CN113913414A

CN113913414A - 高稳定性和高催化效率的双碱基酶Kex2突变体

Info

Publication number: CN113913414A
Application number: CN202110589752.6A
Authority: CN
Inventors: 刘晓
Original assignee: SHANGHAI YAXIN BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: SHANGHAI YAXIN BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2021-05-28
Filing date: 2021-05-28
Publication date: 2022-01-11
Anticipated expiration: 2041-05-28
Also published as: CN113913414B

Abstract

本发明提供了一种高稳定性和高催化效率的双碱基酶Kex2突变体。本发明揭示了Kex2蛋白酶的一些位点与其稳定性、底物亲和力和催化效率密切相关，进而提供了优化的Kex2蛋白酶突变体，与野生型相比，所述突变体的稳定性、底物亲和力和催化效率更好。本发明也提供了优化的表达重组Kex2蛋白酶突变体的方法，其产量高、生产成本低、适合规模化生产。

Description

高稳定性和高催化效率的双碱基酶Kex2突变体

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种高稳定性和高催化效率的双碱基酶Kex2突变体。

背景技术

来源于自然界中的蛋白酶，是维持生物体正常代谢不可缺少的专一的高效的催化剂。一般情况下，在生物体内，除了某些特殊的蛋白酶在极酸极碱的情况下可以发挥作用，一般蛋白酶作用条件比较温和，适应于生物体内的环境，这也是自然选择的结果。酶稳定性极高对生物体会产生危害，比如胰腺炎，由于胰蛋白酶分子上基因突变，使得胰酶酶活升高，稳定性增强，导致胰酶易自激活或难以降解，过度酶切导致胰脏受损。过度稳定的蛋白酶会对生物体造成伤害。但是，在现代的工业应用中，人们更希望得到的是耐酸、耐碱、耐冷热的稳定蛋白酶。因此，一些来自于生物体的酶，当进行工业化应用时，需要进行改造，以提高其稳定性，酶解效率等。

Kex2蛋白酶(EC.3.4.21.61)是一种钙离子依赖型的丝氨酸蛋白酶，可以特异性识别两个连续的碱性氨基酸(Arg-Arg或Lys-Arg或Lys-Lys)并在第二个碱性氨基酸的羧基端肽键进行切割。Kex2蛋白酶包含814个氨基酸残基，分为了七个结构域：信号肽(1-19氨基酸残基)、前肽(20-113氨基酸残基)、催化结构域(114-410氨基酸残基)、P-结构域(411-624氨基酸残基)、丝氨酸/苏氨酸富集区(625-679氨基酸残基)、跨膜区(680-699氨基酸残基)以及胞浆区(700-814氨基酸残基)。研究发现信号肽、跨膜区和胞浆区这三个结构域与Kex2蛋白酶的活性无关，去除这些结构域不会影响蛋白酶的活性，因此在表达时通常只表达前肽至丝氨酸/苏氨酸富集区这四个结构域的氨基酸片段。

Kex2蛋白酶在生物医药行业有广泛应用前景，相比胰蛋白酶，Kex2酶切位点更特异。在已有的工作中，本发明人成功利用毕赤酵母表达系统表达了含有Kex2前肽、催化结构域、P结构域和丝氨酸/苏氨酸富集区结构域的20至667位氨基酸残基序列，利用毕赤酵母α-信号肽取代原Kex2信号肽(1-19氨基酸残基)，可以得到直接分泌到胞外的目的蛋白。然而在纯化过程中发现，该Kex2蛋白酶会出现自降解的现象，产生多条杂条带，酶活性降低。在分析其氨基酸序列后发现，Kex2蛋白自身结构中含有多对连续碱性氨基酸残基位点，这可能是导致其自降解的原因。

因此，本领域迫切需要找到能够稳定表达Kex2的方法，并且藉由该方法获得具有良好酶活性的蛋白。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高稳定性和高催化效率的双碱基酶Kex2突变体。

在本发明的第一方面，提供一种提高双碱基酶Kex2的稳定性、底物亲和力和催化效率的方法，所述方法包括：将双碱基酶Kex2进行突变，使其氨基酸序列对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列，第542位由Arg突变为Leu或His；较佳地突变为Leu。

在一个优选例中，所述方法还包括使其第291位由Lys突变为His或Leu；较佳地突变为His。

在另一优选例中，所述的稳定性包括：温度稳定性。

在另一优选例中，所述的双碱基酶Kex2包括：全长的SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽。

在另一优选例中，所述的双碱基酶Kex2包括：SEQ ID NO:1中第20～814位氨基酸序列的多肽。

在另一优选例中，所述的双碱基酶Kex2包括：SEQ ID NO:1中第114～814位氨基酸序列的多肽。

在本发明的另一方面，提供一种双碱基酶Kex2突变体，其氨基酸序列对应于SEQID NO:1所示氨基酸序列，第542位由Arg突变为Leu或His；较佳地突变为Leu。

在一个优选例中，所述突变体的氨基酸序列对应于SEQ ID NO:1，还包括第291位由Lys突变为His或Leu；较佳地突变为His。

在本发明的另一方面，提供分离的多核苷酸，所述的多核苷酸编码所述的突变体。

在本发明的另一方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体，或基因组中整合有所述的多核苷酸。

在一个优选例中，所述宿主细胞包括：原核细胞或真核细胞；较佳地，所述真核宿主细胞包括：酵母细胞、真菌细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞等；所述原核宿主细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌等。

在另一优选例中，所述宿主细胞为酵母细胞。

在另一优选例中，所述载体中，所述的多核苷酸的3’端，还包括信号肽和/或启动子。

在本发明的另一方面，提供一种生产所述的双碱基酶Kex2的突变体的方法，包括步骤：(1)培养所述的宿主细胞，获得培养物；和(2)从培养物中分离所述的双碱基酶Kex2突变体。

在本发明的另一方面，提供所述的双碱基酶Kex2突变体的用途，用于靶向两个连续碱性氨基酸(如Arg-Arg、Lys-Arg、Lys-Lys或Pro-Arg)并在第二个碱性氨基酸的羧基端肽键进行切割。

在本发明的另一方面，提供一种用于靶向两个连续碱性氨基酸并在第二个碱性氨基酸的羧基端肽键进行切割的组合物，其中含有所述的双碱基酶Kex2突变体，以及食品学、药学或工业学上可接受的载体。

在本发明的另一方面，提供一种用于靶向两个连续碱性氨基酸并在第二个碱性氨基酸的羧基端肽键进行切割的试剂盒，其中含有所述的组合物；或，含有所述的双碱基酶Kex2突变体。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、Kex2蛋白酶的空间结构示意图，其中包括R542位点的示意位点。

图2、Kex2-K291H和Kex2-K291L以及野生型Kex2的纯化电泳结果。

图3、Kex2-R542L和Kex2-R542H的诱导表达后不同时间的电泳结果。

图4、Kex2-R542L的纯化后电泳结果；(a)Kex2-R542H纯化后电泳结果；(b)Kex2-R542L纯化后电泳结果。

图5、Kex2-K291H-R542L的诱导表达后不同时间的电泳结果。

图6、Kex2-K291H-R542L纯化电泳结果。

图7、Kex2-R542L、Kex2-R542H以及野生型Kex2的动力学测定。

图8、双突变体Kex2-K291H-R542L动力学测定。

图9、双突变体Kex2-K291H-R542L、单突变体及野生型分别在4℃(a)和25℃(b)温度下的温度稳定性。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究试验，发现Kex2蛋白酶的一些位点与其稳定性、底物亲和力和催化效率密切相关。在此基础上，本发明人获得了一种Kex2蛋白酶突变体，与野生型相比，所述突变体的稳定性、底物亲和力和催化效率更好。本发明也提供了优化的表达重组Kex2蛋白酶突变体的方法，其产量高、生产成本低、适合规模化生产。

术语

如本文所用，除非另外说明，所述的“Kex2蛋白酶的突变体”、“突变型Kex2蛋白酶”可互换使用，是指对应于野生型Kex2蛋白酶(如SEQ ID NO:1)发生以下位置的突变后所构成的蛋白：第542位；较佳地，其第291位也发生突变。

如本文所用，术语“双碱基酶Kex2”与“Kex2蛋白酶”可互换使用。

如本文所用，除非另外说明，所述的“Kex2蛋白酶的突变体”、“突变型Kex2蛋白酶”可互换使用，是指对野生型的Kex2蛋白酶进行突变后的产物。

如本文所用，若需要表示野生型的Kex2蛋白酶，其将被标示为“野生型Kex2蛋白酶”、SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的蛋白或WT。

如本文所用，“分离的Kex2蛋白酶突变体”是指Kex2蛋白酶突变体基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化Kex2蛋白酶突变体。基本上纯的蛋白在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。

如本文所用，“重组的(Recombinant；R)”是指借助基因工程手段来获得(或大量制备)的蛋白、基因工程载体或细胞等。

如本文所用，“提高稳定性、底物亲和力和催化效率”是指与改造前的野生型Kex2蛋白酶相比，发生突变的Kex2蛋白酶的稳定性、底物亲和力和催化效率发生统计学意义的提高，或称为显著性的提高。例如，在同一种反应条件/环境下，稳定性、底物亲和力和催化效率提高的突变型Kex2蛋白酶比改造前的酶(如野生型酶)显著提高5％以上，10％以上，20％以上，30％以上，50％以上，70％以上，80％以上，100％，150％以上等。

如本文所用，术语“含有”或“包括”包括了“包含”、“基本上由……构成”、和“由……构成”。术语“基本上由……构成”指在组合物/反应体系/试剂盒中，除了含有必要成分或必要组份之外，还可含有少量的且不影响有效成分的次要成分和/或杂质。

如本文所用，术语“有效量”是指可对本发明感兴趣的反应产生功能或活性、达到预期效果(准确的检测结果)的量。

Kex2蛋白酶突变体、其编码核酸及构建体

本发明的Kex2蛋白酶突变体可以是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。

本发明还包括所述Kex2蛋白酶突变体的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然Kex2蛋白酶突变体相同的生物学功能或活性的蛋白。本发明的蛋白片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的蛋白，或(iii)附加的氨基酸序列融合到此蛋白序列而形成的蛋白(如前导序列或分泌序列或用来纯化此蛋白的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。然而，需要满足的条件是：所述的Kex2蛋白酶突变体及其片段、衍生物和类似物的氨基酸序列中，必然存在至少一种本发明上面所特别指出的突变，较佳地，该突变为对应于SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，包括第542位突变为Leu或His(优选突变为Leu)，较佳地第291位突变为His或Leu(优选突变为His)。

在本发明中，术语“Kex2蛋白酶突变体”还包括(但并不限于)：若干个(通常为1-20个，更佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个、1-3个、或1-2个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括Kex2蛋白酶突变体的活性片段和活性衍生物。但是在这些变异形式中，肯定存在本发明上面所述的突变，较佳地，该突变为对应于SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，包括第542位突变为Leu或His(优选突变为Leu)，较佳地第291位突变为His或Leu(优选突变为His)。

在本发明中，术语“Kex2蛋白酶突变体”还包括(但并不限于)：与所述的Kex2蛋白酶突变体的氨基酸序列具有80％以上，较佳地85％以上，更佳地90％以上，进一步更佳地95％以上，如98％以上、99％以上序列相同性的保留其蛋白活性的衍生的蛋白。同样地，这些衍生的蛋白中，肯定存在本发明上面所述的突变。

发明还提供所述Kex2蛋白酶突变体的类似物。这些类似物与所述Kex2蛋白酶突变体的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

本发明还提供了编码本发明Kex2蛋白酶突变体或其保守性变异蛋白的多核苷酸序列。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。

编码所述突变体的成熟蛋白的多核苷酸包括：只编码成熟蛋白的编码序列；成熟蛋白的编码序列和各种附加编码序列；成熟蛋白的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

“编码蛋白的多核苷酸”可以是包括编码此蛋白的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或Kex2蛋白酶突变体编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述突变的酶的方法。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列来表达或生产重组的Kex2蛋白酶突变体。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码Kex2蛋白酶突变体的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，Kex2蛋白酶突变体多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含Kex2蛋白酶突变体编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

本发明中，所述的宿主细胞可以是真核细胞，如酵母细胞，霉菌细胞，植物细胞；或是原核细胞，如细菌细胞(代表性例子有：大肠杆菌、枯草杆菌、链霉菌、农杆菌)。在本发明的具体实施例中，以酵母细胞作为宿主细胞。

本领域一般技术人员清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

突变体的重组表达

本发明建立的重组细胞(宿主细胞)可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在表达时，本发明的Kex2蛋白酶突变体可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声处理、高速离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

本发明的重组表达Kex2蛋白酶突变体的方法，解决了现有技术中重组Kex2蛋白酶稳定性偏低、容易自降解的问题，同时还提高了其催化效率。

Kex2蛋白酶突变体的应用

本发明的改造的Kex2蛋白酶突变体有多方面的与Kex2蛋白酶特性相关的用途，包括但不限于：靶向两个连续碱性氨基酸(如Arg-Arg、Lys-Arg、Lys-Lys或Pro-Arg)并在第二个碱性氨基酸的羧基端肽键进行切割。

结合两个单独位点的突变后的结果，K291H单突变体的稳定性升高，而R542L单突变体的催化效率提高，将两个位点的最佳突变位点组合获得了稳定性提高，催化效率提高的Kex2蛋白酶的双突变体：Kex2-K291H-R542L。这一突变体作为本发明的最为优选的实施方式。

作为一种实施方式，所述的Kex2蛋白酶突变体可应用于蛋白氨基酸序列的酶解。

本发明的Kex2蛋白酶突变体能在酵母中高效表达，具有产量高、稳定性好、酶活高、成本低、适合大规模工业生产的优点。同时，本发明的Kex2蛋白酶突变体可稳定性理想，符合工业生产所需。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

材料与方法

质粒与菌株

质粒：含野生型Kex2基因序列的pPIC9K质粒。

宿主细胞：毕赤酵母GS115菌株。

主要试剂和培养基

实验所用内切酶、连接酶和蛋白分子量标准购自Takara生物有限公司。

测活底物叔丁氧羰-谷氨酰胺-精氨酸-精氨酸-对硝基苯胺(Boc-Gln-Arg-Arg-pNA)购自Sigma。

MD培养基：1.34％YNB，2％葡萄糖，4×10^-5％生物素。

YPD培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖。

BMGY培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，100mmol/L磷酸钾缓冲液，pH5.0，4×10^-5％生物素，1％甘油。

BMMY培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，100mmol/L磷酸钾缓冲液，pH5.0，4×10^-5％生物素，1％甲醇。

重组毕赤酵母菌株的筛选

测序确认正确后进行质粒小量抽提。选取SalⅠ限制性内切酶将质粒线性化，然后使用电击转化法将线性化的质粒转化至毕赤酵母GS115中，先涂布于MD平板进行第一次筛选，然后收集菌落，重新涂布于含有不同浓度G418的YPD平板进行第二次筛选。

诱导表达和纯化

挑取含高浓度G418的YPD平板上的单菌落至YPD液体培养基中，待菌液浓度达到OD₆₀₀为2.0时，再接种至BMGY培养基中，待菌液浓度达到OD₆₀₀为20.0时，将菌液离心，菌体重悬于BMMY培养基中，每24小时添加终浓度为1％的甲醇，诱导72小时。

诱导结束后将菌液离心，将上清液进行透析，去除培养外液中高浓度的磷酸盐和色素小分子，透析外液为20mmol/L乙酸钠-乙酸缓冲液，pH 5.2。使用Q-FF阴离子交换柱进行纯化，并用pH5.2，20mmol/L NaCl，20mmol/L乙酸钠-乙酸缓冲液和pH5.2，200mmol/LNaCl，20mmol/L乙酸钠-乙酸缓冲液等体积线性洗脱，分步收集洗脱液，SDS-PAGE鉴定蛋白纯度，超滤除盐后测定蛋白酶活性。

活性测定

测活底物为叔丁氧羰-谷氨酰胺-精氨酸-精氨酸-对硝基苯胺(Boc-Gln-Arg-Arg-pNA，或Boc-QRR-pNA)。该底物在405nm处无吸光值，当Kex2蛋白酶在-RR-位点切割后，产生了两个片段Boc-Gln-Arg-Arg和pNA，pNA在405nm处有吸光值，且吸光值大小与浓度成正比。

酶活力单位(U)的定义为：在25℃，pH8.0的条件下，每分钟催化1μmol的Boc-QRR-pNA转化为产物所需要的酶量。将Boc-QRR-pNA溶于50mmol/LTris-HCl，pH8.0，2mmol/LCaCl₂的测活缓冲液中。底物在25℃水浴中孵育30分钟以上，取3ml底物于玻璃比色皿中，加入适量酶，在波长405nm下，每间隔30s记录吸光值A405，连续记录5分钟，然后根据下列公式计算酶活：

其中，ΔA为测量时间段内吸光值A405的差值，TV为测活体系总体积，ΔT为测量时长，SV为测活体系中加入酶的体积，L为比色皿光程，L＝1cm，ε为反应体系中pNA的摩尔消光系数，ε＝1.02X 10⁴(L·mol^-1·cm^-1)。

动力学参数

利用Lineweaver-Burk双倒数作图法，分别配制浓度为10、20、30、50、100、200、300μmol/L的底物，在不同浓度底物下测定蛋白酶的反应速率，得到V(μmol/min)，然后以

作图，拟合出一条直线，其横轴截距为-1/Km，纵轴截距为1/Vmax。计算出Km和Vmax值。

Kcat测定方法：

Kcat＝Vmax/[E0]，计算出Kcat；

E0为测定中加入的酶的浓度。

Kcat/Km测定：将Kcat与Km值相除。

温度稳定性

将纯化后的Kex2蛋白酶在不同温度(4℃、25℃)下孵育，每2小时测定一次经不同温度处理后的蛋白酶的活性。结果为三组平行实验平均值，规定未经处理蛋白酶的活性为100％，计算经不同温度和时间处理后的蛋白酶的残留活性，以温度为横坐标，蛋白酶的残留活性为纵坐标作图。

野生型Kex2蛋白酶序列信息

Kex2蛋白酶包含814个氨基酸残基：信号肽(signal sequence，1-19残基)，前肽(propeptide，20-113残基)，催化结构域(catalysis domain，114-410残基)，P-结构域(P-domain，411-624残基)，Ser/Thr富集区(Ser/Thr rich domain，625-679残基)，跨膜区(transmembrance domain(TMD)，680-699残基)，胞浆区(C-terminal tail，700-814残基)。其氨基酸序列如下(SEQ ID NO:1)：

MKVRKYITLC FWWAFSTSAL VSSQQIPLKD HTSRQYFAVE SNETLSRLEE MHPNWKYEHDVRGLPNHYVF SKELLKLGKR SSLEELQGDN NDHILSVHDL FPRNDLFKRL PVPAPPMDSS LLPVKEAEDKLSINDPLFER QWHLVNPSFP GSDINVLDLW YNNITGAGVV AAIVDDGLDY ENEDLKDNFC AEGSWDFNDNTNLPKPRLSD DYHGTRCAGE IAAKKGNNFC GVGVGYNAKI SGIRILSGDI TTEDEAASLI YGLDVNDIYSCSWGPADDGR HLQGPSDLVK KALVKGVTEG RDSKGAIYVF ASGNGGTRGD NCNYDGYTNS IYSITIGAIDHKDLHPPYSE GCSAVMAVTY SSGSGEYIHS SDINGRCSNS HGGTSAAAPL AAGVYTLLLE ANPNLTWRDVQYLSILSAVG LEKNADGDWR DSAMGKKYSH RYGFGKIDAH KLIEMSKTWE NVNAQTWFYL PTLYVSQSTNSTEETLESVI TISEKSLQDA NFKRIEHVTV TVDIDTEIRG TTTVDLISPA GIISNLGVVR PRDVSSEGFKDWTFMSVAHW GENGVGDWKI KVKTTENGHR IDFHSWRLKL FGESIDSSKT ETFVFGNDKE EVEPAATESTVSQYSASSTS ISISATSTSS ISIGVETSAI PQTTTASTDP DSDPNTPKKL SSPRQAMHYF LTIFLIGATFLVLYFMFFMK SRRRIRRSRA ETYEFDIIDT DSEYDSTLDN GTSGITEPEE VEDFDFDLSD EDHLASLSSSENGDAEHTID SVLTNENPFS DPIKQKFPND ANAESASNKL QELQPDVPPS SGRS

实施例1、Kex2-K291点突变构建

使用重叠延伸PCR法构建点突变。在Kex2蛋白酶原始序列中找到对应的核酸序列，根据毕赤酵母的偏好性设计突变引物，引物序列如表1所示。然后进行两次PCR反应得到Kex2-K291H和Kex2-K291L突变后的核酸序列。经过连接、转化和筛选后，挑选阳性重组子送至生工生物(Sangon Biotech)有限公司进行测序。

表1、突变引物

Kex2-K291H和Kex2-K291L以及野生型Kex2的纯化电泳结果如图2所示。

实施例2、突变体Kex2-R542以及Kex2-K291-R542双突变体的构建

为了进一步优化Kex2蛋白酶，在全长Kex2及其Kex2-K291点突变氨基酸序列基础上，本发明人使用重叠延伸PCR法构建点突变，设计了多种多样的Kex2蛋白酶突变体。

本发明人的分析结果显示，R542位点处于β-折叠区内。该位点的精氨酸非常容易被识别并被切割，因此R542位点也有较大的概率是降解位点，从而影响其稳定性。该R542位点不属于催化活性中心，在空间结构上距离Kex2蛋白酶的催化三联体S385-H213-D175远。本发明人发现，对其进行突变后不会影响蛋白酶发挥其生物活性，但是有利于其稳定性的提高，因此决定将R542位点的精氨酸进行突变。

Kex2蛋白酶R542位点的结构图图1。

突变体的Kex2-R542L和Kex2-R542H的构建方法参考实施例2。Kex2-R542L和Kex2-R542H的诱导表达后不同时间的电泳结果如图3，可见Kex2-R542L的表达量明显高，说明Kex2-R542H的突变可能存在一些影响蛋白表达的因素，而Kex2-R542L则是更为适合的突变形式。

Kex2-R542L和Kex2-R542H突变体的纯化电泳结果如图4(a)-(b)所示。

同时，参考实施例2同样的突变方法，本发明人也构建了Kex2-K291H-R542L双位点突变体。Kex2-K291H-R542L的诱导表达后不同时间的电泳结果如图5，在使用甲醇诱导的24小时后，目的蛋白开始分泌到培养基中，在电泳图中能看到较明显条带。

Kex2-K291H-R542L纯化电泳结果如图6。

实施例3、Kex2蛋白酶及其突变体的降解情况及活性或亲和力测定

1、Kex2-K291单突变体

诱导后，每24小时取培养液离心，取上清液进行电泳鉴定，Kex2蛋白酶的天然形式和突变体均成功表达，在甲醇的诱导下分泌到培养液中，表观分子量为75kDa。经过Q-FF纯化后，SDS-PAGE电泳检测如图2，野生型Kex2蛋白酶在纯化过程中发生了降解，出现了非单一条带，在66kDa处出现了一条杂条带，而Kex2-K291突变体在纯化过程中未发现明显的降解，仍为单一条带。

2、Kex2-R542单突变体

本发明人进一步测定了Kex2-R542L、Kex2-R542H以及野生型的动力学参数，测定结果如图7和表2。

表2、Kex2-R542H和Kex2-R542L动力学参数

根据表2结果显示，突变体Kex2-R542L的Km值减小，即突变体与底物的亲和力增加了。突变体的Kcat值均增大，Kex2-R542L的Kcat值约为野生型Kex2的Kcat值的2倍。

Kex2-R542L、Kex2-R542H突变体的Kcat/Km值也显著增大，其中Kex2-R542L甚至高达野生型Kex2蛋白酶的10.0倍。因此，突变体蛋白酶的催化效率发生了非常显著的提高，尤其是Kex2-R542L效果尤为理想。

3、Kex2-K291H-R542L双突变体

本发明人进一步也测定了Kex2-K291H-R542L双突变体的动力学参数，测定结果如图8和表3。

表3、Kex2-K291H-R542L动力学参数

根据上述，与Kex2-K291H突变体相比，双突变体Kex2-K291H-R542L的Kcat值和Kcat/Km值都增大了，Kex2-K291H-R542L的催化效率比Kex2-K291H的催化效率高。

本发明人分析了不同温度下Kex2及其突变体的稳定性，结果如图9(a)-(b)。在4℃条件下，Kex2-K291H-R542L在24小时后能够保留较高活性。当温度升高至25℃后，Kex2-K291H-R542L在24小时后仍可以保持90％的活性，与Kex2-K291H基本相同。

因此，从稳定性方面来看，Kex2-R542L的稳定性尚不够高，随着时间的增加降低稳定性减低幅度相对大。然而，双突变体Kex2-K291H-R542L的稳定性可达到与Kex2-K291H突变体的稳定性基本相同。

综上，本发明获得了表达量高、稳定性高、底物亲和力高且催化效率大大提高的Kex2酶突变体，适用于规模化应用。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改RPK改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 上海雅心生物技术有限公司

<120> 高稳定性和高催化效率的双碱基酶Kex2突变体

<130> 211441

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 814

<212> PRT

<213> 酵母(saccharomyces)

<400> 1

Met Lys Val Arg Lys Tyr Ile Thr Leu Cys Phe Trp Trp Ala Phe Ser

1 5 10 15

Thr Ser Ala Leu Val Ser Ser Gln Gln Ile Pro Leu Lys Asp His Thr

20 25 30

Ser Arg Gln Tyr Phe Ala Val Glu Ser Asn Glu Thr Leu Ser Arg Leu

35 40 45

Glu Glu Met His Pro Asn Trp Lys Tyr Glu His Asp Val Arg Gly Leu

50 55 60

Pro Asn His Tyr Val Phe Ser Lys Glu Leu Leu Lys Leu Gly Lys Arg

65 70 75 80

Ser Ser Leu Glu Glu Leu Gln Gly Asp Asn Asn Asp His Ile Leu Ser

85 90 95

Val His Asp Leu Phe Pro Arg Asn Asp Leu Phe Lys Arg Leu Pro Val

100 105 110

Pro Ala Pro Pro Met Asp Ser Ser Leu Leu Pro Val Lys Glu Ala Glu

115 120 125

Asp Lys Leu Ser Ile Asn Asp Pro Leu Phe Glu Arg Gln Trp His Leu

130 135 140

Val Asn Pro Ser Phe Pro Gly Ser Asp Ile Asn Val Leu Asp Leu Trp

145 150 155 160

Tyr Asn Asn Ile Thr Gly Ala Gly Val Val Ala Ala Ile Val Asp Asp

165 170 175

Gly Leu Asp Tyr Glu Asn Glu Asp Leu Lys Asp Asn Phe Cys Ala Glu

180 185 190

Gly Ser Trp Asp Phe Asn Asp Asn Thr Asn Leu Pro Lys Pro Arg Leu

195 200 205

Ser Asp Asp Tyr His Gly Thr Arg Cys Ala Gly Glu Ile Ala Ala Lys

210 215 220

Lys Gly Asn Asn Phe Cys Gly Val Gly Val Gly Tyr Asn Ala Lys Ile

225 230 235 240

Ser Gly Ile Arg Ile Leu Ser Gly Asp Ile Thr Thr Glu Asp Glu Ala

245 250 255

Ala Ser Leu Ile Tyr Gly Leu Asp Val Asn Asp Ile Tyr Ser Cys Ser

260 265 270

Trp Gly Pro Ala Asp Asp Gly Arg His Leu Gln Gly Pro Ser Asp Leu

275 280 285

Val Lys Lys Ala Leu Val Lys Gly Val Thr Glu Gly Arg Asp Ser Lys

290 295 300

Gly Ala Ile Tyr Val Phe Ala Ser Gly Asn Gly Gly Thr Arg Gly Asp

305 310 315 320

Asn Cys Asn Tyr Asp Gly Tyr Thr Asn Ser Ile Tyr Ser Ile Thr Ile

325 330 335

Gly Ala Ile Asp His Lys Asp Leu His Pro Pro Tyr Ser Glu Gly Cys

340 345 350

Ser Ala Val Met Ala Val Thr Tyr Ser Ser Gly Ser Gly Glu Tyr Ile

355 360 365

His Ser Ser Asp Ile Asn Gly Arg Cys Ser Asn Ser His Gly Gly Thr

370 375 380

Ser Ala Ala Ala Pro Leu Ala Ala Gly Val Tyr Thr Leu Leu Leu Glu

385 390 395 400

Ala Asn Pro Asn Leu Thr Trp Arg Asp Val Gln Tyr Leu Ser Ile Leu

405 410 415

Ser Ala Val Gly Leu Glu Lys Asn Ala Asp Gly Asp Trp Arg Asp Ser

420 425 430

Ala Met Gly Lys Lys Tyr Ser His Arg Tyr Gly Phe Gly Lys Ile Asp

435 440 445

Ala His Lys Leu Ile Glu Met Ser Lys Thr Trp Glu Asn Val Asn Ala

450 455 460

Gln Thr Trp Phe Tyr Leu Pro Thr Leu Tyr Val Ser Gln Ser Thr Asn

465 470 475 480

Ser Thr Glu Glu Thr Leu Glu Ser Val Ile Thr Ile Ser Glu Lys Ser

485 490 495

Leu Gln Asp Ala Asn Phe Lys Arg Ile Glu His Val Thr Val Thr Val

500 505 510

Asp Ile Asp Thr Glu Ile Arg Gly Thr Thr Thr Val Asp Leu Ile Ser

515 520 525

Pro Ala Gly Ile Ile Ser Asn Leu Gly Val Val Arg Pro Arg Asp Val

530 535 540

Ser Ser Glu Gly Phe Lys Asp Trp Thr Phe Met Ser Val Ala His Trp

545 550 555 560

Gly Glu Asn Gly Val Gly Asp Trp Lys Ile Lys Val Lys Thr Thr Glu

565 570 575

Asn Gly His Arg Ile Asp Phe His Ser Trp Arg Leu Lys Leu Phe Gly

580 585 590

Glu Ser Ile Asp Ser Ser Lys Thr Glu Thr Phe Val Phe Gly Asn Asp

595 600 605

Lys Glu Glu Val Glu Pro Ala Ala Thr Glu Ser Thr Val Ser Gln Tyr

610 615 620

Ser Ala Ser Ser Thr Ser Ile Ser Ile Ser Ala Thr Ser Thr Ser Ser

625 630 635 640

Ile Ser Ile Gly Val Glu Thr Ser Ala Ile Pro Gln Thr Thr Thr Ala

645 650 655

Ser Thr Asp Pro Asp Ser Asp Pro Asn Thr Pro Lys Lys Leu Ser Ser

660 665 670

Pro Arg Gln Ala Met His Tyr Phe Leu Thr Ile Phe Leu Ile Gly Ala

675 680 685

Thr Phe Leu Val Leu Tyr Phe Met Phe Phe Met Lys Ser Arg Arg Arg

690 695 700

Ile Arg Arg Ser Arg Ala Glu Thr Tyr Glu Phe Asp Ile Ile Asp Thr

705 710 715 720

Asp Ser Glu Tyr Asp Ser Thr Leu Asp Asn Gly Thr Ser Gly Ile Thr

725 730 735

Glu Pro Glu Glu Val Glu Asp Phe Asp Phe Asp Leu Ser Asp Glu Asp

740 745 750

His Leu Ala Ser Leu Ser Ser Ser Glu Asn Gly Asp Ala Glu His Thr

755 760 765

Ile Asp Ser Val Leu Thr Asn Glu Asn Pro Phe Ser Asp Pro Ile Lys

770 775 780

Gln Lys Phe Pro Asn Asp Ala Asn Ala Glu Ser Ala Ser Asn Lys Leu

785 790 795 800

Gln Glu Leu Gln Pro Asp Val Pro Pro Ser Ser Gly Arg Ser

805 810

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 2

ccggaattct tggtctcctc tcaacaaatc 30

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 3

atagtttagc ggccgcttat ggggtatttg gatc 34

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 4

cagatttggt gaagcatgct ttggttaagg 30

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 5

ccttaaccaa agcatgcttc accaaatctg 30

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 6

cagatttggt gaagttggct ttggttaagg 30

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 7

ccttaaccaa agccaacttc accaaatctg 30

Claims

1.一种提高双碱基酶Kex2的稳定性、底物亲和力和催化效率的方法，其特征在于，所述方法包括：将双碱基酶Kex2进行突变，使其氨基酸序列对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列，第542位由Arg突变为Leu或His；较佳地突变为Leu。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括使其第291位由Lys突变为His或Leu；较佳地突变为His。

3.一种双碱基酶Kex2突变体，其特征在于，其氨基酸序列对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列，第542位由Arg突变为Leu或His；较佳地突变为Leu；

较佳地，所述突变体的氨基酸序列对应于SEQ ID NO:1，还包括第291位由Lys突变为His或Leu；较佳地突变为His。

4.分离的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸编码权利要求3所述的突变体。

5.一种载体，其特征在于，它含有权利要求4所述的多核苷酸。

6.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求5所述的载体，或基因组中整合有权利要求4所述的多核苷酸。

7.一种生产权利要求3所述的双碱基酶Kex2的突变体的方法，其特征在于，包括步骤：

(1)培养权利要求5所述的宿主细胞，获得培养物；和

(2)从培养物中分离权利要求1所述的双碱基酶Kex2突变体。

8.权利要求3所述的双碱基酶Kex2突变体的用途，用于靶向两个连续碱性氨基酸并在第二个碱性氨基酸的羧基端肽键进行切割。

9.一种用于靶向两个连续碱性氨基酸并在第二个碱性氨基酸的羧基端肽键进行切割的组合物，其特征在于，其中含有权利要求3所述的双碱基酶Kex2突变体，以及食品学、药学或工业学上可接受的载体。

10.一种用于靶向两个连续碱性氨基酸并在第二个碱性氨基酸的羧基端肽键进行切割的试剂盒，其特征在于，其中含有权利要求9所述的组合物；或，含有权利要求3所述的双碱基酶Kex2突变体。