CN108624571B

CN108624571B - 具有催化dhap或d-g3p合成丙烯酸功能的酶及其应用

Info

Publication number: CN108624571B
Application number: CN201710174172.4A
Authority: CN
Inventors: 江会锋; 徐占梅; 刘玉万; 燕志慧; 卢丽娜
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin National Synthetic Biotechnology Innovation Center Co ltd
Priority date: 2017-03-22
Filing date: 2017-03-22
Publication date: 2019-12-10
Anticipated expiration: 2037-03-22
Also published as: CN108624571A

Abstract

本发明公开了具有催化DHAP或D‑G3P合成丙烯酸功能的酶及其应用。本发明提供了蛋白质，是如下1)或2)：1)序列表中序列1所示的蛋白质；2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由序列1衍生的蛋白质。本发明的实验证明，本发明发现一个新蛋白CeasA，可以用来催化DHAP或D‑G3P生成丙烯酸，有望实现生物法绿色生产丙烯酸。

Description

具有催化DHAP或D-G3P合成丙烯酸功能的酶及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及具有催化DHAP或D-G3P合成丙烯酸功能的酶及其应用。

背景技术

丙烯酸(Acrylic acid)，化学式为C₃H₄O₂，是无色透明、味苦辣、带有刺激性气味的腐蚀性液体，能溶于水、乙醇及乙醚等，不耐光及热，有自聚性。丙烯酸是重要的有机化工原料,大部分用于生产丙烯酸酯(如丙烯酸甲酯、乙酯、丁酯及辛酯等),少量用于生产高吸水性树脂、助洗涤剂和水处理剂等。丙烯酸及其酯系列产品可广泛应用于涂料、化纤、纺织、皮革、塑料、粘和剂、石油开采等各个领域。

丙烯酸主要采用化学方法生产。丙烯酸在20世纪30年代实现工业化生产。其生产历程经历了几个阶段：氯乙醇法、氰乙醇法、高压Reppe法、烯酮法、丙烯腈水解法和丙烯氧化法。前面几种工艺因技术和经济原因已经基本被淘汰。现在采用的丙烯氧化法是20世纪60年代发展起来的方法。所谓丙烯两步氧化法是在复合金属氧化物催化剂存在下,经空气氧化先生成丙烯醛,再进一步催化氧化成丙烯酸。

丙烯酸及其酯是现代有机化工中重要的基础原料和高分子单体，在精细化工的应用中占有相当重要的地位。尽管丙烯氧化法具有工艺先进、原料价格低廉、效率高等优点，发展迅速，在丙烯酸及其酯的生产中占据主导地位。然而，目前丙烯酸的生产原料归根结底还是来源于石油，其生产能耗高，污染较严重，加上石油资源日益匮乏，导致原料价格攀升，生产成本必然增加，因此可再生的生物基丙烯酸替代石油基丙烯酸是大势所趋。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种蛋白质。

本发明提供的蛋白质，是如下1)或2)：

1)序列表中序列1所示的蛋白质；

2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由序列1衍生的蛋白质。

上述经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

例如：在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。同时，在C末端或N末端添加一个或数个氨基酸，通常也不会改变蛋白质的功能。

编码上述蛋白质的DNA分子也是本发明保护的范围。

上述DNA分子是如下1)-3)中任一种的DNA分子：

1)编码区为序列表中序列3所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子；

3)与1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子。

上述2)中严格条件是指：(1)在较低的离子强度和较高的温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在95％以上，优选为在97％以上时才发生杂交；并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与序列1所示的成熟多肽具有相同的生物学活性和功能。

上述3)中限定的多核苷酸序列有70％同一性且编码具有催化DHAP或D-G3P缩合合成丙烯酸功能的蛋白质的多核苷酸。其中，与上述1)限定的多核苷酸序列杂交的核酸片段，长度至少含10个核苷酸，优选地，20个核苷酸以上，更优选地，50个核苷酸以上，最佳为100个核苷酸以上。

进一步地，上述核苷酸为DNA或RNA。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以单链的或者是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。

含有上述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的范围。

或，扩增上述核酸分子全长或其任意片段的引物对也是本发明保护的范围。

上述蛋白、上述DNA分子或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在制备催化DHAP(磷酸二羟基丙酮)或D-G3P(D-3-磷酸甘油醛)合成丙烯酸产品中的应用也是本发明保护的范围；

或上述蛋白、上述DNA分子或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌催化DHAP或D-G3P合成丙烯酸中的应用也是本发明保护的范围。

本发明另一个目的是提供一种催化DHAP或D-G3P合成丙烯酸的产品。

本发明提供的产品，包括上述蛋白、上述DNA分子或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

上述重组载体指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、动物细胞病毒、逆转录病毒或其它载体。在本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达的基于T7启动子的表达载体，如pET-28a等；在酵母中表达的载体，如YEp系列载体等；在哺乳动物细胞中表达的MSXND表达载体等。总之，只要能在宿主细胞内稳定复制和存在，任何载体都可以用于构建重组表达载体。

优选地，所述重组载体为在pET-28a载体的多克隆位点，插入序列表中序列3所示的核苷酸。可选的，克隆位点为NdeI酶切位点和XhoI酶切位点。

上述重组菌包含上述重组载体，且指原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞如哺乳动物细胞。优选地为大肠杆菌、酵母。

上述产品中，所述产品为试剂盒；

或所述产品包括TPP和MgSO₄。

本发明第3个目的是提供一种催化DHAP或D-G3P合成丙烯酸的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：以DHAP或D-G3P为底物，用上述蛋白催化合成丙烯酸。

上述方法中，所述催化反应的条件为25℃-37℃反应20h；

或所述催化反应的条件为30℃反应20h。

上述方法中，所述催化反应所需的pH值为7.4-8.2；

或所述催化反应的所需的pH值为8.2；

或所述催化所需的反应体系包括TPP和MgSO₄。

上述反应体系(200μL)如下：5mM DHAP或D-G3P，2mM TPP(焦磷酸硫胺素)，6mMMgSO₄、1mg/ml上述纯化的CeasA蛋白和蛋白缓冲液(50mM Tris-HCl，2mM EDTA，0.1％Triton X-100，pH8.2)混匀，得到反应体系。

本发明的实验证明，本发明发现一个新蛋白CeasA，可以用来催化DHAP或D-G3P生成丙烯酸，有望实现生物法绿色生产丙烯酸。

附图说明

图1为重组质粒pET-28a-ceasA的质粒图谱示意图。

图2为CeasA纯化SDS-PAGE示意图。

图3为丙烯酸标准品LC-MS分析的色谱图。

图4为对照样品产物LC-MS分析的色谱图。

图5为CeasA催化D-G3P产物LC-MS分析的色谱图。

图6为丙烯酸标准品HPLC分析的色谱图。

图7为CeasA催化DHAP产物HPLC分析的色谱图。

图8为CeasA催化D-G3P产物LC-MS分析的质谱图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

在下面的实施例中进一步说明本发明，但并不限制本发明的范围。部分分子克隆方法细节依据试剂、酶或试剂盒提供商家不同而有所差别，应当按照产品说明进行操作，在实施例中不再详细描述。

实施例1、CeasA蛋白的获得

1、ceasA基因获得

在Nocardia sp.BMG51109中发现ceasA基因，其核苷酸序列为序列1，该基因编码的蛋白为CeasA蛋白，其氨基酸序列为序列2，在不改变ceasA氨基酸序列的前提下，将上述野生型ceasA基因的密码子替换为大肠杆菌偏好(高频使用)的密码子，经密码子优化后，得到优化后ceasA基因序列，具有大肠杆菌偏爱密码子，其基因序列为序列3。

2、表达载体的构建

将序列3所示的优化后ceasA基因替换pET-28a载体(Novagen，Kan⁺，见图1)酶切位点NdeI和XhoI之间的DNA片段，得到重组质粒，命名为pET-28a-ceasA。

3、基因的表达

为了体外检测CeasA酶活性，在大肠杆菌中对该酶进行外源表达及纯化。

(1)将大肠杆菌表达型重组质粒pET-28a-CeasA转入E.coli BL21(DE3)中，获得重组菌。采用卡那霉素抗性平板进行阳性克隆筛选(Kan⁺，100mg/mL)，37℃过夜培养；

(2)挑单克隆至5mL LB液体培养基中(Kan⁺，100mg/mL)，37℃、220r/min培养至OD₆₀₀为0.6-0.8。将5mL LB培养基中菌液转接至800mL 2YT培养基中(Kan⁺，100mg/mL)，37℃、220rpm培养至OD₆₀₀为0.6-0.8时，降温至16℃，加IPTG至终浓度0.5mM，诱导表达16h；

(3)将上述培养菌液收集到收菌瓶中，5500r/min离心15min；

(4)弃上清，用35mL蛋白缓冲液(50mM Tris-HCl，2mM EDTA，0.1％Triton X-100，pH7.4)将所得菌体沉淀悬起，倒入50mL离心管中，-80℃冰箱保存。

4、蛋白纯化

(1)破菌：采用高压低温破碎仪，在压力1200bar，4℃条件下对于上述3得到的菌体沉淀破菌2次。4℃、10000r/min离心45min，取离心后的沉淀、上清，制样；

(2)纯化：上清液经0.45μm微孔滤膜抽滤，进行镍亲和层析纯化，具体步骤如下：

a：柱平衡：挂上清前，先用ddH₂O洗2个柱体积，再用蛋白缓冲液平衡Ni亲和层析柱1个柱体积；

b：上样：将上清按0.5mL/min流速缓慢经过Ni亲和层析柱，再重复一次；

c：洗脱杂蛋白：采用蛋白缓冲液冲洗1个柱体积，再用50mL含50mM咪唑的蛋白缓冲液去洗脱结合较强的杂蛋白，取前几滴流穿样品，制样；

d：洗脱目的蛋白：分别用20mL含100mM，200mM，300mM咪唑蛋白缓冲液将目的蛋白洗脱下来，取前几滴流穿样品，制样，12％SDS-PAGE检测，结果如图2所示。

(3)浓缩换液：将收集到的目的蛋白用50mL Amicon超滤管(30kDa，Millipore公司)离心浓缩(4℃、3400r/min)，浓缩至1mL。加10mL蛋白缓冲液，浓缩至1mL，重复该过程1次，得到纯化蛋白CeasA。

(4)用Nondrop 2000微量分光光度计检测浓缩后蛋白浓度，为4mg/mL。即得到纯化浓缩的CeasA蛋白，其氨基酸序列为序列2。

实施例2、CeasA蛋白在催化DHAP或D-G3P合成丙烯酸中的应用

1、CeasA催化DHAP或D-G3P缩合合成丙烯酸

反应方程式如下1)或2)：

2、CeasA酶活性检测

对照组：反应体系(200μL)如下：5mM DHAP或D-G3P，2mM TPP(焦磷酸硫胺素)，6mMMgSO₄和蛋白缓冲液(50mM Tris-HCl，2mM EDTA，0.1％Triton X-100，pH8.2)混匀，得到反应体系。

CeasA组：反应体系(200μL)如下：5mM DHAP或D-G3P，2mM TPP(焦磷酸硫胺素)，6mMMgSO₄、1mg/ml实施例1制备纯化的CeasA蛋白和蛋白缓冲液(50mM Tris-HCl，2mM EDTA，0.1％Triton X-100，pH8.2)混匀，得到反应体系。

将上述各组反应体系混匀后于30℃反应20h。反应结束后，12000rpm离心2min,所得上清液用0.22μm滤器过滤后，进行HPLC或HPLC-MS检测。

丙烯酸标准品购自Sigma-Aldrich公司。

上述HPLC检测条件：

色谱柱：Aminex HPX-87H Ion Exclusion Colum(300mm×7.8mm)，紫外检测器，检测波长210nm。

流动相：5mM硫酸

柱温：35℃

流速：0.6ml/min

上述HPLC-MS检测条件：

a)HPLC：

色谱柱：Waters SunFire C18(4.6×250mm)column，紫外检测器，检测波长210nm。

流动相：90％10mM乙酸铵/10％甲醇

柱温：35℃

流速：1ml/min

b)MS检测条件：

负离子模式；

Ion Source Gas1:55psi

Ion Source Gas2:55psi

Curtain Gas:35psi

IonSpray Voltage Floating:4500v

Interface Heater Temperature:550℃。

图3为丙烯酸标准品LC-MS分析的色谱图。图4为对照组产物LC-MS分析的色谱图。图5为CeasA组催化D-G3P的产物LC-MS分析的色谱图。图6为丙烯酸标准品HPLC分析的色谱图。图7为CeasA组催化DHAP的产物HPLC分析的色谱图。图8为CeasA组催化D-G3P产物LC-MS分析的质谱图。

可以看出，CeasA催化5mM D-G3P得到28.61mg/L的丙烯酸,催化5mM DHAP得到1.73mg/L的丙烯酸，因此，30℃下，1mg/mL的CeasA酶20h能够催化5mM D-G3P产生28mg/L的丙烯酸。

对照例：

Ceas2(EC 2.5.1.66)：N2-(2-carboxyethyl)arginine synthase是Streptomycesclavuligerus棒酸生物合成中的TPP依赖性的酶。

按照实施例2的方法，将Ceas2替换CeasA，催化DHAP或D-G3P生成丙烯酸，结果Ceas2在30℃下，1mg/mL的酶20h可以催化5mM D-G3P得到6.67mg/L的丙烯酸,催化5mM DHAP得到7.06mg/L的丙烯酸。

序列表

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 具有催化DHAP或D-G3P合成丙烯酸功能的酶及其应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1680

<212> DNA

<213> Nocardia sp.

<400> 1

atgaacgtcg ccaccgcgct actacgccga ctccgggcga tcggaatcga acatatattc 60

ggaatagtcg gccgcgaggc cagcgcgatc tcgttcaacg agatacctga tatacatttc 120

gttctcaccc ggcacgaatt caccgccggc gtcgcggcat gttcgatgtc gaggttcacc 180

ggaactccgc aggtgagctt tgcgacaatc ggcccgggag cggcaaacct catgaccgcc 240

gtcgccacgg caaccctgga tcgatatcct ctcatcgcga ttgtggcaca ccatgaaaca 300

tatgaaatag cgcacaacaa tgcccatcaa tgtatcgact ccgtatcgat ggcgaagccg 360

atttcgaagt acgctcatct ggtcaccggc ccggacgact tgttcacaag tctcgaccgt 420

gccctgaaca tagcgcagac cccgcccgcg ggcccggcat ttctcgccgt accgatcgat 480

atactggcgg caccggctcg cgcccggatg gcctacgaga aaccgagttc cgcacctgtc 540

gcaccgtcat ccgcgaccgt cgacggtcca ccgtctccgg acctgagaaa aatcgtcgcc 600

gcacttcgga gctgtagcaa cccgattatt gccgtcggag atgccgctct gaagtcgggc 660

ctcacgccgg acatcgttcg catggcggag cgttcgaaca tcccggtcgt gactacatac 720

gccgccaaag gggccctacc gggagaacat cctctcgact acggcgcgat cactccctat 780

atggactcga tcctggagtt cccggctctg gacaccctct tcgaacccat cgacttcgtg 840

ctgctgatct gttatgaccc ggccgagcac ctctatccgc ggctgtggac gagaggcagg 900

cagaagactg tcgcccgact gtccgaccac aaggacgact ccggcctctc ggtcttcgac 960

atcgatgccg tccatccctt gcgagaggcg atcgacttca tcgccgggaa ttcggccggg 1020

accaggcgcg agccccactc catcgacaaa ctccgcgacc gaatcgacga gcttttcaac 1080

gactccgaag aattgccgat cggtgtcaag ccgacccagg tgctgcgaac ccttcacgag 1140

catctggaag gattcatcct ggccagcgac gtcggattac accggcacgt ctccgcgctc 1200

ttcttcaagg cgagcaggcc actcgacttc gtcacctcgg ccgggctctc gtcgttcggc 1260

acgggcatgg gcctcggcat cggcgccaaa ctggccaacc cggacaggcc ggtcgtgata 1320

atcgcaggcg acggtggctt ccattcggtc tcgggagatc tcgaaacggt cgtgcggctc 1380

ggcctcgacg tgctgatcat catcatgaac aactccgcga gcagcctgat ccaacgctac 1440

gaatcgctcg gaaaccggcc ggaaaacccg ggaatcacca cattcggtac cgtcgacttc 1500

gcggccctgg cgcaggccaa cggatgccgg ggattacgtg cggaatctct cgcagaactg 1560

cgcgaatcga tcgccatcgg cacacgttca ccggggccta cattggtgga cgtcagaata 1620

gaatacccgg atctctatat gaacgggtac tcgaccaact atcatacccg gcaggcgcaa 1680

<210> 2

<211> 560

<212> PRT

<213> Nocardia sp.

<400> 2

Met Asn Val Ala Thr Ala Leu Leu Arg Arg Leu Arg Ala Ile Gly Ile

1 5 10 15

Glu His Ile Phe Gly Ile Val Gly Arg Glu Ala Ser Ala Ile Ser Phe

20 25 30

Asn Glu Ile Pro Asp Ile His Phe Val Leu Thr Arg His Glu Phe Thr

35 40 45

Ala Gly Val Ala Ala Cys Ser Met Ser Arg Phe Thr Gly Thr Pro Gln

50 55 60

Val Ser Phe Ala Thr Ile Gly Pro Gly Ala Ala Asn Leu Met Thr Ala

65 70 75 80

Val Ala Thr Ala Thr Leu Asp Arg Tyr Pro Leu Ile Ala Ile Val Ala

85 90 95

His His Glu Thr Tyr Glu Ile Ala His Asn Asn Ala His Gln Cys Ile

100 105 110

Asp Ser Val Ser Met Ala Lys Pro Ile Ser Lys Tyr Ala His Leu Val

115 120 125

Thr Gly Pro Asp Asp Leu Phe Thr Ser Leu Asp Arg Ala Leu Asn Ile

130 135 140

Ala Gln Thr Pro Pro Ala Gly Pro Ala Phe Leu Ala Val Pro Ile Asp

145 150 155 160

Ile Leu Ala Ala Pro Ala Arg Ala Arg Met Ala Tyr Glu Lys Pro Ser

165 170 175

Ser Ala Pro Val Ala Pro Ser Ser Ala Thr Val Asp Gly Pro Pro Ser

180 185 190

Pro Asp Leu Arg Lys Ile Val Ala Ala Leu Arg Ser Cys Ser Asn Pro

195 200 205

Ile Ile Ala Val Gly Asp Ala Ala Leu Lys Ser Gly Leu Thr Pro Asp

210 215 220

Ile Val Arg Met Ala Glu Arg Ser Asn Ile Pro Val Val Thr Thr Tyr

225 230 235 240

Ala Ala Lys Gly Ala Leu Pro Gly Glu His Pro Leu Asp Tyr Gly Ala

245 250 255

Ile Thr Pro Tyr Met Asp Ser Ile Leu Glu Phe Pro Ala Leu Asp Thr

260 265 270

Leu Phe Glu Pro Ile Asp Phe Val Leu Leu Ile Cys Tyr Asp Pro Ala

275 280 285

Glu His Leu Tyr Pro Arg Leu Trp Thr Arg Gly Arg Gln Lys Thr Val

290 295 300

Ala Arg Leu Ser Asp His Lys Asp Asp Ser Gly Leu Ser Val Phe Asp

305 310 315 320

Ile Asp Ala Val His Pro Leu Arg Glu Ala Ile Asp Phe Ile Ala Gly

325 330 335

Asn Ser Ala Gly Thr Arg Arg Glu Pro His Ser Ile Asp Lys Leu Arg

340 345 350

Asp Arg Ile Asp Glu Leu Phe Asn Asp Ser Glu Glu Leu Pro Ile Gly

355 360 365

Val Lys Pro Thr Gln Val Leu Arg Thr Leu His Glu His Leu Glu Gly

370 375 380

Phe Ile Leu Ala Ser Asp Val Gly Leu His Arg His Val Ser Ala Leu

385 390 395 400

Phe Phe Lys Ala Ser Arg Pro Leu Asp Phe Val Thr Ser Ala Gly Leu

405 410 415

Ser Ser Phe Gly Thr Gly Met Gly Leu Gly Ile Gly Ala Lys Leu Ala

420 425 430

Asn Pro Asp Arg Pro Val Val Ile Ile Ala Gly Asp Gly Gly Phe His

435 440 445

Ser Val Ser Gly Asp Leu Glu Thr Val Val Arg Leu Gly Leu Asp Val

450 455 460

Leu Ile Ile Ile Met Asn Asn Ser Ala Ser Ser Leu Ile Gln Arg Tyr

465 470 475 480

Glu Ser Leu Gly Asn Arg Pro Glu Asn Pro Gly Ile Thr Thr Phe Gly

485 490 495

Thr Val Asp Phe Ala Ala Leu Ala Gln Ala Asn Gly Cys Arg Gly Leu

500 505 510

Arg Ala Glu Ser Leu Ala Glu Leu Arg Glu Ser Ile Ala Ile Gly Thr

515 520 525

Arg Ser Pro Gly Pro Thr Leu Val Asp Val Arg Ile Glu Tyr Pro Asp

530 535 540

Leu Tyr Met Asn Gly Tyr Ser Thr Asn Tyr His Thr Arg Gln Ala Gln

545 550 555 560

<210> 3

<211> 1680

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400> 3

atgaacgttg ctaccgctct gctgcgtcgt ctgcgtgcta tcggtatcga acacatcttc 60

ggtatcgttg gtcgtgaagc ttctgctatc tctttcaacg aaatcccgga catccacttc 120

gttctgaccc gtcacgaatt caccgctggt gttgctgctt gctctatgtc tcgtttcacc 180

ggtaccccgc aggtttcttt cgctaccatc ggtccgggtg ctgctaacct gatgaccgct 240

gttgctaccg ctaccctgga ccgttacccg ctgatcgcta tcgttgctca ccacgaaacc 300

tacgaaatcg ctcacaacaa cgctcaccag tgcatcgact ctgtttctat ggctaaaccg 360

atctctaaat acgctcacct ggttaccggt ccggacgacc tgttcacctc tctggaccgt 420

gctctgaaca tcgctcagac cccgccggct ggtccggctt tcctggctgt tccgatcgac 480

atcctggctg ctccggctcg tgctcgtatg gcttacgaaa aaccgtcttc tgctccggtt 540

gctccgtctt ctgctaccgt tgacggtccg ccgtctccgg acctgcgtaa aatcgttgct 600

gctctgcgtt cttgctctaa cccgatcatc gctgttggtg acgctgctct gaaatctggt 660

ctgaccccgg acatcgttcg tatggctgaa cgttctaaca tcccggttgt taccacctac 720

gctgctaaag gtgctctgcc gggtgaacac ccgctggact acggtgctat caccccgtac 780

atggactcta tcctggaatt cccggctctg gacaccctgt tcgaaccgat cgacttcgtt 840

ctgctgatct gctacgaccc ggctgaacac ctgtacccgc gtctgtggac ccgtggtcgt 900

cagaaaaccg ttgctcgtct gtctgaccac aaagacgact ctggtctgtc tgttttcgac 960

atcgacgctg ttcacccgct gcgtgaagct atcgacttca tcgctggtaa ctctgctggt 1020

acccgtcgtg aaccgcactc tatcgacaaa ctgcgtgacc gtatcgacga actgttcaac 1080

gactctgaag aactgccgat cggtgttaaa ccgacccagg ttctgcgtac cctgcacgaa 1140

cacctggaag gtttcatcct ggcttctgac gttggtctgc accgtcacgt ttctgctctg 1200

ttcttcaaag cttctcgtcc gctggacttc gttacctctg ctggtctgtc ttctttcggt 1260

accggtatgg gtctgggtat cggtgctaaa ctggctaacc cggaccgtcc ggttgttatc 1320

atcgctggtg acggtggttt ccactctgtt tctggtgacc tggaaaccgt tgttcgtctg 1380

ggtctggacg ttctgatcat catcatgaac aactctgctt cttctctgat ccagcgttac 1440

gaatctctgg gtaaccgtcc ggaaaacccg ggtatcacca ccttcggtac cgttgacttc 1500

gctgctctgg ctcaggctaa cggttgccgt ggtctgcgtg ctgaatctct ggctgaactg 1560

cgtgaatcta tcgctatcgg tacccgttct ccgggtccga ccctggttga cgttcgtatc 1620

gaatacccgg acctgtacat gaacggttac tctaccaact accacacccg tcaggctcag 1680

Claims

1.蛋白、编码所述蛋白的核酸分子或含有所述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在制备催化DHAP或D-G3P合成丙烯酸产品中的应用；

所述蛋白是序列表中序列2所示的蛋白质。

2.蛋白、编码所述蛋白的核酸分子或含有所述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在催化DHAP或D-G3P合成丙烯酸中的应用；

所述蛋白是序列表中序列2所示的蛋白质。

3.一种催化DHAP或D-G3P合成丙烯酸的方法，包括如下步骤：以DHAP或D-G3P为底物，用蛋白催化合成丙烯酸；

所述蛋白是序列表中序列2所示的蛋白质。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述催化反应的条件为25℃-37℃反应20h。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述催化反应的条件为30℃反应20h。

6.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述催化反应所需的pH值为7.4- 8.2。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：

所述催化反应所需的pH值为8.2；

所述催化所需的反应体系包括TPP和MgSO₄。