CN117586415A - 一种重组Ulp1融合蛋白酶及其制备方法 - Google Patents

一种重组Ulp1融合蛋白酶及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种重组Ulp1融合蛋白酶及其制备方法。具体地，本发明提供了一种重组Ulp1融合蛋白酶，所述融合蛋白酶具有式I所示的结构：(Z1)n‑L1‑Ulp1‑L2‑(Z1)m。本发明应用大肠杆菌表达系统，通过设计表达载体，实现了重组Ulp1融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达。与原始Ulp1蛋白酶相比，本发明所述的重组Ulp1融合蛋白酶具有更好的溶解性和更低的等电点，使得下游分离和纯化工艺更加简单有效，提高了Ulp1的酶活性稳定性和生产工艺收率。酶活性分析结果证明重组表达的S13‑Ulp1或Ulp1‑S13融合蛋白酶具有比原始Ulp1酶更高的催化活性。本发明提供的制备工艺为工业化高效生产Ulp1酶奠定了基础。

Description

一种重组Ulp1融合蛋白酶及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医药研究开发领域，具体涉及一种重组Ulp1融合蛋白酶及其制备方法。
背景技术
融合表达技术是制备重组多肽和蛋白的常用技术，引入标签蛋白进行融合表达可以起到防止目的蛋白或多肽被降解、屏蔽外源蛋白对宿主的毒性作用、提高表达产量和促进目的蛋白正确折叠等重要作用。在生产工艺中，标签蛋白可被与之匹配的工具蛋白酶移除，以获得目的蛋白或多肽。
在常用的标签蛋白中，SUMO标签-Ulp1酶系统由于具有独特的优势，被越来越多地用于融合蛋白的重组表达(Malakhov Michael P,et al.Journal of structural andfunctional genomics,5(1-2),pp.75-86(2004))。SUMO蛋白本身具有良好的溶解性，可显著促进目的蛋白以可溶形式表达，简化下游提取纯化工艺。相比于谷胱甘肽转移酶、硫氧还蛋白、绿色荧光蛋白、麦芽糖结合蛋白等融合标签，SUMO蛋白的分子量较小，在融合蛋白中占比小，可提高目的蛋白相比比率，有利于提升生产效率(Panavas Tadas,SandersCarsten and Butt Tauseef R.Methods in molecular biology(Clifton,N.J.)497(2009):303-17)。
更重要的是，移除SUMO标签所用的工具酶Ulp1识别的是SUMO蛋白的三维结构，而非一般蛋白酶所识别的部分肽段一级序列。因此，Ulp1酶具有极高的特异性。其次，Ulp1酶的酶切位点位于SUMO标签蛋白的C末端Gly的羧基侧，融合蛋白经过Ulp1切割后，靶蛋白的N端不含任何多余的氨基酸残基，尤其适用于医药蛋白的研发(Tauseef R.Butt,etal.Protein Expression and Purification 43.1(2005):1-9)。再次，Ulp1酶在较宽泛的温度(4～37℃)和pH(5.5～ 10.5)范围内都具有高效的酶切活性，且对蛋白质纯化中常用的咪唑、尿素、盐酸胍等不敏感，可在更加宽泛的工艺条件下进行酶切，简化纯化过程。
全长Ulp1酶由621个残基组成，其催化结构域位于C端218AA，即 Ulp1(404-621)(缪语,et al.上海交通大学学报(医学版)v.34, No.252.11(2014):1683-1687)。目前文献报道的及商业化的Ulp1蛋白酶几乎均为通过大肠杆菌重组表达的Ulp1(404-621)蛋白，表达产量介于20～355mg/L发酵液之间(陈兴华,et al.中国生物工程杂志,No.179.03(2007):34-41；李诗洁,et al.中国生物工程杂志v.38,No.312.03(2018):51-61；冯秀萍,et al.中国生物工程杂志v.29,No.203.02(2009):81-86)。
但重组Ulp1蛋白酶的分离纯化面临诸多挑战，传统纯化手段收率较低，限制了其作为工具酶在重组蛋白和重组多肽类药物制备中的应用。已有文献报道重组Ulp1的下游纯化工艺多采用Ni柱亲和层析(陈兴华,et al.出处同上；李诗洁,et al.出处同上)。由于Ni填料价格昂贵、载样量衰减快、且存在镍离子脱落导致潜在毒性等问题，该方法通常难以实现大规模工业化生产。
protein A(蛋白A)是金黄色葡萄球菌的一种膜蛋白。S1蛋白是基于protein A蛋白B结构域的突变体。主要是把序列中的碱性氨基酸突变成其它氨基酸，达到降低等电点(pI)的目的。S1蛋白作为标签蛋白与其它蛋白融合表达时，具有助溶、提高表达量、辅助蛋白折叠、保持蛋白稳定性等特点。
因此，本领域亟需开发出一种以融合蛋白的形式表达的Ulp1蛋白酶，以实现对催化活性不产生显著影响且降低纯化难度，具有重要的应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高活力重组Ulp1融合蛋白。
本发明的另一目的是提供重组Ulp1融合蛋白的制备方法。
在本发明的第一方面，提供了一种重组Ulp1融合蛋白酶，所述融合蛋白酶具有式I所示的结构：
(Z1)n-L1-Ulp1-L2-(Z1)m(I)
其中，
Z1为单体肽元件；
n为0、1、2或3；
m为0、1、2或3；
2≤m+n≥4；
L1和L2各自独立为：无或(Z3-Z4)q；
其中，q为1或2时，Z3为无或连接肽，Z4为无或酶切位点，且Z3和 Z4不同时为无；
(Z1)n和/或(Z1)m为多聚体时，各单体肽元件之间可以有或无间隔元件 (1-5aa)；
“-”表示连接上述各元件的肽键。
在另一优选例中，所述融合蛋白酶特异性识别和切割SUMO融合标签。
在另一优选例中，所述Z1各自独立选自下组：
(a)如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；
(b)与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列≥80％同源性(较佳地≥85％，更佳地≥90％，更佳地≥95％，最佳地≥97％的同源性)且保留所述可特异性识别和切割SUMO融合标签的多肽；
(c)将SEQ ID NO:2所示氨基酸序列经过1-3个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且保留所述可特异性识别和切割SUMO融合标签的衍生多肽。
在另一优选例中，所述Ulp1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在另一优选例中，所述连接肽部分由1～50个AA构成，可包含中性或带正电荷或带负电荷的氨基酸残基。
在另一优选例中，所述Z4含有酶切位点，所述的酶切位点的氨基酸序列如SEQ IDNO:6所示。
在另一优选例中，所述融合蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
在另一优选例中，所述融合蛋白酶的等电点PI≥4且≤6，较佳地<5.5，最佳地<5。
在本发明的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明第一方面所述的融合蛋白酶。
在本发明的第三方面，提供了一种表达载体，所述表达载体包括本发明第二方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的表达载体选自下组：DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、转座子、或其组合。
在另一优选例中，所述的表达载体是pET28a。
在本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有本发明第三方面所述的载体，或染色体中整合有外源的本发明第二方面所述的多核苷酸，或表达本发明第一方面所述的融合蛋白酶。
在另一优选例中，所述的宿主细胞选自大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞或其组合。
在本发明的第五方面，提供了一种制备本发明第一方面所述的重组Ulp1 融合蛋白酶的方法，包括步骤：
(a)在适合表达的情况下，培养本发明第四方面所述的宿主细胞，从而获得重组Ulp1融合蛋白酶；
(b)从培养物中分离融合蛋白酶。
在另一优选例中，所述的分离方法包括对所述的融合蛋白酶进行机械高压匀浆。
在另一优选例中，所述的分离方法包括：在诱导剂存在的条件下，对重组 Ulp1融合蛋白酶进行高密度发酵诱导。
在另一优选例中，所述的诱导剂为IPTG。
在另一优选例中，所述的诱导剂IPTG的浓度为0.25-0.35mmol/L，较佳地0.3mmol/L。
在另一优选例中，所述的诱导温度为25-32℃，较佳地32℃。
在另一优选例中，所述的分离包括对匀浆液进行壳聚糖凝絮处理。
在另一优选例中，所述的分离还包括对所述的融合蛋白酶进行一步离子交换层析。
在另一优选例中，所述的离子交换层析为阴离子交换层析。
在本发明的第六方面，提供了一种制备目的多肽的方法，将本发明第一方面所述的融合蛋白酶对含有融合标签的重组蛋白与进行切割，从而获得经酶切的目的多肽。
在另一优选例中，所述的目的多肽的等电点PI与本发明第一方面所述的融合蛋白酶的等电点PI差值>0.5，较佳地>1.0。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例) 中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了pET28a-S13Ulp1表达质粒图。
图2显示了SUMO-ACTH蛋白经S13-Ulp1酶切后样品的HPLC分析图谱。
图3显示了大肠杆菌表达S13-Ulp1的SDS-PAGE分析结果。
图4显示了阴离子交换层析纯化S13-Ulp1蛋白的层析图谱。
图5显示了阴离子交换层析纯化前后的S13-Ulp1样品的SDS-PAGE分析。
图6显示了SUMO-ACTH蛋白经S13-Ulp1酶切后产物峰的质谱分析图谱。
图7显示了pET28a-Ulp1表达质粒图。
图8显示了大肠杆菌表达Ulp1的SDS-PAGE分析结果。
图9显示了CM柱纯化Ulp1蛋白的层析图谱。
图10显示了CM柱纯化Ulp1的SDS-PAGE分析结果。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，经过大量的筛选，意外地获得了一种高效表达、可特异性移除SUMO标签的S13-Ulp1工具酶。实验结果表明，重组 S13-Ulp1融合蛋白在大肠杆菌中高效表达。与原始的Ulp1蛋白酶相比，添加标签后的S13-Ulp1蛋白具有更好的溶解性和更低的等电点，使得下游分离纯化工艺更加简单高效，更易得到澄清的粗酶溶液，以及使用阴离子交换层析进行进一步纯化。S13-Ulp1融合蛋白可特异性地移除SUMO标签，获得结构正确的目的多肽ACTH，S13-Ulp1融合蛋白具有与Ulp1相同的识别和切割SUMO 标签的特异性和催化活性。在此基础上完成了本发明。
术语
在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。
如本文所用，术语“任选”或“任选地”意味着随后所描述的事件或情况可以发生但不是必须发生。
本发明所述的“序列同一性”表示当具有适当的替换、插入或缺失等突变的情况下最佳比对和比较时，两个核酸或两个氨基酸序列之间的同一性程度。本发明中所述的序列和其具有同一性的序列之间的序列同一性可以至少为85％、 90％或95％，优选至少为95％。非限制性实施例包括85％、86％、87％、88％、 89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％。
小泛素相关修饰蛋白(SUMO)
小泛素相关修饰蛋白(SUMO)是一种高度保守的泛素样蛋白(small ubiquitinlike protein,UBL)家族成员。
Ulp1酶
“Ulp1”即SUMO蛋白酶，是半胱氨酸蛋白酶超家族的成员之一。到目前为止，在酵母中共发现了Ulp1和Ulp2两种SUMO蛋白酶，这两种酶共有一段约200氨基酸的催化结构域，即Ulp1(403-621)，其具有完整的蛋白酶活性。
全长Ulp1酶由621个残基组成，其催化结构域位于C端218AA，即 Ulp1(404-621)(缪语,et al.上海交通大学学报(医学版)v.34； No.252.11(2014):1683-1687)。目前文献报道的及商业化的Ulp1蛋白酶几乎均为通过大肠杆菌重组表达的Ulp1(404-621)蛋白，表达产量介于20～355mg/L发酵液之间(陈兴华,et al.中国生物工程杂志,No.179.03(2007):34-41；李诗洁,et al. 中国生物工程杂志v.38；No.312.03(2018):51-61；冯秀萍,et al.中国生物工程杂志v.29；No.203.02(2009):81-86)。
融合蛋白及其制备
在本发明中，“融合蛋白”、“重组蛋白”、“本发明蛋白”、“本发明融合蛋白”可互换使用，均指本发明第一方面所述的融合蛋白。“融合蛋白”是指通过DNA 重组技术获得的将两个或多个基因重组后表达的蛋白。“截短蛋白”又称为“截短体蛋白”或“蛋白截短体”，是指通过DNA重组技术，特异性表达蛋白中一个或多个片段的蛋白。“蛋白结构域”是蛋白分子中具有相对特定的结构和相对独立的功能的区域。嵌合蛋白、融合蛋白或蛋白结构域可以使用本领域已知的任何技术来生成，包括但不限于PCR扩增和重组、降钙素原介导的寡核苷酸定向突变、限制性内切核酸酶消化或者使用寡核苷酸接头等。
如本文所用，术语“融合蛋白”还包括具有上述活性的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：1-3个(通常为1-2个，更佳地1个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为3个以内，较佳地为2个以内，更佳地为1个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的结构和功能。此外，所述术语还包括单体和多聚体形式的本发明多肽。该术语还包括线性以及非线性的多肽(如环肽)。
本发明还包括上述融合蛋白的活性片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明融合蛋白的功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或几个保守或非保守性氨基酸残基 (优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇) 融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(与前导序列、分泌序列或6His等标签序列融合而形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
一类优选的活性衍生物指与本发明的氨基酸序列相比，有至多3个，较佳地至多2个，更佳地至多1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。
表A
最初的残基 代表性的取代 优选的取代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu Glu
Cys(C) Ser Ser
Gln(Q) Asn Asn
Glu(E) Asp Asp
Gly(G) Pro；Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe Leu
Leu(L) Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Leu
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala Leu
本发明还提供本发明融合蛋白的类似物。这些类似物与本发明的多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
此外，还可以对本发明融合蛋白进行修饰。修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
术语“编码本发明融合蛋白的多核苷酸”可以是包括编码本发明融合蛋白的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或融合蛋白的片段、类似物和衍生物。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的融合蛋白的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件(或严紧条件)下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS， 60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll， 42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。
本发明的融合蛋白和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地，被纯化至均质。
本发明多核苷酸全长序列通常可以通过PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的 DNA分子(或如载体)和细胞中。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的多核苷酸。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA 末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
表达载体
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或本发明融合蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的融合蛋白。一般来说有以下步骤：
(1)用本发明的编码本发明融合蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
(2)在合适的培养基中培养的宿主细胞；
(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，编码融合蛋白的多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明融合蛋白编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、 DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母、植物细胞(如人参细胞)。
本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用 MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本发明的主要优点包括：
1)本发明应用大肠杆菌表达系统，通过设计表达载体，实现了重组 S13-Ulp1融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达，发酵单位达到2.3g/L。
2)与原始Ulp1蛋白酶相比，添加标签后的S13-Ulp1蛋白具有更好的溶解性和更低的等电点，使得下游分离纯化工艺更加简单高效，具体而言包括更易得到澄清的粗酶溶液，以及可以使用阴离子交换层析进行一步纯化，获得纯度高达95％的S13-Ulp1融合蛋白，澄清步骤和阴离子纯化步骤的总收率为64％。
3)使用带SUMO标签的融合蛋白SUMO-ACTH作为底物，对S13-Ulp1蛋白移除SUMO标签的生物活性进行验证，结果显示S13-Ulp1融合蛋白可特异性地移除SUMO标签，获得结构正确的目的多肽ACTH，该结果证明了S13-Ulp1融合蛋白具有与Ulp1相同的识别和切割SUMO标签的特异性和催化活性。
4)本发明提供的制备工艺为工业化高效生产制备Ulp1酶奠定了基础。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York: Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1融合蛋白的表达载体和基因工程菌株的构建
1.1融合蛋白S13-Ulp1的基因工程菌的构建
利用NcoⅠ和BamHⅠ酶切位点将S13-Ulp1的基因亚克隆到pET28a载体中。 S13-Ulp1的结构如表1所示。卡那霉素抗性和目的基因表达的质粒编码由T7 启动子控制。将构建的质粒pET28a-S13Ulp1转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑选克隆后得到表达N端带有S13标签的Ulp1蛋白(即S13-Ulp1)的基因工程菌株。表达载体图谱如图1所示。
1.2其他融合蛋白的基因工程菌的构建
重复1.1的步骤，基因结构如表1所示。
表1融合蛋白基因工程菌的构建
基因/蛋白编号 基因结构 分子量(kDa) 等电点(pI) Ulp1活性结构域/融合蛋白
Ulp1 His6-Ulp1 26.7 7.142 95.6％
Ub-Ulp1 Ub-Z4-Ulp1 40.9 8.997 65.4％
S13-Ulp1 S13-Z4-Ulp1 46.0 4.339 54.6％
B3-Ulp1 B3-Z4-Ulp1 45.8 5.527 54.6％
Ulp1-S13 Ulp1-Z4-S1 46.0 4.339 54.6％
A3-Ulp1 A3-Z4-Ulp1 46.2 5.581 54.6％
基因结构：
1.Ulp1：SUMO protease ULP1[Saccharomyces cerevisiae S288C](NCBI NO.:NC_001148.41.)活性结构域403-621；
2.His6：6个组氨酸聚体；
3.Ub：泛素蛋白(SEQ ID NO:5)；
4.S13:protein A(NCBI NO.:YP_498670.1)B结构域突变体S1(SEQ ID NO: 2)的3聚体；
5.B3:protein A(NCBI NO.:YP_498670.1)B结构域突变体的B3(SEQ ID NO:3)3聚体。
6.Z4：TEV蛋白酶位点ENLYFQG(SEQ ID NO:6)。
7.A3:protein A(NCBI NO.:YP_498670.1)B结构域A的3聚体(SEQ ID NO: 4)。
实施例2发酵表达
实施例中对融合蛋白Ulp1的发酵表达，包括以下步骤：
2.1种子液培养
取甘油管保藏菌种10μl加入含有30ml液体种子培养基(氯化钠10g/L、胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L；pH 7.0；卡那霉素25μg/ml)的250ml摇瓶中，于37℃，220rpm培养12h后种子液的OD600nm可达到2.0±0.3，然后按1％接种量接种于发酵罐中。
2.2高密度发酵
发酵培养基的组成为葡萄糖2g/L、甘油30g/L、酵母浸粉15g/L、硫酸铵 3g/L、十二水合磷酸氢二钠17.2g/L、磷酸二氢钾3g/L、氯化钾1g/L、氯化钠 0.5g/L、无水硫酸镁0.51g/L、无水氯化钙0.011g/L、聚醚消泡剂0.2g/L、微量元素母液(六水合氯化钴1.8g/L、四水合氯化锰24.4g/L、七水合硫酸锌20g/L、五水合硫酸铜7.5g/L、七水合硫酸亚铁67.2g/L、浓盐酸2.5g/L)0.5ml/L。接种后设置初始培养温度为32℃，转速为400rpm，pH为7.0，空气通量为8L/min，设置溶氧>40％且串级转速。培养至10-11h时发酵罐的转速达到最大且同时溶氧将下降至40％一下，调节培养温度至35℃，并调节罐压至0.04-0.05MPa。培养至11.5～13h时开始以流加方式加入补料培养基(甘油750g/L，酵母浸粉 22.5g/L，无水硫酸镁15g/L)，使溶氧维持在40％±20％。当培养至发酵液 OD600nm达到60时加入终浓度为0.3mM的IPTG诱导目的蛋白表达，同时调节培养温度至30℃。
培养至18-19h后时发酵液OD600nm可达到100-150，停止发酵培养。发酵液经固液分离(8000×g，20min)后收集菌体。
实施例3酶活性测定和计算方法
在分析和计算融合蛋白的酶活性时，按照以下描述的方法对底物 SUMO-ACTH进行酶切，然后采用HPLC对酶切溶液中的目的产物ACTH进行外标法定量，代表性的HPLC分析图谱如图2所示，目的产物ACTH的保留时间RT为12.041min。根据定量结果计算不同样品的酶活力。
将酶液样品使用缓冲液(50mmol/L磷酸二氢钠，pH8.0)稀释至100～ 500U/ml后取10μl与200μl底物(3mg/ml，pH7.1)混合均匀后于32℃下反应 30min，然后加入10％TFA溶液5μl终止反应。
酶活的定义为在上述条件下，每分钟催化生成1μg ACTH所需的酶量为1 个活性单位。
采用HPLC法测定终止液中产物ACTH的含量，具体方法如下：
色谱柱：YMC-Pack Pro C18柱(4.6×250mm，5μm，12nm)。
流动相A：0.1％TFA，0.5％(w/v)硫酸铵溶液；流动相B：乙腈。
流速：1.0ml/min，柱温：40℃，检测波长：215nm。
洗脱梯度：
取样进行HPLC分析，以外标法计算各条件酶切溶液中ACTH的浓度，计算公式如下：
式中，CA：酶切终止液中的ACTH的浓度(μg/μl)；AT：酶切溶液中产物 ACTH的峰面积；AR：ACTH对照品的峰面积；CR：ACTH对照品的浓度(μg/μl)； X：ACTH对照品的含量。
酶溶液的活性按照以下公式计算：
式中，P：酶活力浓度(U/ml)；CA：酶切溶液中的ACTH的浓度(μg/μl)；N：酶溶液的稀释倍数。
实施例4粗酶液制备
4.1高压匀浆
取湿菌体以1g：10ml的比率加入缓冲液(50mmol/L NaH2PO4 pH＝7.5)重悬均匀，然后于1200bar压力进行高压匀浆2次。匀浆液经高速离心(12000×g， 20min)后收集上清液。取样进行SDS-PAGE电泳验证，结果如图3所示，表明重组S13-Ulp1融合蛋白具有显著的表达，且其SDS-PAGE分子量与理论基本一致。SDS-PAGE结果还说明S13-Ulp1融合蛋白在大肠杆菌中几乎全部以可溶形式表达，高压匀浆破胞沉淀物中含量极低。
4.2澄清
使用壳聚糖对浑浊的匀浆液进行絮凝和澄清处理，并对澄清步骤中壳聚糖的浓度进行了优化。将不同体积的浓度为2％壳聚糖母液缓慢加入匀浆液中，室温搅拌20min后静置1h，然后离心取上清液进行酶活力和OD600分析。考察当壳聚糖的终浓度分别为0‰、1‰、2‰、2.5‰、3‰、4‰时对S13-Ulp1匀浆液的絮凝澄清效果，结果如下表所示：
表2壳聚糖对Ulp1酶匀浆液澄清的效果
壳聚糖终浓度 匀浆液pH 絮凝后pH 酶活力(U/ml) 酶活回收率(％) OD600
0％ 7.8 7.8 23232 100 0.433
0.1％ 7.8 7.3 23674 101.9 0.401
0.2％ 7.8 7.2 18741 80.7 0.252
0.25％ 7.8 7.1 18566 79.9 0.198
0.3％ 7.8 7.1 9387 40.4 0.132
0.4％ 7.8 7.0 829 3.5 0.110
从上表中可以看出，加入终浓度为0.2～0.25％的壳聚糖后溶液的浑浊度明显下降，酶活收率约为80％。当壳聚糖终浓度为0.4％时，酶活力降低了96.5％。
实施例5离子交换柱纯化
使用阴离子交换层析对实施例4获得的粗酶液进行纯化，具体条件为：
层析柱：Hitrap DEAE FF，柱体积(CV)为5ml；
缓冲液A：50mmol/L磷酸二氢钠，pH8.0；
缓冲液B：50mmol/L磷酸二氢钠，0.8mol/L氯化钠，pH8.0。
柱平衡：100％A，3CV
将经过澄清处理后S13-ULP1样品pH调节至8.0，0.2um滤膜过滤后上样至预平衡的层析柱中，以25％B柱冲洗6CV，然后进行梯度洗脱，洗脱方式为 25～100％B，10CV。
层析图谱如图4所示，收集目的蛋白S13-Ulp1洗脱峰，进行活性和 SDS-PAGE纯度分析。
结果
活性和纯度分析结果如图5所示。实验结果显示，经过一步阴离子交换纯化，S13-Ulp1蛋白的纯度可达到95％，酶活性收率为80％。
实施例6酶切产物的质谱验证
取实施例5中纯化后的S13-Ulp1蛋白，按照实施例3描述的条件对 SUMO-ACTH底物进行酶切，所得酶切溶液进行HPLC分析，并收集保留时间为12min的洗脱峰，然后进行质谱分析。
结果
质谱分析结果如图6所示。结果显示，该产物峰的单同位素([M+H]+)为 4565.32，与ACTH的理论值4567.20一致。该结果证明了SUMO-ACTH蛋白经S13-Ulp1酶切后可产生结构完整且N端无多余氨基酸残留的目的产物 ACTH，证明本方法制备的重组S13-Ulp1酶可正确识别并切割SUMO标签。
实施例7 Ulp1菌株的高密度发酵(对比实施例)
Ulp1菌株的种子液培养和发酵罐培养调控过程与实施例2基本一致。发酵结束后收集菌体，按照实施例2相同的条件进行下一步的高压匀浆处理，所得匀浆液经离心后取上清进行SDS-PAGE分析。
结果
电泳结果如图8所示，表达的Ulp1蛋白的条带位置与理论一致，Ulp1蛋白主要在大肠杆菌胞内上清中表达，但是同时也有较多蛋白存在于高压匀浆破胞沉淀中。
实施例8壳聚糖对Ulp1酶匀浆液澄清(对比实施例)
参照实施例4中描述的方法对Ulp1菌体进行重悬、高压匀浆和固液分离后，制备得到Ulp1匀浆液上清。将不同体积的浓度为2％壳聚糖母液缓慢加入匀浆液中，室温搅拌20min后静置1h，然后离心取上清液进行酶活力和 OD600nm分析。考察当壳聚糖的终浓度分别为0‰、1‰、2‰、2.5‰、3‰、4‰时对Ulp1匀浆液的絮凝澄清效果。试验结果如下表所示：
表3壳聚糖对Ulp1酶匀浆液澄清的效果
从上表中可以看出，加入终浓度为0.2～0.25％的壳聚糖后溶液的浑浊度较初始料液显著降低，但是酶活力损失较大，回收率约为54.7～65％。
以上实验结果表明与实施例4中S13-Ulp1匀浆液相比，向Ulp1匀浆液中加入相同终浓度的壳聚糖进行澄清处理后，上清中的Ulp1酶活力回收率显著下降。其原因可能是Ulp1更加容易聚集沉淀或在壳聚糖絮凝时更易被其他杂质共沉淀。带有S13融合标签的S13-Ulp1蛋白由于溶解性更好而不易发生沉淀。
实施例9 Ulp1酶的纯化(对比实施例)
按照文献报道(冯秀萍,et al.出处同上)使用更低pH缓冲液(50mmol/L PB,50mmol/L NaCl,1mmol/L EDTA,0.1mmol/L DTT,5％甘油,pH5.8)对Ulp1菌体进行重悬、高压匀浆等处理，制备得到匀浆液后仍旧是高度浑浊的。Ulp1匀浆液经高速离心后取上清，按照文献公开条件使用阳离子交换柱进行纯化，主要条件如下：
层析柱：HitrapCM FF，柱体积(CV)为5ml；
缓冲液A：20mmol/L PB，50mmol/L NaCl，5％甘油，pH5.8；
缓冲液B：20mmol/L PB，1mol/L NaCl，5％甘油，pH5.8
柱平衡：缓冲液A平衡5CV；
将高速离心后的ULP1溶液使用0.45μm膜过滤后上样至预平衡的层析柱中，然后进行梯度洗脱，洗脱方式为100％A,4CV；0～100％B,20CV；100％B, 10CV。
层析图谱如图9所示，收集目的蛋白Ulp1洗脱峰，进行活性和SDS-PAGE 纯度分析。
结果
分析结果如图10所示。结果表明，按照文献条件可进行一步CM阳离子交换纯化，Ulp1蛋白的纯度可达到90％，但是在纯化上样过程中有较多的Ulp1 酶活力流穿，纯化收率仅为18％。
实施例10融合蛋白的纯化对比
按照上述实施例1、实施例2中的方法，对Ub-Ulp1、B3-Ulp1、Ulp1-S13 进行重组表达。将Ub、B3标签于Ulp1进行融合表达，使其等电点改变。
表4融合蛋白的纯化
融合蛋白纯化结果如表4所示。不同融合蛋白对Ulp1产生的影响不一。比较发现，Ub-Ulp1表达产量极低，无法通过纯化获得较纯的目的蛋白。 S13-Ulp1等电点最低，具有最优的分离纯化效果，且分离产物纯度可达95％。 Ulp1-S13的等电点与S13-Ulp1相同，分离产物纯度为92％。
实施例11酶的比活力测定
比活力(U/mg)计算公式＝单位体积酶活力(U/ml),单位体积蛋白含量(mg/ml)
首先通过BCA蛋白定量检测试剂盒对实施例5所制备的高纯度样品进行蛋白质量测定，方法如下：
1.按照以下公式计算所需的BCA工作液总体积。BCA工作液总体积＝(标准曲线测定点数+样品数)×重复次数×每个样品所需的BCA工作液体积。
2.根据所需的BCA工作液总体积，定量取溶液A：溶液B＝50：1，混匀，制成BCA工作液。
3.取一定量的BSA标准溶液(5mg/mL)，用1X PBS(137mMNaCl,2.7 mMKCl,8mMNa2HPO4·7H2O,1.5mM KH2PO4,pH 7.4)溶液稀释为500 μg/mL。
4.取16支1.5mL离心管，设置为8个重复管号，按照下表平行操作。
表5
5.将样品用1X PBS做适当倍数的稀释备用，使浓度在25～500μg/mL范围内。
6.选取酶标板上20个孔，分为标准组和样品组。其中16个孔，每个标准品设置1个重复，各孔分别加入20μl相应浓度的标准蛋白质溶液；剩余4孔，分为2个重复组，重复孔编号相同。其中编号不同的两孔加入浓度不同的20μl 样品稀释液。
7.各酶标孔加入200μl BCA工作液，迅速混匀。在37℃水浴中保温30min，冷却至室温后，在酶标仪上测各孔的A562值。
8.以标准组各孔A562平均值为纵坐标，对应的蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。根据两个相同样品稀释液A562值的平均值，在标准曲线上计算出该样品经过稀释后的蛋白质浓度。选择合适稀释度的样品计算最终的样品蛋白浓度，再由稀释倍数计算原样品蛋白质浓度，选择稀释浓度在25～500μg/mL 范围内的样品进行蛋白浓度计算。
实施例12酶比活力比较
按照实施例12中的方法对Ulp1、S13-Ulp1、Ulp1-S13的比活力进行测定，标准曲线R2＝0.998。
表6蛋白浓度以及比活力测定结果
蛋白纯度 酶活力(U/ml) 浓度(mg/ml) 比活力(U/mg)
Ulp1 90％ 24698.461 2.111 12999.190
S13-Ulp1 95％ 38404.219 2.014 18115.198
Ulp1-S13 92％ 27359.950 1.739 17099.969
BCA测定蛋白浓度结果以及比活力结果如表6所示。在三种酶中，S13-Ulp1 的蛋白浓度最高，然后是Ulp1-S13，Ulp1最低。类似地，S13-Ulp1的比活力最高，然后是Ulp1-S13，Ulp1最低。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种重组Ulp1融合蛋白酶，其特征在于，所述融合蛋白酶具有式I所示的结构：
(Z1)n-L1-Ulp1-L2-(Z1)m(I)
其中，
Z1为单体肽元件；
n为0、1、2或3；
m为0、1、2或3；
2≤m+n≥4；
L1和L2各自独立为：无或(Z3-Z4)q；
其中，q为1或2时，Z3为无或连接肽，Z4为无或酶切位点，且Z3和Z4不同时为无；
(Z1)n和/或(Z1)m为多聚体时，各单体肽元件之间可以有或无间隔元件(1-5aa)；
“-”表示连接上述各元件的肽键。
2.如权利要求1所述的融合蛋白酶，其特征在于，所述融合蛋白酶特异性识别和切割SUMO融合标签。
3.如权利要求1所述的融合蛋白酶，其特征在于，所述Z1各自独立选自下组：
(a)如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；
(b)与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列≥80％同源性(较佳地≥85％，更佳地≥90％，更佳地≥95％，最佳地≥97％的同源性)且保留所述可特异性识别和切割SUMO融合标签的多肽；
(c)将SEQ ID NO:2所示氨基酸序列经过1-3个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且保留所述可特异性识别和切割SUMO融合标签的衍生多肽。
4.如权利要求1所述的融合蛋白酶，其特征在于，所述融合蛋白酶的氨基酸序列如SEQID NO:7所示。
5.如权利要求1所述的融合蛋白酶，其特征在于，所述融合蛋白酶的等电点PI≥4且≤6，较佳地<5.5，最佳地<5。
6.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码如权利要求1所述的融合蛋白酶。
7.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括如权利要求6所述的多核苷酸。
8.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有如权利要求7所述的载体，或染色体中整合有外源的如权利要求6所述的多核苷酸，或表达如权利要求1所述的融合蛋白酶。
9.一种制备如权利要求1所述的重组Ulp1融合蛋白酶的方法，其特征在于，包括步骤：
(a)在适合表达的情况下，培养如权利要求8所述的宿主细胞，从而获得重组Ulp1融合蛋白酶；
(b)从培养物中分离融合蛋白酶。
10.一种制备目的多肽的方法，其特征在于，将权利要求1所述的融合蛋白酶对含有融合标签的重组蛋白与进行切割，从而获得经酶切的目的多肽。
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