CN117165605A - 重组抗坏血酸氧化酶的制备方法 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种重组抗坏血酸氧化酶的制备方法。本申请中提供的抗坏血酸氧化酶的制备方法，依赖毕赤酵母作为异源表达的真菌宿主系统，以甲醇为唯一碳源，具有可稳定遗传、成本低易培养、可规模化、可翻译后修饰以及分泌表达等优势；可获得低成本、大规模生产高酶活的抗坏血酸氧化酶蛋白。

Description

重组抗坏血酸氧化酶的制备方法

技术领域

本发明涉及生物工程领域，特别涉及重组抗坏血酸氧化酶的制备方法。

背景技术

抗坏血酸氧化酶(Ascorbic acid oxidase，AAO)属于多铜氧化酶，可将抗坏血酸催化为脱氢抗坏血酸，伴随着分子氧还原为水。AAO是一种同型二聚体铜蛋白，每个亚基有4个铜原子，其中3个在结构域1(Ser31-Tyr163)和结构域3(Asn374-Pro579)的交界处形成三核铜簇，而另个铜原子在结构域1上以单核形式存在。铜原子是抗坏血酸氧化酶的酶促反应的重要组分，推测三核铜簇用于与氧结合并储存电子，单核形式的铜原子则可与抗坏血酸结合。此外，酚类化合物也可作为抗坏血酸的竞争性抑制底物。

抗坏血酸氧化酶广泛存在于植物中，调控着植物的发芽、生长发育和逆境胁迫等生理过程。在实际应用中，抗坏血酸氧化酶主要用于酶法测定L-抗坏血酸含量、微量测定溶解氧以及消除L-抗坏血酸对过氧化物酶偶联酶法测定的干扰。目前已从黄瓜、西葫芦、南瓜、甜瓜和烟草等植物中纯化得到抗坏血酸氧化酶，并对其理化性质、酶学特性以及催化机制进行深入研究。然而，直接从植物中提取的抗坏血酸氧化酶不仅成本高、受限于原料，而且纯化产物杂蛋白较多，易对检测结果产生干扰，因此这极大限制抗坏血酸氧化酶在检测中的应用。

随着分子生物学的发展，微生物重组表达目的蛋白已成为低成本得到大量高纯度目的蛋白的高效方法。然而，现有技术中，利用微生物重组表达抗坏血酸氧化酶相关报道很少，专利JP1997168389A中公开了一种使用大肠杆菌表达抗坏血酸氧化酶的方法，但该方法不仅产量不高，而且产的酶活性很低，无法满足商业化和工业化所需。因此，尚需开发一种适宜工业化生产的高活性坏血酸氧化酶的制备方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗坏血酸氧化酶的制备方法。

本发明的另一目的提供一种含有经上述方法制备获得的重组抗坏血酸氧化酶的试剂盒。

为解决上述技术问题，本发明第一方面提供了一种编码抗坏血酸氧化酶蛋白的多核苷酸，所述多核苷酸经密码子优化，且所述多核苷酸选自以下任一种：

(i)如SEQ ID NO.2所示序列的多核苷酸；

(ii)与如SEQ ID NO.2所示序列的同源性大于95％的多核苷酸；和

(iii)与(i)或(ii)中所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸。

本发明第二方面，提供了一种表达载体，所述表达载体包括本发明第一方面提供的多核苷酸。

在一些优选的方案中，所述表达载体为毕赤酵母菌表达载体，更优选为pPIC9、pPic9k、pHIL-S1、pPICZαA、pPinkα-HC或pYAM75P，最优选为pPic9k。

本发明第三方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括本发明第二方面提供的表达载体；或者

所述宿主细胞的基因组中整合有如本发明第一方面提供的多核苷酸。

在一些优选的方案中，所述宿主细胞为毕赤酵母菌(Pichia.pastoris)。

本发明第四方面提供了一种制备抗坏血酸氧化酶蛋白的方法，所述方法包括步骤：培养本发明第三方面所述的宿主细胞，以表达出目的蛋白；和

分离所述目的蛋白，即得所述抗坏血酸氧化酶蛋白。

在一些优选的方案中，在BSM培养基中培养所述宿主细胞。

在一些优选的方案中，在YPD培养基中培养所述宿主细胞。

在一些优选的方案中，首先在YPD培养基中培养所述宿主细胞，得到单菌落后接种于BSM培养基中培养所述宿主细胞。

在一些优选的方案中，在25-30℃下培养所述宿主细胞，例如28℃。

在一些优选的方案中，在pH为4.8-5.5的培养基中培养所述宿主细胞。

在一些优选的方案中，在搅拌速度为200-1000rpm的条件下培养所述宿主细胞，例如250rpm。

在一些优选的方案中，首先在含有甘油的培养基中培养所述宿主细胞，后加入甲醇继续培养，以表达出目的蛋白。

在一些优选的方案中，首先在含有甘油的培养基中培养所述宿主细胞，当OD值达到180-240后继续培养至少0.8-1.2小时，再加入甲醇继续培养，以表达出目的蛋白。

在一些优选的方案中，甲醇的加入速率为2-7g/(L*h)。

在一些优选的方案中，加入甲醇后培养所述宿主细胞至少60小时，优选60-120小时。

在一些优选的方案中，所述分离所述目的蛋白的步骤包括：

将经破碎的目的蛋白上清液与流动相同时通过层析柱进行洗脱，收集洗脱液。

本发明第五方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括：如本发明第一方面提供的的多核苷酸；或者

如本发明第二方面提供的表达载体；或者

如本发明第三方面所述的宿主细胞；或者

或者根据本发明第四方面所述的方法制备的抗坏血酸氧化酶蛋白。

本发明相对于现有技术而言，至少具有下述优点：

(1)本发明依赖毕赤酵母作为异源表达的真菌宿主系统，以甲醇为唯一碳源，具有可稳定遗传、成本低易培养、可规模化、可翻译后修饰以及分泌表达等优势；

(2)本发明中的方法利用毕赤酵母异源表达抗坏血酸氧化酶蛋白，可获得低成本、大规模生产高酶活的抗坏血酸氧化酶蛋白。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。

图1是根据本发明实施例中电转筛选平板照片；

图2是根据本发明实施例中纯化表达产物电泳图(目的蛋白：61.7kDa)；

图3是根据本发明实施例中抗坏血酸氧化酶酶活测定标准曲线图。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，开发了在毕赤酵母表达体系下培养抗坏血酸氧化酶的方法，该方法产量高、产品酶活力高，发酵生产成本低，具有较好的工业应用价值。

目的蛋白及其编码序列

本发明中，目的蛋白为“抗坏血酸氧化酶”氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。根据本发明目的蛋白的氨基酸序列可获得编码其的基因序列。

经同义密码子优化的多核苷酸序列

为提高目的基因在异源宿主中的表达效率，本发明中还涉及经密码子优化的多核苷酸序列，由编码目的蛋白的基因序列经同义密码子优化获得。本发明中，术语“同义密码子优化”是指根据实际做蛋白表达或生产的生物(包括大肠杆菌、酵母、哺乳动物血细胞、植物细胞、昆虫细胞等)表现出的密码子利用差异，避免使用低利用率或稀有的密码子，来提高基因合成效率的方式。对目的基因进行同义密码子优化的方式不唯一，可选地，可进行大肠杆菌同义密码子偏好性优化以提升目的基因在大肠杆菌中的表达效率；可进行毕赤酵母同义密码子偏好性优化，以提升目的基因在毕赤酵母中的表达效率。即使用于生产的生物相同，同义密码子在偏好性优化的方式也不限于一种，例如本发明的实施方式中，对编码目的蛋白SEQ ID NO.1的基因序列进行毕赤酵母同义密码子偏好性优化，得到如SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4等多个不同的优化密码子。经不同方式优化所得的密码子，表达产量相差较大。

本发明还涉及上述多核苷酸的同源序列，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的蛋白质片段、类似物和衍生物。如本领域所知的，多核苷酸的同源序列是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码多肽的功能。

在一个实施方式中，上述同源序列与多核苷酸序列具有大于80％，更优选大85％，更优选大90％，更优选大91％，更优选大92％，更优选大93％，更优选大94％，更优选大95％的同源性。本发明中所用的，术语“同源性”和“同一性”可互换使用，是指两个或更多个多核苷酸或多肽之间相同(即相同)核苷酸或氨基酸的百分比。可以通过以下方法测量两个或多个多核苷酸或多肽之间的序列同一性。排列多核苷酸或多肽的核苷酸或氨基酸序列，对排列的多核苷酸或多肽中含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置的数量进行评分，并将其与排列的多核苷酸或多肽中含有不同核苷酸或氨基酸残基的位置的数量进行比较。多核苷酸可以在一个位置上不同，例如，根据包含不同的核苷酸(即，替换或变异)或核苷酸的缺失(即，在多核苷酸中插入或缺失一个或两个核苷酸)。多肽可以例如通过含有氨基酸(即，取代或变异)或氨基酸的缺失(即，插入一个或两个多肽中的氨基酸或氨基酸的缺失)在一个位置上不同。可以通过将含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置的数量除以多核苷酸或多肽中氨基酸残基的总数来计算序列同一性。例如，百分比同一性可通过将含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置的数量除以多核苷酸或多肽中核苷酸或氨基酸残基的总数，然后乘以100来计算。

本发明还涉及上述多核苷酸序列互补的序列。本发明中，术语“序列互补”和“反向序列互补”可互换使用，指的是与原多核苷酸序列的方向相反，且与原多核苷酸序列互补的序列。例如，如果原始多核苷酸序列是ACTGAAC，则其反向互补序列是GTTCAT。

获取本发明中多核苷酸序列信息后，可溶通过本领域技术人员熟知的方法制备得到多核苷酸序列。例如：PCR扩增法或化学合成法。

(1)PCR扩增法

可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，使模板与设计的引物互补序列配对结合，然后在在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复循环变性--退火--延伸扩增得到有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起得到全长cDNA序列。

(2)化学合成法

采用过磷酸二酯法，磷酸三酯法，亚磷酸三酯法进行化学合成目的基因，使用核酸合成仪可通过自动化方法进行操作，当序列长度较短时(通常为60-80bp)，化学合成法被认为是更优选的获得核苷酸序列的方式。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

含有多核苷酸序列的载体

本发明还涉及含有多核苷酸序列的载体。本发明中“载体”表示线性或环状DNA分子，其包含编码目的蛋白的片段，所述目的蛋白可操作地连接到提供其转录的其它片段。这样的附加片段可以包括启动子和终止子序列，并且可以任选地包括一个或多个复制起点，一个或多个可选择标记，增强子，多腺苷酸化信号，载体等。载体片段可以衍生自宿主生物体，另一生物体，质粒或病毒DNA，或可以是合成的。载体可以是合成的或方便地进行重组DNA操作的任何表达载体，载体的选择通常取决于载体要导入的宿主细胞。因此，载体可以是自主复制载体，即载体，其作为染色体外实体存在，染色体外实体的复制与染色体复制无关，例如质粒。或者，载体可以是当引入宿主细胞时整合到宿主细胞基因组中并与其整合的染色体一起复制的载体。在一个实施方案中，本发明的载体是表达载体。一些实施例中，使用pPIC9、pPic9k、pHIL-S1、pPICZαA、pYAM75P作为载体。一个实施例中选择pPic9k作为载体，以获取更高效的表达效率。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明蛋白的编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。示例性地，使用DNA内切酶将载体DNA分子切割成可与外源基因连接的线性分子，然后将经密码子优化的目的基因片段连接于载体，可选用单酶切位点的黏端连接、双酶切片段的定向克隆、不同限制酶切位点的黏端连接、平端连接、人工接头连接或同寡核苷酸末端连接实现外源DNA片段的插入。

含有多核苷酸的宿主细胞

本发明还涉及用本发明的载体经基因工程产生的宿主细胞。本发明中“宿主细胞”是引入了外源多核苷酸和/或载体的细胞。宿主细胞可以是真核宿主细胞或原核宿主细胞，宿主细胞优选是真菌，并且优选是酵母菌，更优选是毕赤酵母菌(Pichia.pastoris)，例如GS115，KM71和SMD1168毕赤酵母菌株。

本领域的技术人员熟知的方法能用于将含有多核苷酸序列的载体插入、转染或以其他方式转化到宿主细胞中，从而获得含有本发明多核苷酸序列并能够表达目的蛋白的转化体。当宿主是毕赤酵母菌时，可选用热击法或电转化发法。

(1)热击法

热击法将质粒DNA粘附在感受态大肠杆菌细胞表面，并经过42℃左右的短时间热击处理，促进质粒DNA吸收。

(2)电转化法

将感受态的大肠杆菌和质粒混合液加入预冷的电击杯中，放入电转仪进行电击以诱导质粒DNA进入宿主细胞。

得到转化体后，可使用本领域常规的方法挑取转化子(筛选平板生长出的单菌落)，例如遗传检验法、测序法、菌落PCR法等。

制备目的蛋白的方法

本发明还涉及制备目的蛋白的方法，包括：(1)用本发明的编码目的蛋白的多核苷酸(或同源序列)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2)在合适的培养基中培养的宿主细胞；(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

获得含有本发明多核苷酸序列的转化子，可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的目的蛋白。根据所用的宿主细胞，选用常规培养基在适于宿主细胞生长的条件下进行培养，同时可根据表达情况对培养基进行优化，以提升表达稳定性和表达效率。一些例子中，可选的培养基为LB、LLB、YPD、BMGY、BMMY、YPDS+Zeocin、MGY、MGYH、RD、SOC培养基等，优选为BSM培养基。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

一般地，在摇瓶水平培养宿主细胞至长出单菌落，挑取之接种于发酵罐进行大规模生产。生产时发酵条件通常不同于摇瓶水平，通常可通过控制搅拌速度，培养温度、培养体系pH、补碳条件可提升发酵生产的产量和稳定性，最优的培养条件受菌种和所生产的目的蛋白的不同而影响。在本发明的一些实施方式中，发酵培养时优选的培养条件为pH为4.8-5.5，培养温度为25-30℃，搅拌速度为200-1000rpm。

在本发明的一些实施方式中，首先在含有甘油的培养基中培养宿主细胞，后在培养基中加入甲醇继续培养，以表达出目的蛋白。为进一步提高产量，首先在含有甘油的培养基中培养宿主细胞，当OD值达到180-240后继续培养至少0.8-1.2小时，再加入甲醇继续培养，甲醇加入的速率优选为2-7g/(L*h)，加入甲醇后培养至少60小时，优选60-120小时后放罐，收集目的蛋白发酵液进行分离和纯化的步骤。

本发明中，在成功培养得到目的蛋白后，还涉及对其进行分离和纯化的步骤，例如从培养基中分离和纯化蛋白质以获得高纯度的目的蛋白。虽纯化目的蛋白的方法可是本领域技术人员熟知的常规手段，包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

除非另有指明，本文所用的技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义，需要注意的是，本文所用的术语仅为了描述具体实施方式，而非意图限制本申请的示例性实施方式。

实施例1

(1)构建含有AAO的基因序列重组表达载体

获取AAO的基因序列，并对其进行毕赤酵母同义密码子偏好性优化，得到优化后的密码子序列SEQ ID NO.2，连接载体为pPic9k，由北京擎科生物科技有限公司合成。

(2)质粒线性化

在含100μg/mL氨苄抗性的LB平板划线培养含有质粒的大肠杆菌甘油菌，37℃过夜培养后，接单菌落于100μg/mL氨苄抗性的LB培养基，37℃、230rpm振荡培养过夜，以获得较高浓度的菌液。参照说明书，使用天根生化科技(北京)有限公司的高纯度质粒小提试剂盒提取质粒。在质粒中加入Sal I以及相应的Buffer，37℃酶切2h。后续用无水乙醇和醋酸钠沉淀线性化的质粒，回收并贮存至-20℃。

(3)毕赤酵母感受态细胞的制备

在YPD平板上划线培养GS115，28℃培养2-3天，得到单菌落。接单菌落于YPD培养基，28℃、250rpm振荡培养过夜，得到一级菌液。接0.5％-1.5％一级菌液于YPD培养基，28℃、250rpm振荡培养至OD₆₀₀在1.3-1.5之间。1500g 4℃离心5min收集菌体，用无菌水洗涤菌体两次后，用1M山梨醇溶液重悬冰浴5min后1500g 4℃离心5min，最后用1M山梨醇溶液复溶，即得到感受态细胞。

(4)重组质粒的导入

取10μL线性化质粒和80μGS115感受态细胞于电转杯，吹打均匀，冰浴后放入电转仪。电转成功后，加入1mL YPDS，吹打均匀，28℃培养箱中培养2h以上。取50-100μL菌液均匀涂布于含有G418的YPDS平板，28℃培养5-10d，得到20-50个转化子，如图1所示。

(5)重组蛋白的表达

挑取上述平板的15个单菌落，分别接种于BMGY培养基中，28℃、250rpm培养24-36h后，加入终浓度为0.5％甲醇诱导，并此后每24h加入终浓度为0.5％甲醇。采用Bradford法测定诱导前和诱导72h、144h样品的蛋白浓度，并挑取蛋白浓度高的进行定性测活(采用索莱宝抗坏血酸氧化酶(AAO)活性检测试剂盒)。结果如表1，15个转化子的蛋白含量随着诱导时间不断增大，其中GS115-3/6/7/10/12的最终蛋白浓度高于450μg/mL。对上述样品进行定性测活，结果如表2。GS115-7/12个电转菌株的发酵液有酶活，且GS115-12显示最大的吸光值变化，因此选择GS115-12为后续扩大培养的菌株。

表1发酵液诱导前、诱导72h和144h的蛋白浓度

表2诱导144h发酵液的定性测活

样品	OD差(10min)
		GS115-3(10μL)	-0.0615
GS115-6(10μL)	0.0077
		GS115-7(10μL)	0.0939
GS115-10(10μL)	-0.0249
		GS115-12(10μL)	0.1403
空载	0.012
		空白1	0.0252
阳性酶(1μL)	0.1552

AAO的氨基酸序列SEQ ID NO.1

SQIRHYKWEVEYMFWAPDCNENIVMGINGQFPGPTIRANAGDTVVVELINKLHTEGVVIHWHGILQRGTPWADGTASISQ

CAINPGETFFYNFTVDNPGTFFYHGHLGMQRSAGLYGSLIVDPPQGKKEPFHYDGEINLLLSDWWHQSIHKQEVGLSSKP

IRWIGEPQTILLNGRGQFDCSIAAKYDSNLEPCKLKGSEPCAPYIFHVMPKKTYRIRIASTTALAALNFAIGNHPLLVVE

ADGNYVQPFYTSDIDIYSGESYSVLITTDQNPSENYWVSVGTRGRHPNTPPGLTLLNYLPNSVSKLPTSPPPETPAWDDF

DRSKNFTYRITAAMGSPKPPVKSNRRIFLLNTQNVINGYVKWAINDVSLALPPTPYLGAMKFNLLHAFDQNPPPEVFPED

YDIDTPPTNEKTKIGNGVYQFKIGEIVDVILQNANMMKENLSEIHPWHLHGHDFWVLGYGDGKFTAEEESSLNLKNPPLR

NTVVIFPYGWTAIRFVADNPGVWAFHCHIEPHLHMGMGVVFAEGVEKVGRIPTKALACGGTAKSLINNP

优化密码子SEQ ID NO.2

AGTCAAATCAGACACTACAAATGGGAGGTTGAGTACATGTTCTGGGCACCTGATTGTAATGAGAACATTGTGATGGGTAT

TAATGGACAATTCCCTGGACCTACCATTAGAGCCAATGCTGGTGATACTGTCGTTGTCGAGCTGATTAACAAATTGCACA

CCGAAGGTGTCGTCATTCATTGGCATGGAATCTTGCAAAGAGGTACGCCTTGGGCTGATGGTACTGCTTCCATTTCTCAA

TGTGCTATTAACCCTGGAGAAACCTTCTTCTACAACTTCACTGTTGACAATCCAGGTACCTTCTTCTACCACGGTCATTT

GGGTATGCAAAGATCCGCTGGTTTGTACGGTAGTCTTATTGTTGACCCTCCACAAGGTAAGAAAGAGCCATTTCACTACG

ATGGTGAGATCAACTTGTTGCTGTCCGATTGGTGGCATCAATCCATTCACAAGCAAGAAGTCGGTCTTTCTTCCAAACCA

ATCAGATGGATTGGTGAACCACAGACAATCTTGCTTAACGGAAGAGGTCAATTCGACTGTTCCATCGCTGCTAAGTACGA

CTCTAATTTGGAGCCATGTAAGCTGAAAGGTAGTGAGCCATGTGCACCATACATCTTTCATGTGATGCCAAAGAAGACTT

ACAGAATTAGAATTGCCAGTACTACCGCTTTGGCTGCTTTGAATTTCGCTATCGGTAATCATCCATTGCTGGTTGTCGAA

GCAGATGGAAACTACGTTCAACCATTCTACACTTCCGACATTGACATCTATAGTGGTGAGTCTTACAGTGTTCTGATCAC

AACTGATCAGAATCCATCAGAGAATTACTGGGTCAGTGTTGGAACAAGAGGTAGACATCCAAATACTCCACCAGGTTTAA

CCTTGTTGAACTACCTGCCTAACTCTGTTTCAAAGCTGCCTACTAGTCCACCACCAGAGACTCCAGCTTGGGATGACTTC

GATAGATCCAAGAACTTTACCTACAGAATTACCGCTGCTATGGGAAGTCCAAAGCCACCTGTCAAGTCCAACAGAAGAAT

CTTTCTGTTGAATACTCAGAACGTTATCAATGGATACGTGAAATGGGCTATTAATGACGTTAGTTTGGCTTTGCCTCCAA

CACCTTATTTGGGTGCTATGAAATTTAACCTGTTGCATGCTTTCGACCAGAATCCACCTCCAGAAGTCTTTCCAGAAGAC

TACGATATCGATACACCTCCAACTAATGAGAAGACCAAGATCGGTAATGGTGTTTATCAGTTCAAGATTGGTGAGATTGT

TGACGTTATTCTTCAGAATGCTAACATGATGAAAGAGAACCTGTCCGAAATTCACCCTTGGCATCTGCATGGTCACGATT

TCTGGGTTCTGGGTTACGGTGATGGTAAGTTTACTGCTGAAGAAGAATCCAGTCTGAACCTTAAGAATCCACCTTTGAGA

AATACCGTTGTGATCTTCCCTTATGGTTGGACCGCCATCAGATTTGTTGCTGATAATCCAGGTGTTTGGGCATTCCATTG

TCATATTGAACCTCATTTGCACATGGGTATGGGTGTTGTGTTCGCTGAAGGTGTAGAGAAGGTCGGAAGAATACCTACTA

AGGCTCTGGCTTGTGGTGGTACTGCTAAGAGTCTGATTAACAATCCA

实施例2

挑取上述实施例1中制备的GS115-12号阳性转化子，划线于YPD平板，28℃培养3-5d直至长出单菌落。挑取单菌落于5mL YPD培养基中，28℃、250rpm培养18～24h。按1％接种量转接入100mL YPG培养基中，28℃、250rpm培养18-24h后按5％的接种量接种于装有2L无机盐培养基(BSM培养基)的5L发酵罐中。发酵条件：搅拌：200-1000rpm；温度：25-30℃；DO：20-50％(DO不足时适当通入纯氧)。pH：pH用氨水自控4.8-5.5。

DO或pH反弹后开始流加葡萄糖5-12g/(L*h)，OD₆₀₀达到180-240后停止补加葡萄糖，1h后开始补甲醇诱导，甲醇补料速率2-7g/(L*h)，每24h取样。甲醇诱导60-120h后放罐，4500rpm离心5min，获得上清溶液。使用Bradford法检测蛋白浓度，如表3所示，发酵液的蛋白含量随着诱导时间不断增大，最终放罐蛋白浓度是364.2μg/mL。

表3发酵过程蛋白浓度

实施例3

(1)样品处理

使用超滤系统将上清浓缩10-15倍，然后使用5-15倍体积的Buffer A进行超滤换液。12000rpm，4℃离心30min，取上清，0.22μm膜过滤。

(2)阴离子柱纯化

用20ml Q-HP柱纯化。流速为3.0mL/min，上完样使用20mL Buffer A冲洗UV和电导至基线。洗脱程序包括：Step 1:0％C，1.5CV，3.0mL/min；Step 35％C，2CV，3.0mL/min；Step3:100％C，2CV，3.0mL/min。纯化后电泳结果如图2所示，3C7-3C10管有对应目的条带，和少量的杂蛋白。

超滤浓缩和纯化使用的缓冲溶液：

Buffer A：50mM Tris、50mM NaCl，pH8.0

Buffer C：100mM Tris，1M NaCl，pH 8.0

对比例1

不同的密码子优化的方式，在毕赤酵母表达体系下坏血酸氧化酶的产品产量相差较大，发明人经过大量实验优化获得一系列密码子(如表4所示)，一些经优化的密码子表达效率较低，同样条件下发酵培养产量较小，另一些表达产物无酶活，甚至没有表达产物。

表4

优化密码子序列编号	放罐蛋白浓度
		SEQ ID NO.3	225.1μg/mL
SEQ ID NO.4	41.2μg/mL

上表4中，SEQ ID NO.3优化密码子在毕赤酵母表达体系下能够表达一定量的坏血酸氧化酶的产品，但产量不及SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3优化密码子表达产量过低，应用价值小。

SEQ ID NO.3

TCACAAATACGTCATTACAAATGGGAAGTAGAATACATGTTTTGGGCTCCTGATTGTAACGAGAATATTGTGATGGGAAT

TAATGGCCAATTCCCTGGTCCTACCATTAGAGCAAATGCTGGAGACACTGTTGTCGTGGAACTTATTAATAAGCTGCACA

CTGAAGGAGTTGTAATTCATTGGCATGGCATTTTGCAAAGGGGTACCCCATGGGCTGATGGTACTGCTAGTATCTCACAG

TGTGCAATCAATCCTGGGGAGACCTTTTTTTATAATTTTACTGTTGATAACCCCGGTACCTTCTTTTATCATGGACATTT

GGGTATGCAAAGGAGTGCCGGTCTTTATGGATCTCTAATAGTGGATCCACCACAGGGAAAAAAGGAGCCATTTCATTATG

ACGGTGAGATTAACTTGTTATTATCAGACTGGTGGCATCAAAGCATACATAAACAGGAAGTGGGCTTATCTTCAAAACCT

ATTCGTTGGATCGGTGAACCGCAAACTATTCTGCTAAACGGCAGAGGCCAATTTGATTGTTCAATTGCAGCCAAATATGA

TTCCAATCTGGAACCTTGTAAGTTAAAAGGTTCTGAACCATGCGCACCTTACATCTTCCATGTCATGCCTAAAAAGACAT

ACAGAATTAGAATTGCTAGTACTACCGCCCTTGCAGCCTTAAATTTTGCGATAGGAAATCACCCTTTACTAGTGGTTGAG

GCAGACGGCAATTACGTTCAGCCATTCTACACTTCTGACATAGATATATATTCAGGTGAGTCATATTCAGTATTAATAAC

AACTGATCAAAACCCTTCCGAGAATTATTGGGTTTCTGTCGGTACCCGTGGCCGTCATCCAAACACTCCCCCTGGTCTAA

CTTTGCTAAACTATCTTCCTAATTCTGTGAGCAAGTTGCCCACAAGTCCTCCACCTGAAACACCAGCATGGGACGACTTT

GATAGATCTAAAAATTTCACATATAGAATAACAGCAGCTATGGGCTCTCCAAAGCCACCAGTAAAGAGTAACAGACGTAT

TTTTCTTCTGAATACGCAGAACGTTATAAACGGATACGTCAAGTGGGCTATTAATGACGTCTCTTTAGCTCTTCCACCAA

CTCCATACTTAGGTGCTATGAAGTTCAATCTATTGCACGCTTTTGATCAAAACCCACCACCAGAGGTTTTCCCAGAAGAC

TATGATATTGATACACCACCCACTAATGAGAAAACTAAGATCGGTAACGGCGTGTACCAGTTTAAAATTGGTGAAATTGT

GGACGTCATTTTGCAAAACGCTAATATGATGAAAGAGAATCTAAGCGAGATCCATCCTTGGCATCTGCATGGACATGACT

TCTGGGTTTTGGGATACGGCGATGGAAAGTTCACTGCTGAGGAAGAATCATCTCTAAATTTGAAAAATCCGCCTTTGAGA

AACACTGTTGTTATTTTTCCTTATGGATGGACAGCTATCCGTTTTGTAGCGGATAATCCAGGTGTGTGGGCATTTCACTG

CCATATTGAGCCACATTTACACATGGGTATGGGTGTTGTTTTCGCTGAGGGTGTCGAAAAAGTTGGGAGGATTCCCACTA

AGGCATTAGCCTGTGGTGGTACAGCCAAGTCTTTGATTAATAACCCT

SEQ ID NO.4

TCTCAAATCAGACACTACAAATGGGAAGTTGAATATATGTTCTGGGCACCAGACTGTAATGAAAATATAGTTATGGGTAT

CAATGGTCAGTTTCCAGGTCCAACCATAAGAGCTAATGCTGGTGATACCGTAGTCGTTGAATTGATTAATAAGTTACATA

CTGAAGGTGTTGTTATTCACTGGCATGGTATTTTACAAAGAGGCACACCATGGGCTGACGGTACTGCATCTATTTCACAA

TGTGCAATCAATCCAGGTGAAACATTTTTCTATAACTTCACCGTGGATAATCCTGGTACTTTTTTCTATCATGGTCATTT

AGGTATGCAAAGATCTGCAGGTTTGTATGGTTCTTTGATTGTTGATCCACCACAAGGCAAGAAAGAGCCTTTCCATTATG

ATGGTGAAATTAATTTATTATTGTCAGATTGGTGGCACCAATCTATTCATAAACAAGAAGTTGGTTTATCGTCGAAGCCA

ATTAGATGGATTGGTGAACCTCAAACAATTCTTTTGAATGGCAGAGGTCAATTCGATTGTTCTATTGCTGCTAAATACGA

TTCTAACTTGGAACCCTGTAAATTAAAAGGTTCTGAACCATGTGCTCCATACATCTTTCATGTTATGCCCAAAAAGACTT

ATAGAATCAGGATTGCTTCTACAACTGCTTTGGCAGCCTTGAATTTTGCTATTGGTAATCATCCTCTGTTGGTTGTTGAA

GCTGATGGTAACTACGTTCAACCATTCTATACTTCTGACATTGATATATACTCTGGTGAATCTTATAGCGTCTTAATAAC

GACAGATCAAAACCCATCTGAAAATTATTGGGTTTCTGTGGGTACTAGAGGTAGACATCCAAATACTCCACCAGGTTTAA

CTTTATTGAATTATTTGCCCAATTCCGTTTCTAAGTTGCCAACTTCTCCTCCACCAGAAACCCCAGCCTGGGACGACTTT

GATAGATCCAAAAATTTCACTTACAGAATCACGGCCGCAATGGGTTCTCCAAAACCACCAGTCAAGAGTAATCGTAGAAT

TTTTTTGTTGAATACCCAAAATGTAATTAACGGATATGTTAAGTGGGCTATTAATGATGTTTCTTTGGCCTTGCCTCCAA

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TACGACATTGATACTCCACCAACAAACGAAAAAACAAAAATTGGTAATGGCGTTTATCAATTCAAAATAGGTGAAATCGT

TGACGTTATTTTGCAAAATGCAAATATGATGAAAGAAAACTTATCTGAAATTCACCCATGGCATTTGCATGGTCATGATT

TCTGGGTTTTAGGTTACGGTGATGGTAAATTTACTGCTGAAGAGGAATCATCTCTGAACTTGAAAAATCCACCTTTAAGA

AACACCGTGGTTATTTTTCCATACGGTTGGACTGCAATAAGATTTGTTGCTGATAATCCAGGTGTTTGGGCTTTCCATTG

TCATATAGAACCACATTTACATATGGGTATGGGTGTCGTATTTGCAGAAGGCGTTGAAAAAGTTGGTAGAATTCCAACAA

AAGCATTGGCTTGTGGTGGTACAGCTAAGTCTTTGATTAACAACCCA

【酶活检测】

AAO可直接氧化抗坏血酸，因此可通过测定抗坏血酸氧化量，可检测AAO的活性，检测波长为265nm。具体实验步骤如下：

1)酶标仪预热30min，设置孵育温度为25℃。

2)采用索莱宝抗坏血酸氧化酶(AAO)试剂盒，按照其说明书配置反应液。

3)在96孔酶标板中加入100μL工作液，在265nm处检测OD值A1，25℃反应2min后，在265nm处检测OD值A2，计算反应前后的OD差值A1-A2。

4)将AAO阳性酶(512U/μL)梯度稀释成不同浓度，建立标准曲线。根据标准曲线计算确定酶活。抗坏血酸氧化酶标准曲线结果见图3。

将实施例和对比例(优化密码子SEQ ID NO.3)中制备的重组酶按照上述方法测吸光度，结果如下表5：

表5纯化成品的酶活测定结果

对比例纯化后样品浓度为5.893mg/mL，平均活力为82.1U/mL，则比活力为82.1/5.893＝13.93U/mg。

实施例纯化后样品浓度为6.577mg/mL，平均活力为217.6U/mL，则比活力为217.6/6.577＝33.08U/mg，明显高于对比例。

本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。

Claims (10)

1.一种编码抗坏血酸氧化酶蛋白的分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸经密码子优化，且所述多核苷酸选自以下任一种：

(i)如SEQ ID NO.2所示的多核苷酸；

(ii)与如SEQ ID NO.2所示序列的同源性大于95％的多核苷酸；和

(iii)与(i)或(ii)中所述的序列互补的多核苷酸。

2.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括如权利要求1所述的多核苷酸。

3.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为毕赤酵母菌表达载体，优选为pPic9k。

4.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括如权利要求2或3所述的表达载体；或者

所述宿主细胞的基因组中整合有如权利要求1所述的多核苷酸。

5.一种制备抗坏血酸氧化酶蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

使含有如权利要求1所述的多核苷酸载体转化宿主细胞；

培养所述宿主细胞，以表达所述抗坏血酸氧化酶蛋白。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在BSM培养基中培养所述宿主细胞。。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，首先在YPD培养基中培养所述宿主细胞，得到单菌落后接种于BSM培养基中培养所述宿主细胞。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，首先在含有甘油的培养基中培养所述宿主细胞，后加入甲醇继续培养，以表达出目的蛋白。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在25-30℃下培养所述宿主细胞；

和/或，在pH为4.8-5.5的培养基中培养所述宿主细胞；

和/或，在搅拌速度为200-1000rpm的条件下培养所述宿主细胞。

10.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：如权利要求1所述的多核苷酸；或者

如权利要求2或3所述的表达载体；或者

如权利要求4所述的宿主细胞；或者

根据权利要求5至9任一项所述的方法所制备的抗坏血酸氧化酶蛋白。