KR20240072296A - 단량체 DsRed와 인테인 변이체를 이용한 재조합 단백질의 세포 외부 분비 시스템 - Google Patents
단량체 DsRed와 인테인 변이체를 이용한 재조합 단백질의 세포 외부 분비 시스템 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20240072296A KR20240072296A KR1020220146820A KR20220146820A KR20240072296A KR 20240072296 A KR20240072296 A KR 20240072296A KR 1020220146820 A KR1020220146820 A KR 1020220146820A KR 20220146820 A KR20220146820 A KR 20220146820A KR 20240072296 A KR20240072296 A KR 20240072296A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- intein
- protein
- seq
- recombinant vector
- target protein
- Prior art date
Links
- 230000028327 secretion Effects 0.000 title claims abstract description 57
- 230000017730 intein-mediated protein splicing Effects 0.000 title claims abstract description 42
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 title abstract description 9
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 title abstract description 9
- 108010021843 fluorescent protein 583 Proteins 0.000 title abstract 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 118
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 98
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 55
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 23
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 23
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 15
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 241000006271 Discosoma sp. Species 0.000 claims abstract description 8
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 241000006867 Discosoma Species 0.000 claims abstract description 6
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 29
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 16
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 12
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 12
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 5
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 3
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 3
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 claims description 2
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 claims description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 abstract 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 50
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 description 20
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 11
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 9
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 9
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 9
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 description 8
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 7
- 235000019687 Lamb Nutrition 0.000 description 7
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 7
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 7
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 5
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 5
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 229920000139 polyethylene terephthalate Polymers 0.000 description 3
- 239000005020 polyethylene terephthalate Substances 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 3
- 239000003774 sulfhydryl reagent Substances 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003846 Carbonic anhydrases Human genes 0.000 description 2
- 108090000209 Carbonic anhydrases Proteins 0.000 description 2
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 2
- 241001575835 Ideonella sakaiensis Species 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 2
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- 230000007026 protein scission Effects 0.000 description 2
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 2
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YBADLXQNJCMBKR-UHFFFAOYSA-M (4-nitrophenyl)acetate Chemical compound [O-]C(=O)CC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 YBADLXQNJCMBKR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound NCC(O)=O.OCC(N)(CO)CO AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 101100136076 Aspergillus oryzae (strain ATCC 42149 / RIB 40) pel1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000014653 Carica parviflora Nutrition 0.000 description 1
- 241000243321 Cnidaria Species 0.000 description 1
- 101710199851 Copy number protein Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N DMSO Substances CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 1
- 108091008794 FGF receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000044168 Fibroblast Growth Factor Receptor Human genes 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000693878 Ideonella sakaiensis (strain NBRC 110686 / TISTR 2288 / 201-F6) Poly(ethylene terephthalate) hydrolase Proteins 0.000 description 1
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N Lithium Chemical compound [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 102000018819 Protein Translocation Systems Human genes 0.000 description 1
- 108010052646 Protein Translocation Systems Proteins 0.000 description 1
- 101000693873 Unknown prokaryotic organism Leaf-branch compost cutinase Proteins 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 229920006237 degradable polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004941 influx Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 101150040383 pel2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150050446 pelB gene Proteins 0.000 description 1
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- -1 polyethylene terephthalate Polymers 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 238000002525 ultrasonication Methods 0.000 description 1
- 239000000277 virosome Substances 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
- C07K14/43595—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from coelenteratae, e.g. medusae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/90—Fusion polypeptide containing a motif for post-translational modification
- C07K2319/92—Fusion polypeptide containing a motif for post-translational modification containing an intein ("protein splicing")domain
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 발명은 단량체 DsRed와 인테인 변이체를 이용한 재조합 단백질의 세포 외부 분비 시스템에 관한 것으로, 구체적으로는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 디스코소마(Discosoma sp.) 유래 형광단백질의 단량체 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 인테인 Mtu ΔI-CM을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자;가 순차적으로 연결된 것을 특징으로 하는, 목적 단백질의 세포 밖(extracellular) 분비를 향상시키기 위한 재조합 벡터 및 이를 이용한 목적 단백질의 생산 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 단량체 DsRed와 인테인 변이체를 이용한 재조합 단백질의 세포 외부 분비 시스템에 관한 것으로, 세포 외부로 단백질 분비가 가능한 디스코소마 형광단백질의 단량체 변이체(monomeric DsRed)와 단백질 절단능력을 지닌 인테인 Mtu ΔI-CM을 목적 단백질에 융합하여 재조합 단백질을 고효율로 세포 외부로 생산 및 분비하도록 하는 시스템에 관한 것이다.
단백질 산업이 증가하면서 재조합 단백질은 사용 목적과 생산 규모에 따라서 여러 종류의 발현시스템으로 생산되고 있다. 생물학적 숙주에 따라 상기 발현시스템에는 여러 종류가 있는데, 대표적으로 많이 쓰이는 것은 대장균이나 효모와 같은 미생물을 이용하거나 곤충세포, 동물세포, 식물세포를 이용하는 방법 등이 있다. 특히, 대장균 발현 시스템은 유전자 조작이 용이하고 경제적인 방법으로 널리 알려져 있다. 그러나, 사이토카인(cytokine)과 같은 진핵 세포 유래의 단백질을 생산하고자 할 경우에는 당화(glycosylation) 등과 같은 번역 후 수식이 불가능하고, 배양 배지로의 단백질 분비가 어려우며, 많은 단백질의 경우에서 이황화결합(disulfide bond)의 접힘(folding)이 제대로 이루어지지 않아 불용체(inclusion body)와 같은 불용성 단백질 형태로 생산되어 활성을 갖지 못하는 등의 단점이 있다. 이에 분비 발현, 분자 샤페론(molecular chaperon)의 공동발현, 재접힘(re-folding) 연구 등을 통하여 이러한 문제점을 조금씩 극복해 가고 있는 실정이다.
한편, 한국공개특허 제2021-0069271호에는 '스플릿 인테인을 접목한 가용성 향상 이중 기능성 융합 태그를 이용한 재조합 섬유아세포 성장인자 수용체의 제조방법, 정제방법, 및 이의 용도'가 개시되어 있고, 미국공개특허 제2020-00199183호에는 Mtu ΔI-CM intein의 변이체를 이용한 목적 단백질의 분리 방법에 관한 'MTU DELTA-I-CM INTEIN VARIANT AND THE USE THEREOF'이 개시되어 있으나, 본 발명의 단량체 DsRed와 인테인 변이체를 이용한 재조합 단백질의 세포 외부 분비 시스템에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 재조합 단백질 생산에 있어서 목적 단백질의 세포 밖(extracellular) 분비 효율을 향상시킬 수 있는 시스템을 개발하고자 하였다.
이를 위해, 디스코소마(Discosoma sp.) 유래 형광단백질의 단량체 변이체(monomeric DsRed)와 단백질 절단능력을 지닌 인테인 Mtu ΔI-CM을 목적 단백질에 융합하여 대장균 세포에서 발현시켰다. 그 결과, 본 발명의 monomeric DsRed-인테인 Mtu ΔI-CM 시스템이 종래 가장 효율적인 캐리어 단백질로 알려진 YebF 시스템과 대비 현저히 우수한 목적 단백질의 세포 밖 분비 효율을 나타내는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 디스코소마(Discosoma sp.) 유래 형광단백질의 단량체 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 인테인 Mtu ΔI-CM을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자;가 순차적으로 연결된 것을 특징으로 하는, 목적 단백질의 세포 밖(extracellular) 분비를 향상시키기 위한 재조합 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 숙주세포를 배양하여 목적 단백질의 발현을 유도하고 이를 수득하는 단계;를 포함하는, 목적 단백질의 생산 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는 목적 단백질의 세포 밖 분비 증진용 조성물을 제공한다.
본 발명의 디스코소마 형광단백질의 단량체 변이체(monomeric DsRed) 및 인테인 Mtu ΔI-CM 기반 시스템은 높은 효율로 목적하는 단백질을 세포 외부로 분비할 수 있고, 캐리어 단백질의 제거를 위한 추가 공정이 필요하지 않으므로, 다양한 목적 단백질의 생산 및 세포밖 분비를 위한 시스템으로 이용되어 유용 목적 단백질의 생산에 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 대장균에서 monomeric DsRed (이하 mDsRed)의 세포 외 분비 발현을 확인한 것으로, 30℃에서 48시간 배양 후 SDS-PAGE를 통해 단백질 분비 양상을 확인한 결과이다. Cell: 전세포 분획(whole cell fraction), Sup: 세포 밖 분획(extracellular fraction).
도 2는 mDsRed-bCA와 YebF-bCA의 단백질 분비 발현을 비교한 것으로, (a)는 분비 발현된 단백질의 정제 후 SDS-PAGE 분석 결과로, 로딩 시료는 48시간 배양 후의 세포 밖 분획(extracellular fraction)으로부터 정제된 단백질이다. (b)는 세포 밖 분획의 bCA 효소 활성 측정을 통한 분비 발현량 비교 결과이다.
도 3은 mDsRed-bCA와 mDsRed-intein-bCA의 분비 효율을 비교한 것으로, 37℃에서 배양하여 세포 밖 분획에 분비된 mDsRed의 형광을 측정하여 상대적으로 정량한 결과이다.
도 4는 서로 다른 분비 시스템(YebF, mDsRed, mDsRed-intein) 간의 bCA 분비 효율을 비교한 것으로. (a)는 37℃에서 9시간 동안 배양한 후 SDS-PAGE를 통한 단백질 분비량을 분석한 결과이다. MW: molecular weight marker, Sup: 세포 밖 분획(extracellular fraction), Sol: 전세포 분획(whole cell fraction) 중 가용성(soluble) 분획, Insol: 전세포 분획 중 불용성(insoluble) 분획. (b)는 (a)의 'Sup'시료를 이용하여 bCA 효소 활성 측정을 통한 분비 발현량 비교 결과이다.
도 5는 서로 다른 분비 시스템을 이용한 isPETase의 분비 효율을 비교한 것으로, 37℃에서 48시간 동안 배양한 후 세포 밖 분획을 이용하여 에스터라제(esterase) 효소 활성 측정을 통한 분비 발현량을 비교한 결과이다.
도 2는 mDsRed-bCA와 YebF-bCA의 단백질 분비 발현을 비교한 것으로, (a)는 분비 발현된 단백질의 정제 후 SDS-PAGE 분석 결과로, 로딩 시료는 48시간 배양 후의 세포 밖 분획(extracellular fraction)으로부터 정제된 단백질이다. (b)는 세포 밖 분획의 bCA 효소 활성 측정을 통한 분비 발현량 비교 결과이다.
도 3은 mDsRed-bCA와 mDsRed-intein-bCA의 분비 효율을 비교한 것으로, 37℃에서 배양하여 세포 밖 분획에 분비된 mDsRed의 형광을 측정하여 상대적으로 정량한 결과이다.
도 4는 서로 다른 분비 시스템(YebF, mDsRed, mDsRed-intein) 간의 bCA 분비 효율을 비교한 것으로. (a)는 37℃에서 9시간 동안 배양한 후 SDS-PAGE를 통한 단백질 분비량을 분석한 결과이다. MW: molecular weight marker, Sup: 세포 밖 분획(extracellular fraction), Sol: 전세포 분획(whole cell fraction) 중 가용성(soluble) 분획, Insol: 전세포 분획 중 불용성(insoluble) 분획. (b)는 (a)의 'Sup'시료를 이용하여 bCA 효소 활성 측정을 통한 분비 발현량 비교 결과이다.
도 5는 서로 다른 분비 시스템을 이용한 isPETase의 분비 효율을 비교한 것으로, 37℃에서 48시간 동안 배양한 후 세포 밖 분획을 이용하여 에스터라제(esterase) 효소 활성 측정을 통한 분비 발현량을 비교한 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 디스코소마(Discosoma sp.) 유래 형광단백질의 단량체 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 인테인 Mtu ΔI-CM을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자;가 순차적으로 연결된 것을 특징으로 하는, 목적 단백질의 세포 밖(extracellular) 분비를 향상시키기 위한 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명에 따른 재조합 벡터에 있어서, 상기 디스코소마 유래 형광단백질(Discosoma sp. red fluorescent protein; DsRed)의 단량체 변이체(monomeric DsRed)는 당업계에서 리포터(reporter) 단백질로 이용되어 온 펩티드로서, 본 발명에서는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 monomeric DsRed가 목적 단백질의 세포 외부로의 분비를 유도하는 캐리어(carrier)로 사용될 수 있음을 확인하였다.
또한, 본 발명에 따른 재조합 벡터에 있어서, 상기 인테인 Mtu ΔI-CM은 pH 유도성 C-말단 절단(cleavage) 활성을 가지는 자가 스플라이싱(self-splicing) 단백질 변이체로서, 인테인 Mtu ΔI-CM의 C-말단에 융합된 단백질을 절단할 수 있다. 인테인(intein) 단백질의 주요 용도 중 하나는 단백질 정제를 위한 정제 태그와의 결합이다. 자가 스플라이싱 인테인의 N- 또는 C-말단에서 활성 아미노산을 돌연변이시킴으로써, 말단의 활성을 침묵시킬 수 있고, 적절한 변형을 통해 N-말단 또는 C-말단에서만 절단할 수 있는 인테인을 얻을 수 있었다. 일반적으로, 인테인의 N-말단 절단은 티올 시약에 의해 유도되는 반면, C-말단 절단은 pH 변화 또는 티올 시약에 의해 유도될 수 있다. 티올 시약에 의해 유발된 인테인의 절단과 비교하여 pH에 의해 유발된 인테인의 C-말단 절단은 (1) 관심 분자의 정확한(authentic) N-말단을 생성할 수 있어 약학 폴리펩타이드 생산에 중요하고, (2) 환원제가 필요없어 이황화 결합을 가진 폴리펩타이드 또는 단백질의 생산에 이로우며, (3) 버퍼 용액의 pH 값만 변경하면 되기 때문에 경제적이고 편리한 특성이 있다.
본 발명에 따른 재조합 벡터에 있어서, 상기 monomeric DsRed 및 인테인 Mtu ΔI-CM는 각각 서열번호 2 및 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 재조합 벡터에 있어서, 상기 monomeric DsRed를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있고, 상기 인테인 Mtu ΔI-CM을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3의 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다.
구체적으로, 상기 monomeric DsRed 또는 인테인 Mtu ΔI-CM을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1 또는 3의 염기서열과 각각 70% 이상, 더 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 서열번호 1 또는 서열번호 3의 염기서열은 대장균의 코돈에 최적화된 서열일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어 "코돈 최적화"는 코딩된 단백질이 유기체에서 보다 효율적으로 발현되도록 특정 유기체에서 우선적으로 사용되는 것으로 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 코돈을 변화시키는 것을 의미한다. 대부분의 아미노산이 "동의어" 또는 "동의" 코돈이라고 하는, 몇몇 코돈에 의해 표시된다는 점에서, 유전자 코드가 축퇴적이지만, 특정 유기체에 의한 코돈 용법은 임의적이지 않고 특정 코돈 트리플렛에 편향적이다. 이러한 코돈 용법 편향성은 소정 유전자, 공통 기능 또는 조상 기원의 유전자, 고도로 발현되는 단백질 대 낮은 복제수 단백질, 및 유기체 게놈의 집합적 단백질 코딩 영역과 관련하여 더 높을 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 재조합 벡터에서 상기 monomeric DsRed를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 인테인 Mtu ΔI-CM을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자는 작동가능하게 연결된 것일 수 있다.
본 발명에서 "작동가능하게 연결된(operably linked)"이란 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다. 즉, 상기 monomeric DsRed를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 인테인 Mtu ΔI-CM을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자는 벡터 내에 있는 프로모터에 의해 그 발현이 조절될 수 있도록 연결될 수 있다.
또한, 본 발명의 재조합 벡터에 있어서, 상기 목적 단백질 코딩 유전자 상류에 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 NEXT 태그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 NEXT 태그는 C-말단에 연결되는 목적 단백질의 수용성을 증가시킬 수 있는 태그이다(한국등록특허공보 10-2106773).
본 발명의 일 구현 예에 따른 재조합 벡터에 있어서, 상기 monomeric DsRed와 인테인 Mtu ΔI-CM은 링커로 연결될 수 있고, 바람직하게는 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 GGGGS 링커로 연결될 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 당업계에 통상적으로 사용되는 다양한 링커를 사용할 수 있다.
본 발명에서 용어 "목적 단백질"은 당업자가 대량으로 생산하고자 하는 단백질로서, 재조합 발현 벡터에 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 삽입하여 형질전환체에서 발현이 가능한 모든 단백질을 의미한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 재조합 벡터에 있어서, 상기 목적 단백질은 효소, 항원, 항체, 세포수용체, 구조 단백질, 혈청 단백질 및 세포 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 생물학적 활성을 가지는 다양한 종류의 의료용, 연구용 또는 산업용 단백질을 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 것을 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
또한, 용어 "벡터(vector)" 또는 "발현 벡터(expression vector)"는 유전자 전사와 번역에 제공되는 요소와 추가 단편으로 구성되어 작동 가능하도록 연결된 폴리펩티드를 암호화하는 단편으로 구성되는 선형 또는 원형의 DNA 분자이다. 추가 단편은 프로모터 및 전사 종료 신호서열을 포함한다. 벡터 또는 발현벡터는 하나 이상의 복제 개시점과 하나 이상의 선택 마커 등을 포함한다. 벡터 또는 발현벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유도되거나, 또는 둘 다의 요소를 포함한다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 명세서에서 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호교환적으로 사용된다.
물론 모든 벡터가 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않고, 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 상태에서, 다른 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택하여 적용할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이고, 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
본 발명의 숙주세포는 목적 단백질의 세포 밖 분비가 향상된 것이 특징이다.
상기 숙주세포는 DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현 효율이 높은 세포가 통상 사용되며, 원핵 및 진핵 세포를 포함하는 모든 미생물로서, 박테리아, 효모, 곰팡이 등이 가능하다. 본 발명의 일 구현 예에서는 상기 숙주세포가 대장균(Escherichia coli)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 상기 형질전환된 숙주세포는 임의의 형질전환 방법에 따라 제조할 수 있다. 본 명세서에서 용어 "형질전환(transformation)"은 외부 DNA를 숙주세포로 도입하여 외부 DNA가 숙주세포의 염색체의 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것으로, 외부의 DNA를 세포 내로 도입하여 인위적으로 유전적인 변화를 일으키는 현상을 의미한다.
본 발명에서 상기 유전자를 숙주세포의 염색체상에 삽입하는 방법으로는 통상적으로 알려진 유전자조작방법을 사용할 수 있다.
또한, 형질전환방법에는 발현벡터를 이용한 방법 외에도, 숙주세포의 염색체상에 직접 삽입하는 방법도 이용될 수 있다.
일반적으로 전기천공법(electroporaton), 리포펙션, 탄도법, 비로솜, 리포솜, 면역리포솜, 다가양이온 또는 지질:핵산 접합체, 네이키드 DNA, 인공 바이론, 화학물질 촉진 DNA 유입, 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 미세주입법(microinjection), 초산 리튬-DMSO법 등이 이용될 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 숙주세포를 배양하여 목적 단백질의 발현을 유도하고 이를 수득하는 단계;를 포함하는, 목적 단백질의 생산 방법을 제공한다.
본 발명에 다른 목적 단백질의 생산 방법에 있어서, 상기 재조합 벡터는 목적 단백질의 세포 밖(extracellular) 분비를 향상시킬 수 있는 것으로, 디스코소마(Discosoma sp.) 유래 형광단백질의 단량체 변이체 및 인테인 Mtu ΔI-CM을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 자세한 사항은 전술한 것과 같다.
본 발명의 생산 방법에 있어서, 상기 형질전환된 숙주세포의 배양은 공지된 기술을 이용하여 숙주세포의 종류 및 발현시키고자 하는 목적 단백질의 제조에 적합한 배지에서 이루어질 수 있다. 적합한 배양 배지는 상업적으로 입수하거나 예를 들면, ATCC (American Type Culture Collection)의 카탈로그와 같은 간행물에 기재된 성분 및 조성비에 따라 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 생산 방법에 있어서, 상기 목적 단백질의 수득은 숙주세포 배양액으로부터 상기 목적 단백질을 분리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 분리 방법은 예를 들어 원심분리, 여과, 추출, 분무 건조, 증발 또는 침전을 포함하는 통상적인 방법에 의해서 배지로부터 분리될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 더 나아가 분리된 단백질은 크로마토그래피(예를 들면 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기별 배제), 투석, 전기영동, 분별 용해(예를 들면 암모늄 설페이트 침전), SDS-PAGE 또는 추출을 포함하는 공지된 다양한 방법을 통해서 정제될 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 생산 방법에 있어서, 회수된 목적 단백질이 낮은 순도라도 문제없는 경우는 정제없이 그대로 사용할 수 있으나, 목적 단백질 뿐만 아니라 세포 내의 다양한 단백질들 또한 미량으로 세포 밖으로 분비(또는 유출)되므로 순수하게 목적 단백질만 얻기 위해서는 정제 과정이 필요될 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는, 목적 단백질의 세포 밖(extracellualr) 분비 증진용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 목적 단백질의 세포 밖 분비를 증가시켜 목적 단백질의 생산 수율을 향상시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 명세서에서, "포함한다"는 표현은 "구비한다", "함유한다", "가진다" 또는 "특징으로 한다" 등의 표현과 등가(等價)의 의미를 가지는 개방형 기재이며, 추가로 열거되어 있지 않은 요소, 재료 또는 공정을 배제하지 않는다. 또한 "실질적으로…로 구성된다"는 표현은 특정된 요소, 재료 또는 공정과 함께 열거되어 있지 않은 다른 요소, 재료 또는 공정이 발명의 적어도 하나의 기본적이고 신규한 기술적 사상에 허용할 수 없을 만큼의 현저한 영향을 미치지 않는 양으로 존재할 수 있는 것을 의미한다. 또한 "구성된다"는 표현은 기재된 요소, 재료 또는 공정만이 존재하는 것을 의미한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 대장균 균주 및 배양 조건
유전자 재조합 벡터 제작을 위해 사용한 균주는 대장균(Escherichia coli) TOP10이고, 단백질 발현을 하기 위해 사용한 균주는 대장균 BL21(DE3)이다. 대장균은 Luria-Bertani (LB) 배지에서 37℃, 180 rpm 조건하에서 배양되었으며 필요에 따라 50 ㎍/㎖ 암피실린(ampicillin)이 첨가되었다.
2. 발현 벡터 제작
monomeric DsRed (이하 mDsRed), YebF, LamB, PM3, intein Mtu ΔI-CM (이하, intein)과 bCA (bovine carbonic anhydrase), isPETase (Ideonella sakaiensis PETase)의 각 아미노산 서열에 대해 코돈 최적화(codon optimization)를 수행하고, 유전자를 합성하였다(Genscript, USA). mDsRed 단독 발현을 위한 벡터 제작을 위해, 양 말단에 NdeI과 XhoI이 추가되어 합성된 mDsRed의 유전자 DNA를 NdeI과 XhoI 제한효소를 이용하여 절단하여 이를 동일한 제한효소로 처리된 pET-22b(+) 벡터(Novagen, USA)에 삽입하였다. 이외의 발현 벡터 클로닝 과정은 표 2의 프라이머 서열을 이용하여 PCR을 거쳐 수행되었다. PCR 산물은 pGEM T-easy 벡터에 클로닝되었고, 서열분석(sequencing)을 통해 확인한 후 발현 벡터로 옮겨졌다. mDsRed와 bCA, YebF와 bCA, mDsRed와 intein, NEXT와 isPETase 사이에는 각각 링커(서열번호 6)가 삽입되었다. 발명에 사용된 모든 단백질은 C-말단에 His6-tag을 지니도록 하였다.
| Name | 서열번호 | 핵산 또는 아미노산 정보 |
| monomeric DsRed | 1 | ATGGACAACACCGAGGACGTCATCAAGGAGTTCATGCAGTTCAAGGTGCGCATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACTACTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCAAGCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGCAGGTGACCAAGGGCGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCCCAGTTCCAGTACGGCTCCAAGGCCTATGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACATGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCACCTGGGAGCGCTCCATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGGAGGTGCAGCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCACCTTCATCTACAAGGTGAAGTTCAAGGGCGTGAACTTCCCCGCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACTGCCGGCTGGGAGCCCTCCACCGAGAAGCTGTACCCCCAGGACGGCGTGCTGAAGGGCGAGATCTCCCACGCCCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACACCTGCGACTTCAAGACCGTGTACAAGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCAACCACTACGTGGACTCCAAGCTGGACATCACCAACCACAACGAGGACTACACCGTGGTGGAGCAGTACGAGCACGCCGAGGCCCGCCACTCCGGCTCCCAG |
| 2 | MDNTEDVIKEFMQFKVRMEGSVNGHYFEIEGEGEGKPYEGTQTAKLQVTKGGPLPFAWDILSPQFQYGSKAYVKHPADIPDYMKLSFPEGFTWERSMNFEDGGVVEVQQDSSLQDGTFIYKVKFKGVNFPADGPVMQKKTAGWEPSTEKLYPQDGVLKGEISHALKLKDGGHYTCDFKTVYKAKKPVQLPGNHYVDSKLDITNHNEDYTVVEQYEHAEARHSGSQ | |
| Intein Mtu ΔI-CM | 3 | GCGCTGGCGGAGGGCACCCGTATCTTCGACCCGGTTACCGGTACCACCCACCGTATCGAAGATGTGGTTGGTGGCCGTAAGCCGATTCACGTGGTTGCGGCGGCGAAGGATGGTACCCTGCATGCGCGTCCGGTGGTTAGCTGGTTTGACCAGGGCACCCGTGATGTGATCGGTCTGCGTATTGCGGGTGGCGCGATTCTGTGGGCGACCCCGGACCACAAGGTTCTGACCGAATATGGTTGGCGTGCGGCGGGTGAACTGCGTAAAGGTGATCGTGTGGCGCAGCCGCGTCGTTTCGACGGTTTTGGTGATAGCGCGCCGATTCCGGCGCGTGTTCAAGCGCTGGCGGACGCGCTGGACGATAAGTTCCTGCACGATATGCTGGCGGAGGAACTGCGTTATAGCGTTATTCGTGAGGTGCTGCCGACCCGTCGTGCGCGTACCTTTGGCCTGGAAGTGGAGGAACTGCACACCCTGGTGGCGGAAGGTGTGGTTGTGCACAACTCC |
| 4 | ALAEGTRIFDPVTGTTHRIEDVVGGRKPIHVVAAAKDGTLHARPVVSWFDQGTRDVIGLRIAGGAILWATPDHKVLTEYGWRAAGELRKGDRVAQPRRFDGFGDSAPIPARVQALADALDDKFLHDMLAEELRYSVIREVLPTRRARTFGLEVEELHTLVAEGVVVHNS | |
| NEXT tag | 5 | MAVQHSNAPLIDLGAEMKKQHKEAAPEGAAPAQGKAPAAEAKKEEAPKPKPVV |
| GS linker | 6 | GGGGS |
| bCA | 7 | ATGGGCAGCCACCACTGGGGTTACGGCAAACACAACGGTCCGGAACACTGGCACAAGGACTTTCCGATTGCGAACGGTGAACGTCAGAGCCCGGTGGACATTGATACCAAAGCGGTGGTTCAAGATCCGGCGCTGAAGCCGCTGGCGCTGGTTTATGGTGAAGCGACCAGCCGTCGTATGGTGAACAACGGCCACAGCTTTAACGTTGAGTACGACGATAGCCAGGACAAAGCGGTGCTGAAGGATGGTCCGCTGACCGGCACCTATCGTCTGGTTCAGTTCCACTTTCACTGGGGTAGCAGCGACGATCAAGGCAGCGAACACACCGTGGACCGTAAGAAATACGCGGCGGAGCTGCACCTGGTTCACTGGAACACCAAATATGGTGATTTTGGCACCGCGGCGCAGCAACCGGATGGTCTGGCGGTGGTTGGCGTGTTTCTGAAAGTTGGTGACGCGAACCCGGCGCTGCAAAAGGTGCTGGACGCGCTGGATAGCATCAAGACCAAAGGCAAGAGCACCGACTTCCCGAACTTTGATCCGGGCAGCCTGCTGCCGAACGTTCTGGATTACTGGACCTATCCGGGCAGCCTGACCACCCCGCCGCTGCTGGAAAGCGTGACCTGGATCGTTCTGAAAGAGCCGATTAGCGTGAGCAGCCAGCAAATGCTGAAGTTCCGTACCCTGAACTTTAACGCGGAGGGTGAACCGGAGCTGCTGATGCTGGCGAACTGGCGTCCGGCGCAGCCGCTGAAAAACCGTCAAGTTCGTGGCTTCCCGAAG |
| 8 | MGSHHWGYGKHNGPEHWHKDFPIANGERQSPVDIDTKAVVQDPALKPLALVYGEATSRRMVNNGHSFNVEYDDSQDKAVLKDGPLTGTYRLVQFHFHWGSSDDQGSEHTVDRKKYAAELHLVHWNTKYGDFGTAAQQPDGLAVVGVFLKVGDANPALQKVLDALDSIKTKGKSTDFPNFDPGSLLPNVLDYWTYPGSLTTPPLLESVTWIVLKEPISVSSQQMLKFRTLNFNAEGEPELLMLANWRPAQPLKNRQVRGFPK | |
| isPETase | 9 | ATGGGCCAGACCAATCCGTATGCGCGCGGCCCCAACCCTACCGCCGCCTCGTTGGAAGCCAGCGCGGGACCCTTTACCGTTCGTAGCTTTACCGTTAGCCGTCCGTCCGGATATGGTGCAGGGACCGTCTATTACCCAACCAATGCAGGCGGCACCGTTGGCGCGATTGCAATCGTCCCCGGGTACACCGCGCGTCAAAGCAGCATTAAGTGGTGGGGTCCGCGCTTAGCTAGCCACGGCTTTGTGGTTATTACCATCGATACGAACAGCACTCTAGACCAGCCCAGCAGCCGTAGCTCGCAACAGATGGCCGCGCTTCGTCAAGTTGCGAGCTTGAACGGGACCAGCAGTAGCCCGATTTACGGAAAGGTCGATACTGCCCGCATGGGTGTGATGGGCCACTCAATGGGGGGCGGCGGTTCACTTATTAGCGCCGCGAACAACCCGAGTTTAAAAGCAGCGGCACCGCAGGCGCCGTGGGACTCTTCAACCAACTTCAGCAGTGTTACCGTGCCGACGCTGATTTTCGCGTGCGAGAATGATAGCATTGCACCGGTGAACAGCAGCGCGCTGCCGATTTATGATAGCATGTCCCGCAACGCAAAACAGTTTCTGGAAATTAACGGCGGTAGCCACTTTTGTGCCAACTCTGGGAACAGCAACCAGGCACTGATCGGAAAAAAAGGGGTTGCATGGATGAAACGATTCATGGATAATGACACCCGCTACTCAACCTTCGCCTGTGAGAATCCCAACAGCACACGCGTGTCGGATTTTCGCACCGCGAACTGTTCC |
| 10 | MGQTNPYARGPNPTAASLEASAGPFTVRSFTVSRPSGYGAGTVYYPTNAGGTVGAIAIVPGYTARQSSIKWWGPRLASHGFVVITIDTNSTLDQPSSRSSQQMAALRQVASLNGTSSSPIYGKVDTARMGVMGHSMGGGGSLISAANNPSLKAAAPQAPWDSSTNFSSVTVPTLIFACENDSIAPVNSSALPIYDSMSRNAKQFLEINGGSHFCANSGNSNQALIGKKGVAWMKRFMDNDTRYSTFACENPNSTRVSDFRTANCS | |
| YebF | 11 | ATGAAAAAAAGAGGGGCGTTTTTAGGGCTGTTGTTGGTTTCTGCCTGCGCATCAGTTTTCGCTGCCAATAATGAAACCAGCAAGTCGGTCACTTTCCCAAAGTGTGAAGATCTGGATGCTGCCGGAATTGCCGCGAGCGTAAAACGTGATTATCAACAAAATCGCGTGGCGCGTTGGGCAGATGATCAAAAAATTGTCGGTCAGGCCGATCCCGTGGCTTGGGTCAGTTTGCAGGACATTCAGGGTAAAGATGATAAATGGTCAGTACCGCTAACCGTGCGTGGTAAAAGTGCCGATATTCATTACCAGGTCAGCGTGGACTGCAAAGCGGGAATGGCGGAATATCAGCGGCGT |
| 12 | MKKRGAFLGLLLVSACASVFAANNETSKSVTFPKCEDLDAAGIAASVKRDYQQNRVARWADDQKIVGQADPVAWVSLQDIQGKDDKWSVPLTVRGKSADIHYQVSVDCKAGMAEYQRR | |
| LamB | 13 | ATGATGATTACTCTGCGCAAACTTCCTCTGGCGGTTGCCGTCGCAGCGGGCGTAATGTCTGCTCAGGCAATGGCC |
| 14 | MMITLRKLPLAVAVAAGVMSAQAMA | |
| PM3 | 15 | ATGAAATACCTGCTGCCGACCGCTGCTGCTGGTCTGCTGCTCCTCGCTGCCCAGCCGACGATGGCC |
| 16 | MKYLLPTAAAGLLLLAAQPTMA |
| 프라이머 | 서열(5'→3') (밑줄: 제한효소 자리) | 클로닝 대상 |
| Forward | CATATGGACAACACCGAGGA (서열번호 17) | monomeric DsRed |
| Reverse | CCATGGAACCTCCACCGCCCTGGGAGCCGGAGTG (서열번호 18) | |
| Forward | CATATGAAAAAAAGAGGGGCGTT (서열번호 19) | YebF |
| Reverse | CCATGGAACCTCCACCGCCACGCCGCTGATATTCCG (서열번호 20) | |
| DsRed Forward | CATATGGACAACACCGAGGA (서열번호 17) | monomeric DsRed-Intein Mtu ΔI-CM |
| DsRed Reverse | CTGGGAGCCGGAGTG (서열번호 21) | |
| Intein Forward | CCCGCCACTCCGGCTCCCAGGGCGGTGGAGGTAGCGCGCTGGCGGAGG (서열번호 22) | |
| Intein Reverse | CCATGGAGTTGTGCACAACCACAC (서열번호 23) | |
| Forward | CCATGGGCAGCCACCACTGGGGTT (서열번호 24) | bCA |
| Reverse | CTCGAGCTTCGGGAAG (서열번호 25) | |
| Forward | CCATGGGCCAGACCAAT (서열번호 26) | isPETase |
| Reverse | CTCGAGGGAACAGTTCGC (서열번호 27) | |
| NEXT Forward | CCATGGCTGTTCAACATAGCA (서열번호 28) | NEXT-isPETase |
| NEXT Reverse | AAGCTTGCTGCCACCTCCGCCCACAACGGGTTTTGGTTTAG (서열번호 29) | |
| isPETase Forward | AAGCTTCAGACCAATCCGTATGCGCGCGGC (서열번호 30) | |
| isPETase Reverse | CTCGAGGGAACAGTTCGC (서열번호 27) | |
| Forward | TATGATGATTACTCTGCGCAAACTTCCTCTGGCGGTTGCCGTCGCAGCGGGCGTAATGTCTGCTCAGGCAATGGC (서열번호 31) | LamB |
| Reverse | CATGGCCATTGCCTGAGCAGACATTACGCCCGCTGCGACGGCAACCGCCAGAGGAAGTTTGCGCAGAGTAATCATCA (서열번호 32) | |
| Forward | TATGAAATACCTGCTGCCGACCGCTGCTGCTGGTCTGCTGCTCCTCGCTGCCCAGCCGACGATGGC (서열번호 33) | PM3 |
| Reverse | CATGGCCATCGTCGGCTGGGCAGCGAGGAGCAGCAGACCAGCAGCAGCGGTCGGCAGCAGGTATTTCA (서열번호 34) |
2-1. mDsRed-bCA, YebF-bCA와 mDsRed-intein-bCA 벡터 제작
monomeric DsRed (이하, mDsRed)와 YebF는 NdeI이 포함된 정방향 프라이머와 NcoI이 포함된 역방향 프라이머를 이용하여 PCR을 통해 증폭하였다. 이후 발현 벡터인 pET-22b(+) 벡터에 NdeI과 NcoI 사이에 삽입되었다. Intein Mtu ΔI-CM (이하, intein)은 mDsRed와 오버랩핑된 프라이머를 디자인하여 overlap PCR을 통해 제한효소 추가없이 융합되어 양 말단이 NdeI과 NcoI으로 존재하는 mDsRed-intein 유전자를 만들었고, 이를 pET-22b(+) 벡터에 삽입하였다. bCA는 Ncol과 XhoI을 포함한 프라이머를 이용하여 증폭되었고, 이후 각 캐리어(carrier) 단백질이 삽입된 벡터의 NcoI, XhoI을 이용하여 삽입되었다.
2-2. mDsRed-intein-isPETase와 mDsRed-intein-NEXT-isPETase 벡터 제작
mDsRed-intein-isPETase의 경우, mDsRed-intein-bCA 벡터에서 bCA 부분을 NcoI과 XhoI으로 떼어낸 후, 동일한 제한효소 사이트를 지니는 프라이머로 증폭된 isPETase 유전자로 치환하는 방식으로 제작하였다. mDsRed-intein-NEXT-isPETase 벡터에 경우, NEXT는 양 말단이 NcoI과 HindⅢ가 되도록, isPETase의 경우 양 말단이 HindⅢ와 XhoI이 되도록 프라이머를 디자인하였고 이를 이용하여 PCR 및 클로닝을 진행하였다. 이후, 유사하게 mDsRed-intein-bCA 벡터에서 bCA 대신 NEXT-isPETase로 치환하였다.
2-3. LamB-isPETase와 PM3-isPETase 벡터 제작
프라이머 어닐링을 통해 양 말단에 NdeI과 NcoI 제한효소로 이루어진 LamB DNA와 PM3 DNA를 얻었다. DsRed-intein-bCA 벡터에서 DsRed-intein 대신에 LamB와 PM3 DNA로 치환하였다.
3. 재조합 단백질의 발현
구축된 벡터를 대장균 BL21(DE3)에 도입하였고, 이를 50 ㎍/㎖ 암피실린(ampicillin)이 첨가된 LB 배지에서 37℃, 180 rpm조건으로 배양하였다. 세포의 농도가 OD600 = 0.6~0.8에 도달하였을 때 isopropyl-b-D-thiogalactopyranoside (IPTG)를 첨가하여 단백질 발현을 유도하였다. 단백질 발현 유도 이후 37℃에서 배양할 경우 1 mM의 농도로 IPTG를 사용하였고, 30℃에서 배양할 경우 0.2 mM의 농도로 IPTG를 처리하였다. 일정 시간 배양 이후 배양액을 4℃, 4000×g에서 10분 간 원심분리하여 펠렛(whole cell fraction)과 상층액(extracellular fraction)을 분리하고 각각을 회수하였다.
4. 세포 분획
상기 펠렛(whole cell fraction)은 용해 버퍼(50 mM sodium phosphate, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8.0)에 재현탁하였다. 이들을 얼음물 상에서 초음파처리(ultrasonication)를 통해 파쇄하였고, 파쇄액을 4℃, 10,000×g 에서 10분간 원심분리한 후 상층액은 가용성 분획(soluble fraction, S)으로 명명했고, 펠렛은 동일한 부피의 용해 버퍼로 재현탁하여 불용성 분획(insoluble fraction, IS)으로 명명했다.
5. 단백질 정제
세포 밖 분획(extracellular fraction)을 Ni-NTA 아가로스 비드와 혼합 후 30분 동안 얼음에서 반응시켰다. 이후 혼합물을 정제용 컬럼에 넣어 비드는 컬럼에 남겼고 나머지 배지(medium)는 흘려보내 제거하였다. 세척 버퍼(50 mM sodium phosphate, 300 mM NaCl, 20 mM imidazole, pH 8.0)를 이용해 비드를 충분히 세척하였고, 그 후 용출(elution) 버퍼(50 mM sodium phosphate, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8.0)를 이용해 비드에 붙은 단백질을 용출시켰다. 정제된 단백질을 투석(dialysis) tubing (Spectra/Por®, molecular weight cutoff 10 kDa)에 담아 투석 버퍼(20 mM sodium phosphate, 300 mM NaCl, pH 7.5) 조건에서 투석을 철저히 수행하였다.
6. SDS-PAGE 분석 및 겔 염색
준비된 샘플은 4× sample buffer (Bio-Rad, USA)와 3:1의 부피비로 혼합하여 100℃에서 10분간 가열하였다. 15% 폴리아크릴아미드를 포함한 Tris-glycine 겔에서 SDS-PAGE를 실시하였다. 전기영동이 완료된 겔은 0.1% 쿠마시 브릴리언트블루(Coomassie brilliant blue) R-250 (Bio-Rad)으로 염색하였다.
7. 이산화탄소 수화(hydration) 활성 측정
효소의 CO2 수화 활성은 Wilbur-Anderson assay 기반의 분광분석법을 이용하여 측정하였다. 일회용 큐벳(cuvette)에 반응 버퍼(20 mM Tris-sulfate buffer, 100 μM phenol red, 500 mM NaCl, pH 8.3) 600 ㎕, 시료 10 ㎕, CO2-포화수(saturated water) 400 ㎕를 넣고 반응시켰다. 570 nm에서의 흡광도 변화값을 측정하였으며, 흡광도가 1.2부터 0.18까지 감소하는데 걸리는 시간을 구하였다. 효소를 사용한 경우의 시간을 t로, 효소 대신 블랭크 버퍼(dialysis buffer)를 사용한 경우의 시간을 t0로 놓았다. 효소 활성(Wilbur-Anderson Unit; WAU) 값은 로 구하였다. 모든 실험은 0℃에서 진행하였다.
8. 에스터라제(esterase) 활성 측정
세포 밖 분획(extracellular fraction)을 이용하여 에스터라제 활성을 측정하였다. 일회용 큐벳에 반응 버퍼(20 mM sodium phosphate, 300 mM NaCl, pH 7.5) 800 ㎕, 시료 100 ㎕, 100% 아세토니트릴(acetonitrile)에 녹아 있는 30 mM para-nitrophenyl acetate 100 ㎕를 넣고 25℃에서 반응시켰다. 곧바로 405 nm에서의 흡광도의 변화값을 측정하였다. 모 벡터(parent vector)를 지닌 대장균으로부터 동일하게 얻어낸 세포 밖 분획의 활성을 blank 활성으로 두고 이 값으로 보정하여 각 시료의 에스터라제 활성을 구하였다. 각 시료의 활성은 정제 및 정량된 isPETase의 활성과 비교하였으며, 이를 통해 각 샘플 내 isPETase를 간접적으로 정량하였다.
9. 형광 강도 측정
시간별로 샘플링 된 세포 밖 분획을 96-웰 세포 배양 플레이트에 200 ㎕씩 분주하였다. 마이크로플레이터 리더(Tecan, Switzerland)를 이용하여 각 웰의 DsRed 형광 강도(fluorescence intensity)를 측정하였다. Excitation 파장은 544 nm, emission 파장은 590 nm로 설정하였다.
실시예 1. monomeric DsRed의 세포 밖(extracellular) 분비 확인 및 융합 단백질 분비 효율 비교
본 발명에서는 산호초인 디스코소마(Discosoma sp.) 유래의 적색 형광단백질의 monomeric DsRed (이하, mDsRed)를 대장균에서 세포 밖 분비를 위한 캐리어 단백질(carrier protein)로 사용하였다. 대장균 세포를 이용하여 mDsRed를 30℃에서 48시간 동안 발현시키고 전세포 분획(whole cell fraction)과 세포 밖 분획(extracellular fraction)의 단백질 양을 확인한 결과, 대부분의 mDsRed 단백질이 세포 밖 분획에서 발견되었다(도 1). 이를 통해 mDsRed는 대장균에서 발현했을 때 세포 밖으로 분비됨을 확인하였다.
mDsRed와 다른 단백질의 융합 단백질도 세포 외 분비가 가능함을 확인하기 위해 모델 단백질로서 bCA (bovine carbonic anhydrase)를 사용하였다. 현존하는 가장 효율적인 캐리어 단백질인 YebF를 대조군으로 선정하여 mDsRed와 비교하였다. bCA와 캐리어 단백질의 융합 단백질(mDsRed-bCA, YebF-bCA)을 제작하여 30℃와 37℃에서 각각 48시간 동안 발현시키고 단백질 분비를 확인하였다. 그 결과 모든 온도에서 YebF-bCA보다 mDsRed-bCA의 분비량이 높았다(도 2a). 효소 활성을 통해 분비된 단백질을 정량한 결과 유사한 양상을 확인할 수 있었으며, YebF-bCA에 비해 mDsRed-bCA가 최대 30배 높게 세포 밖으로 분비되는 것으로 나타났다(도 2b). 최종적으로 30℃에서 48시간 이후 140 ㎎/L의 mDsRed-bCA를 세포 밖 분획에서 얻을 수 있었다.
실시예 2. Intein Mtu ΔI-CM 도입에 의한 mDsRed 시스템의 분비 효율 향상
단백질 절단 능력을 지닌 intein Mtu ΔI-CM (이하, intein)을 mDsRed와 목적 단백질 사이에 융합하여 발현하게 되면, 목적 단백질만을 얻어내기 위하여 분비 후 mDsRed를 절단하는 과정이 불필요하기 때문에 더욱 효율적일 것으로 예상되었다. mDsRed-bCA와 mDsRed-intein-bCA를 발현하여 세포 밖 분획에 분비된 mDsRed의 형광 세기를 토대로 분비 속도를 비교하였다. mDsRed-bCA 경우 분비가 포화될 때까지 24시간 이상 걸리는 반면, mDsRed-intein-bCA의 경우 10시간만에 분비가 포화되었다(도 3). 따라서 mDsRed-intein으로 발현한 경우, 캐리어 단백질의 세포 밖 분비 속도가 약 2.4배 이상 향상되었음을 확인할 수 있었다.
본 발명자는 단 시간 배양 시 mDsRed-intein-bCA 시스템의 단백질 분비 효율을 mDsRed-bCA와 YebF-bCA 시스템과 비교하였다. 캐리어가 아닌 목적 단백질의 분비를 확인하기 위해 SDS-PAGE 및 bCA의 활성 테스트를 수행하였다. 37℃에서 9시간 배양한 뒤 세포 밖 분획을 분리하였고, 전세포 분획은 추가적으로 가용성(soluble) 분획과 불용성(insoluble) 분획으로 나누어 분석하였다. SDS-PAGE 분석 결과, YebF-bCA의 경우 대부분 불용성으로 발현되어 단백질이 거의 분비되지 못했다(도 4a). mDsRed-bCA 또한 대부분 불용성으로 발현되었으나 YebF-bCA보다 많은 양이 가용성으로 발현되었고, mDsRed-intein-bCA의 경우 절반 정도 가용성으로 발현되었다(도 4a). 흥미롭게도 mDsRed-intein-bCA의 경우 세포 내에서 이미 intein에 의한 절단이 일어났으며, 겔상에서 mDsRed-intein과 bCA의 밴드가 따로 나타남을 확인할 수 있었다(도 4a). 분비 속도 측면에서, mDsRed-bCA는 가용성 단백질이 대부분 세포 안에 존재하고 있는 것에 반해, mDsRed-intein-bCA를 통해 발현/절단된 가용성 bCA의 대부분이 세포 밖으로 분비되었다(도 4a). 9시간 배양 샘플을 이용하여 분비된 bCA의 활성 측정을 통해 정량한 결과, SDS-PAGE 결과와 비슷한 양상을 보였으며, 최대 분비 속도를 보인 mDsRed-intein-bCA의 경우 약 30 ㎎/L의 bCA 단백질이 분비되었다(도 4b).
실시예 3. mDsRed-intein-NEXT 시스템 구축 및 PET 분해 효소 분비 테스트
또다른 목적 단백질로서 이데오넬라 사카이엔시스(Ideonella sakaiensis) 유래의 PET(polyethylene terephthalate) 분해효소(isPETase)를 선정하여 테스트하였다. isPETase의 경우 가용성 형태의 발현이 어려운 단백질로, 본 발명자의 이전 연구에서 개발한 수용성 태그인 NEXT를 mDsRed-intein 시스템에 융합한 새로운 mDsRed-intein-NEXT 시스템을 구축하였고, 이를 mDsRed-intein 및 기존 연구들에서 isPETase의 분비 발현에 사용되어온 YebF, LamB, PM3 (pelB mutant) 시스템과 비교하였다. 37℃에서 48시간 동안 배양한 후 isPETase의 분비량을 효소 활성 (esterase activity) 측정을 통해 정량하였다. 그 결과 YebF, LamB 및 PM3 시스템 대비 mDsRed-intein-isPETase의 분비량이 우수하였으며, mDsRed-intein-NEXT-isPETase의 분비량이 가장 높았으며, 기존 시스템 대비 최대 7배 정도 높은 것으로 확인되었다(도 5).
본 발명에서는 mDsRed가 대장균에서 세포 외 분비 발현을 위한 캐리어 단백질로 사용할 수 있음을 확인하였다. 그리고 mDsRed-intein 융합 시스템을 이용해 목적 단백질의 세포 밖 분비속도를 현저히 증가시켰다. 기존에 사용되던 가장 효율적인 캐리어 단백질 중 하나인 YebF와 비교하여 mDsRed-intein 융합 시스템이 목적 단백질의 분비량 및 분비속도 모두 향상시키는 것을 확인하였다. 특히, 본 발명의 시스템은 분비 이후 불필요한 캐리어 단백질의 절단 과정이 불필요하다는 점에서 매우 경제적이며 효율적이다. 따라서, 본 발명의 시스템은 향후 재조합 단백질의 손쉬운 생산·정제를 위해 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 항균 펩타이드 등의 분비를 통한 미생물 기반 치료제나 플라스틱 등 난분해성 중합체를 분해하는 미생물 개발 등에도 성공적으로 적용될 수 있을 것이다.
서열목록 전자파일 첨부
Claims (11)
- 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 디스코소마(Discosoma sp.) 유래 형광단백질의 단량체 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 인테인 Mtu ΔI-CM을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자;가 순차적으로 연결된 것을 특징으로 하는, 목적 단백질의 세포 밖(extracellular) 분비를 향상시키기 위한 재조합 벡터.
- 제1항에 있어서, 상기 목적 단백질은 효소, 항원, 항체, 세포수용체, 구조 단백질, 혈청 단백질 및 세포 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
- 제1항에 있어서, 상기 목적 단백질 코딩 유전자 상류에 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 NEXT 태그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
- 제1항에 있어서, 상기 형광단백질의 단량체 변이체와 인테인 Mtu ΔI-CM은 링커를 통해 연결된 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
- 제4항에 있어서, 상기 링커는 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 GGGGS 링커인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
- 제1항에 있어서, 상기 형광단백질의 단량체 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
- 제1항에 있어서, 상기 인테인 Mtu ΔI-CM을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포.
- 제8항에 있어서, 상기 숙주세포는 대장균인 것을 특징으로 하는 숙주세포.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환하는 단계; 및
상기 형질전환된 숙주세포를 배양하여 목적 단백질의 발현을 유도하고 이를 수득하는 단계;를 포함하는, 목적 단백질의 생산 방법. - 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는, 목적 단백질의 세포 밖(extracellualr) 분비 증진용 조성물.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220146820A KR20240072296A (ko) | 2022-11-07 | 2022-11-07 | 단량체 DsRed와 인테인 변이체를 이용한 재조합 단백질의 세포 외부 분비 시스템 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220146820A KR20240072296A (ko) | 2022-11-07 | 2022-11-07 | 단량체 DsRed와 인테인 변이체를 이용한 재조합 단백질의 세포 외부 분비 시스템 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20240072296A true KR20240072296A (ko) | 2024-05-24 |
Family
ID=91320955
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020220146820A KR20240072296A (ko) | 2022-11-07 | 2022-11-07 | 단량체 DsRed와 인테인 변이체를 이용한 재조합 단백질의 세포 외부 분비 시스템 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20240072296A (ko) |
-
2022
- 2022-11-07 KR KR1020220146820A patent/KR20240072296A/ko unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Bardwell et al. | The nucleotide sequence of the Escherichia coli K12 dnaJ+ gene. A gene that encodes a heat shock protein. | |
| KR100316347B1 (ko) | 대장균엔테로톡신ⅱ신호펩티드의변형체와인체성장호르몬의융합단백질을발현하는재조합미생물및그를이용한인체성장호르몬의제조방법 | |
| KR101373297B1 (ko) | 대장균 포스포글리세르산 인산화효소 유전자를 융합 파트너로서 포함하는 발현벡터 | |
| KR20190060024A (ko) | 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 신규한 펩타이드 및 이를 포함하는 융합 단백질 | |
| KR20240072296A (ko) | 단량체 DsRed와 인테인 변이체를 이용한 재조합 단백질의 세포 외부 분비 시스템 | |
| US20140154742A1 (en) | Novel expression and secretion vector systems for heterologous protein production in escherichia coli | |
| ES2337684T3 (es) | Carboxipeptidasa b recombinante y su purificacion. | |
| KR102617593B1 (ko) | 바이러스 뉴클레오캡시드를 이용한 목적 단백질 발현 플랫폼 | |
| KR100890184B1 (ko) | ＳｌｙＤ를 융합파트너로 이용한 재조합 단백질의 제조방법 | |
| RU2807615C2 (ru) | Способ получения биологически активных рекомбинантных протеинов | |
| CN116355932B (zh) | 重组载体和制备μ-芋螺毒素的方法 | |
| KR102009709B1 (ko) | 융합 폴리펩타이드를 이용하여 인간 부갑상선 호르몬 1-84를 생산하는 방법 | |
| KR100890187B1 (ko) | Ｔｓｆ를 융합파트너로 이용한 재조합 단백질의 제조방법 | |
| KR100890183B1 (ko) | 말산탈수소효소를 융합파트너로 이용한 재조합 단백질의제조방법 | |
| JP5020487B2 (ja) | 融合タンパク質発現用新規ｄｎａ及び該ｄｎａを用いたタンパク質の製造方法 | |
| KR101077611B1 (ko) | 주화성 단백질 ＣｈｅＺ를 융합발현파트너로 이용한 가용성재조합 단백질의 제조방법 | |
| CN115820677A (zh) | 重组slo抗原的制备方法和应用 | |
| JPH05219963A (ja) | 温度誘導分泌発現ベクターおよびその原核細胞での使用 | |
| KR100890186B1 (ko) | ＲｐｏＳ를 융합파트너로 이용한 재조합 단백질의 제조방법 | |
| KR100890185B1 (ko) | Ｃｒｒ을 융합파트너로 이용한 재조합 단백질의 제조방법 | |
| KR100890188B1 (ko) | ＰｏｔＤ를 융합파트너로 이용한 재조합 단백질의 제조방법 | |
| CN116606874A (zh) | 胱硫醚-β-合成酶的制备方法和应用 | |
| KR100890189B1 (ko) | Ｒｎａ 중합효소 알파 소단위를 융합파트너로 이용한재조합 단백질의 제조방법 | |
| CN115838437A (zh) | 人NT-proBNP融合蛋白及其制备方法和应用 | |
| JPS61185197A (ja) | ウロガストロンの微生物学的製造法 |