するウサギ血清でイムノブロットして
適当な分子量の目に見えるバンドを得た。
実施例７（融合タンパク質−CKS/tPAのクリングル領
域） 組織プラスミノーゲン活性化因子の「クリングル」
「パシー（Patthy,L.）のCell、41:657（1985）］領域
をコードする遺伝子を合成し、pTB270［ザブレン（Zabl
en,L.B.）、未出版］中に335bpのHind III−Kpn I断片
としてクローニングした。pTB270ベクター（第12図参
照）はpTB210の誘導体であり、合成マルチクローニング
部位リンカーをBgl II−Kpn I消化pTB210中に連結する
ことにより構築した。ついでpTB210プラスミドをHind I
II−Kpn Iで消化し、クリングル領域遺伝子断片に連結
した。コンピテントなXL−1 Blue細胞（ストラタジー
ン）を形質転換した。適当な挿入を含むクローンを、プ
ラスミドのDNAシークエンシングにより確認した。融合
タンパク質のレベルは、全細胞タンパク質の30〜40％に
達した。
実施例５の工程（Ｂ）のようにして細胞を溶解するこ
とにより、培養液からCKS/クリングルタンパク質を抽出
し、細胞の破片を沈澱させ、可溶性の融合タンパク質を
含む上清を回収した。タンパク質を「塩析」することに
よりさらに精製を行った。簡単に説明すると、硫酸アン
モニウムを10％（w/v）で加え、不溶性のタンパク質を
遠心分離によりペレット化した。このフラクションのペ
レットをアッセイして融合タンパク質の存在しないこと
を明らかにした後、捨てた。硫酸アンモニウムを最終濃
度が30％になるように上清に加え、不溶性タンパク質を
ペレット化した。このペレットは最初の融合タンパク質
を70％含んでおり、純度が75％であった。
実施例８（融合タンパク質−CKS/SPL（pVal）） 820bp EcoR I断片中に含まれるヒト肺界面活性剤遺伝
子、SPL（pVal）［ウイットセット（Witsett）らのより
1987年10月に出願された米国特許出願第101,680号明細
書参照］をpTB210中にクローニングした。突起状（over
hanging）EcoR I末端をクレノー断片およびdNTP'sを用
いて充填した。ついで平滑末端断片をPvu II消化pTB210
中に連結した。コンピテントなXL−1 Blue細胞（ストラ
タジーンを形質転換した後、多数の形質転換体からDNA
を単離し、制限エンドヌクレアーゼでマッピングして適
当な方向に挿入を有するクローンを同定した。全細胞溶
解物に基づく融合タンパク質の発現レベルは３％であっ
た。実施例５の工程（Ｂ）に記載のようにして細胞溶解
しペレット化することによりタンパク質を約50％の純度
まで精製した。融合タンパク質を用いゲル精製生成物で
ウサギを免疫することにより、SPLペプチドに対する抗
体を産生させた。
（Ｂ）pValの139nt活性化領域とともにkdsBを含むハイ
ブリッド遺伝子を、該活性化領域をコードするBgl II−
Hind III末端合成断片（上記特許出願参照）をBgl II−
Hind III消化pTB201中にクローニングすることにより構
築した。全細胞溶解物をアッセイしたところ、全細胞タ
ンパク質の40％までのレベルが発現されたことが示され
た（第13図参照）。
実施例９（融合タンパク質−CKS/SPL（Phe）） 1635bp EcoR I−Hind III断片中に含まれるヒト肺界
面活性剤遺伝子、SPL（phe）（ウイットセットらの上記
米国特許出願明細書に開示）をpTB210中にクローニング
した。この遺伝子は、クローンPhe7−１から1948bpEcoR
I断片として単離され、クレノー断片およびdNTP'sを用
いて平滑末端充填し、ついでHind IIIで消化した。この
断片をPvu II−Hind III消化pTB210中に連結し、コンピ
テントなXL−1Blue細胞中に形質転換した。CKS/SPL（Ph
e）融合タンパク質レベルは、全細胞タンパク質の９％
であった。融合タンパク質は、細胞の溶解後のペレット
（実施例５の工程（Ｂ））中で純度50％であった。ゲル
精製CKS/SPL（Phe）を用いてウサギを免疫し、タンパク
質のSPL（Phe）に対する抗体を産生させた。
実施例10（融合タンパク質−CKS/合成HIV−2TMP断片） 本実施例では、HIV−２（ヒト免疫不全ウイルスII）
膜透過性タンパク質（TMP）の一部を含む合成DNA断片を
CKS発現ベクター中にクローニングした。融合タンパク
質をコードする得られた遺伝子は、CKS（カルボキシル
末端に９残基末端）、10アミノ酸残基リンカー、HIV−
２ウイルスの主要エピトープ［エンベロープアミノ酸位
502〜609、アミノ酸番号はゲイエダー（Guyader）らのN
ature326:662（1987）によりる］とそれに続く他の10ア
ミノ酸残基リンカーからなっていた。この融合タンパク
質は全細胞タンパク質の15％まで発現され、HIV−２抗
体を含有する血清の検出に有用であることがわかった。
（Ａ）HIV−2 TMP断片の合成およびクローニング HIV−2 TMP断片は、第14図に明らかにされているよう
に、HIV−2 TMPのアミノ酸末端108アミノ酸（Tyr502か
らTrp609まで）をコードする。この遺伝子断片の合成
は、マンデッキにより1986年７月８日に出願された米国
特許出願第883,242号明細書に開示されたオリゴヌクレ
オチドによる２本鎖切断修復の方法を用いて行った。TM
P遺伝子断片を含む５つのDNA断片を一緒に連結し、puC1
9のHind III−Sal I部位にクローニングした（第15ず参
照）。pJC22で示されるクローンを制限マッピングで同
定し、その主要なヌクレオチド配列を確認した。クロー
ンpJC22をHind III−Asp718で消化して、合成HIV−2 TM
P遺伝子断片を含む361bp断片を放出させ、これをプラス
ミドpTB210のHind III−Asp718部位に連結し、XL1細胞
中に形質転換した。pJC100で示されるクローンを単離
し、制限マッピングしてkdsBとHIV−2 TMPとのハイブリ
ッドを同定した。
（Ｂ）pJC100によりコードされる融合タンパク質の特徴
付け 250ml容フラスコ中のLB/Amp（50ml）にpTB210/XL1か
またはpJC100/XL1の一夜培養液（500μ）を接種し、O
D600が0.5吸光度単位に達するまで（1.5〜2.0時間）37
℃で振盪し、このときIPTGを最終濃度が1mMとなるよう
に加えた。培養液のアリコート（1.5ml）を４時間のあ
いだ１時間毎に除き、ついで誘導18時間後に最後のアリ
コートを取った。これらのアリコートをペレット化し、
１×処理バッファーの適当な容量中で溶解して細胞の最
終濃度を10OD600吸光度単位とした。各時点におけるア
リコート（15μ）を12.5％SDS/PAGEゲル上の電気泳動
にかけ、電気泳動的にニトロセルロースを移した。HIV
−２陽性ヒト血清またはCKSに対するヤギ抗体を用い実
施例３の工程（Ｂ）に記載のようにしてイムノブロッテ
ィングを行った。HIV−２陽性ヒト血清は、pTB210/XL1
培養液に対してはシグナルを示さなかったがpJC1000/XL
1に対しては期待される分子量で強いシグナルを示し
た。CKSに対するヤギ抗体は、期待される分子量で両培
養液に対して強く反応した。同様のSDS/SAGEゲルを用い
クーマシーブルー染色したところ、融合タンパク質の発
現は誘導３〜４時間後に全タンパク質の15％のレベルで
ピークに達することが示された。第16図は、誘導前後の
種々の時点での12.5％SDS/PAGEゲルのクーマシーブルー
染色により見られるように、10容発酵槽でのCKS/HIV
−2 TMP融合タンパク質の発現を示している。融合タン
パク質の部分的精製は、実施例５の工程（Ｂ）に記載の
方法により得られ、同様の結果が示された。
【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明のプラスミドクローニングベクターの
図解である。 第２図は、CKS遺伝子を含むプラスミドpTB201の図解で
ある。 第３図は、pWM145からのpTB201の構築の説明図である。 第４図は、本発明のクローニングベクターpTB201の合成
lacP型プロモーター領域のDNA配列を示す模式図であ
る。 第５図は、pTB201含有JM103細胞からの種々の量の全細
胞溶解物のクーマシーブリリアントブルー染色SDS−PAG
Eゲルおよび対応するゲルスキャン／インテグレーショ
ンを示す模式図およびグラフである。 第６図は、CKS融合タンパク質を同定するための種々に
希釈したヤギ抗CKS血清の滴定を最適化するために用い
たCKS産生および非産生細胞のイムノブロッティングの
結果を示す模式図である。図中、ｍはタンパク質分子量
のマーカーを、ａは陰性コントロールJM103全細胞溶解
物を、ｂは陽性コントロールpTB201/JM103全細胞溶解物
の場合をそれぞれ示す。 第７図は、HIV p41融合タンパク質の発現に用いたプラ
スミドpTB210を示す模式図である。 第８図は、天然の遺伝子に関連して種々の合成p41遺伝
子を、タンパク質の疎水性プロットおよび名クローンの
発現レベルとともに示す模式図である。 第９図は、p120のカルボキシル末端を有する合成p41の
全長の配列を示す模式図である。図中、配列の上に示し
た破線はpTB310Bの配列を示す。pTB310Aの配列は、△で
示すＡ（nt813）の欠失がある他はpTB310Bと同じであ
る。プラスミドpTB321は、p120のカルボキシル末端をコ
ードする挿入１（nt15〜143）を含んでいる。プラスミ
ドpTB322は、p41の疎水性領域をコードする挿入２（nt6
10〜720）を含んでいる。 第10図は、pTB310から発現された融合タンパク質の酸加
水分解物のイムノブロッティングおよびクーマシーブリ
リアントブルー染色SDS−PAGEの結果を示す模式図であ
る。クーマシーブリリアントブルー染色SDS−PAGEは右
側に、ヒトAIDS陽性血清を用いたSDS−PAGEのイムノブ
ロッティングは左側に示してある。 第11図は、本発明においてクローニングベクターとして
用いるプラスミドpTB260を示す模式図である。 第12図は、本発明においてクローニングベクターとして
用いるプラスミドpTB270の模式図である。 第13図は、MW（分子量）標準、XL−１、非融合CKSおよ
びCKS/活性SPL（Val）をクーマシーブリリアントブルー
染色SDS−PAGEゲルかけた結果を示す模式図である。各
タイプのクローンからほぼ等しい数の細胞を溶解し、ゲ
ル上に負荷した。「XL−１」で示したレーンは、プラス
ミドを含まないXL−1Blue細胞株からの細胞溶解物のも
のであり、「非融合CKS」は、pTB201 CKS発現ベクター
を含むXL−1Blue細胞からの細胞溶解物のものであり、
「CKS/活性SPL（Val）」は、pTB201プラスミド上でkdsB
遺伝子と融合したpVal肺界面活性剤遺伝子の活性領域を
含むXL−１細胞株からの細胞溶解物のものである。 第14図は、５′側にHind III/Bgl IIリンカーを３′側
にSal Iリンカーがそれぞれ付加した合成HIV−2 TPM断
片のDNAおよびアミノ酸配列を示す模式図である。 第15図は、pJC22およびpJC100の構築を示す模式図であ
る。 第16図は、クローンpJC100におけるCKS/HIV−2 TMP融合
タンパク質の発現の誘導の前後における経時変化をクー
マシーブリリアントブルー染色ゲルで示した模式図であ
る。

Claims (14)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】微生物中でタンパク質を発現する方法であ
    って、 （ａ）調節領域、該調節領域の調節下にあり該調節領域
    に関して適当な解読わくにあるCKSタンパク質をコード
    する領域、および該CKSタンパク質をコードする領域に
    隣接した発現させようとする目的タンパク質をコードす
    る領域を含むDNAベクターであって、該調節領域が該CKS
    タンパク質コード領域および該目的タンパク質コード領
    域の発現を指令するものであるDNAベクターを調製し、 （ｂ）該微生物を該DNAベクターで形質転換し、ついで （ｃ）CKSと該目的タンパク質との融合タンパク質を発
    現させる ことを特徴とする方法。
  2. 【請求項２】目的タンパク質が、ヒト肺表面活性物質、
    HIVタンパク質およびHSVI Iタンパク質よりなる群から
    選ばれたものである請求項（１）記載の方法。
  3. 【請求項３】HIVタンパク質がHIV−１およびHIV−２よ
    りなる群から選ばれたものである請求項（２）記載の方
    法。
  4. 【請求項４】DNAベクターが、 （ａ）lac調節領域を有するプラスミドDNAを調製し、 （ｂ）該調節領域の調節下にあり該調節領域に関して適
    当な解読わくにあるCKSタンパク質をコードする遺伝子
    を挿入し、ついで （ｃ）該目的タンパク質をコードするDNA領域を該CKS遺
    伝子に隣接させて挿入し、その際、該目的タンパク質を
    コードする該DNA領域は該調節領域の調節下にあるよう
    にする ことにより調製されたもので請求項（１）記載の方法。
  5. 【請求項５】調節領域、該調節領域の調節下にあり該調
    節領域に関して適当な解読わくにあるCKSをコードする
    領域および該CKSタンパク質をコードする領域に隣接し
    た異種タンパク質をコードする領域を含むプラスミドか
    らなることを特徴とする異種タンパク質発現用に細胞を
    形質転換させるためのクローニングベクター。
  6. 【請求項６】（ａ）調節領域、該調節領域の調節下にあ
    り該調節領域に関して適当な解読わくにあるCKS酵素を
    コードする領域および該CKSタンパク質をコードする領
    域に隣接した目的タンパク質をコードする領域を含むDN
    Aベクターを調製し、 （ｂ）該目的タンパク質が異種タンパク質となるような
    細胞を該DNAベクターで形質転換し、 （ｃ）該細胞をクローニングし、 （ｄ）該クローニング細胞を培養し、 （ｅ）CKSと該目的タンパク質との融合生成物を回収
    し、ついで （ｆ）融合タンパク質中の目的タンパク質からCKSタン
    パク質を開裂させることを特徴とするタンパク質の製造
    方法。
  7. 【請求項７】目的タンパク質が、ヒト肺表面活性物質、
    HIVタンパク質およびHSVI Iタンパク質よりなる群から
    選ばれたものである請求項（６）記載の方法。
  8. 【請求項８】HIVタンパク質がHIV−１およびHIV−２よ
    りなる群から選ばれたものである請求項（６）記載の方
    法。
  9. 【請求項９】（ａ）プロモーター、 （ｂ）該プロモーターの下流に位置するリボソーム結合
    部位、 （ｃ）該リボソーム結合部位の下流に位置するCKSをコ
    ードする第一塩基サブ配列、および （ｄ）該第一塩基サブ配列の下流に位置するペプチド配
    列をコードする第二塩基サブ配列 からなることを特徴とするプラスミドベクター中へ挿入
    するための塩基配列。
  10. 【請求項１０】第二塩基サブ配列がウイルスタンパク質
    をコードする請求項（９）記載の塩基配列。
  11. 【請求項１１】第二塩基サブ配列が、HSVI Iタンパク質
    をコードするDAN配列およびHIVタンパク質をコードする
    DNA配列よりなる群から選ばれたものである請求項（1
    0）記載の塩基配列。
  12. 【請求項１２】第二塩基サブ配列が、HIVIタンパク質を
    コードするDNA配列およびHIVI Iタンパク質をコードす
    るDNA配列よりなる群から選ばれたものである請求項（1
    0）記載の塩基配列。
  13. 【請求項１３】第二塩基サブ配列がヒトタンパク質をコ
    ードするものである請求項（９）記載の塩基配列。
  14. 【請求項１４】第二塩基サブ配列が細菌タンパク質をコ
    ードするものである請求項（９）記載の塩基配列。
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