RU2807615C2 - Способ получения биологически активных рекомбинантных протеинов - Google Patents

Способ получения биологически активных рекомбинантных протеинов Download PDF

Info

Publication number
RU2807615C2
RU2807615C2 RU2022109102A RU2022109102A RU2807615C2 RU 2807615 C2 RU2807615 C2 RU 2807615C2 RU 2022109102 A RU2022109102 A RU 2022109102A RU 2022109102 A RU2022109102 A RU 2022109102A RU 2807615 C2 RU2807615 C2 RU 2807615C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
target
sumo
protein
proteins
target protein
Prior art date
Application number
RU2022109102A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2022109102A (ru
Inventor
Дмитрий Георгиевич Козлов
Евгения Павловна Санникова
Наталья Владимировна Булушова
Ирек Ильясович Губайдуллин
Александр Алексеевич Горбунов
Александр Сергеевич Комолов
Original Assignee
Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр "Курчатовский институт"
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр "Курчатовский институт" filed Critical Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр "Курчатовский институт"
Publication of RU2022109102A publication Critical patent/RU2022109102A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2807615C2 publication Critical patent/RU2807615C2/ru

Links

Abstract

Способ получения биологически активных рекомбинантных протеинов, содержащих до 4 дисульфидных связей. Способ предусматривает разработку генетической конструкции, кодирующей предшественник целевого белка-мишени, содержащий в своем составе расположенные в порядке перечисления от N-конца к С-концу последовательность самоассоциирующего пептида L6KD, включающего следующие друг за другом 6 остатков лейцина, последовательность белка SUMO - продукта гена Smt3 дрожжей Saccharomyces cerevisiae и последовательность целевого белка-мишени, первый N-концевой остаток которого, следующий за последовательностью белка SUMO, отличен от пролина. Созданную генетическую конструкцию используют для получения целевого белка-мишени путем трансформации этой конструкцией подходящего реципиентного штамма, культивирования трансформированного штамма в условиях, обеспечивающих экспрессию генетической конструкции и микробиологический синтез предшественника целевого белка-мишени в форме нерастворимых телец включения, с последующим выделением синтезированных телец включения из клеток штамма-продуцента, высвобождением из их состава растворимого целевого белка-мишени с помощью подходящей производной SUMO-специфичной протеиназы, отделением остатков нерастворимых телец включения с помощью центрифугирования и дальнейшей очисткой высвобожденного белка-мишени с использованием методов молекулярной биологии, без применения ренатурации. Изобретение обеспечивает эффективное получение биологически активных рекомбинантных белков-мишеней, производимых с использованием микробиологического синтеза без применения процедур денатурации/ренатурации. 5 ил., 2 табл., 16 пр.

Description

Область техники
Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа получения целевых биологически активных рекомбинантных белков и полипептидов (протеинов, белков-мишеней), производимых с использованием микробиологического синтеза.
Уровень техники
Традиционные способы микробиологического синтеза биологически активных рекомбинантных белков и полипептидов (протеинов, белков-мишеней) предусматривают создание и использование генетических конструкций, штаммов и методов их культивирования, а также, как правило, включают сложные комбинации хроматографических методов очистки целевых продуктов. Разработка и применение этих способов обычно требует значительных экономических и временных затрат.В этой связи большую актуальность приобретают универсальные способы, позволяющие ускорить разработку технологий получения белков-мишеней и снизить себестоимость конечных продуктов [обзоры Yang X., Pistolozzi М, Lin Zh. New trends in aggregating tags for therapeutic protein purification. Biotechnology Letters, 2018, 40, 745-753; Gomari M.M., Saraygord-Afshari N., Farsimadan M., Rostami N., Aghamiri S., Farajollahi M.M. Opportunities and challenges of the tag-assisted protein purification techniques: Applications in the pharmaceutical industry. Biotechnol Adv, 2020, 45, 107653].
Их разработка требует решения, по крайней мере, двух взаимосвязанных технологических задач: получения целевых белков-мишеней в биологически активном состоянии и их хотя бы первичного отделения/очистки от основной массы примесных клеточных белков. При этом успешное решение первой задачи, например, путем биосинтеза белков-мишеней с использованием развитой технологии растворимых гибридных белков, включающих универсальные аффинные метки, как правило, приводит к необходимости применения дорогостоящих сорбентов на стадии аффинной очистки. С другой стороны, удешевление очистки путем применения центрифугирования или фильтрации целевых белков, получаемых в нерастворимом виде в тельцах включения (ТВ) в клетках E.coli, сопровождается необходимостью разрабатывать трудоемкие и не до конца эффективные методы восстановления биологически активного состояния (корректной конформации) белков-мишеней с применением процедур денатурации/ренатурации.
В этой связи актуальность приобретают компромиссные способы получения биологически активных белков-мишеней, не требующие применения процедур денатурации/ренатурации и при этом позволяющие для очистки/отделения целевых продуктов, по крайней мере, первичной, использовать недорогие методы центрифугирования или фильтрования.
Из предшествующего уровня техники известна группа способов получения белков-мишеней с помощью растворимых SUMO-фьюжнов, включающих последовательности белков SUMO и пептидных тэгов, опосредующих аффинную очистку [Butt T.R., Edavettal S.C., Hall J.P., Mattern M.R. SUMO fusion technology for difficult-to-express proteins. Protein Expr Purif, 2005, 43(1), 1 -9; Marblestone J.G., Edavettal S.C., Lim Y., Lim P., Zuo X., Butt T.R. Comparison of SUMO fusion technology with traditional gene fusion systems: Enhanced expression and solubility with SUMO. Protein Set, 2006, 15(1), 182-189]. Они также обеспечивают получение белков-мишеней в биологически активном состоянии без использования ренатурации и позволяют упростить их очистку за счет использования универсальных аффинных сорбентов. Для их реализации наиболее часто используют белок SUMO дрожжей Saccharomyces cerevisiae [Johnson et al., 1997; Muller et al., 1998], кодируемый геном SMT3 и состоящий из 98 аминокислотных остатков [MossessovaE., Lima CD. Ulp1-SUMO crystal structure and genetic analysis reveal conserved interactions and a regulatory element essential for cell growth in yeast. Mol Cell, 2000, 5(5), 865-876]. Использование SUMO является ключевым элементом и залогом высокой результативности указанной группы способов. Присутствие SUMO обеспечивает высокие показатели растворимости и процессинга фьюжнов, а также стимулирует корректную свертку белков-мишеней [Malakhov М.Р., Mattern M.R., Malakhova О.А., Drinker M., Weeks S.D., Butt T.R. SUMO fusions and SUMO-specific protease for efficient expression and purification of proteins. J Struct Funct Genomics, 2004, 5(1-2), 75-86; Butt T.R., Edavettal S.C., Hall J.P., Mattern M.R. SUMO fusion technology for difficult-to-express proteins. Protein Expr Purif, 2005, 43(1), 1-9; Marblestone J.G., Edavettal S.C., Lim Y., Lim P., Zuo X., Butt T.R. Comparison of SUMO fusion technology with traditional gene fusion systems: Enhanced expression and solubility with SUMO. Protein Set, 2006, 15(1), 182-189].
При реализации указанной группы способов захват и первичные стадии очистки белков-мишеней (из клеточных лизатов) проводят без разрушения SUMO-фьюжнов. Высвобождение белков-мишеней из состава SUMO-фьюжнов осуществляют на завершающих стадиях очистки с использованием ферментативного гидролиза (процессинга), осуществляемого под действием производных SUMO-специфичной протеиназы Ulp1, например, ULP275 [RU 2451076] или других вариантов [Li S.-J., Hochstrasser М. The Ulp1 SUMO isopeptidase: distinct domains required for viability, nuclear envelope localization, and substrate specificity. J Cell Biol, 2003, 160, 1069-1081; Butt T.R., Edavettal S.C., Hall J.P., Mattern M.R. SUMO fusion technology for difficult-to-express proteins. Protein Expr Purif, 2005, 43(1), 1-9].
Возможность использовать производные протеиназы Ulp1 относят к преимуществам указанной группы способов, поскольку:
1) действие протеиназ, направленное на пептидную или изопептидную связь, соединяющую консервативный С-концевой дипептид Гли-Гли SUMO и следующий с ним аминокислотный остаток белка-мишени, обладает исключительной высокой селективностью и практически не зависит от природы этого аминокислотного остатка (исключая пролин), который, в том числе, может быть представлен целым структурным элементом, включающим дисульфидную связь [RU 2441072];
2) протеиназы обладают чрезвычайно высокой активностью и обеспечивают эффективный гидролиз SUMO-фьюжнов в соотношении фермента к субстрату 1: 5000 и более [Malakhov М.Р., Mattern M.R., Malakhova О.A., Drinker М., Weeks S.D., Butt T.R. SUMO fusions and SUMO-specific protease for efficient expression and purification of proteins. J Struct Fund Genomics, 2004, 5(1-2), 75-86; Butt T.R., Edavettal S.C., Hall J.P., Mattern M.R. SUMO fusion technology for difficult-to-express proteins. Protein Expr Purif, 2005, 43(1), 1-9; Marblestone J.G., Edavettal S.C., Lim Y, Lim P., Zuo X., Butt T.R. Comparison of SUMO fusion technology with traditional gene fusion systems: Enhanced expression and solubility with SUMO. Protein Sci., 2006, 15(1), 182-189];
3) протеиназы обладают чрезвычайно высокой специфичностью и способны безошибочно распознавать SUMO в составе любых SUMO-фьюжнов, поскольку взаимодействуют не с отдельным сайтом, а с трехмерной структурой SUMO [Wilkinson K.D. Regulation of ubiquitin-dependent processes by deubiquitinating enzymes. FASEB J, 1997, 11, 1245-1256; Chung C.H., Baek S.H. Deubiquitinating enzymes: their diversity and emerging roles. Biochem Biophys Res Commun, 1999,266, 633-640; Mossessova E., Lima CD. Ulp1-SUMO crystal structure and genetic analysis reveal conserved interactions and a regulatory element essential for cell growth in yeast. Mol Cell, 2000, 5(5), 865-876; Butt T.R., Edavettal S.C., Hall J.P., Mattern M.R. SUMO fusion technology for difficult-to-express proteins. Protein Expr Purif, 2005, 43(1), 1-9];
4) протеиназы обладают низкой чувствительности к условиям ферментативной реакции [Malakhov M.R, Mattern M.R., Malakhova О.А., Drinker M., Weeks S.D., Butt T.R. SUMO fusions and SUMO-specific protease for efficient expression and purification of proteins. J Struct Funct Genomics, 2004, 5(1-2), 75-86; Butt T.R., Edavettal S.C., Hall J.P., Mattern M.R. SUMO fusion technology for difficult-to-express proteins. Protein Expr Purif, 2005, 43(1), 1-9].
В совокупности уникальные физико-химические характеристики SUMO и уникальные ферментативные характеристики производных протеиназы Ulp1 обеспечивают их эффективное применение для решения широкого круга задач: (1) увеличения экспрессии белков-мишеней в клетках эукариот и прокариот; (2) увеличения растворимости и стимулирования корректной свертки белков-мишеней в составе SUMO-фьюжнов в ходе их биосинтеза; (3) упрощения очистки белков-мишеней; (4) получения белков-мишеней с заданными N-концевыми последовательностями [Malakhov M.R, Mattern M.R., Malakhova О.А., Drinker M., Weeks S.D., Butt T.R. SUMO fusions and SUMO-specific protease for efficient expression and purification of proteins. J Struct Funct Genomics, 2004, 5(1-2), 75-86; Marblestone J.G., Edavettal S.C., Lim Y., Lim P., Zuo X., Butt T.R. Comparison of SUMO fusion technology with traditional gene fusion systems: Enhanced expression and solubility with SUMO. Protein Sci, 2006, 15(1), 182-189].
В то же время уникальные свойства и высокая эффективность их применения для организации биосинтеза и процессинга растворимых SUMO-содержащих фьюжнов, ни в коей мере не являются обоснованием возможности и эффективности их применения в отношение фьюжнов, синтезируемых в форме нерастворимых ТВ. Сведений о процессинге SUMO-фьюжнов в составе нерастворимых ТВ в источниках научно-технической информации не обнаружено.
Наиболее близким к заявляемому изобретению является способ биосинтеза биологически активных белков-мишеней в составе нерастворимых интеин-содержащих гибридных белков (фьюжнов), содержащих самоассоциирующие тэги (CAT). В процессе биосинтеза такие САТ-содержащие фьюжны самоассоциируют с образованием нерастворимых агрегатов, называемых активными тельцами включения (АТВ) [US 9200306]. От обычных телец включения (ТВ) АТВ отличает присутствие в их составе белков-мишеней в корректно свернутом биологически активном состоянии. Высвобождение белков-мишеней из состава АТВ осуществляется в процессе очистки в результате автокаталитического интеин-зависимого гидролиза (процессинга) фьюжнов [обзор Lin Zh., Zhao Q., Xing L., Zhou В., Wang X. Aggregating tags for column-free protein purification. Biotechnol. J., 2015, 10, 1877-1886]. Данный способ эффективно используют для получения рекомбинантного глюкагоноподобного пептида и других белков [US 9200306; Xing L., Xu W., Zhou В., Chen Y., Lin Z. Facile expression and purification of the antimicrobial peptide histatin 1 with a cleavable self-aggregating tag (cSAT) in Escherichia coli. Protein Expr. Purif., 2013, 88, 248-253; Zhao Q., Xu W, Xing L., Lin Z. Recombinant production of medium-to large-sized peptides in Escherichia coli using a cleavable self-aggregating tag. Microb Cell Fact, 2016, 15, 136; Zhao Q., Zhou В., Gao X., Xing L., Wang X., Lin Z. A cleavable self-assembling tag strategy for preparing proteins and peptides with an authentic N-terminus. Biotechnol J, 2017, 12:1600656; Lin Z., Ndengue P.P.A., Jing Y, Zhao L., Yang X. Facile expression and purification of active human growth hormone in E.coli by a cleavable self-aggregating tag scheme. Protein Expr Purif, 2021, 188, 105974].
Ключевым технологическим преимуществом указанного способа является обегченное разделение целевых белков и примесных клеточных белков с использованием центрифугирования (осаждения) или фильтрации, снижающее трудозатраты и себестоимость производимых протеинов. Реализация способа включает три этапа. На первом из них осаждение/фильтрация используется для отделения нерастворимых АТВ от растворимых клеточных белков. На втором этапе осуществляют автокаталитический интеин-зависимый процессинг фьюжнов и высвобождение белков-мишеней из состава нерастворимых АТВ. На третьем этапе осаждение/фильтрация используют для отделения растворимых белков-мишеней, высвобожденных из состава АТВ, от остатков нерастворимых АТВ. Результирующие препараты белков-мишеней характеризуются высокой степенью первичной очистки [US 9200306; Xing L., Xu W., Zhou В., Chen Y., Lin Z. Facile expression and purification of the antimicrobial peptide histatin 1 with a cleavable self-aggregating tag (cSAT) in Escherichia coli. Protein Expr. Purif., 2013, 88, 248-253; Zhao Q., Xu W., Xing L., Lin Z. Recombinant production of medium-to large-sized peptides in Escherichia coli using a cleavable self-aggregating tag. Microb Cell Fact, 2016, 15, 136; Zhao Q., Zhou В., Gao X., Xing L., Wang X., Lin Z. A cleavable self-assembling tag strategy for preparing proteins and peptides with an authentic N-terminus. Biotechnol J, 2017, 12:1600656; Lin Z., Ndengue P.P.A., Jing Y, Zhao L., Yang X. Facile expression and purification of active human growth hormone in E.coli by a cleavable self-aggregating tag scheme. Protein Expr Purif, 2021, 188, 105974], при необходимости их дальнейшая очистка может проводиться с использованием стандартных методов, известных из уровня техники.
Эффективность указанного способа снижают потери, возникающие вследствие недостаточно эффективной свертки отдельных компонентов фьюжна, неполного и/или преждевременного высвобождения белка-мишени из состава фьюжна [Zhao Q., Zhou В., Gao X., Xing L., Wang X., Lin Z. A cleavable self-assembling tag strategy for preparing proteins and peptides with an authentic N-terminus. Biotechnol J, 2017, 12:1600656], наличия структурных особенностей фьюжна, снижающих автокаталитическую активность интеинов [Mathys S., Evans Т.С., Chute I.C., Wu H., Chong S., Benner J., Liu X.Q., Xu M.Q. Characterization of a self-splicing mini-intein and its conversion into autocatalytic N- and C-terminal cleavage elements: facile production of protein building blocks for protein ligation. Gene, 1999, 231(1-2), 1-13], деградации белка-мишени в ходе продолжительного процессинга. К числу ограничений способа может относиться также предпочтительная локализация белка-мишени на N-конце синтезируемого фьюжна, поскольку именно такая конфигурация фьюжна используется в большинстве работ. Известна лишь одна работа, в которой синтезируемый фьюжн содержал белок-мишень в С-концевом положении [Zhao Q., Zhou В., Gao X., Xing L., Wang X., Lin Z. A cleavable self-assembling tag strategy for preparing proteins and peptides with an authentic N-terminus. Biotechnol J, 2017, 12:1600656].
Технической проблемой, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является расширение арсенала средств для получения биологически активных рекомбинантных белков-мишеней.
Раскрытие сущности изобретения
Техническим результатом заявляемого изобретения является получение биологически активных рекомбинантных белков-мишеней, производимых с использованием микробиологического синтеза без применения процедур денатурации/ренатурации.
Для достижения технического результата предложен способ получения биологически активных рекомбинантных протеинов, содержащих до 4 дисульфидных связей, заключающийся в разработке генетической конструкции, кодирующей предшественник целевого белка-мишени, содержащий в своем составе расположенные в порядке перечисления от N-конца к С-концу последовательность самоассоциирующего пептида L6KD, заключающего следующие друг за другом 6 остатков лейцина, последовательность белка SUMO - продукта гена Smt3 дрожжей Saccharomyces cerevisiae и последовательность целевого белка-мишени, первый N-концевой остаток, следующий за последовательностью белка SUMO, отличен от пролина, и использования созданной генетической конструкции для получения целевого белка-мишени путем трансформации этой конструкцией подходящего реципиентного штамма, культивирования трансформированного штамма в условиях, обеспечивающих экспрессию генетической конструкции и микробиологический синтез предшественника целевого белка-мишени в форме нерастворимых телец включения, с последующим выделением синтезированных телец включения из клеток штамма-продуцента, высвобождением из их состава растворимого целевого белка-мишени с помощью подходящей производной SUMO-специфичной протеиназы, отделением остатков нерастворимых телец включения с помощью центрифугирования и дальнейшей очисткой высвобожденного белка-мишени с использованием методов молекулярной биологии, известных из уровня техники, без применения ренатурации.
Для осуществления биосинтеза SUMO-фьюжна, заключающего последовательность целевого белка-мишени разрабатывают генетическую конструкцию, кодирующую целевой SUMO-фьюжн, и получают рекомбинантный штамм-продуцент, в клетках которого осуществляют экспрессию генетической конструкции. Предпочтительно для биосинтеза SUMO-фьюжна создают штаммы-продуценты на основе клеток бактерий или дрожжей.
Присутствие в составе SUMO-фьюжна последовательности белка SUMO стимулирует синтез целевого белка-мишени в корректной свернутом биологически активном состоянии, не требующем ренатурации. В этой связи, синтезированные ТВ относятся к категории АТВ.
- синтезированные АТВ извлекают из клеток штамма-продуцента, для чего, применяя методы, известные из уровня техники, вскрывают клетки штамма-продуцента и с помощью центрифугирования или фильтрации отделяют нерастворимые АТВ от растворимых клеточных белков, после чего суспендируют АТВ в подходящем буфере и получают суспензию нерастворимых АТВ для дальнейшей работы;
- суспензию АТВ обрабатывают подходящей SUMO-специфичной протеиназой, обеспечивающей гидролиз пептидной связи, соединяющей последовательность белка SUMO с последовательностью целевого белка-мишени в составе SUMO-фьюжна, и высвобождение целевого белка-мишени в растворимую фракцию;
- высвобожденный из состава АТВ растворимый целевой белок-мишень отделяют от остатков нерастворимых АТВ с использованием центрифугирования или фильтрации и получают препарат целевого биологически активного белка-мишени. При этом ни на одном из этапов осуществления заявляемого способа не применяют процедуру ренатурации целевого белка-мишени или его предшественника.
При этом АТВ, формируемые в клетках штамма-продуцента в результате самоассоциации SUMO-фьюжнов, содержащих в своем составе последовательность белка SUMO в сочетании самоассоциирующим пептидом, обеспечивают доступ SUMO-специфичной протеиназы к сайтам протеолиза и, как результат, высокую эффективность процессинга, высвобождение и последующее отделение целевого белка-мишени в форме растворимого белка от остатков нерастворимых АТВ. В результате ферментативного процессинга суспензии нерастворимых АТВ получают препарат растворимого целевого белка-мишени, который обладает биологической активностью и, как правило, имеет уровень чистоты, превышающий 85%. При необходимости доочистка полученного препарата может быть проведена с использованием методов, известных из уровня техники, но без применения ренатурации.
Таким образом, заявляемый способ обеспечивает получение и полностью контролируемое высвобождение биологически активного белка-мишени, как в способе-прототипе на основе использования SUMO. В то же время благодаря использованию самоассоциирующего пептида согласно заявляемому способу первичную очистку целевых SUMO-фьюжнов осуществляют в облеченном режиме с помощью центрифугирования или фильтрации, как по способу-прототипу на основе фьюжнов с интеином.
Было обнаружено, что фьюжны белка SUMO, известного своей высокой растворимостью [Malakhov M.R, Mattern M.R., Malakhova O.A., Drinker M., Weeks S.D., Butt T.R. SUMO fusions and SUMO-specific protease for efficient expression and purification of proteins. J Struct Funct Genomics, 2004, 5(1-2), 75-86; Marblestone J.G., Edavettal S.C., Lim Y, Lim R, Zuo X., Butt T.R. Comparison of SUMO fusion technology with traditional gene fusion systems: Enhanced expression and solubility with SUMO. Protein ScL, 2006, 15(1), 182-189], содержащие на N-конце самоассоциирующий пептид L6KD, способны эффективно синтезироваться в форме нерастворимых ТВ.
Было обнаружено, что в составе целевых SUMO-фьюжнов, синтезируемых в форме нерастворимых ТВ, белок SUMO стимулирует корректную свертку белков-мишеней и тем самым обеспечивает их биосинтез в биологически активном состоянии, что позволяет называть синтезируемые ТВ активными тельцами включения (АТВ).
Было обнаружено, что каталитически-активные производные SUMO-специфичной протеиназы Ulp1 дрожжей S. cerevisiae способны осуществлять специфический ферментативный гидролиз (процессинг) SUMO-фьюжнов, синтезированных в форме нерастворимых АТВ, и высвобождать из их состава растворимые белки-мишени, пригодные для дальнейшей очистки с использованием методов, известных из уровня техники, без применения ренатурации.
Характерной особенностью заявляемого способа является С-концевое расположение белков-мишеней в составе целевых SUMO-фьюжнов, синтезируемых в форме нерастворимых АТВ.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 показан анализ растворимости целевых SUMO-фьюжнов, содержащих флюоресцентные белки-мишени eGFP и sfGFP, синтезируемых в клетках E.coli. Состав целевых фьюжнов указан над дорожками. На дорожки в пропорциональном количестве наносили образцы фракций суммарных (Т), растворимых (S) и нерастворимых (Р) клеточных белков. Положение полос, соответствующих различным целевым фьюжнам, показано стрелками. М-маркеры молекулярного веса М (кДа).
На фиг. 2 показан анализ процессинга нерастворимых целевых фьюжнов, содержащих флюоресцентные белки-мишени eGFP и sfGFP. Состав целевых фьюжнов указан над дорожками. На дорожки в пропорциональном количестве наносили: исходный образец нерастворимых клеточных белков (Р), контрольный образец нерастворимых клеточных белков, не обрабатывавшийся протеиназой Ulp275 (РО), а также образцы суммарных (t), растворимых (s) и нерастворимых (р) белков фракции нерастворимых клеточных белков, обработанных протеиназой Ulp275. Образцы были обработаны SUMO-протеиназой Ulp275 в пропорции 1:250 к количеству целевого фьюжна в образце в течение 22 часов при температуре 30°С. Стрелками показано положение полос, соответствующих указанным белкам. М - маркеры молекулярного веса белков. Приведены данные относительной флюоресценции соответствующих образцов флюоресцентных белков-мишеней eGFP и sfGFP. За 100% принята флюоресценция образцов t.
На фиг. 3 показан: а) анализ биосинтеза, растворимости и процессинга целевого фьюжна L6KD-SUMO-Glp.На дорожки в пропорциональном количестве наносили препараты фракций суммарного (Т), растворимого (S) и нерастворимого (Р) клеточных белков, контрольный образец нерастворимых клеточных белков, не подвергавшийся обработке протеиназой Ulp275 (РО), а также образцы суммарных (t), растворимых (s) и нерастворимых (р) белков фракции нерастворимых клеточных белков, обработанных протеиназой Ulp275. Стрелками показано положение полос, соответствующих исходному фьюжну LeKD-SUMO-Glp и его процессированному фрагменту L6KD-SUMO. М - маркеры молекулярного веса белков, б) масс-спектрометрический анализ образцов суммарных (t, сверху) и растворимых (s, снизу) белков фракции нерастворимых клеточных белков, обработанных протеиназой Ulp275. Показано положение пиков, соответствующих исходному целевому фьюжну LeKD-SUMO-Glp и продуктам его процессинга, белку L6KD-SUMO и целевому белку-мишени Glp.
На фиг. 4 показан: а) анализ биосинтеза, растворимости и процессинга целевого фьюжна L6KD-SUMO-PhtD19. На дорожки в пропорциональном количестве наносили препараты фракций суммарного (Т), растворимого (S) и нерастворимого (Р) клеточных белков, контрольный образец нерастворимых клеточных белков, не подвергавшийся обработке протеиназой U1p275 (РО), а также образцы суммарных (t), растворимых (s) и нерастворимых (р) белков фракции нерастворимых клеточных белков, обработанных протеиназой Ulp275. Стрелками показано положение полос, соответствующих исходному фьюжну L6KD-SUMO-PhtD19 и его процессированному фрагменту L6KD-SUMO. М - маркеры молекулярного веса белков, б) масс-спектрометрический анализ образцов суммарных (t, сверху) и растворимых (s, снизу) белков фракции нерастворимых клеточных белков, обработанных протеиназой U1p275. Показано положение пиков, соответствующих исходному целевому фьюжну L6KD-SUMO-PhtD19 и продуктам его процессинга, белку L6KD-SUMO и целевому белку-мишени PhtD19.
На фиг. 5 показан: а) анализ биосинтеза, растворимости и процессинга целевого фьюжна L6KD-SUMO-Brz53. На дорожки в пропорциональном количестве наносили препараты фракций суммарного (Т), растворимого (S) и нерастворимого (Р) клеточных белков, контрольный образец нерастворимых клеточных белков, не подвергавшийся обработке протеиназой Ulp275 (РО), а также образцы суммарных (t), растворимых (s) и нерастворимых (р) белков фракции нерастворимых клеточных белков, обработанных протеиназой Ulp275. Стрелками показано положение полос, соответствующих исходному фьюжну L6KD-SUMO-Brz53, его процессированному фрагменту L6KD-SUMO и зрелому целевому белку-мишени - браззеину Brz53. М - маркеры молекулярного веса белков, б) масс-спектрометрический анализ образцов суммарных (t, сверху) и растворимых (s, снизу) белков фракции нерастворимых клеточных белков, обработанных протеиназой Ulp275. Показано положение пиков, соответствующих исходному целевому фьюжну L6KD-SUMO-Brz53 и продуктам его процессинга, белку LeKD-SUMO и целевому белку-мишени Brz53; в) ВЭЖХ анализ образца целевого белка-мишени Brz53, полученного с использованием заявляемого способа (сверху), и контрольного образца браззеина Brz53, секретированного в клетках дрожжей (снизу).
Осуществление изобретения
1) С использованием методов генетической инженерии получают генетическую конструкцию, кодирующую рекомбинантную молекулу целевого SUMO-фьюжна, который включает три принципиальные части:
N-концевую часть, заключающую последовательность самоассоциирующего пептида L6KD, отвечающего за биосинтез SUMO-фьюжна в форме нерастворимых АТВ;
- центральную часть, заключающую последовательность белка SUMO дрожжей S. cerevisiae, стимулирующего корректную свертку целевого белка-мишени и его высвобождение из состава нерастворимых АТВ под действием SUMO-специфичной протеиназы;
- С-концевую часть, заключающую последовательность целевого белка-мишени.
2) Конструируют штамм-продуцент, обеспечивающий биосинтез SUMO-фьюжна, заключающего последовательность целевого белка-мишени. С этой целью в клетки подходящего реципиентного штамма, например -реципиентного штамма Е. coli BL21(DE3), путем трансформации вводят созданную генетическую конструкцию, кодирующую целевой SUMO-фьюжн, заключающий последовательность белка-мишени.
3) Разрабатывают и осуществляют культивирование штамма-продуцента, обеспечивающее эффективный биосинтез и накопление целевого SUMO-фьюжна в форме нерастворимых АТВ. Для этого посевной материал клеток штамма-продуцента культивируют при подходящей температуре в диапазоне от 18°С до 40°С, например, при 37°С в питательной среде, включающей источники углерода, азота и минеральные соли, обычно используемые для выращивания клеток E.coli [Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984. - 479 с.]. Культивирование осуществляют с использованием шейкеров или в биореакторах (ферментерах). Индукцию экспрессии генетической конструкции, обеспечивающей биосинтез целевого SUMO-фьюжна, осуществляют путем внесения индуктора в среду культивирования. В качестве индуктора используют изопропил-P-D-1-тиогалактопиранозид (ИПТГ) в концентрации от 0,1 до 2 мМ или лактозу в концентрации от 0,5% до 3%. Индуктор вносят на стадии роста культуры, предшествующей стационарной фазе роста. Индукцию осуществляют на протяжении не менее 1 ч. В процессе индукции клетки штамма-продуцента синтезируют и накапливают целевой SUMO-фьюжн в форме нерастворимых АТВ в количестве до 40% от суммарного белка клеток. По окончании культивирования, например, с использованием центрифугирования производят отделение биомассы клеток штамма-продуцента, содержащих целевой SUMO-фьюжн, от культуральной среды.
4) Полученную биомассу клеток штамма-продуцента подвергают дезинтеграции. Для дезинтеграции используют подходящее ультразвуковое оборудование или Френч-пресс, после чего, применяя центрифугирование или фильтрацию, из полученного клеточного лизата отделяют фракцию нерастворимых клеточных белков, среди которых с помощью электрофореза обнаруживают целевой SUMO-фьюжн в форме нерастворимых АТВ в количестве до 85%) от суммы белков выделенной фракции.
5) Выделенные АТВ суспендируют в буфере подходящего состава, например, фосфатно-солевом или трис-буфере, после чего полученную суспензию инкубируют в течение от 0,01 часа до 48 часов при температуре от 4°С до 37°С в присутствие каталитически-активного фрагмента SUMO-специфичной протеиназы Ulp1 дрожжей Saccharomyces cerevisiae, например, Ulp275 [RU 2451076], применяемого в пропорции от 1:10000 до 1:10 (по весу) относительно количества целевого SUMO-фьюжна. В процессе инкубации осуществляют ферментативный гидролиз от 10% до 100% SUMO-фьюжна, присутствующего в образце, и высвобождают из его состава растворимый целевой белок-мишень. При необходимости, используя специфические методы, известные из уровня техники, оценивают активность процессированного белка-мишени.
6) По окончании ферментативного гидролиза SUMO-фьюжна из состава целевого препарата с эффективностью до 90% удаляют остатки нерастворимых АТВ. С этой целью смесь растворимого белка-мишени и остатков нерастворимых АТВ вновь подвергают центрифугированию или фильтрации. В результате получают препарат растворимого целевого белка-мишени с чистотой свыше 90%.
7) При необходимости с использованием методов, известных из уровня техники, производят доочистку полученного растворимого белка-мишени без применения ренатурации и получают конечный препарат, содержащий целевой биологически активный рекомбинантный белок-мишень (протеин).
Пример 1. Конструирование плазмиды pET28S-His10-eGFP для биосинтеза фьюжна His10-eGFP
С целью получения вспомогательной плазмиды проводят ПЦР-амплификацию гена eGFP. Матрицей для амплификации служит плазмида pEGFP (Clontech). Для амплификации используют праймеры:
В составе праймеров подчеркнуты последовательности сайтов узнавания рестриктаз NcoI, BglII и BamIII (pGFP-dir), а также XhoI (pGFP-rev).
Амплифицированный фрагмент ДНК очищают из геля, используя с этой целью набор Qiagen (Qiagen, cat.№28706) и после открывания концов с использованием рестриктаз NcoI и XhoI клонируют в лабораторном векторе pET28S, расщепленном по таким же сайтам. Вектор pET28S, являющийся производным стандартного вектора pET28b+(Novagen), содержит мутацию, вместо уникального сайта BglII вектор содержит последовательность сайта Sail.
В результате клонирования получают плазмиду pET28S-His10-eGFP. В составе этой плазмиды клонированный фрагмент ДНК заключает структурный ген eGFP прецизионно слитый с 5'-концевой последовательностью ДНК, кодирующей 10 остатков гистидина, находящейся в окружении сайтов узнавания рестриктаз BglII и BamIII (см. структуру праймера pGFP-dir). Плазмиду pET28S-His10-eGFP используют для биосинтеза и анализа экспрессии фьюжна Hism-eGFP, а также для клонирования других фрагментов ДНК.
Пример 2. Клонирование гена SMT3, кодирующего белок SUMO дрожжей Saccharomyces cerevisiae
Ген SMT3 амплифицируют в ходе ПЦР с использованием в качестве матрицы хромосомной ДНК штамма S.cerevisiae Y618 [Kartasheva et al., 1996, Yeast 12: 1297-1300]. Амплификацию проводят в две стадии. Сначала амплифицируют два перекрывающихся фрагмента ДНК, для чего используют следующие пары праймеров:
Фрагмент 1 размером 129 п.о.:
N450 (5'-atatccatggaaaagagatctgactcagaagtcaatcaagaa)
N454 (5'-cttgaagaaaatctctgaa)
Фрагмент 2 размером 180 п.о.:
N453 (5'-ttcagagattttcttcaag)
N452 (5'-atatcaattggatccaccaatctgttctctgtga).
В составе праймеров подчеркнуты последовательности сайтов узнавания рестриктаз NcoI и BglII (N450), а также BamIII (N452).
Амплифицированные фрагменты ДНК элюируют из агарозного геля как в примере 1, и их смесь используют для ПЦР-лигирования. Д ля этого проводят ПЦР-амплификацию на смеси фрагментов 1 и 2 в качестве матрицы. Праймерами для амплификации служат N450 и N468. Полученный в результате ПЦР фрагмент ДНК размером 310 п. о. элюируют из агарозного геля, обрабатывают рестриктазами NcoI и BamIII и клонируют в плазмиде pET28S-His10-eGFP (Пример 1), расщепленной по таким же сайтам. В результате клонирования получают плазмиду pET28S-SUMO-eGFP, в составе которой нуклеотидную последовательность клонированного гена подтверждают секвенированием.
Полученную плазмиду pET28S-SUMO-eGFP используют для конструирования других плазмид в качестве источника BglII/XhoI фрагмента ДНК, кодирующего слитый белок SUMO-eGFP.
Пример 3. Конструирование плазмиды pET28S-HIS10-SUMO-EGFP ДЛЯ БИОСИНТЕЗА И АНАЛИЗА СВОЙСТВ ФЬЮЖНА HIS10-SUMO-EGFP
Плазмиду pET28S-His10-SUMO-eGFP конструируют путем замещения уникального BamIII/XhoI фрагмента ДНК плазмиды pET28S-His10-eGFP, кодирующего eGFP, на уникальный BglII/XhoI фрагмент ДНК плазмиды pET28S-SUMO-eGFP, кодирующий фьюжн SUMO-eGFP.
Полученную плазмиду pET28S-His10-SUMO-eGFP используют для биосинтеза и анализа свойств контрольного фьюжна His10-SUMO-eGFP, включающего последовательность белка SUMO, но не включающего самоассоциирующий пептид LeKD.
Пример 4. Конструирование плазмиды pET28-L6KD-eGFP для биосинтеза и анализа свойств АТВ, содержащих фьюжн L6KD-eGFP
Для получения фрагмента ДНК, кодирующего слитый белок L6KD-eGFP, используют ПЦР. Матрицей для амплификации служит плазмида pET28S-His10-eGFP. Амплификацию проводят в две стадии. Сначала получают базовый фрагмент ДНК, для амплификации которого используют праймеры:
N1472(5'-tataccatggtgctgttactgctgttgaaggatggatccatggtgagcaagggc)
N619(5'-ggtggcagcagccaactcagctt)
Затем, используя базовый фрагмент в качестве матрицы, получают целевой фрагмент ДНК, который амплифицируют с помощью праймеров N1473 (5'-tataccatgggtttgctgttactgctgttgaa) и N619.
В составе праймеров подчеркнуты последовательности сайтов узнавания рестриктаз NcoI (N1472 и N1473) и BamIII (N1472).
Амплифицированный фрагмент ДНК элюируют из агарозного геля, обрабатывают рестриктазами NcoI и XhoI и клонируют в плазмиде рЕТ28b+(Novagen), расщепленной по таким же сайтам. В результате клонирования получают плазмиду pET28-L6KD-eGFP, в составе которой нуклеотидную последовательность клонированного гена подтверждают секвенированием.
Полученную плазмиду pET28-L6KD-eGFP используют для биосинтеза и анализа свойств нерастворимых АТВ, содержащих фьюжн L6KD-eGFP, не включающий последовательность белка SUMO.
Пример 5. Конструирование плазмиды pET28-L6KD-SUMO-eGFP для биосинтеза и анализа свойств АТВ, содержащих фьюжн L6KD-SUMO-eGFP
Плазмиду pET28-L6KD-SUMO-eGFP конструируют путем замещения уникального ВаmIII/XhoI фрагмента ДНК плазмиды pET28-L6KD-eGFP, кодирующего белок-мишень eGFP, на уникальный BgHI/XhoI фрагмент ДНК плазмиды pET28S-SUMO-eGFP, кодирующий слитый белок SUMO-eGFP.
Сконструированную плазмиду pET28-L6KD-SUMO-eGFP используют для биосинтеза и анализа свойств нерастворимых АТВ, содержащих фьюжн L6KD-SUMO-eGFP, в составе которого последовательность белка-мишени eGFP слита с последовательностью белка L6KD-SUMO.
Пример 6. Конструирование плазмиды pET28-L6KD-sfGFP для биосинтеза и анализа свойств АТВ, содержащих фьюжн L6KD-sfGFP
Известен аналог белка eGFP - белок sfGFP - «superfolder GFP», обладающий собственной улучшенной эффективностью свертки [Aronson D.E., Costantini L.M., Snapp E.L. Superfolder GFP is fluorescent in oxidizing environments when targeted via the Sec translocon. Traffic, 2011, 12(5), 543-8].
Фрагмент ДНК, кодирующий белок sfGFP, получают с помощью ПЦР. Матрицей для ПЦР служит плазмида pAAV-CAG-NES-GAF-CaMP2-sfGFP [Subach О.М. and Subach F.V. GAF-CaMP3-sfGFP, an enhanced version of the near-infrared genetically encoded positive phytochrome-based calcium indicator for the visualization of neuronal activity. Int J Mol Scl, 2020, 21(18), 6883], для ПЦР используют праймеры pGFP-dir и pGFP- rev (Пример 1). В результате амплификации получают целевой фрагмент ДНК, заключающий ген sfGFP, который элюируют из агарозного геля, обрабатывают рестриктазами ВаmIII. и XhoI и используют для замещения исходного ВаmIII/XhoI фрагмента ДНК в плазмиде pET28-L6KD-eGFP (Пример 4). В результате замещения получают плазмиду pET28-L6KD-sfGFP, в составе которой нуклеотидную последовательность клонированного гена подтверждают секвенированием.
Полученную плазмиду pET28-L6KD-sfGFP используют для биосинтеза и анализа свойств нерастворимых АТВ, содержащих фьюжн L6KD-sfGFP, включающий последовательность эффективно сворачиваемого варианта белка sfGFP и не включающий последовательность белка SUMO.
Пример 7. Конструирование плазмиды pET28-L6KD-SUMO-sfGFP для биосинтеза и анализа свойств АТВ, содержащих фьюжн L6KD-SUMO-sfGFP
Конструирование проводят, как описано в примере 6 за исключением того, что для замещения исходного фрагмента ДНК используют плазмиду pET28-L6KD-SUMO-eGFP (Пример 5). В результате замещения получают плазмиду pET28-L6KD-SUMO-sfGFP, которую используют для биосинтеза и анализа свойств нерастворимых АТВ, содержащих фьюжн L6KD-SUMO-sfGFP, в составе которого последовательность эффективно сворачиваемого варианта белка-мишени sfGFP слита с последовательностью белка L6KD-SUMO.
Пример 8. Конструирование плазмиды pET28-L6KD-SUMO-Glp для биосинтеза и анализа свойств АТВ, содержащих фьюжн L6KD-SUMO-Glp
Подготавливают вспомогательную плазмиду pET28-Glp, содержащую фрагмент ДНК, кодирующий модифицированный глюкагоно-подобный пептид 1 человека Glp. Плазмиду pET28-Glp получают из плазмиды рЕТ28-Glp20 [RU 2642260] путем замещения уникального NcoI/BamIII фрагмента ДНК, содержащего ген Glp20, на фрагмент «В», имеющий липкие концы NcoI и ВаmIII, кодирующий модифицированный глюкагоно-подобный пептид 1 человека [RU 2642260]. В полученной плазмиде pET28-Glp последовательность ДНК, кодирующая ген Glp, содержит уникальный сайт узнавания рестриктазы KpnI и заканчивается терминирующим кодоном, расположенным сразу после сайта ВаmIII.
Фрагмент ДНК, кодирующий фьюжн L6KD-SUMO, получают с помощью ПЦР, матрицей для ПЦР служит плазмида pET28-L6KD-SUMO-eGFP. Амплификацию проводят с использованием праймеров N685 (5'-taatacgactcactataggg) и N1790 (5'-taaaggtaccttcaccatgtccaccaatctgttctctgt). В составе праймера N1790 подчеркнута последовательность сайта узнавания рестриктазы KpnI.
Амплифицированный фрагмент ДНК обрабатывают рестриктазами NcoI и KpnI и полученный NcoIlKpnI фрагмент ДНК используют для замещения NcoIlKpnI фрагмента ДНК в плазмиде pET28-Glp.В результате получают плазмиду pET28-L6KD-SUMO-Glp, которую используют для биосинтеза и анализа свойств нерастворимых АТВ, содержащих фьюжн L6KD-SUMO-Glp, в составе которого последовательность белка-мишени Glp слита с последовательностью белка LeKD-SUMO.
Пример 9. Конструирование плазмиды pET28-L6KD-SUMO-PhtD19 для биосинтеза и анализа свойств АТВ, содержащих Фьюжн L6KD-SUMO-PhtD19
Известен пептид PhtD_19, называемый здесь пептидом PhtD19, являющийся фрагментом pneumococcal histidine triad protein D fragment (a.a. 200-219) [Papastamatiou T, Routsias JG, Koutsoni O, Dotsika E, Tsakris A, Spoulou V. Evaluation of protective efficacy of selected immunodominant B-cell epitopes within virulent surface proteins of Streptococcus pneumoniae. Infect. Immun., 2018, 86(3), е00673-17]. Пептид является иммунодоминантным B-клеточным эпитопом белка, расположенного на поверхности клеток Streptococcus pneumoniae, и представляет интерес в качестве кандидатного компонента соответствующей вакцины.
Фрагмент ДНК, кодирующий пептид PhtD19, получают с помощью ПЦР, который проводят, используя смесь праймеров N-PhtD19 (5'-ggcgtagaggatcgagatct), N1762 (5'-ggtaatgatcaccatgcggcacaatatatgcatcgccagatctcgatcctctacgcc) и N1763 (5'-tatactcgagttacagttcgttcttcggaatgtaatggtaatgatcaccatgcggc). Амплифицированный фрагмент ДНК обрабатывают рестриктазами BglUII и XhoI и полученный BglII/XhoI фрагмент ДНК используют для замещения ВаmIII/XhoI фрагмента ДНК в плазмиде pET28-L6KD-SUMO-eGFP. В результате получают плазмиду pET28-L6KD-SUMO-PhtD19, которую используют для биосинтеза и анализа свойств нерастворимых АТВ, содержащих фьюжн L6KD-SUMO-PhtD19, в составе которого последовательность белка-мишени PhtD19 слита с последовательностью белка L6KD-SUMO.
Пример 10. Конструирование плазмиды pET28-L6KD-SUMO-Brz53 для биосинтеза и анализа свойств АТВ, содержащих фьюжн L6KD-SUMO-Brz53
Известен белок браззеин, обладающий сладким вкусом и относящийся к семейству дефензин-подобных белков (Defensin-like protein) Pentadiplandra brazzeana (GeneBank P56552). Одна из зрелых более сладких форм белка, называемая здесь Brz53, имеет размер 53 аминокислотных остатка и содержит 4 дисульфидные связи [Hellekant G., Danilova V. Brazzein a small, sweet protein: discovery and physiological overview. Chem Senses, 2005, 30 Suppl 1, i88-9].
Структура праймеров, используемых для конструирования фрагмента ДНК, кодирующего белок Brz53, приведена ниже.
Фрагмент ДНК Brzz, кодирующий белок Brz53, получают с использованием ПЦР-амплификации, проводимой на смеси олигонуклеотидов b3 и и4 с использованием праймеров N1840 и b2. Структура получаемого синтетического гена и кодируемого ею белка приведены ниже:
Параллельно с использованием праймеров N450 (Пример 2) и N1841 (5'-tccaccaatctgttctctgtg) амплифицируют фрагмент ДНК SUMO-F, кодирующий белок SUMO. Матрицей для амплификации служит ДНК плазмиды pET28S-SUMO-eGFP.
На завершающем этапе смесь амплифицированных фрагментов ДНК Brzz и SUMO-F используют для ПЦР-лигирования. С этой целью проводят ПЦР-амплификацию на смеси фрагментов ДНК и праймеров N450 и b2. Результирующий ПЦР фрагмент ДНК размером очищают из агарозного геля, обрабатывают рестриктазами ЕсоШ и XhoI и клонируют в плазмиде рЕТ28-L6KD)-SUMO-eGFP (Пример 5), расщепленной по таким же сайтам. В результате клонирования получают плазмиду pET28-L6KD-SUMO-Brz53, в составе которой нуклеотидную последовательность клонированного гена подтверждают секвенированием.
Плазмиду pET28-L6KD-SUMO-Brz53 используют для биосинтеза и анализа свойств нерастворимых АТВ, содержащих фьюжн L6KD-SUMO-Brz53, в составе которого последовательность белка-мишени Brz53 слита с последовательностью белка L6KD-SUMO.
Пример 11. Получение контрольного образца браззеина Brz53, секретированного в клетках дрожжей Pichia pastoris
Для получения контрольного образца браззеина используют синтетический ген браззеина Brz53 и конструируют штамм-продуцент дрожжей Pichia pastoris, аналогично тому, как описано в работе [Poirier N., Roudnitzky N., Brockhoff A., Belloir C., Maison M., Thomas-Danguin Т., Meyerhof W., Briand L. Efficient production and characterization of the sweet-tasting brazzein secreted by the yeast Pichia pastoris. J Agric Food Chem., 2012, 60(39), 9807-9814]. Для конструирования штамма-продуцента применяют ранее разработанный молекулярно-генетический инструментарий [RU 2522479]. Очистку контрольного образца браззеина Brz53 проводят, как описано в работе [Poirier N., Roudnitzky N., Brockhoff A., Belloir C., Maison M., Thomas-Danguin Т., Meyerhof W., Briand L. Efficient production and characterization of the sweet-tasting brazzein secreted by the yeast Pichia pastoris. J Agric Food Chem., 2012, 60(39), 9807-9814].
Полученный контрольный образец браззеина используют в качестве образца сравнения для выполнения ВЭЖХ анализа браззеина Brz53, произведенного с использованием заявляемого способа.
Пример 12. Получение штамма-продуцента целевого фьюжна (варианты)
Штамм - продуцент целевого фьюжна (варианты) получают путем трансформации реципиентного штамма E.coli BL21(DE3) (Novagen) - ВКПМ В-10189. Трансформацию осуществляют путем введения в клетки реципиентного штамма плазмиды для биосинтеза целевого фьюжна (примеры 3-10) с применением реактива СаСl2 [Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984. - 479 с.]. Колонии трансформированного штамма отбирают на селективной среде, содержащей антибиотик канамицин. В результате трансформации получают трансформированный штамм - продуцент, который содержит плазмиду для биосинтеза целевого фьюжна и в ответ на внесение в среду культивирования индуктора ИПТГ или лактозы осуществляет биосинтез целевого фьюжна.
Пример 13. Биосинтез белка-мишени в составе целевого фьюжна (варианты)
Биосинтез целевого фьюжна осуществляют следующим образом. Сначала получают посевную культуру штамма-продуцента. Для этого одну колонию штамма-продуцента засевают в пробирку, содержащую 3 мл среды YTS следующего состава (мас. %): дрожжевой экстракт - 1, триптон бакто - 2, NaCl - 1, канамицин - 0,003, вода - остальное. Посевную культуру штамма-продуцента выращивают на ротационном шейкере со скоростью вращения 250 об/мин в течение 4 часов при температуре 37°С.
На втором этапе посевную культуру переносят в среду для индукции. С этой целью 0,5 мл посевной культуры переносят в колбу, содержащую 50 мл среды TRB следующего состава (мас. %): дрожжевой экстракт - 2,4; триптон бакто - 1,2; одномолярный фосфатный буфер (рН7) - 10; одномолярный раствор сульфата магния - 0,2; лактоза - 0,5; глицерин - 0,5; канамицин - 0,009; вода - остальное. Культивирование в среде для индукции продолжают в течение 20 часов на ротационном шейкере со скоростью вращения 250 об/мин при оптимальной температуре в тех же условиях.
Для биосинтеза целевых фьюжнов с использованием плазмид, сконструированных как описано в примерах 3-9, оптимальной температурой является 30°С.
Для биосинтеза целевого фьюжна с использованием плазмиды, сконструированной как описано в примере 10, оптимальной температурой является 22°С.
По окончании культивирования измеряют оптическую плотность клеточной культуры при длине волны 600 нм, используют подходящий спектрофотометр. Затем в отдельную пробирку отбирают объем клеточной культуры (предварительно хорошо перемешанной на вортексе), соответствующий 20 о.е. Клетки осаждают центрифугированием в течение 2 минут со скоростью 13200 об/мин, надосадочную жидкость тщательно удаляют с использованием водоструйного насоса. Полученный клеточный осадок промывают. С этой целью осадок суспендируют в 1 мл буфера PBS и вновь центрифугируют в том же режиме, надосадочную жидкость удаляют.
В результате получают образец клеток штамма-продуцента, который используют для анализа результатов биосинтеза целевого фьюжна.
Пример 14. Методы анализа белка-мишени в составе целевого фьюжна (варианты)
Дезинтеграция клеток штамма-продуцента
Для проведения анализа целевого фьюжна проводят дезинтеграцию клеток штамма-продуцента. С этой целью образец клеток штамма-продуцента ресуспендируют в 1 мл подходящего буфера, например, буфера PBS или буфера 50 мМ Tris-HCl, рН 7.0. Суспензию клеток хорошо перемешивают на вортексе, охлаждают на льду подвергают дезинтеграции, например, с использованием дезинтегратора ультразвукового лабораторного Bioblock Scientific Vibra cell 75043, в режиме: 5 секунд пульс, 10 секунд пауза, 40 секунд (то есть 9 микроциклов). Отбирают 100 мкл пробы Т суммарного лизата.
Остальной объем лизата центрифугируют 10 минут при 13200 об/мин при температуре 4°С. Отбирают 100 мкл пробы S осветленного лизата, после чего надосадочную жидкость тщательно удаляют с использованием водоструйного насоса. Фракцию осадка ресуспендируют в 0,9 мл PBS, перемешивая на вортексе до гомогенного состояния и получают пробу Р нерастворимых клеточных белков.
Определение флюоресценции
Образцы фракций клеточного лизата штамма-продуцента, синтезировавшего флюоресцентный белок-мишень (eGFP или sfGFP) в составе целевого фьюжна, используют для измерения флюоресценции.
Показатель флюоресценции отражает количество корректно свернутого биологически активного белка eGFP в образце.
В лунки плашки для измерения флюоресценции вносят по 160 мкл буфера PBS. Затем в эти лунки вносят отобранные пробы Т, S и Р по 40 мкл в лунку. Конечный объем жидкости во всех лунках составляет 200 мкл. Образцы в лунках тщательно перемешивают с использованием горизонтального шейкера. Измерения проводят с использованием подходящего оборудования, например, с помощью микропланшетного анализатора Turner Biosystems Modulus II с использованием фильтра с длинами волн: ех 525 нм, em 580-640 нм. Полученные значения флюоресценции делят на 4 для расчета удельной величины, соответствующей 1 о.е. клеток.
Полученные значения флюоресценции образцов подвергают математической и статистической обработке и результирующие значения заносят в итоговую таблицу.
Оценка уровня биосинтеза и растворимых свойств целевого фьюжна
Образцы белков отобранных проб Т, S и Р подвергают анализу с использованием гель-электрофорореза в 15% полиакриламидном геле в денатурирующих восстанавливающих условиях с окрашиванием Кумасси G-250 по стандартной процедуре.
Обнаружив на геле на дорожке, соответствующей образцу Т, S или Р, полосу целевого фьюжна, используют экспертную оценку и сопоставляют ее интенсивность с интенсивностью остальных белковых полос на этой же дорожке. В результате получают оценочный показатель относительного содержания целевого фьюжна в соответствующей фракции клеточного лизата. Оценочный показатель образца Т характеризует уровень биосинтеза целевого фьюжна в клетках штамма-продуцента.
Сопоставляя оценочные показатели интенсивности полос целевого фьюжна на дорожках, соответствующих образцам Т, S и Р, делают заключение о растворимых свойствах целевого фьюжна и о его биосинтезе в форме нерастворимых телец включения в клетках штамма-продуцента.
Процессинг нерастворимых АТВ с помощью SUMO-специфичной протеазы Анализируют процессинг белков, являющихся составной частью пробы Р.
100 мкл пробы Р используют для измерения концентрации белка. С этой целью образец пробы Р центрифугируют 10 минут при 13200 об/мин при температуре 4°С, надосадочную жидкость удаляют водоструйным насосом, осадок растворяют в 100 мкл 8 М мочевины и используют для измерения концентрации белка по методу Брэдфорда [Bradford М.М. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem., 1976, 72, 248-254].
Оставшиеся 800 мкл суспензии нерастворимого белка пробы Р подвергают осаждению с помощью центрифугирования в прежнем режиме, полученный осадок суспендируют в 800 мкл буфера 10 мМ Tris-HCl, рН 8.0 и разделяют на аликвоты по 200 мкл в каждой.
В соответствии с результатами определения концентрации белка по Брэдфорду в полученные аликвоты объемом 200 мкл вносят препарат очищенного фермента SUMO-протеиназы Ulp275 [RU 2451076] в соотношении 1/100 относительно количества целевого фьюжна в каждой аликвоте. Разницу в объемах полученных реакционных смесей выравнивают с помощью буфера. Реакцию проводят при 30°С в течении 4 часов.
По завершении реакции содержимое каждой реакционной смеси перемешивают и отбирают пробу "t" суммарного белка для анализа с использованием гель-электрофореза. Оставшуюся часть образцов подвергают центрифугированию в течение 10 минут при 13200 об/мин при 4°С. После центрифугирования отбирают образец "s" надосадочной жидкости, содержащей фракцию растворимых белков реакционной смеси. Остальную надосадочную жидкость тщательно удаляют с помощью водоструйного насоса. Полученный осадок суспендируют в 200 мкл исходного буфера и отбирают образец "р" нерастворимых белков.
Анализ отобранных образцов t, s и р проводят с помощью гель-электрофореза.
В результате анализа оценивают эффективность процессинга целевого фьюжна под действием SUMO-протеиназы Ulp275 и растворимые свойства белка-мишени, высвобождаемого из состава целевого фьюжна под действием протеиназы. В случае, показатель относительного содержания белка-мишени в образце s превосходит аналогичный показатель образца t, считают, что белок-мишень обладает растворимыми свойствами.
Растворимость коротких белков-мишеней, полученных в результате процессинга АТВ с помощью SUMO-специфичной протеиназы и не разрешаемых с помощью гель-электрофореза, оценивают с использованием масс-спектрометрического анализа продуктов процессинга. Считают, что белок-мишень обладает растворимыми свойствами, если по данным масс-спектрометрии показатель относительного содержания белка-мишени в образце s превосходит аналогичный показатель образца t.
Масс-спектрометрический анализ продуктов процессинга
Массспектрометрический анализ проводят на MALDI-времяпролетном масс-спектрометре UltrafleXtreme ("Bruker Daltonics", Германия), оснащенном УФ-лазером (Nd). Масс-спектры получают в линейной моде режима положительных ионов с использованием рефлектрона. Точность измеренных средних масс составляет 3 Да. Для определения расчетных значений масс белков используют программный пакет Vector NTI ("Thermo Fisher Scientific", США).
Сравнительный ВЭЖХ-анализ браззеина Brz53
Сравнительный анализ браззеина проводят с помощью офВЭЖХ, например, с использованием высокоэффективного жидкостного хроматографа UltiMate 3000 HPLC (Thermo Fisher Scientific, США) и колонки YMC-Pack ODS-A (С18), 5 мкм, 300А, 4,6 × 250 мм (YMC CO., LTD, Япония). Разделение компонентов осуществляют путем градиентного элюирования, в качестве подвижной фазы используют: буфер А - 0,2%-ная трифторуксусная кислота (Sigma Aldrich, США), буфер Б - 80% ацетонитрил (J.T. Baker, Нидерланды) в буфере А. Скорость потока - 1,0 мл/мин. Температура колонки - 35°С. Детектирование проводят при длине волны 210 нм. Объем вводимой пробы - 20 мкл.
Пример 15. Применение заявляемого способа для получения белков-мишеней eGFP и sfGFP
Целевые белки-мишени eGFP и sfGFP различаются между собой эффективностью сворачивания, белок eGFP обладает низкой, a sfGFP («superfolder GFP») - намного более высокой эффективностью корректного сворачивания [Aronson D.E., Costantini L.M., Snapp E.L. Superfolder GFP is fluorescent in oxidizing environments when targeted via the Sec translocon. Traffic, 2011, 12(5), 543-8].
Как показывают результаты, синтез белков-мишеней eGFP и sfGFP в составе целевых фьюжнов L6KD-eGFP, L6KE, -SUMO-eGFP, L6KD-sfGFP и L6KD-SUMO-sfGFP, независимо от присутствия SUMO в их составе, осуществляется преимущественно во фракции (Р) нерастворимых клеточных белков и характеризуется высоким уровнем синтеза, их доля во фракции суммарных (Т) клеточных белков превышает 20% (фиг.1). В этих же условиях контрольный фьюжн His10-SUMO-eGFP, не содержащий L6KD), накапливается преимущественно во фракции растворимых (S) клеточных белков (фиг. 1).
Анализ флюоресцирующей активности (Табл. 1) свидетельствует о том, что предшественники целевых белков-мишеней eGFP и sfGFP, синтезируемые в составе нерастворимых ТВ, обнаруживаемых во фракции Р клеточных лизатов, обладают флюоресцентной (биологической) активностью, то есть -формируют АТВ.
При этом включение SUMO в состав предшественника eGFP, обладающего низкой эффективностью сворачивания, увеличивает синтез активного eGFP в клетках с 4% до 20% относительно контрольного уровня, также с 2% до 96% возрастает доля активных eGFP в составе нерастворимых АТВ. Включение SUMO в состав предшественника sfGFP, обладающего высокой эффективностью сворачивания, не влияет на показатели уровня синтеза активного sfGFP в клетках и доли активного sfGFP в составе нерастворимых АТВ (табл.1).
Таким образом, представленные результаты доказывают, что:
1) применение заявляемого способа обеспечивает синтез предшественников целевых биологически активных белков-мишеней eGFP и sfGFP в форме нерастворимых АТВ;
2) включение белка SUMO в состав предшественников целевых белков eGFP и sfGFP оказывает положительное (eGFP) или нейтральное (sfGFP) влияние на уровень синтеза и способность предшественника активного белка-мишени формировать нерастворимые АТВ.
Результаты, представленные на Фиг. 2 свидетельствуют о том, что действие SUMO-специфичной протеиназы Ulp275 на АТВ, содержащие целевые фьюжны L6KD-SUMO-eGFP и L6KD-SUMO-sfGFP, обеспечивает эффективное высвобождение зрелых биологически активных белков-мишеней eGFP и sfGFP в растворимую фракцию. При этом центрифугирование процессированных образцов обеспечивает очистку целевых растворимых белков-мишеней eGFP и sfGFP от остатков нерастворимых АТВ (Фиг. 2).
В совокупности представленные результаты доказывают высокую эффективность получения биологически активных белков-мишеней eGFP и sfGFP с использованием заявляемого способа.
Пример 16. Применение заявляемого способа для получения белков-мишеней Brz53. Glp и PhtD19
Целевые белки-мишени Brz53, Glp и PhtD19 отличаются друг от друга и от белков-мишеней eGFP и sfGFP биологической активностью, третичной структурой, молекулярной массой, эффективностью сворачивания, наличием дисульфидных связей и др.
Результаты применения заявляемого способа для получения белков-мишеней Glp, PhtD19 и Brz53 в составе целевых фьюжнов LeKD-SUMO-Glp, L6KD-SUMO-PhtD19 и L6KD-SUMO-Brz53 представлены на Фиг. 3а, 4а и 5а, соответственно. Представленные результаты показывают, что каждый из целевых фьюжнов синтезируется в клетках штамма-продуцента в составе ТВ во фракции нерастворимых клеточных белков (Фиг. 3а, 4а и 5а). Выделение из клеток и последующая обработка нерастворимых ТВ с помощью SUMO-специфичной протеиназы Ulp275 обеспечивает высвобождение целевых белков Glp, PhtD19 и Brz53 в растворимую фракцию и осаждение нерастворимых остатков исходных ТВ с использованием центрифугирования (Фиг. 3а, 4а и 5а).
Биологическую активность белков-мишеней Glp, PhtD19 и Brz53, высвобождаемых из состава ТВ, непосредственное измерение которой затруднено, доказывают путем определения ключевых показателей, характерных для биологически активных форм этих белков. Таким показателем является молекулярный вес указанных белков-мишеней.
Результаты масс-спектрометрического анализа молекулярного веса белков, получаемых путем процессинга АТВ с использованием протеиназы Ulp275, приведены на Фиг. 3б, 4б и 5б и отражены в таблице 2. Как хорошо видно, измеренные показатели целевых белков-мишеней Glp, PhtD19 и Brz53 совпадают с расчетными величинами. Таким образом, заявляемый способ обеспечивает получение белков-мишеней Glp и PhtD19, обладающих целевыми характеристиками. С другой стороны, соответствие измеренного и расчетного показателей молекулярного веса доказывает наличие в структуре белка Brz53 4 дисульфидных связей. Анализ с использованием обращенно-фазовой ВЭЖХ (Фиг. 5в) также подтверждает идентичность белка-мишени Brz53, полученного с использованием заявляемого способа, и контрольного образца биологически активного браззеина Brz53, содержащего в своем составе 4 дисульфидные связи, полученного путем секреции в дрожжах.
Таким образом, результаты анализов доказывают, что заявляемый способ обеспечивает высокую эффективность получения целевых белков-мишеней Glp, PhtD19 и Brz53, обладающих характеристиками биологически активных форм этих белков. При этом, как и ранее в отношение белков-мишеней eGFP и sfGFP, для получения целевых белков-мишеней Glp, PhtD19 и Brz53 процедура денатурации/ренатурации не применялась.
Таким образом, совокупность представленных данных доказывает, что заявляемый способ обеспечивает высокую эффективность получения целевых белков-мишеней, имеющих отличия в биологической активности, третичной структуре, молекулярной массе, эффективности сворачивания, наличии дисульфидных связей и др. При этом получаемые с использованием заявляемого способа целевые белки-мишени демонстрируют биологическую активность непосредственно или обладают физико-химические характеристиками, свойственными их биологически активным формам.

Claims (1)

  1. Способ получения биологически активных рекомбинантных протеинов, содержащих до 4 дисульфидных связей, заключающийся в разработке генетической конструкции, кодирующей предшественник целевого белка-мишени, содержащий в своем составе расположенные в порядке перечисления от N-конца к С-концу последовательность самоассоциирующего пептида L6KD, заключающего следующие друг за другом 6 остатков лейцина, последовательность белка SUMO - продукта гена Smt3 дрожжей Saccharomyces cerevisiae и последовательность целевого белка-мишени, первый N-концевой остаток, следующий за последовательностью белка SUMO, отличен от пролина, и использования созданной генетической конструкции для получения целевого белка-мишени путем трансформации этой конструкцией подходящего реципиентного штамма, культивирования трансформированного штамма в условиях, обеспечивающих экспрессию генетической конструкции и микробиологический синтез предшественника целевого белка-мишени в форме нерастворимых телец включения, с последующим выделением синтезированных телец включения из клеток штамма-продуцента, высвобождением из их состава растворимого целевого белка-мишени с помощью подходящей производной SUMO-специфичной протеиназы, отделением остатков нерастворимых телец включения с помощью центрифугирования и дальнейшей очисткой высвобожденного белка-мишени с использованием методов молекулярной биологии, известных из уровня техники, без применения ренатурации.
RU2022109102A 2022-04-06 Способ получения биологически активных рекомбинантных протеинов RU2807615C2 (ru)

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2022109102A RU2022109102A (ru) 2023-10-06
RU2807615C2 true RU2807615C2 (ru) 2023-11-17

Family

ID=

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2441072C1 (ru) * 2010-12-28 2012-01-27 Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП "ГосНИИгенетика") ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК, ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО БЕЛКА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЗМЕТИОНИНОВОГО ИНТЕРФЕРОНА АЛЬФА-2b ЧЕЛОВЕКА ИЗ ЭТОГО ГИБРИДНОГО БЕЛКА
RU2451076C1 (ru) * 2011-05-26 2012-05-20 Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП "ГосНИИгенетика") СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТЕИНАЗЫ Ulp275
US9200306B2 (en) * 2012-10-12 2015-12-01 Tsinghua University Methods for production and purification of polypeptides

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2441072C1 (ru) * 2010-12-28 2012-01-27 Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП "ГосНИИгенетика") ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК, ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО БЕЛКА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЗМЕТИОНИНОВОГО ИНТЕРФЕРОНА АЛЬФА-2b ЧЕЛОВЕКА ИЗ ЭТОГО ГИБРИДНОГО БЕЛКА
RU2451076C1 (ru) * 2011-05-26 2012-05-20 Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП "ГосНИИгенетика") СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТЕИНАЗЫ Ulp275
US9200306B2 (en) * 2012-10-12 2015-12-01 Tsinghua University Methods for production and purification of polypeptides

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YANG X. ET AL. Cleavable Self-Aggregating Tags (cSAT) for Therapeutic Peptide Expression and Purification. In: Garcia Fruitоs, E., Aris Giralt, A. (eds) Insoluble Proteins. Methods in Molecular Biology, 2022, vol 2406. Humana, New York, NY. PP. 131-143 https://doi.org/10.1007/978-1-0716-1859-2_7 Найдено онлайн: https://link.springer.com/protocol/10.1007/978-1-0716-1859-2_7 Дата обращения 27.10.2022. ZHOU X.F. ET AL. A simple and rapid protein purification method based on cell-surface display of SUMO-fused recombinant protein and Ulp1 protease. AMB Expr 10, 65 (2020). https://doi.org/10.1186/s13568-020-00999-4 Найдено онлайн: https://amb-express.springeropen.com/articles/10.1186/s13568-020-00999-4 Дата обращения 27.10.2022. ZHOU B. ET AL. Small surfactant-like peptides can drive soluble proteins into active aggregates. Microb Cell Fact 11, 10 (2012). https://doi.org/10.1186/1475-2859-11-10 Найдено онлайн: https://link.springer.com/article/10.1186/1475-2859-11-10 Дата обращения 27.10.202 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2474457C (en) Protein tag comprising a biotinylation domain and method for increasing solubility and determining folding state
CN113195521B (zh) Mtu ΔI-CM内含肽变体和其应用
WO2007009351A1 (en) A method of secretion expression of lysostaphin in escherichia coli at high level
AU2003238441A1 (en) Protein tag comprising a biotinylation domain and method for increasing solubility and determining folding state
US20230128192A1 (en) Methods for enzymatic peptide ligation
CN113234707A (zh) 一种蛋白酶k突变体及其制备方法
KR102608876B1 (ko) 글리칸 분석을 위한 효소
RU2807615C2 (ru) Способ получения биологически активных рекомбинантных протеинов
KR20190060024A (ko) 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 신규한 펩타이드 및 이를 포함하는 융합 단백질
Greimann et al. Reconstitution of RNA exosomes from human and Saccharomyces cerevisiae: cloning, expression, purification, and activity assays
US8530217B2 (en) Processing of peptides and proteins
KR102064810B1 (ko) 재조합 폴리펩타이드 생산용 n-말단 융합 파트너 및 이를 이용하여 재조합 폴리펩타이드를 생산하는 방법
EP2643457B1 (en) Compositions and methods of producing enterokinase in yeast
KR100752683B1 (ko) 발리엔아민 생합성에 관여하는 발리오론 생합성 효소, 이의유전자, 프라이머쌍 및 이를 이용한 발리오론 생합성효소의 생산방법
KR102009709B1 (ko) 융합 폴리펩타이드를 이용하여 인간 부갑상선 호르몬 1-84를 생산하는 방법
JP4631436B2 (ja) メタロエンドペプチダーゼ
Na et al. Expression and purification of ubiquitin-specific protease (UBP1) of Saccharomyces cerevisiae in recombinant Escherichia coli
KR102011291B1 (ko) 신규한 융합 폴리펩타이드 및 이를 이용하여 인간 부갑상선 호르몬 1-34를 생산하는 방법
Dihazi et al. One-step purification of recombinant yeast 6-phosphofructo-2-kinase after the identification of contaminants by MALDI-TOF MS
KR100980378B1 (ko) 고농도 우레아하에서 안정된 활성을 갖는 디유비퀴틸레이팅효소를 이용한 펩티드의 제조방법
KR100419592B1 (ko) 클루이베로마이세스 마르시아누스의 퀴논옥시도리덕테이즈 유전자 및 이로부터 발현되는 단백질
KR20240072296A (ko) 단량체 DsRed와 인테인 변이체를 이용한 재조합 단백질의 세포 외부 분비 시스템
KR100860083B1 (ko) 갯벌 메타게놈 유래 신규 리파제 유전자 및 이로부터코딩되는 리파제 단백질
MXPA06006747A (es) Procesamiento de peptidos y proteinas.
KR20230120361A (ko) 단백질의 용해도를 증가시키는 펩타이드 태그