CN117004679A - 南极假丝酵母脂肪酶b分子进化及催化合成（s）-1,4-苯并二噁烷 - Google Patents

南极假丝酵母脂肪酶b分子进化及催化合成（s）-1,4-苯并二噁烷 Download PDF

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Abstract

本发明提供了南极假丝酵母脂肪酶B和突变体及其制法和应用。具体地，本发明涉及一种南极假丝酵母脂肪酶B的体外定向进化及其催化动力学拆分(R,S)‑1,4‑苯并二噁烷‑2‑甲酸甲酯合成手性药物中间体的应用及其条件优化。本发明还提供了体外动力学拆分反应的方法。本发明的酶和突变体可用于体外酶促合成(R)‑或(S)‑1,4‑苯并二噁烷类分子。

Description

南极假丝酵母脂肪酶B分子进化及催化合成（S）-1,4-苯并二 噁烷
技术领域
本发明属于分子生物学和生物催化领域，具体地涉及南极假丝酵母脂肪酶B 及催化(R,S)-1,4-苯并二噁烷-2-甲酸甲酯动力学拆分的应用。本发明提供了南极假丝酵母脂肪酶B及其突变体，及催化(R,S)-1,4-苯并二噁烷-2-甲酸甲酯。
背景技术
1,4-苯并二噁烷(1,4-Benzodioxane)是药物化学中广泛使用的一种多功能结构模块，用于合成多种生物活性化合物。1,4-苯并二噁烷衍生物具有前列腺素I2诱导剂、神经营养、抗血管生成以及抗氧化等生物活性，可作为抗肿瘤药物与抗菌剂。研究发现其S和R构型有不同的功能，如(S)-构型1,4-苯并二噁烷衍生物类药物普罗克生(Proroxan)，多沙唑嗪(Doxazosin)等具有更强的抗高血压功能，(R)-型的 MCK-242是抗抑郁药的重要成分。因此制备特定手性构型的1,4-苯并二噁烷对于医药产业具有重要意义。
目前，1,4-苯并二噁烷类化合物主要通过化学方法获得，通过不对称合成、结晶、外消旋体拆分、手性池和手性HPLC等步骤，获得特定构型的手性分子。其制备过程存在对映体选择性低、有毒有害副产物多、后续分离纯化步骤复杂、分离成本高等缺点，因此建立绿色、高效的生物酶法合成得到研究者的广泛关注。Rouf 等用Arthrobacter来源的脂肪酶催化动力学拆分(R,S)-1,4-苯并二噁烷-2-甲酸甲酯，合成了含1,4-苯并二噁烷骨架的(S)-型对映体，实现了42％的转化率和73％的ees值；Kalkote等利用Alcaligenes来源的脂肪酶水解甲磺酸多沙唑嗪中间体(R,S)-甲基 -1，4-苯并二噁英-2-羧酸盐获得(S)-型酸，实现89％的ees值，但是没有转化率的记录。然而目前文献报道的酶法催化动力学拆分的对映体选择性仍然有限，不能满足药物高效制造的需求，因此亟需对候选酶进一步酶分子改造以实现特定构型光学纯 1,4-苯并二噁烷类化合物的精准合成。
南极假丝酵母脂肪酶B(Candida antarctica lipase B，CalB)是一种具有高催化活性的微生物脂肪酶，在手性药物的动力学拆分已有成功报道。Sikora等人通过野生型CalB催化β-受体阻滞剂(R,S)-普萘洛尔动力学拆分，获得(S)-醋酸普萘洛尔，产物的ees值达到90.1％；然而对其他药物合成，由于底物结合口袋对底物立体选择性低，仍需进行分子改造，例如Liu等人通过半理性设计，构建了CalB突变体EF5，提高了对(R)-型的3-取代戊二酸单酯的选择性；进一步利用分子对接等手段确定了活性口袋和底物通道上两个关键残基D223和A281的突变能降低构象动力学参数，得到更高R对映体选择性(>99.00％)的突变体D223V/A281S。Marton等人曾发现突变体I189A、L278V和A282L改变了通往活性位点的疏水通道的宽度和形状，导致了对映体选择性的改变。且Shen等人构建的CalB的突变体I189K实现583.8g L-1 d-1的莫西沙星手性中间体产率。Wu等人预测了E188位点与对映体选择性的相关性，且Katarzyna等发现E188对酶与底物结合比较重要。Wu等人也发现CalB的突变体A225M对(S)-型1,4-苯并二噁烷有更高的选择性(>90％)。此外，Magnusson 等人曾通过理性设计发现催化活性中心(催化三联体S105-D187-H224)附近的残基突变对于底物的立体选择性有主要影响
目前，文献报道的酶法催化动力学拆分的对映体选择性还有进一步提升的空间，因此亟需进一步改造酶分子以实现更高的对映体选择性。
发明内容
本发明的目的就是提供南极假丝酵母脂肪酶B及其突变体的制法及其催化 (R,S)-1,4-苯并二噁烷-2-甲酸甲酯动力学拆分的方法及优化条件。
在本发明的第一方面，提供了一种酶法催化动力学拆分方法，包括步骤：
(a)在南极假丝酵母脂肪酶B或其突变体的存在下，使底物(R,S)-1,4-苯并二噁烷-2- 甲酸甲酯发生酶促动力学拆分反应，从而形成含反式产物(S)-1,4-苯并二噁烷-2-甲酸的反应混合物，
其中，所述反应混合物中，(S)-1,4-苯并二噁烷-2-甲酸(式(S)-2化合物)的数量A1与(R)-1,4-苯并二噁烷-2-甲酸的数量A2之比A1/A2≥2:1。
在另一优选例中，所述的突变体在选自下组的位点具有突变：223位、225位或其组合，其中所述位点基于SEQ ID No:1所示的野生型南极假丝酵母脂肪酶B序列。
在另一优选例中，所述的突变体具有选自下组的223位的突变：D223N、D223G、D223S、D223R、D223T。
在另一优选例中，所述的突变体具有选自下组的225位的突变：A225K、A225R、A225W、A225Y。
在另一优选例中，所述的突变体具有选自下组的突变：D223N/A225K、 D223G/A225W、D223S/A225W、D223G/A225Y、D223N/A225Y、D223S/A225R、 D223S/A225Y、D223G/A225K、D223R/A225R、D223R/A225W、D223T/A225Y。
在另一优选例中，所述的突变体具有以下突变：D223N/A225K，其中所述位点基于SEQ ID No:1所示的野生型南极假丝酵母脂肪酶B序列。
在另一优选例中，所述的突变体(D223N/A225K的突变型南极假丝酵母脂肪酶B)的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。
在另一优选例中，所述的突变体具有以下突变：E188Q/I189T，其中所述位点基于SEQ ID No:1所示的野生型南极假丝酵母脂肪酶B序列。
在另一优选例中，所述的突变体(E188Q/I189T的突变型南极假丝酵母脂肪酶B)的氨基酸序列如SEQ ID No:3所示。
在另一优选例中，所述的突变体具有上述223位和/或225位的突变，还进一步具有E188Q/I189T突变。
在另一优选例中，所述的突变体具有D223N/A225K和E188Q/I189T突变，其中所述位点基于SEQ ID No:1所示的野生型南极假丝酵母脂肪酶B序列。
在另一优选例中，所述的突变体对(S)-1,4-苯并二噁烷-2-甲酸的拆分选择性优于野生型南极假丝酵母脂肪酶B。
在另一优选例中，所述的突变体对(S)-1,4-苯并二噁烷-2-甲酸的拆分选择性Y1与野生型南极假丝酵母脂肪酶B对(S)-1,4-苯并二噁烷-2-甲酸的拆分选择性Y0之比 (Y1/Y0)≥1.2，较佳地≥1.5，更佳地≥2.0(如1.2-5，较佳地1.5-3.0，更佳地2.0-2.5)。
在另一优选例中，所述的突变体保留野生型南极假丝酵母脂肪酶B对(S)-1,4-苯并二噁烷-2-甲酸的拆分选择性。
在另一优选例中，在步骤(a)中，在一液相反应体系中进行。
在另一优选例中，所述液相反应体系的溶剂选自下组：DMSO、正丁醇、异丙醇、乙酸乙酯、氯仿等。
在另一优选例中，在步骤(a)中，反应温度30-45℃，较佳地33-42℃，更佳地 35-39℃。
在另一优选例中，在步骤(a)中，反应时间为40-60min。
在另一优选例中，所述方法还包括步骤：
(b)从所述反应混合物分离出反式产物(S)-1,4-苯并二噁烷-2-甲酸。
在本发明的第二方面，提供了一种酶法催化动力学拆分方法，包括步骤：
(a)在南极假丝酵母脂肪酶B的选择性反转突变体的存在下，使底物(R,S)-1,4-苯并二噁烷-2-甲酸甲酯发生酶促动力学拆分反应，从而形成含反式产物(R)-1,4-苯并二噁烷-2-甲酸的反应混合物，
其中，所述反应混合物中，(R)-1,4-苯并二噁烷-2-甲酸的数量A2与(S)-1,4-苯并二噁烷-2-甲酸的数量A1之比A2/A1≥1:1。
在另一优选例中，所述的选择性反转突变体具有选自下组的突变：E188D/I189M、E188N/I189Y、E188D/I189Y、E188D/I189F，其中所述位点基于SEQ ID No:1所示的野生型南极假丝酵母脂肪酶B序列。
在另一优选例中，在步骤(a)中，在一液相反应体系中进行。
在另一优选例中，所述液相反应体系的溶剂选自下组：DMSO、正丁醇、异丙醇、乙酸乙酯、氯仿等。
在另一优选例中，在步骤(a)中，反应温度30-45℃，较佳地33-42℃，更佳地35-39℃。
在另一优选例中，在步骤(a)中，反应时间为40-60min。
在另一优选例中，所述方法还包括步骤：
(b)从所述反应混合物分离出反式产物(S)-1,4-苯并二噁烷-2-甲酸。
在本发明的第三方面，提供了一种分离的或纯化的南极假丝酵母脂肪酶 B(CalB)突变体，所述的突变体选自下组：
(i)具有D223N/A225K的南极假丝酵母脂肪酶B突变体；
(ii)具有E188Q/I189T的南极假丝酵母脂肪酶B突变体；
其中，所述的氨基酸编号基于SEQ ID No:1所示的野生型南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)的氨基酸序列；
在另一优选例中，所述的具有D223N/A225K的突变型南极假丝酵母脂肪酶B突变体的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示；
在另一优选例中，所述的具有E188Q/I189T的突变型南极假丝酵母脂肪酶B突变体的氨基酸序列如SEQ ID No:3所示。
在本发明的第四方面，提供了一种分离的或纯化的南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)突变体，所述的突变体为具有选自下组突变的南极假丝酵母脂肪酶B突变体：
E188D/I189M、E188N/I189Y、E188D/I189Y或E188D/I189F；
其中，所述的氨基酸编号基于SEQ ID No:1所示的野生型南极假丝酵母脂肪酶B的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述的第四方面突变体基于不同于野生型CalB的反转的水解偏好性，即优先水解R构型底物。
在本发明的第五方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸编码本发明第三或第四方面所述南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)突变体。
在另一优选例中，所述编码突变型南极假丝酵母脂肪酶B的多核苷酸的序列与SEQID NO:4基本相同，不同点仅在于：编码特定位点的突变氨基酸的密码子存在不同(例如，对于D223N/A225K突变型南极假丝酵母脂肪酶B而言，则对应于223位氨基酸的密码子为编码氨基酸N的密码子，对应于225位氨基酸的密码子为编码氨基酸K的密码子)。
在本发明的第六方面，提供了一种载体，所述的载体含有本发明第五方面所述的多核苷酸。
在本发明的第七方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，所述的宿主细胞含有本发明第六方面所述的载体，或其基因组中整合本发明第五方面所述的多核苷酸。
在本发明的第八方面，提供了一种本发明第三或第四方面所述的南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)突变体的用途，它被用于催化动力学拆分反应，或被用于制备催化动力学拆分反应的催化制剂。
在另一优选例中，所述动力学拆分反应的底物包括：(R,S)-1,4-苯并二噁烷-2-甲酸甲酯。
在另一优选例中，所述南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)突变体用于较野生型CalB 更佳地优先分解(R)-1,4-苯并二噁烷-2-甲酸甲酯。
在另一优选例中，所述南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)突变体的选择性反转，用于优先分解(S)-1,4-苯并二噁烷-2-甲酸甲酯。
在本发明的第九方面，提供了一种进行动力学拆分反应的反应体系，所述的反应体系包括：
(Z1)酶，所述酶选自下组：南极假丝酵母脂肪酶B或其突变体；和
(Z2)(R,S)-1,4-苯并二噁烷-2-甲酸甲酯底物。
在另一优选例中，所述的突变体为本发明第三或第四方面所述的南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)突变体。
在另一优选例中，所述的反应体系还包括：
(Z3)溶剂；
(Z4)磷酸盐缓冲液混合。
在另一优选例中，所述的溶剂选自下组的有机溶剂：DMSO、正丁醇、异丙醇、乙酸乙酯、氯仿或其组合。
在另一优选例中，所述的溶剂为双相溶剂体系。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例) 中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了南极假丝酵母脂肪酶B纯化后SDS-PAGE电泳分析结果图。
图2显示了南极假丝酵母脂肪酶B及突变体催化(R,S)-1,4-苯并二噁烷-2- 甲酸甲酯动力学拆分生成(S)-1,4-苯并二噁烷-2-甲酸的转化率与ees值。
图3显示了南极假丝酵母脂肪酶B及其构型反转偏好突变体催化 (R,S)-1,4-苯并二噁烷-2-甲酸甲酯动力学拆分生成(R)-1,4-苯并二噁烷-2-甲酸的ees值。
图4显示了温度对南极假丝酵母脂肪酶B野生型和突变体D223N/A225K 催化动力学拆分的反应影响。
图5显示了共溶剂种类对南极假丝酵母脂肪酶B野生型和突变体 D223N/A225K催化动力学拆分的反应影响。
图6显示了共溶剂百分比对南极假丝酵母脂肪酶B野生型和突变体 D223N/A225K催化动力学拆分的反应影响。
图7显示了南极假丝酵母脂肪酶B野生型和突变体催化(R,S)-1,4-苯并二噁烷-2-甲酸甲酯动力学拆分的时间进程。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，经过大量筛选，首次意外地开发了一种可以选择性地酶促动力学拆分(R,S)-1,4-苯并二噁烷-2-甲酸甲酯的方法。具体地，本发明人发现，南极假丝酵母脂肪酶B及其突变体对于(R,S)-1,4-苯并二噁烷-2- 甲酸甲酯具有拆分选择性。本发明人还对南极假丝酵母的脂肪酶B进行进行定向进化改造，并获得了对映体选择性改善的突变蛋白(如选择性ees值显著提升的突变体D223N/A225K。此外，本发明人还意外地获得了对(R,S)-1,4-苯并二噁烷-2-甲酸甲酯底物选择性发生反转的南极假丝酵母脂肪酶B的突变体 E188D/I189M。本发明的南极假丝酵母脂肪酶B及其突变体可用于体外酶法选择性地合成对S型或R型1,4-苯并二噁烷-2-甲酸。在此基础上完成了本发明。
定义
如本文所用，术语“南极假丝酵母脂肪酶B突变体”、“南极假丝酵母脂肪酶B 突变蛋白”、“突变型南极假丝酵母脂肪酶B”可互换使用，指与野生型南极假丝酵母脂肪酶B的氨基酸序列相比，具有一个或多个氨基酸取代、缺失或插入的突变蛋白。
如本文所用，“ee值”即enantiomeric excess的缩写，指对映体过剩率，定义为在对映体混合物中一个异构体a比另一个异构体b多出来的量占总量的百分数。
如本文所用，“ees值”指底物过剩率，定义为在底物对映体混合物中R型异构体比S型异构体多出的量占总量的百分数。
AS和AR分别表示反应后，底物中R构型底物和S构型底物的未被水解的量。以(R,S)-1,4-苯并二噁烷-2-甲酸甲酯为例，R构型底物指(R)-1,4-苯并二噁烷-2- 甲酸甲酯；而S构型底物指(S)-1,4-苯并二噁烷-2-甲酸甲酯。
本发明蛋白
如本文所用，术语“本发明蛋白”指出南极假丝酵母脂肪酶B或其突变体。
在本发明中，一类特别优选的蛋白是
(i)具有D223N/A225K的南极假丝酵母脂肪酶B突变体；
(ii)具有E188Q/I189T的南极假丝酵母脂肪酶B突变体。
如本文所用，“分离的多肽”是指所述多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化所述多肽。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。所述多肽的纯度还可以用氨基酸序列进行进一步分析。
本发明的活性多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、植物)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是脱水缩合的，也可以是非脱水缩合的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括所述多肽的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持所述多肽相同的生物学功能或活性的多肽。
本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
所述的多肽优选序列为SEQ ID NO:2或3所示的多肽，该术语还包括具有与所示多肽具有相同功能的、SEQ ID NO:2或3序列的变异形式及衍生多肽。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30 个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在 C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。
例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括本发明南极假丝酵母脂肪酶B(CalB) 的活性片段和活性衍生物。本发明还提供所述多肽的类似物。
这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D- 氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
本发明蛋白的氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可以用于本发明。例如，所述的标签可以是FLAG、HA、 HA1、c-Myc、Poly–His、Poly-Arg、Strep-TagII、AU1、EE、T7、4A6、ε、B、 gE、以及Ty1。这些标签可用于对蛋白进行纯化。
为了使翻译的蛋白分泌表达(如分泌到细胞外)，还可在所述南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)的氨基酸氨基末端添加上信号肽序列，如pelB信号肽等。信号肽在多肽从细胞内分泌出来的过程中可被切去。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括 cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。 DNA可以是编码链或非编码链。
以编码D223N/A225K的突变型的CalB为例，编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQID NO:2所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:2的蛋白质，但与SEQ ID NO:4所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码SEQ ID NO:1的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件(或严紧条件)下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC， 0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO:1所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR) 以确定和/或分离编码南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)蛋白的多聚核苷酸。
本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。本发明的南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法 (RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)多肽。一般来说有以下步骤：
用本发明的编码南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；在合适的培养基中培养的宿主细胞；从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含南极假丝酵母脂肪酶B(CalB) 编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。
在另一优选例中，合适的宿主细胞包括革兰氏阳性细菌如枯草芽孢杆菌，革兰氏阴性细菌如大肠杆菌，放线菌如链霉菌，酵母如酿酒酵母，真菌如曲霉菌，它们的细胞均是常用的重组载体的宿主细胞。
本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10 到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用 MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
应用
本发明还提供了本发明南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)及其突变体的应用，尤其是在催化使(R,S)-1,4-苯并二噁烷-2-甲酸甲酯进行动力学拆分反应方面的应用。
一种优选的例子是用于药物中间体的合成。代表性地，本发明的南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)可用于制备(S)-1,4-苯并二噁烷或(R)-1,4-苯并二噁烷类产物。
南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)催化生成的(S)-1,4-苯并二噁烷类化合物是合成抗高血压药物的多沙唑嗪、普罗派生等药物的重要中间体，(R)-1,4-苯并二噁烷类化合物是合成抗抑郁药物MCK-242等的重要中间体。本发明的南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)及其突变体可催化生成(S)-1,4-苯并二噁烷或(R)-1,4-苯并二噁烷类对映体纯化合物。
由于本发明的某些突变的南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)对(S)-1,4-苯并二噁烷类化合物的对映体选择性显著提高(如D223N/A225K)，因此可用于体外酶法合成(S)-1,4-苯并二噁烷-2-甲酸。
由于本发明的某些突变的南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)对(R)-1,4-苯并二噁烷类化合物具有反转的对映体选择性(如E188D/I189M)，因此可用于体外酶法合成(R)-1,4-苯并二噁烷-2-甲酸。
典型地，本发明提供了一种使用本发明的南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)在体外合成相应(S)-1,4-苯并二噁烷或(R)-1,4-苯并二噁烷类对映体纯化合物的方法。在本发明方法中，以(R,S)-1,4-苯并二噁烷-2-甲酸甲酯原料，在南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)的催化作用下可直接生成相应的产物(S)-1,4-苯并二噁烷或 (R)-1,4-苯并二噁烷类对映体纯化合物。
优选地，所述南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)或上述第二方面所提供的南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)突变体。在优化后的条件下，南极假丝酵母脂肪酶 B(CalB)催化反应的转化率为47.5％,ees值达93.9％。
优选地，所述酶载量为18μg/mL。
优选地，所述底物浓度为1mg/mL底物。
优选地，所述的双相溶剂体系为正丁醇/磷酸盐缓冲液(20:80，v/v)。
优选地，所述温度为37℃
优选地，所述反应时间50min。
合成(S)-1,4-苯并二噁烷-2-甲酸的方法
在本发明中，还提供了一种使用本发明南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)体外合成(S)-1,4-苯并二噁烷-2-甲酸的方法。典型的，该方法包括：以(R,S)-1,4-苯并二噁烷-2-甲酸甲酯为原料，在南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)的催化作用下可直接生成(S)-1,4-苯并二噁烷-2-甲酸。
实验表明，本发明的酶特别适合用于通过体外酶法转化合成(S)-1,4-苯并二噁烷-2-甲酸。
优选地，所述南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)或上述第二方面所提供的还原胺化酶突变体。在相同条件下，南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)突变体催化 (R,S)-1,4-苯并二噁烷-2-甲酸甲酯生成(S)-1,4-苯并二噁烷-2-甲酸的对映体选择性明显提高，转化率为47.5％,ees值达93.9％。
优选地，所述酶载量为18μg/mL。
优选地，所述底物浓度为1mg/mL底物。
优选地，所述的双相溶剂体系为正丁醇/磷酸盐缓冲液(20:80，v/v)。
优选地，所述温度为37℃
优选地，所述反应时间50min。
本发明的主要优点包括：
(a)利用本发明所述的南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)突变体在体外酶法合成相应的(S)-1,4-苯并二噁烷-2-甲酸，转化率为47.5％,ees值可达93.9％。
(b)利用本发明所述的南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)在体外酶法合成(S)-1,4-苯并二噁烷-2-甲酸，ees值可达69.3％；其突变体在相同条件下，催化合成(S)-1,4-苯并二噁烷-2-甲酸的对映体选择性明显提高，可达93.9％。
(c)利用本发明所述的南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)成功实现了在体外酶法合成对映体纯的(S)-1,4-苯并二噁烷-2-甲酸。
(d)本发明获得的南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)及其突变体可用于体外酶法合成对映体纯的(S)-1,4-苯并二噁烷-2-甲酸，是区别于现有生产技术的一种新的生产方法，生产过程简化、消耗低、绿色环保。
下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和分数是重量百分比和重量分数。
材料和试剂
本发明所述的生物材料的来源的一般性说明：
引物合成：本发明中所使用的引物均由上海擎科生物科技有限公司合成制备。
实验中所使用的PrimeSTAR Max DNA聚合酶购自TakaRa公司；使用的 DNA胶回收试剂盒及质粒小提试剂盒均购自Axygen公司。
实施例1南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)的构建
具体地，在本实施例中，本发明基于南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)及其编码序列。其氨基酸序列如SEQ ID No:1所示：
对CalB基因经过密码子优化后，以便于在大肠杆菌中表达。优化后的编码序列如SEQ ID No:4所示：
通过全基因合成方法合成SEQ ID No:4所示的序列，两端添加了酶切位点 NcoⅠ和XhoⅠ，将该全长序列克隆入至市售的pET-22b(+)质粒的NcoⅠ、XhoⅠ酶切位点。
实施例2南极假丝酵母脂肪酶B表达与纯化
将上述筛选基因的重组表达质粒热休克转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞，进行基因表达及蛋白纯化。培养重组菌至OD600为0.6-0.8时，添加IPTG至终浓度为0.01mM，在低温15℃、220 rpm条件下诱导培养过夜。
离心收集菌体，将细胞重悬于20 mM Tris-HCl缓冲液中(pH8.0，500mM NaCl，20mM咪唑)。250mL的培养细胞最终重悬于40mL的缓冲液中，使用高压匀浆细胞破碎仪(4～6℃，700pa)进行细胞破碎，然后细胞破碎液以12000rpm高速离心 30min(4℃)，收集上清液再次重复12000rpm离心30min(4℃)，收集上清利用 Ni-NTA柱亲和纯化蛋白，使用20mMTris-HCl缓冲液(pH8.0，500mM NaCl， 50mM咪唑)洗脱杂蛋白，最后使用20mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0，500mM NaCl，200mM咪唑)洗脱目标蛋白，洗脱目标蛋白液经过浓缩除盐得到纯化的蛋白。
纯化的蛋白保存50mM PBS缓冲液中(pH 7.5)，使用SDS-PAGE对纯化后的蛋白进行电泳检测，使用Bradford蛋白浓度测定试剂盒(上海生工生物)测定蛋白浓度。
结果如图1所示。结果表明，在35kDa处得到一条清晰的条带，与预测的重组蛋白大小(34.3kDa)基本一致，这表明目标蛋白CalB已得到纯化。
实施例3南极假丝酵母脂肪酶B突变体的构建及对映体选择性测定在本实施例中，针对南极假丝酵母脂肪酶B具有催化(R,S)-1,4-苯并二噁烷-2- 甲酸甲酯动力学拆分的对映体选择性特征。基于文献挖掘、结构分析等方法选择位点，基于作用距离网络分析对关键位点进行双点组合，对该酶进行定向进化改造以获得能高效催化(R,S)-1,4-苯并二噁烷-2-甲酸甲酯动力学拆分的突变体。
以重组质粒pET22b-CalB为模板，以带有突变位点为22c-trick简并碱基 (NDT,VHG,TGG按比例混合)的互补寡核苷酸作引物，用Primestar高保真酶进行全质粒PCR扩增，获得具有特定突变位点的重组质粒。引物序列如下：
对应于SEQ NO:2中第223位天冬氨酸和223位丙氨酸分别被其他19种氨基酸取代的突变体：第188位谷氨酸和189位异亮氨酸被其他19种氨基酸取代的突变体。
扩增体系为：重组质粒模板20ng、引物(10μm)各1μl、PrimeSTAR Max DNA 聚合酶25μl、补充双蒸水至50μl。扩增条件为：98℃预变性3分钟，98℃变性15秒，55℃退火15秒，72℃延伸2分钟，共25个循环，最后72℃彻底延伸10min。反应结束后，以1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。产物经PCR产物纯化试剂盒纯化回收，用DpnⅠ酶(NEB公司)在37℃条件下消化回收产物2小时，降解初始模板。消化产物转化至E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞，涂布到含有 100μg/mL氨苄青霉素和34μg/mL氯霉素的LB琼脂平板上，37℃过夜培养，筛选阳性克隆，测序验证。得到南极假丝酵母脂肪酶B指定位点的饱和突变体重组菌。
按照实施例2的方法得到南极假丝酵母脂肪酶B指定位点的饱和突变体纯化蛋白。
突变体对映体选择性测定反应体系为：4μg/mL突变体纯酶、1mg/mL (R,S)-1,4-苯并二噁烷-2-甲酸甲酯在正丁醇/磷酸盐缓冲液(20:80，v/v)双相体系中。使用50mM PBS(pH9.0)缓冲液将最终反应体积补足至500μL。反应在30℃下以220rpm的速度振荡孵育30min。然后，加入1mL甲基叔丁基醚萃取，震荡10min后，4℃，12000r/min离心10min，取上层有机相旋转蒸发。加入200μL 正己烷/异丙醇(90:10，v/v)复溶，用0.22μm的有机系滤膜过滤后，以正己烷/异丙醇(90:10，v/v)为流动相进行HPLC检测以确定底物的消耗。
其中HPLC检测重组蛋白动力学拆分(R,S)-1,4-苯并二噁烷-2-甲酸甲酯的方法为：使用IG色谱柱，上样量10μL，流动相为正己烷/异丙醇(90:10， v/v)，流速为1mL/min，柱温为30℃，紫外检测波长为220nm。选择有拆分效果的突变体进行后续的Sanger测序鉴定。
结果如图2所示。结果获得了D223N/A225K、D223G/A225W等24个阳性ees 高于野生型或者对映体选择性相对于野生型发生反转的突变体。DNA测序结果显示，发现对映体选择性改善的突变体主要来自D223/A225位点，对映体选择性发生反转的主要来自E188/I189位点。24个突变体中，有17个突变体与野生型的对映体偏好相同，更倾向于水解(S)-构型的底物生成(S)-酸，且具有改进的对应选择性 (ees值)，比野生型提高1.38-2.46倍。其中，大部分对映体选择性提高的突变体都来自D223/A225位点。D223主要突变为Gly、Ser、Asn、Arg、Thr等残基，而 A225主要突变为具有较大支链的Lys、Trp、Tyr、Arg等残基。而突变体D223N/A225K表现出最好的对映体选择性，其相对于野生型的ees值提高至2.46 倍。E188/I189位点的E188Q/I189T也表现出2.06倍于野生型的ees值。
出乎意料地，E188/I189位点的突变体(E188Q/I189T除外)对于对映体选择性存在反转。如图3所示，相比于野生型，E188D/I189M、E188N/I189Y、E188D/I189Y 等7个突变体表现出了对映体选择性反转(即ees值为负值)，偏好水解(R)-型底物，生成(R)-酸。其中，按反转后偏好性的大小排序为：E188D/I189M＞E188N/I189Y ＞E188D/I189Y＞E188D/I189F。这提示，将188位的E突变为天冬酰胺Asn(N) 或天冬氨酸Asp(D)，和/或将189位的I突变为Met(M)、Phe(F)或Tyr(Y)，有助于使突变蛋白对对映体选择性存在反转，即偏好水解(R)-型底物。
实施例4南极假丝酵母脂肪酶B突变体对(R,S)-1,4-苯并二噁烷-2-甲酸甲酯动力学拆分条件优化
在本实施例中，对实施例3得到的最佳突变体D223N/A225K催化动力学拆分的反应条件进行优化。
4.1温度对酶催化反应的影响
反应体系500μL，包括4μg/mL的野生型或突变体，终浓度为1mg/mL的底物(R,S)-1,4-苯并二噁烷-2-甲酸甲酯，100μL正丁醇，用50mmol/L PBS缓冲液(pH 7.5)补齐至500μL。将样品分别在20、30、37、42℃下的反应30min后，加入1mL 甲基叔丁基醚萃取，震荡10min后，4℃，12000r/min离心10min，取上层有机相旋转蒸发。加入200μL正己烷/异丙醇(90:10，v/v)复溶，用0.22μm的有机系滤膜过滤后，以正己烷/异丙醇(90:10，v/v)为流动相进行HPLC检测野生型和最佳突变体催化底物动力学拆分的转化率和ees值，分析温度对野生型和最佳突变体对动力学拆分反应的影响。
结果如图4所示，野生型和突变体D223N/A225K在37℃时均具有最高的ees 值，分别达到10.3％和29.3％。
4.2磷酸盐/有机溶剂双相体系对酶催化反应的影响
在确定的最佳温度等条件下，研究不同有机溶剂类型对催化反应的影响， HPLC检测纯化后的野生型和最佳突变体的催化特性。分别以20％(v/v)的DMSO、正丁醇、异丙醇、乙酸乙酯、氯仿为共溶剂，37℃下以4μg/mL酶量反应30min 后测定反应转化率和ees值，以确定最佳共溶剂种类；随后，检测野生型和最佳突变体在最佳有机溶剂占比为0％、5％、20％、50％、80％、100％(v/v)时的转化率和 ees值，确定最佳溶剂所占反应体系的百分比对反应的影响。
结果如图5和图6所示，野生型和突变体D223N/A225K的最佳溶剂体系为正丁醇/磷酸盐缓冲液(20:80，v/v)双相溶剂体系。
4.3最佳突变体催化(R,S)-1,4-苯并二噁烷-2-甲酸甲酯动力学拆分时间进程
在确定温度、有机溶剂种类及有机溶剂比例等最优单因素条件后，通过预实验摸索酶量与时间双因素对催化反应的影响，最终以18μg/mL的酶量检测催化 (R,S)-1,4-苯并二噁烷-2-甲酸甲酯动力学反应在10、20、30、40、50、60min的转化率与ees值，获得野生型和突变体动力学拆分时间曲线，得到突变体最佳反应条件。
结果如图7所示，在50min时，野生型的ees值为69.3％，此时转化率为48.4％，而突变体D223N/A225K实现约93.9％的ees值，此时转化率约为47.5％。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列信息
SEQ ID No:1(野生型CalB氨基酸序列)
SEQ ID No:2(D223N/A225K突变型CalB氨基酸序列)
SEQ ID No:3(E188Q/I189T突变型CalB氨基酸序列)
SEQ ID No:4(野生型CalB DNA序列)
/>
序列表
<110> 上海交通大学
<120> 南极假丝酵母脂肪酶B分子进化及催化合成(S)-1,4-苯并二噁烷
<130> P2022-0635
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 317
<212> PRT
<213> 南极假丝酵母(Candida antarctica)
<400> 1
Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val Leu
1 5 10 15
Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly Ala Ser Pro Ser Ser Val Ser Lys
20 25 30
Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr Gly Thr Thr Gly Pro Gln Ser Phe
35 40 45
Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu Ser Thr Gln Leu Gly Tyr Thr Pro Cys
50 55 60
Trp Ile Ser Pro Pro Pro Phe Met Leu Asn Asp Thr Gln Val Asn Thr
65 70 75 80
Glu Tyr Met Val Asn Ala Ile Thr Ala Leu Tyr Ala Gly Ser Gly Asn
85 90 95
Asn Lys Leu Pro Val Leu Thr Trp Ser Gln Gly Gly Leu Val Ala Gln
100 105 110
Trp Gly Leu Thr Phe Phe Pro Ser Ile Arg Ser Lys Val Asp Arg Leu
115 120 125
Met Ala Phe Ala Pro Asp Tyr Lys Gly Thr Val Leu Ala Gly Pro Leu
130 135 140
Asp Ala Leu Ala Val Ser Ala Pro Ser Val Trp Gln Gln Thr Thr Gly
145 150 155 160
Ser Ala Leu Thr Thr Ala Leu Arg Asn Ala Gly Gly Leu Thr Gln Ile
165 170 175
Val Pro Thr Thr Asn Leu Tyr Ser Ala Thr Asp Glu Ile Val Gln Pro
180 185 190
Gln Val Ser Asn Ser Pro Leu Asp Ser Ser Tyr Leu Phe Asn Gly Lys
195 200 205
Asn Val Gln Ala Gln Ala Val Cys Gly Pro Leu Phe Val Ile Asp His
210 215 220
Ala Gly Ser Leu Thr Ser Gln Phe Ser Tyr Val Val Gly Arg Ser Ala
225 230 235 240
Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala Arg Ser Ala Asp Tyr Gly Ile Thr
245 250 255
Asp Cys Asn Pro Leu Pro Ala Asn Asp Leu Thr Pro Glu Gln Lys Val
260 265 270
Ala Ala Ala Ala Leu Leu Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ile Val Ala Gly
275 280 285
Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro Asp Leu Met Pro Tyr Ala Arg Pro Phe
290 295 300
Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser Gly Ile Val Thr Pro
305 310 315
<210> 2
<211> 317
<212> PRT
<213> 人工序列(Ariificial Sequence)
<400> 2
Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val Leu
1 5 10 15
Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly Ala Ser Pro Ser Ser Val Ser Lys
20 25 30
Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr Gly Thr Thr Gly Pro Gln Ser Phe
35 40 45
Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu Ser Thr Gln Leu Gly Tyr Thr Pro Cys
50 55 60
Trp Ile Ser Pro Pro Pro Phe Met Leu Asn Asp Thr Gln Val Asn Thr
65 70 75 80
Glu Tyr Met Val Asn Ala Ile Thr Ala Leu Tyr Ala Gly Ser Gly Asn
85 90 95
Asn Lys Leu Pro Val Leu Thr Trp Ser Gln Gly Gly Leu Val Ala Gln
100 105 110
Trp Gly Leu Thr Phe Phe Pro Ser Ile Arg Ser Lys Val Asp Arg Leu
115 120 125
Met Ala Phe Ala Pro Asp Tyr Lys Gly Thr Val Leu Ala Gly Pro Leu
130 135 140
Asp Ala Leu Ala Val Ser Ala Pro Ser Val Trp Gln Gln Thr Thr Gly
145 150 155 160
Ser Ala Leu Thr Thr Ala Leu Arg Asn Ala Gly Gly Leu Thr Gln Ile
165 170 175
Val Pro Thr Thr Asn Leu Tyr Ser Ala Thr Asp Glu Ile Val Gln Pro
180 185 190
Gln Val Ser Asn Ser Pro Leu Asp Ser Ser Tyr Leu Phe Asn Gly Lys
195 200 205
Asn Val Gln Ala Gln Ala Val Cys Gly Pro Leu Phe Val Ile Asn His
210 215 220
Lys Gly Ser Leu Thr Ser Gln Phe Ser Tyr Val Val Gly Arg Ser Ala
225 230 235 240
Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala Arg Ser Ala Asp Tyr Gly Ile Thr
245 250 255
Asp Cys Asn Pro Leu Pro Ala Asn Asp Leu Thr Pro Glu Gln Lys Val
260 265 270
Ala Ala Ala Ala Leu Leu Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ile Val Ala Gly
275 280 285
Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro Asp Leu Met Pro Tyr Ala Arg Pro Phe
290 295 300
Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser Gly Ile Val Thr Pro
305 310 315
<210> 3
<211> 317
<212> PRT
<213> 人工序列(Ariificial Sequence)
<400> 3
Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val Leu
1 5 10 15
Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly Ala Ser Pro Ser Ser Val Ser Lys
20 25 30
Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr Gly Thr Thr Gly Pro Gln Ser Phe
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Trp Gly Leu Thr Phe Phe Pro Ser Ile Arg Ser Lys Val Asp Arg Leu
115 120 125
Met Ala Phe Ala Pro Asp Tyr Lys Gly Thr Val Leu Ala Gly Pro Leu
130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
Val Pro Thr Thr Asn Leu Tyr Ser Ala Thr Asp Gln Thr Val Gln Pro
180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Ala Gly Ser Leu Thr Ser Gln Phe Ser Tyr Val Val Gly Arg Ser Ala
225 230 235 240
Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala Arg Ser Ala Asp Tyr Gly Ile Thr
245 250 255
Asp Cys Asn Pro Leu Pro Ala Asn Asp Leu Thr Pro Glu Gln Lys Val
260 265 270
Ala Ala Ala Ala Leu Leu Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ile Val Ala Gly
275 280 285
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290 295 300
Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser Gly Ile Val Thr Pro
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<210> 4
<211> 954
<212> DNA
<213> 南极假丝酵母(Candida antarctica)
<400> 4
ctaccttccg gttcggaccc tgccttttcg cagcccaagt cggtgctcga tgcgggtctg 60
acctgccagg gtgcttcgcc atcctcggtc tccaaaccca tccttctcgt ccccggaacc 120
ggcaccacag gtccacagtc gttcgactcg aactggattc ccctctcaac gcagttgggt 180
tacacaccct gctggatctc acccccgccg ttcatgctca acgacaccca ggtcaacacg 240
gagtacatgg tcaacgccat caccgcgctc tacgctggtt cgggcaacaa caaacttccc 300
gtgcttacct ggtcccaggg tggtctggtt gcacagtggg gtctgacctt cttccccagt 360
atcaggtcca aggtcgatcg acttatggcc tttgcgcccg actacaaggg caccgtcctc 420
gccggccctc tcgatgcact cgcggttagt gcaccctccg tatggcagca aaccaccggt 480
tcggcactca ccaccgcact ccgaaacgca ggtggtctga cccagatcgt gcccaccacc 540
aacctctact cggcgaccga cgagatcgtt cagcctcagg tgtccaactc gccactcgac 600
tcatcctacc tcttcaacgg aaagaacgtc caggcacagg ccgtgtgtgg gccgctgttc 660
gtcatcgacc atgcaggctc gctcacctcg cagttctcct acgtcgtcgg tcgatccgcc 720
ctgcgctcca ccacgggcca ggctcgtagt gcagactatg gcattacgga ctgcaaccct 780
cttcccgcca atgatctgac tcccgagcaa aaggtcgccg cggctgcgct cctggcgccg 840
gcagctgcag ccatcgtggc gggtccaaag cagaactgcg agcccgacct catgccctac 900
gcccgcccct ttgcagtagg caaaaggacc tgctccggca tcgtcacccc ctga 954

Claims (10)

1.一种酶法催化动力学拆分方法，其特征在于，包括步骤：
(a)在南极假丝酵母脂肪酶B或其突变体的存在下，使底物(R,S)-1,4-苯并二噁烷-2-甲酸甲酯发生酶促动力学拆分反应，从而形成含反式产物(S)-1,4-苯并二噁烷-2-甲酸的反应混合物，
其中，所述反应混合物中，(S)-1,4-苯并二噁烷-2-甲酸(式(S)-2化合物)的数量A1与(R)-1,4-苯并二噁烷-2-甲酸的数量A2之比A1/A2≥2:1。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的突变体在选自下组的位点具有突变：223位、225位或其组合，其中所述位点基于SEQ ID No:1所示的野生型南极假丝酵母脂肪酶B序列；
或者，所述的突变体具有以下突变：D223N/A225K，其中所述位点基于SEQ ID No:1所示的野生型南极假丝酵母脂肪酶B序列；
或者，所述的突变体具有以下突变：E188Q/I189T，其中所述位点基于SEQ ID No:1所示的野生型南极假丝酵母脂肪酶B序列。
3.一种酶法催化动力学拆分方法，其特征在于，包括步骤：
(a)在南极假丝酵母脂肪酶B的选择性反转突变体的存在下，使底物(R,S)-1,4-苯并二噁烷-2-甲酸甲酯发生酶促动力学拆分反应，从而形成含反式产物(R)-1,4-苯并二噁烷-2-甲酸的反应混合物，
其中，所述反应混合物中，(R)-1,4-苯并二噁烷-2-甲酸的数量A2与(S)-1,4-苯并二噁烷-2-甲酸的数量A1之比A2/A1≥1:1；
其中，所述的选择性反转突变体具有选自下组的突变：E188D/I189M、E188N/I189Y、E188D/I189Y、E188D/I189F，其中所述位点基于SEQ ID No:1所示的野生型南极假丝酵母脂肪酶B序列；
(b)从所述反应混合物分离出反式产物(S)-1,4-苯并二噁烷-2-甲酸。
4.一种分离的或纯化的南极假丝酵母脂肪酶B突变体，其特征在于，所述的突变体选自下组：
(i)具有D223N/A225K的南极假丝酵母脂肪酶B突变体；
(ii)具有E188Q/I189T的南极假丝酵母脂肪酶B突变体；
其中，所述的氨基酸编号基于SEQ ID No:1所示的野生型南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)的氨基酸序列。
5.一种分离的或纯化的南极假丝酵母脂肪酶B突变体，其特征在于，所述的突变体为具有选自下组突变的南极假丝酵母脂肪酶B突变体：
E188D/I189M、E188N/I189Y、E188D/I189Y或E188D/I189F；
其中，所述的氨基酸编号基于SEQ ID No:1所示的野生型南极假丝酵母脂肪酶B的氨基酸序列。
6.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸编码权利要求4或5所述的南极假丝酵母脂肪酶B突变体。
7.一种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求6所述的多核苷酸。
8.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有权利要求7所述的载体，或其基因组中整合权利要求6所述的多核苷酸。
9.一种权利要求4或5所述的南极假丝酵母脂肪酶B突变体的用途，其特征在于，它被用于催化动力学拆分反应，或被用于制备催化动力学拆分反应的催化制剂。
10.一种进行动力学拆分反应的反应体系，其特征在于，所述的反应体系包括：
(Z1)酶，所述酶选自下组：南极假丝酵母脂肪酶B或其突变体；和
(Z2)(R,S)-1,4-苯并二噁烷-2-甲酸甲酯底物。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113564144A (zh) * 2020-04-29 2021-10-29 上海奥博生物医药技术有限公司 脂肪酶突变体及其应用

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