CN116334051A - 一种对核酸提取裂解液中异硫氰酸胍耐受时间延长的蛋白酶k突变体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种对核酸提取裂解液中异硫氰酸胍耐受时间延长的蛋白酶K突变体及其应用。本发明通过对野生型蛋白酶K进行组合定向改造，在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的基础上，将第151位的酪氨酸突变为丙氨酸，第208位的赖氨酸突变为组氨酸，第273的丝氨酸突变为苏氨酸，第293位的甘氨酸突变为丙氨酸。本发明提供的蛋白酶K突变体相比野生型蛋白酶K更加耐受高浓度的异硫氰酸胍，在25℃下，核酸提取裂解液处理后30分钟时残余活力不受影响；处理60分钟时仍然能保持80％以上残余活力，而此时野生型蛋白酶K残余活力仅为28％。由此提高了蛋白酶K对核酸提取试剂盒的核酸提取裂解液的耐受能力。

Description

一种对核酸提取裂解液中异硫氰酸胍耐受时间延长的蛋白酶 K突变体及其应用
技术领域
本发明属于基因工程和酶工程领域，具体涉及一种对核酸提取裂解液中异硫氰酸胍耐受时间延长的蛋白酶K突变体及其应用。
背景技术
蛋白酶K是一种来源于林伯氏白色念球菌(Tritirachium album)的丝氨酸蛋白酶，对蛋白质具有高效的切割能力，而且底物谱非常广泛。能优先分解与疏水性氨基酸、含硫氨基酸、芳香族氨基酸C端邻接的酯键和肽键，常用于降解蛋白产生短肽。蛋白酶K在体外诊断产业、洗涤液、饲料行业以及污水处理等领域均有广泛的应用。在分子诊断领域，蛋白酶K(Proteinase K)是病毒采样液的重要组分，可裂解病毒释放核酸，消除核酸分解酶(RNase)以防止病毒的RNA降解。并且可以灭活病毒，让病毒的蛋白变性，失去活性而“死掉”，不再有传染性，提高运输和检测阶段的安全性。核酸提取过程中，蛋白酶K能降解与核酸结合的蛋白质，促进核酸的分离，在提取高分子量核酸时有很大的优势。蛋白酶K还常被用于降解核酸中的DNA酶和RNA酶。
在一般情况下，蛋白酶K使用的pH范围是7.5-9.0之间，在20℃-60℃摄氏度蛋白酶K都具有活性。蛋白酶K在含有TritX-100、尿素、SDS、胍盐的环境中仍然能存在且具有一定活性，这一特性也是它广泛应用的原因之一。核酸提取裂解液中通常包含异丙醇和异硫氰酸胍(3mol/L)等成分，野生型蛋白酶K在此环境中虽然具有一定的活性，但是只能维持较短的时间，一般不超过5min，这一缺点给核酸提取过程带来了不稳定的因素，影响了核酸提取的效率。世界各国对用于分子诊断的蛋白酶K需求越来越大，野生型蛋白酶K因为在核酸提取裂解液中不能维持长时间的活性影响了核酸提取过程的稳定性。所以急需筛选出对核酸提取裂解液抗性大幅提高的蛋白酶K。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的现状及存在的不足，提供一种对核酸提取裂解液中异硫氰酸胍耐受时间延长的蛋白酶K突变体及其应用。本发明通过理性设计的方法对野生型蛋白酶K进行定向改造，将蛋白酶K的四个氨基酸位点进行组合定向突变。通过定向突变提高了蛋白酶K对核酸提取试剂盒的核酸提取裂解液的耐受能力。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案施行：
第一方面，本发明提供一种对核酸提取裂解液中异硫氰酸胍耐受时间延长的蛋白酶K突变体，所述蛋白酶K突变体选自如下任一种：
(a)其氨基酸序列由SEQ ID NO.1所示序列突变而来，选自下组的至少两个氨基酸残基位点发生突变：将第151位的酪氨酸突变为丙氨酸，第208位的赖氨酸突变为组氨酸，第273的丝氨酸突变为苏氨酸，第293位的甘氨酸突变为丙氨酸；
或，
(b)所述蛋白酶K突变体与(a)所述的氨基酸序列具有95％，优选98％，更优选99％的序列相同性，并且具有(a)所述蛋白酶K的功能，其中对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的Y151，K208，S273，G293位氨基残基与(a)所述的氨基酸序列中的相同；
或，
(c)所述蛋白酶K突变体由在(a)所述的氨基酸序列的C末端和/或N末端添加或缺失1-30个，更优选1-10个，还要优选1-6个，最优选1-3个氨基酸残基而形成，并且具有(a)所述蛋白酶K突变体的功能，其中对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的Y151，K208，S273，G293位与(a)所述的氨基酸序列中的相同。
根据本发明的实施方案，所述突变体的氨基酸序列包含如下位点的突变：对应于SEQ ID NO.1的包含151位、208位、2730位或293位中任意两个位点的氨基酸残基的突变。
在一个实施方案中，所述突变体的氨基酸序列为如下1)-5)中任一种：
1)对应于SEQ ID NO.1的第151位的酪氨酸突变为丙氨酸和第208位的赖氨酸突变为组氨酸；
2)对应于SEQ ID NO.1的第151位的酪氨酸突变为丙氨酸和第273的丝氨酸突变为苏氨酸；
3)对应于SEQ ID NO.1的第151位的酪氨酸突变为丙氨酸和第293位的甘氨酸突变为丙氨酸；
4)对应于SEQ ID NO.1的第208位的赖氨酸突变为组氨酸和第273的丝氨酸突变为苏氨酸；
5)对应于SEQ ID NO.1的第273的丝氨酸突变为苏氨酸和第293位的甘氨酸突变为丙氨酸；
上述5种突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3-7任一种所示。
根据本发明的实施方案，所述突变体的氨基酸序列包含151位、208位、2730位或293位中任意三个位点的氨基酸残基的突变。
在一个实施方案中，所述突变体的氨基酸序列为如下1)-4)中任一种：
1)对应于SEQ ID NO.1的第151位的酪氨酸突变为丙氨酸、第208位的赖氨酸突变为组氨酸和第273的丝氨酸突变为苏氨酸；
2)对应于SEQ ID NO.1的第151位的酪氨酸突变为丙氨酸、第208位的赖氨酸突变为组氨酸和第293位的甘氨酸突变为丙氨酸；
3)对应于SEQ ID NO.1的第151位的酪氨酸突变为丙氨酸、第273的丝氨酸突变为苏氨酸和第293位的甘氨酸突变为丙氨酸；
4)对应于SEQ ID NO.1的第208位的赖氨酸突变为组氨酸、第273的丝氨酸突变为苏氨酸和第293位的甘氨酸突变为丙氨酸；
上述4种突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.8-11任一种所示。
在优选的实施方式中，所述蛋白酶K突变体是在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的基础上，将第151位的酪氨酸突变为丙氨酸，第208位的赖氨酸突变为组氨酸，第273的丝氨酸突变为苏氨酸，第293位的甘氨酸突变为丙氨酸，所述蛋白酶K突变体的氨基酸序列如SEQID NO:12所示。
第二方面，本发明提供编码第一方面所述蛋白酶K突变体的多核苷酸，所述多核苷酸的核苷酸序列可以根据表达系统对密码子的偏好性进行优化。
在优选的实施方式中，所述氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示蛋白酶K突变体的多核苷酸具有如SEQ ID NO.27所示的核苷酸序列。
第三方面，本发明提供一种表达载体，所述载体含有第二方面所述的多核苷酸；较佳地，所述表达载体可选：毕赤酵母表达载体pPinkα-HC，pPIC9K，pPICZα-C；进一步优选地，所述表达载体为pPinkα-HC。
第四方面，本发明提供一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞含有第三方面所述的载体，或基因组中整合有第二方面所述的的多核苷酸；较佳地，所述的宿主细胞包括原核细胞或真核细胞；较佳地，所述真核细胞包括酵母细胞、霉菌细胞、昆虫细胞、植物细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞；较佳地，所述的原核细胞包括大肠杆菌细胞、枯草杆菌细胞；进一步优选地，所述酵母细胞为毕赤酵母pPINK。
第五方面，本发明提供一种产生第一方面所述蛋白酶K突变体的方法，将第四方面所述的遗传工程化的宿主细胞在适宜的条件下繁殖并使其表达第二方面所述的编码蛋白酶K突变体的多核苷酸，然后从宿主细胞培养物中分离得到蛋白酶K突变体。
第六方面，本发明提供一种提高蛋白酶K在核酸提取裂解液中酶活性保持时间的方法，所述方法是将林伯氏白色念球菌来源的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白酶K进行选自下组的至少两个氨基酸残基位点的突变：第151位的酪氨酸突变为丙氨酸，第208位的赖氨酸突变为组氨酸，第273的丝氨酸突变为苏氨酸，第293位的甘氨酸突变为丙氨酸。
第七方面，本发明提供包含第一方面所述的蛋白酶K突变体的组合物，所述组合物中含有酶的保护剂或用于延迟酶分解的物质；优选地，所述组合物的成分，除水外，还包括下列组分：Tris 30mmol/L，Ca2+10mmol/L-50mmol/L，甘油5v％，使用HCl调节pH至7.5-8.4。
第八方面，本发明提供第一方面所述的蛋白酶K突变体、第四方面所述的遗传工程化的宿主细胞或第七方面所述的组合物的用途，用于酶解蛋白质；较佳地，其被用于分解与疏水氨基酸、含硫氨基酸、芳香族氨基酸C末端邻接的酯键或者肽键，酶解蛋白质。
第九方面，本发明提供一种酶解蛋白质的方法，包括：利用第一方面所述的蛋白酶K突变体、第四方面所述的表达该突变体的遗传工程化的宿主细胞或其裂解产物或第七方面所述的组合物进行酶解反应。
第十方面，本发明提供一种用于酶解蛋白质的检测体系或检测试剂盒，其中含有：第一方面所述的蛋白酶K突变体，第四方面所述的表达该突变体的遗传工程化的宿主细胞或其裂解产物。
本发明的有益效果：
本发明提供的蛋白酶K突变体相比野生型蛋白酶K更加耐受高浓度的异硫氰酸胍(如3mol/L)，在25℃下，核酸提取裂解液处理后30分钟时残余活力不受影响；处理60分钟时仍然能保持80％以上残余活力，而此时野生型蛋白酶K残余活力仅为28％。
附图说明
图1.毕赤酵母表达载体pPinkα-HC的质粒图谱；
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
定义与说明：
如本文所用，除非另外说明，所述的“蛋白酶K的突变体”、“突变型蛋白酶K”可互换使用，是指对应于野生型蛋白酶K(如SEQ ID NO:1)，发生选自以下位置的一个或多个突变后所构成的蛋白：第151位的酪氨酸突变为丙氨酸，第208位的赖氨酸突变为组氨酸，第273的丝氨酸突变为苏氨酸，第293位的甘氨酸突变为丙氨酸。
如本文所用，若需要表示野生型的蛋白酶K，其将被标示为“野生型蛋白酶K”、SEQID NO:1所示氨基酸序列的蛋白或WT。
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和蛋白是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或蛋白如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
如本文所用，“分离的蛋白酶K突变体”是指蛋白酶K突变体基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化蛋白酶K突变体。基本上纯的蛋白在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。
如本文所用，“重组的(Recombinant；R)”是指借助基因工程手段来获得(或大量制备)的蛋白、基因工程载体或细胞等。
如本文所用，“对核酸提取裂解液中异硫氰酸胍耐受时间延长”是指与改造前的野生型蛋白酶K相比，发生突变的蛋白酶K的对核酸提取裂解液中异硫氰酸胍耐受时间发生统计学意义的延长，或称为显著性的延长。例如，在同一种反应条件/环境下，突变型蛋白酶K在核酸提取裂解液处理后30分钟时残余活力不受影响；处理60分钟时仍然能保持80％以上残余活力，而此时野生型蛋白酶K残余活力仅为28％。
如本文所用，术语“含有”或“包括”包括了“包含”、“基本上由……构成”、和“由……构成”。术语“基本上由……构成”指在组合物/反应体系/试剂盒中，除了含有必要成分或必要组份之外，还可含有少量的且不影响有效成分的次要成分和/或杂质。
蛋白酶K突变体、其编码核酸及构建体
本发明的蛋白酶K突变体可以是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。
本发明还包括所述蛋白酶K突变体的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然蛋白酶K突变体相同的生物学功能或活性的蛋白。本发明的蛋白片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的蛋白，或(iii)附加的氨基酸序列融合到此蛋白序列而形成的蛋白(如前导序列或分泌序列或用来纯化此蛋白的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。然而，需要满足的条件是：所述的蛋白酶K突变体及其片段、衍生物和类似物的氨基酸序列中，必然存在本发明上面所特别指出的突变，较佳地，该突变为对应于野生型蛋白酶K(如SEQ ID NO:1)，发生选自以下位置的突变后所构成的蛋白：第151位的酪氨酸突变为丙氨酸，第208位的赖氨酸突变为组氨酸，第273的丝氨酸突变为苏氨酸，第293位的甘氨酸突变为丙氨酸。
在本发明中，术语“蛋白酶K突变体”还包括(但并不限于)：若干个(通常为1～20个，更佳地1～10个，还更佳如1～8个、1～5个、1～3个、或1～2个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用`也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括蛋白酶K突变体的活性片段和活性衍生物。但是在这些变异形式中，肯定存在本发明上面所述的突变，较佳地，该突变为对应于野生型蛋白酶K(如SEQ IDNO:1)，发生选自以下位置的突变后所构成的蛋白：第151位的酪氨酸突变为丙氨酸，第208位的赖氨酸突变为组氨酸，第273的丝氨酸突变为苏氨酸，第293位的甘氨酸突变为丙氨酸。
在本发明中，术语“蛋白酶K突变体”还包括(但并不限于)：与所述的蛋白酶K突变体的氨基酸序列具有80％以上，较佳地85％以上，更佳地90％以上，进一步更佳地95％以上，如98％以上、99％以上序列相同性的保留其蛋白活性的衍生的蛋白。同样地，这些衍生的蛋白中，肯定存在本发明上面所述的突变，较佳地，该突变为对应于野生型蛋白酶K(如SEQ ID NO:1)，发生选自以下位置的一个或多个突变后所构成的蛋白：第151位的酪氨酸突变为丙氨酸，第208位的赖氨酸突变为组氨酸，第273的丝氨酸突变为苏氨酸，第293位的甘氨酸突变为丙氨酸。
本发明还提供所述蛋白酶K突变体的类似物。这些类似物与所述蛋白酶K突变体的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
本发明还提供了编码本发明蛋白酶K突变体或其保守性变异蛋白的多核苷酸序列。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
编码所述突变体的成熟蛋白的多核苷酸包括：只编码成熟蛋白的编码序列；成熟蛋白的编码序列和各种附加编码序列；成熟蛋白的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
“编码蛋白的多核苷酸”可以是包括编码此蛋白的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或蛋白酶K突变体编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述突变的酶的方法。
通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列来表达或生产重组的蛋白酶K突变体。一般来说有以下步骤：
(1)用本发明的编码蛋白酶K突变体的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
(2)在合适的培养基中培养的宿主细胞；
(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，蛋白酶K突变体多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含蛋白酶K突变体编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
本发明中，所述的宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如霉菌细胞，酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌、枯草杆菌、链霉菌、农杆菌；真核细胞如酵母、植物细胞等。在本发明的具体实施例中，以酵母细胞作为宿主细胞。
本领域一般技术人员清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
本发明中，可以将多个拷贝的蛋白酶K突变体的多核苷酸插入宿主细胞中以增加蛋白酶K突变体的产生。或将多核苷酸序列整合到宿主细胞基因组中的多拷贝位点以增加的拷贝数目。
突变体的重组表达
本发明建立的重组细胞(宿主细胞)可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在表达时，本发明的蛋白酶K突变体可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声处理、高速离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本发明的重组表达蛋白酶K突变体的方法，解决了现有技术中野生型蛋白酶K在包含异丙醇和异硫氰酸胍等成分的核酸提取裂解液中活性只能维持较短的时间，一般不超过5min的问题，这一缺点给核酸提取过程带来了不稳定的因素，影响了核酸提取的效率。世界各国对用于分子诊断的蛋白酶K需求越来越大，野生型蛋白酶K因为在核酸提取裂解液中不能维持长时间的活性影响了核酸提取过程的稳定性。
重组蛋白酶K的应用
本发明的改造的蛋白酶K突变体有多方面的与蛋白酶K特性相关的用途，包括但不限于：特异性识别和切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键，酶解蛋白质或者变性蛋白质。
作为一种实施方式，所述的蛋白酶K突变体可应用于基因组DNA抽提、酶的消化去除。
作为一种实施方式，所述的蛋白酶K突变体可应用于制备脉冲电泳的染色体DNA，蛋白质印迹以及去除DNA和RNA制备中的核酸酶等
作为一种实施方式，所述的蛋白酶K突变体在原位杂交技术中可用于杂交前的处理，它具有消化包围靶DNA蛋白质的作用，以增加探针与靶核酸结合的机会，提高杂交信号。
作为一些工业方面的实施方式，所述的蛋白酶K突变体可应用在皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面。皮革工业的脱毛和软化已大量利用蛋白酶，具有省时便捷的特点。蛋白酶还可用于蚕丝脱胶、肉类嫩化、酒类澄清。临床上可作药用，如用胃蛋白酶治疗消化不良，用酸性蛋白酶治疗支气管炎，用弹性蛋白酶治疗脉管炎以及用蛋白酶K、胰凝乳蛋白酶对外科化脓性创口的净化及胸腔间浆膜粘连的治疗。加酶洗衣粉是洗涤剂中的新产品，含碱性蛋白酶，能去除衣物上的血渍和蛋白污物。
本发明提供的蛋白酶K突变体相比野生型蛋白酶K更加耐受高浓度的异硫氰酸胍，在核酸提取裂解液中能维持长时间的活性从而提高了核酸提取过程的稳定性。
除非另外定义或由背景清楚指示，否则在本公开中的全部技术与科学术语具有如本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
实施例1：蛋白酶K突变体的重组发酵和纯化
本发明以蛋白酶K的晶体结构作为基础，通过理性设计的方法对野生型蛋白酶K进行定向改造，将氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的野生型蛋白酶K的四个氨基酸位点进行随机组合方式的定向突变。其中，具体的突变位点包括：第151位的酪氨酸突变为丙氨酸，第208位的赖氨酸突变为组氨酸，第273的丝氨酸突变为苏氨酸，第293位的甘氨酸突变为丙氨酸。并分别将第151位的酪氨酸突变为丙氨酸定义为A型突变，第208位的赖氨酸突变为组氨酸定义为B型突变，第273的丝氨酸突变为苏氨酸定义为C型突变，第293位的甘氨酸突变为丙氨酸定义为D型突变。采取了点突变随机组合的方式中(一共十五种方案，具体的突变形式详见下表1)。
表1
A B C D
1 √ ○ ○ ○
2 ○ √ ○ ○
3 ○ ○ √ ○
4 ○ ○ ○ √
5 √ √ ○ ○
6 √ ○ √ ○
7 √ ○ ○ √
8 ○ √ √ ○
9 ○ √ ○ √
10 ○ ○ √ √
11 √ √ √ ○
12 √ √ ○ √
13 √ ○ √ √
14 ○ √ √ √
15 √ √ √ √
注：“√”代表突变体包含该种类型的点突变，“○”代表未包含该种类型的点突变。
通过基因合成的方式合成蛋白酶K突变体1-15的核苷酸序列SEQ ID NO:13-27，在序列两侧添加NotI、CpoI限制性内切酶酶切位点的核苷酸序列。将毕赤酵母表达载体pPinkα-HC(图谱如图1)和蛋白酶K突变体的核苷酸同时使用NotI、CpoI酶双酶切，将酶切产物纯化回收后利用DNA连接酶进行连接。筛选得到重组表达载体。
将构建的重组毕赤酵母工程菌接种于含20mLYDPA液体培养基的试管中，于30℃培养过夜至菌浓为OD600＝5-8；然后将培养物以1：100的比例接种于含100mL YDPA液体培养基的锥形瓶中，30℃震荡培养过夜至菌液浓度为OD600＝35-40，将培养物静置3-4后，倒掉上清液后用100mL YDPA液体培养基重悬；加入0.5％(v/v)甲醇，25℃诱导表达24h-72h，每隔24h向培养基中加入0.5％(v/v)甲醇进行诱导，4℃，5000rpm，离心5min，收集离心上清。
用阳离子交换层析柱进行蛋白酶K的纯化，步骤如下：①将离心上清进行超滤浓缩蛋白浓度为5mg/mL，并且利用上样缓冲液进行置换(上样缓冲液：10mM NaAc、25mM NaCl、pH5.0)；②将阳离子交换层析柱用上样缓冲液进行平衡：③按2ml/min的流速进行蛋白上样，并收集洗脱液；④用洗杂液一(10mM NaAC、25mM NaCl、pH5.0)进行洗杂，洗10个柱体积并且收集洗脱液；⑤用洗杂液二(10mM NaAC、50mM NaCl、pH5.0)进行洗杂，洗10个柱体积并且收集洗杂液；⑥用洗脱液(10mM NaAC、100mM NaCl、pH5.0)进行洗脱，洗脱5个柱体积，并收集洗脱液，得到纯化后的酶；⑦用洗柱液(10mM NaAC、500mM NaCl、pH5.0)冲洗，冲洗10个柱体积；⑧10倍柱体积的超纯水进行冲洗层析柱；⑨20％的乙醇保存阳离子交换层析柱。
实施例2：野生型蛋白酶K(PK)的重组发酵和纯化
野生型的蛋白酶K(PK)的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:1)：
APAVEQRSEAAPLIEARGEMVANKYIVKFKEGSALSALDAAMEKISGKPDHVYKNVFSGFAATLDENMVRVLRAHPDVEYIEQDAVVTINAAQTNAPWGLARISSTSPGTSTYYYDESAGQGSCVYVIDTGIEASHPEFEGRAQMVKTYYYSSRDGNGHGTHCAGTVGSRTYGVAKKTQLFGVKVLDDNGSGQYSTIIAGMDFVASDKNNRNCPKGVVASLSLGGGYSSSVNSAAARLQSSGVMVAVAAGNNNADARNYSPASEPSVCTVGASDRYDRRSSFSNYGSVLDIFGPGTSILSTWIGGSTRSISGTSMATPHVAGLAAYLMTLGKTTAASACRYIADTANKGDLSNIPFGTVNLLAYNNYQALE
上述野生型的蛋白酶K(PK)的编码序列如下(SEQ ID NO:2)：
gccccggccgtggaacagcgctcagaagcagccccgctgattgaagcacgcggcgaaatggttgccaacaagtatattgttaagttcaaagaaggttctgccctgagcgccttagatgcagcgatggaaaaaatttcaggtaaaccggatcatgtgtacaaaaatgtgtttagcggctttgcagccaccttagatgaaaatatggttcgcgtgctgcgcgcacatccggatgtggaatatattgaacaggatgcagttgtgaccattaatgcagcccagaccaatgccccgtggggcttagcacgcatttcttctacctctccgggcacatcaacctattattatgatgaatctgccggtcagggctcttgtgtgtatgtgattgataccggcattgaagcatcacatccggaatttgaaggtcgcgcccagatggttaaaacctattattatagttctcgcgatggcaatggtcatggcacccattgtgcaggcaccgtgggctctcgtacctatggcgttgccaaaaagactcagctgtttggcgttaaagtgctggatgataatggtagcggtcagtattcaaccattattgccggtatggattttgttgcctcagataaaaacaaccgtaattgtccgaaaggcgttgttgcatcactgtcactgggcggcggttatagttcttcagtgaatagtgcagccgcacgcttacagtctagcggtgttatggtggccgtggccgcaggtaataacaatgccgatgcacgtaattatagtccggcaagcgaaccgagtgtttgtaccgtgggtgcaagtgatcgctatgatcgtcgtagtagcttttcaaattatggttcagttttagatatttttggtccggggacgtcaattctgtctacctggattggtggctctacccgtagcatttcagggactagtatggccaccccgcatgttgcaggcttagcagcctatctgatgaccctgggcaaaaccaccgccgcaagcgcctgtcgctatattgccgataccgccaacaaaggcgatctgagcaatattccgtttggcaccgtgaatctgctggcctataataactatcaggccctcgag
其重组发酵和纯化的方法同实施例1。
实施例3：野生型蛋白酶K和蛋白酶K突变体1-15对高浓度的异硫氰酸胍耐受性比较
首先，蛋白酶K残余活力快速检测方法：
1.检测原理：蛋白酶K是由林伯氏白色念球菌(Tritirachium album Limber)分泌的一种重要的丝氨酸蛋白酶，它切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键，对天然蛋白质有较强的降解能力。常使用福林-酚法测定蛋白酶K的活力，但此法操作复杂，反应时间过长，不适用于大规模筛选。故选用如下方法进行定性测定：以Suc-(Ala)2-Pro-Phe-pNA为底物，在一定温度和pH条件下反应，用冰醋酸终止反应，405nm测吸光值，确定酶解反应释放的黄色硝基苯胺的量，从而检测酶活性。
2.适用范围：本方法为定性测活方法，仅用于比较蛋白在裂解液处理后残留活力的高低。一般用于筛选高耐受性的转化子，或判断不同来源蛋白的耐受能力。
3.主要试剂：
a)底物溶液：准确称取5mg Suc-(Ala)2-Pro-Phe-pNA(Sigma)溶于200μLDMSO中，现配现用；
b)酶稀释液：20mM Tris-HCl，2mM CaCl2，过滤除菌，常温放置；
4.样品测定：吸取200μL酶稀释液和7μL底物溶液于酶标板中，25℃平衡5min，混匀后加入10μL酶液样品，继续反应10min后，加入冰醋酸终止反应，混匀后测定405nm处的吸光值；
5.结果分析：残余活力(％)＝Δ处理后/Δ处理前×100％
Δ处理后：处理后样品测定吸光度-空白吸光度
Δ处理前：处理前样品测定吸光度-空白吸光度
接着按照上述方法测试野生型蛋白酶K和蛋白酶K突变体在不同浓度异硫氰酸胍的处理下的残余活力进行比较，具体的处理方法如下：
分别取1.5mg/mL蛋白液9μL，于300μL不同浓度的异硫氰酸胍溶液中25℃处理5min，再按上述方法进行酶活性检测，计算残余活力。
表2.蛋白酶K突变体1-15在浓度的异硫氰酸胍处理后残余活力测定
Figure SMS_1
结果如上表2所示，在浓度为3mol/L的异硫氰酸胍溶液中，野生型蛋白酶K基本上丧失了残余活力,突变体1-4、突变体9以及突变体13也基本丧失了残余活力，而突变体5-8、突变体10-12以及突变体14-15的残余活力大于40％。
实施例4.：野生型蛋白酶K和蛋白酶K突变体1-15对含高浓度的异硫氰酸胍的核酸提取裂解液抗性比较
分别取1.5mg/mL蛋白液9μL，于300μL异硫氰酸胍浓度为3mol/L的核酸提取裂解液中处理，在不同处理时间点分别按上述方法进行酶活性检测，计算残余活力。
表3.蛋白酶K突变体1-15在裂解液处理不同时间后残余活力测定
Figure SMS_2
结果如上表所示，在25℃下，核酸提取裂解液处理后60分钟时野生型蛋白酶K残余活力仅为28％，突变体1-4以及突变体9蛋白酶K残余活力在0％～30之间，而突变体5-8以及突变体10-15在裂解液处理60分钟时仍然能保持50％以上残余活力。
实施例5：野生型蛋白酶K和蛋白酶K突变体活性比较
1.检测原理：蛋白酶K是由林伯氏白色念球菌(Tritirachium album Limber)分泌的一种重要的丝氨酸蛋白酶，它切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键，对天然蛋白质有较强的降解能力。水解血红蛋白产生含有酚基的氨基酸，在碱性条件下可使福林试剂还原，生成钼蓝与钨蓝，其颜色的深浅与酚基氨基酸的含量成正比，通过检测750nm的吸光度，可以计算蛋白酶K的活力。
2.酶活力单位：在37℃以血红蛋白为底物，1分钟内可以产生相当于1μM Folin阳性的氨基酸或多肽的蛋白酶K的量，定义为一个单位蛋白酶K酶活力。
3.主要试剂：
a)福林酚显色液(1M)：购自上海生工；
b)5％ TCA溶液：准确称取4.9g TCA，加入100mL纯水溶解；
c)2％血红蛋白溶液：准确称取2g血红蛋白(Diamond A002402-0005)加入40ml纯水，37℃搅拌30min；加入8ml 1M NaOH溶液，37℃搅拌20min；加入36g尿素，37℃搅拌1h；加入10ml 1M Tris-HCl缓冲液，并用盐酸调节pH值至7.5，0.22μm过滤。-20℃保存，有效期为3个月；4℃保存，有效期为30天。
d)酪氨酸标准液(1.1mM):准确称取0.01812g酪氨酸，加入100ml 0.2M HCl溶解；
e)酶稀释液：对1M Tris-HCl母液和100mM CaCl2母液进行稀释，配制成20mMTris-HCl，2mM CaCl2的酶稀释液，过滤，常温放置。
4.样品测定：
a)纯化得到的蛋白酶液根据蛋白浓度稀释至1mg/mL后再稀释200倍测活；
b)吸取50μL 2％血红蛋白溶液于1.5mL离心管中，37℃平衡10min，混匀后加入10μL稀释好的酶液，继续反应37℃10min后，加入100μL 5％ TCA终止反应；
c)同时做样品空白管，加TCA终止后补加酶稀释液；
d)混匀后室温放置20min，12000rpm离心5min；
e)取60μl上一步离心后的上清，加入120μL 0.5M NaOH，混匀后加入36μL的福林酚显色液，混匀后室温放置30min，测定750nm吸光值变化。
5.活力计算：
酶活(U/mg)＝267×(Δ750nm×0.0256-0.00003)/(10×c)
c:稀释后蛋白浓度
6.取实施例1和2纯化获得的突变体1-15和野生型蛋白酶K样品按照此方法测试酶活，测试结果如下：
表4
Figure SMS_3
Figure SMS_4
结果如上表4所示，本发明中突变体与野生型蛋白酶K酶活性相当，偏差在5％以内；
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种对核酸提取裂解液中异硫氰酸胍耐受时间延长的蛋白酶K突变体，其特征在于，所述蛋白酶K突变体选自如下任一种：
(a)其氨基酸序列由SEQ ID NO.1所示序列突变而来，选自下组的至少两个氨基酸残基位点发生突变：将第151位的酪氨酸突变为丙氨酸，第208位的赖氨酸突变为组氨酸，第273的丝氨酸突变为苏氨酸，第293位的甘氨酸突变为丙氨酸；
或，
(b)所述蛋白酶K突变体与(a)所述的氨基酸序列具有95％，优选98％，更优选99％的序列相同性，并且具有(a)所述蛋白酶K的功能，其中对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的Y151，K208，S273，G293位氨基残基与(a)所述的氨基酸序列中的相同；
或，
(c)所述蛋白酶K突变体由在(a)所述的氨基酸序列的C末端和/或N末端添加或缺失1-30个，更优选1-10个，还要优选1-6个，最优选1-3个氨基酸残基而形成，并且具有(a)所述蛋白酶K突变体的功能，其中对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的Y151，K208，S273，G293位与(a)所述的氨基酸序列中的相同；
优选地，所述突变体的氨基酸序列包含如下位点的突变：对应于SEQ ID NO.1的包含151位、208位、2730位或293位中任意两个位点的氨基酸残基的突变；
进一步优选地，所述突变体的氨基酸序列包含如下1)-5)中任一种突变位点组合：
1)对应于SEQ ID NO.1的第151位的酪氨酸突变为丙氨酸和第208位的赖氨酸突变为组氨酸；
2)对应于SEQ ID NO.1的第151位的酪氨酸突变为丙氨酸和第273的丝氨酸突变为苏氨酸；
3)对应于SEQ ID NO.1的第151位的酪氨酸突变为丙氨酸和第293位的甘氨酸突变为丙氨酸；
4)对应于SEQ ID NO.1的第208位的赖氨酸突变为组氨酸和第273的丝氨酸突变为苏氨酸；
5)对应于SEQ ID NO.1的第273的丝氨酸突变为苏氨酸和第293位的甘氨酸突变为丙氨酸；
上述5种突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3-7任一种所示；
优选地，所述突变体的氨基酸序列包含如下位点的突变：对应于SEQ ID NO.1的包含151位、208位、2730位或293位中任意三个位点的氨基酸残基的突变。
进一步优选地，所述突变体的氨基酸序列包含如下1)-4)中任一种突变位点组合：
1)对应于SEQ ID NO.1的第151位的酪氨酸突变为丙氨酸、第208位的赖氨酸突变为组氨酸和第273的丝氨酸突变为苏氨酸；
2)对应于SEQ ID NO.1的第151位的酪氨酸突变为丙氨酸、第208位的赖氨酸突变为组氨酸和第293位的甘氨酸突变为丙氨酸；
3)对应于SEQ ID NO.1的第151位的酪氨酸突变为丙氨酸、第273的丝氨酸突变为苏氨酸和第293位的甘氨酸突变为丙氨酸；
4)对应于SEQ ID NO.1的第208位的赖氨酸突变为组氨酸、第273的丝氨酸突变为苏氨酸和第293位的甘氨酸突变为丙氨酸；
上述4种突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.8-11任一种所示；
优选地，所述蛋白酶K突变体是在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的基础上，将第151位的酪氨酸突变为丙氨酸，第208位的赖氨酸突变为组氨酸，第273的丝氨酸突变为苏氨酸，第293位的甘氨酸突变为丙氨酸，所述蛋白酶K突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示。
2.编码权利要求1所述蛋白酶K突变体的多核苷酸，所述多核苷酸的核苷酸序列可以根据表达系统对密码子的偏好性进行优化；
优选地，所述多核苷酸具有如SEQ ID NO.17-20、22-27所示的核苷酸序列。
3.一种表达载体，其特征在于，所述载体含有权利要求2所述的多核苷酸；较佳地，所述表达载体可选：毕赤酵母表达载体pPinkα-HC，pPIC9K，pPICZα-C；进一步优选地，所述表达载体为pPinkα-HC。
4.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求3所述的载体，或基因组中整合有权利要求2所述的多核苷酸；较佳地，所述的宿主细胞包括原核细胞或真核细胞；较佳地，所述真核细胞包括酵母细胞、霉菌细胞、昆虫细胞、植物细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞；较佳地，所述的原核细胞包括大肠杆菌细胞、枯草杆菌细胞；进一步优选地，所述酵母细胞为毕赤酵母pPINK。
5.一种产生权利要求1所述蛋白酶K突变体的方法，其特征在于，将权利要求4所述的遗传工程化的宿主细胞在适宜的条件下繁殖并使其表达权利要求2所述的编码蛋白酶K突变体的多核苷酸，然后从宿主细胞培养物中分离得到蛋白酶K突变体。
6.一种提高蛋白酶K在核酸提取裂解液中酶活性保持时间的方法，其特征在于，所述方法是将林伯氏白色念球菌来源的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白酶K的第151位的酪氨酸突变为丙氨酸，第208位的赖氨酸突变为组氨酸，第273的丝氨酸突变为苏氨酸，第293位的甘氨酸突变为丙氨酸。
7.包含权利要求1所述的蛋白酶K突变体的组合物，其特征在于，所述组合物中含有酶的保护剂或用于延迟酶分解的物质；优选地，所述组合物的成分，除水外，还包括下列组分：Tris 30mmol/L，Ca2+10mmol/L-50mmol/L，甘油5v％，使用HCl调节pH至7.5-8.4。
8.权利要求1所述的蛋白酶K突变体、权利要求4所述的遗传工程化的宿主细胞或权利要求7所述的组合物的用途，用于酶解蛋白质；较佳地，其被用于分解与疏水氨基酸、含硫氨基酸、芳香族氨基酸C末端邻接的酯键或者肽键，酶解蛋白质。
9.一种酶解蛋白质的方法，其特征在于，所述方法包括：利用权利要求1所述的蛋白酶K突变体、权利要求4所述的表达该突变体的遗传工程化的宿主细胞或其裂解产物或权利要求7所述的组合物进行酶解反应。
10.一种用于酶解蛋白质的检测体系或检测试剂盒，其中含有：权利要求1所述的蛋白酶K突变体，权利要求4所述的表达该突变体的遗传工程化的宿主细胞或其裂解产物。
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