CN117384981A - 南极假丝酵母脂肪酶b的分子进化及催化高效合成内酯类化合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了南极假丝酵母脂肪酶B和突变体及其制法和应用。具体地，本发明涉及一种南极假丝酵母脂肪酶B的体外定向进化及催化高效合成内酯类化合物。本发明的脂肪酶是来自南极假丝酵母的脂肪酶B(CalB)及其突变体(包括对催化合成内酯类化合物活性显著提高的脂肪酶B突变体)。本发明还提供了体外环化缩合反应方法，包括步骤：在南极假丝酵母的脂肪酶B(CalB)或其突变体存在下，使得特定底物发生环化缩合反应转化为内酯类化合物。本发明的酶和突变体可用于体外酶法合成内酯类化合物。

Description

南极假丝酵母脂肪酶B的分子进化及催化高效合成内酯类化 合物

技术领域

本发明属于分子生物学和生物催化领域，具体地涉及南极假丝酵母脂肪酶B的分子进化及催化高效合成内酯类化合物。

背景技术

内酯是一类重要的高价值化合物和中间体，在食品调味品工业、医药和制药领域有着广泛的应用。根据其羟基缩合位置的不同，脂肪族内酯分为不同类型，包括大环内酯类和α-、β-、γ-和δ-内酯。其中，小环δ-内酯因其浓郁的果香、独特的香气和稳定的理化性质，在食品和化妆品行业具有很高的商业价值。特别是具有奶油风味特征的δ-十二内酯，是最重要的δ-内酯之一，广泛用作食品中的化学调味剂。

δ-内酯可以通过多种方式生产，包括从植物中直接提取以及通过化学合成和生物合成。最常见的提取方法是从植物中提取；然而，由于它们的天然浓度低以及分离和纯化过程的复杂性，从植物中提取δ-内酯的成本很高。目前，有两种主要的δ-内酯生产化学合成工艺；第一种是δ-羟基酸酯化形成δ-内酯。第二种是更流行的化学路线，包括合成重要的中间体2-烷基环戊酮，然后通过Baeyer-Villiger获得δ-内酯氧化。这些过程需要有毒催化剂和不环保的试剂。作为合成δ-内酯的有效替代方法，生物合成已成为一种重要的环境友好和可持续的方法，它允许温和的反应条件和高选择性。最近，已经开发出一种酶系统，该酶系统使用Waltomyceslipofer通过全细胞催化从相应的羟基酸合成δ-内酯。

作为一种多功能酶，CalB可以催化涉及酯键形成和断裂的各种类型的反应，已被用于催化内酯的合成。Robinson等人报道了使用来自南极洲的固定化脂肪酶从16-羟基十六烷酸中获得十六内酯的生物合成路线，但转化率仅为57.4％，不能满足生产要求。这表明CalB虽然具有巨大的潜力δ-内酯的规模化生产，因此本领域迫切需要开发高效率的催化反应。

发明内容

本发明的目的就是提供南极假丝酵母脂肪酶B的分子进化及催化高效合成内酯类化合物。

在本发明的第一方面，提供一种体外环化缩合方法，包括步骤：

在南极假丝酵母脂肪酶B或其突变体的存在下，使得式(Ⅰ)化合物发生环化缩合反应，从而形成式(Ⅱ)化合物：

其中，R₁为H或甲基；

R₂为H、Na或K；

n＝2或3。

当n＝2时，产物为式(Ⅱ)a化合物γ-癸内酯：

在另一优选例中，所述的突变体在选自下组的位点具有突变：188位、189位或其组合，其中所述位点基于SEQ ID No:1所示的野生型南极假丝酵母脂肪酶B序列。

在另一优选例中，所述的突变体具有选自下组的188位的突变：E188Q、E188D。

在另一优选例中，所述的突变体具有以下突变：I189F。

在另一优选例中，所述的突变体具有选自下组的突变：E188Q/I189F、E188D/I189F。

当n＝3时，产物为式(Ⅱ)b化合物δ-十二内酯：

在另一优选例中，所述的突变体在选自下组的位点具有突变：188位、189位或其组合，其中所述位点基于SEQ ID No:1所示的野生型南极假丝酵母脂肪酶B序列。

在另一优选例中，所述的突变体具有选自下组的188位的突变：E188Q、E188D、E188R。

在另一优选例中，所述的突变体具有以下突变：I189F、I189Y、I189M。

在另一优选例中，所述的突变体具有选自下组的突变：E188Q/I189F、E188D/I189Y、E188D/I189F、E188D/I189M、E188R/I189F。

在另一优选例中，所述突变体催化5-羟基十二烷酸钠可直接生成相应的产物δ-十二内酯。

在另一优选例中，所述突变体催化4-羟基癸酸钠可直接生成相应的产物γ-癸内酯。

在另一优选例中，所述底物浓度为0.5-2mM底物。

在另一优选例中，所述反应体系为混合有机溶剂体系。

在另一优选例中，所述有机溶剂的种类无特别限制，对本反应底物及产物无影响即可。

在另一优选例中，所述混合反应体系中的有机溶剂的终浓度为80％-95％。

在另一优选例中，所述温度为37℃-52℃。

在另一优选例中，所述反应时间为11h-15h。

本发明的第二方面，提供一种分离的或纯化的南极假丝酵母脂肪酶B突变体，所述的突变体在选自下组的位点具有突变：188位、189位或其组合，其中所述位点基于SEQ IDNo:1所示的野生型南极假丝酵母脂肪酶B序列。

在另一优选例中，所述的突变体具有选自下组的188位的突变：E188Q、E188D、E188R。

在另一优选例中，所述的突变体具有以下突变：I189F、I189Y、I189M。

在另一优选例中，所述的突变体具有选自下组的突变：E188Q/I189F、E188D/I189F、E188Q/I189F、E188D/I189Y、E188D/I189F、E188D/I189M、E188R/I189F。

较佳地，所述的突变体为E188Q/I189F。

在另一优选例中，所述的南极假丝酵母脂肪酶B突变体具有以下活性：催化5-羟基十二烷酸钠底物进行环化缩和反应，从而形成δ-十二内酯产物。

在另一优选例中，所述的南极假丝酵母脂肪酶B突变体具有以下活性：催化4-羟基癸酸钠底物进行环化缩和反应，从而形成γ-癸内酯产物。

本发明的第三方面，提供了一种编码野生型南极假丝酵母脂肪酶B的经密码子优化的多核苷酸，所述的多核苷酸的序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明的第四方面，提供了一种载体，所述的载体含有本发明第三方面所述的多核苷酸。

本发明的第五方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，所述的宿主细胞含有本发明第四方面所述的载体，或其基因组中整合本发明第三方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，合适的宿主细胞包括革兰氏阳性细菌如枯草芽孢杆菌，革兰氏阴性细菌如大肠杆菌，放线菌如链霉菌，酵母如酿酒酵母，真菌如曲霉菌，它们的细胞均是常用的重组载体的宿主细胞。

在本发明的第六方面，提供了一种本发明第二方面所述的南极假丝酵母脂肪酶B和突变体的用途，它被用于催化环化缩和反应，或被用于制备催化环化缩和反应的催化制剂。

本发明的第七方面，提供了一种南极假丝酵母脂肪酶B及其突变体体外催化合成内酯的方法，包括步骤：在本发明的第二方面所述的南极假丝酵母脂肪酶B及其突变体催化式(Ⅰ)化合物进行环化缩和反应，从而形成内酯产物。

本发明的第八方面，提供了一种进行环化缩合反应的反应体系，所述的反应体系包括：

(S0)本发明第二方面所述的南极假丝酵母脂肪酶B或其突变体；

(S1)式(Ⅰ)化合物：

其中，R₁为H或甲基；

R₂为H、Na或K；

n＝2或3；和

(S2)有机溶剂/Tris-HCl双相溶剂体系。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了南极假丝酵母脂肪酶B纯化后SDS-PAGE电泳分析结果。

图2显示了南极假丝酵母脂肪酶B和突变体催化5-羟基十二烷酸钠高效合成δ-十二内酯的突变体库筛选结果。

图3显示了脂肪酶突变体E188Q/I189F催化合成δ-十二内酯反应产物的GC-MS结果图谱。

图4显示了南极假丝酵母脂肪酶B和突变体催化高效合成γ-癸内酯的突变体库筛选结果。

图5显示了脂肪酶突变体E188Q/I189F催化合成δ-十二内酯反应的溶剂影响结果图。

图6显示了脂肪酶突变体E188Q/I189F催化合成δ-十二内酯反应的时间曲线和温度影响的结果图。

图7显示了脂肪酶突变体E188Q/I189F催化合成δ-十二内酯反应的酶量影响的结果图。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，开发了南极假丝酵母脂肪酶B及其突变体的应用。具体地，本发明人开发了来自南极假丝酵母的脂肪酶B，并对其进行定向进化改造，获得最终脂肪酶活性改善的突变体，例如对5-羟基十二烷酸或其盐活性显著提升的突变体E188Q/I189F，本发明的南极假丝酵母脂肪酶B及其突变体可用于体外酶法合成多种有用的化合物(包括δ-十二内酯、γ-癸内酯)。在此基础上完成了本发明。

具体地，本发明人通过对南极假丝酵母脂肪酶B的序列和结构的研究，基于蛋白结构相似性、保守位点分析和宿主来源多样等原则，采用共进化分析手段进行筛选。随后，将原始及进化的基因在大肠杆菌表达系统中进行功能表达，纯化后获得纯化的南极假丝酵母脂肪酶B及其突变体。经实验证明，获得的重要的成对残基位点(E188/I189)，导致催化效率提高了大约1.0到3.9倍。突变体E188Q/I189F在δ-十二内酯、γ-癸内酯的合成方面具有显著效果，可以直接催化特定底物进行环化缩和反应，从而形成内酯产物。对突变体E188Q/I189F催化合成δ-十二内酯进行条件优化后，酶载量为3mg时，1mM底物在甲苯/Tris-HCl溶剂(9：1，v/v)中于42℃酯化13h，转化率达到了99.53％。

本发明蛋白

如本文所用，术语“南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)”、“本发明的酶”、“本发明的南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)及其突变体”或“本发明的脂肪酶”可互换使用，均指南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)。应理解，该术语包括野生型和突变型的南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)(例如衍生自南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)的衍生多肽)。

本发明提供的南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)及其编码的基因，来源于南极假丝酵母。所述蛋白的野生型氨基酸序列为SEQ ID NO:1，一种优化的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

在本发明中，本发明的CalB也可以是经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸其与SEQ ID NO:1所示蛋白具有相同功能(即具有环化缩合功能)的衍生蛋白。

本发明的酶还包括南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)的突变体。通常，所述突变体是通过用另一种氨基酸残基取代野生型南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)的一个或多个位置上的氨基酸残基而获得的南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)突变体；优选的取代位置为由SEQ ID NO:1表示的南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)氨基酸序列的第188位和第189位。本发明的突变型的南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)可催化5-羟基十二烷酸或其盐进行环化缩和反应，从而形成δ-十二内酯产物，活性比野生型显著提高。

进一步地，所述的南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)突变体是通过用另一种氨基酸残基取代与野生型南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)表现出至少90％同源性的氨基酸序列的南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)的一个或多个位置上的氨基酸残基而获得的南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)突变体；优选的取代位置为由SEQ ID NO:1表示的南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)氨基酸序列的第188位和第189位，突变体可催化5-羟基十二烷酸或其盐进行环化缩和反应，从而形成δ-十二内酯产物，活性比野生型显著提高。

更进一步地，用于取代原有氨基酸残基的所述另一种氨基酸残基优选为谷氨酰胺(氨基酸缩写名称为Q)、苯丙氨酸(氨基酸缩写名称为F)。

在本发明中，在该南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)的突变位点对应的编码的核苷酸编码，应理解为本发明所述的“另一种氨基酸残基”所编码的核苷酸编码。

在本发明中，还提供了一些优选的南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)突变体及其编码的基因，它们的出发南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)的基因序列为序列表中的SEQ ID NO:2，出发氨基酸序列为序列表中的SEQ ID NO:1。

一些优选的突变类型选自下组：它们分别是第188位谷氨酸被谷氨酰胺取代的突变体，第189位异亮氨酸被苯丙氨酸取代的突变体。

如本文所用，“分离的多肽”是指所述多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化所述多肽。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。所述多肽的纯度还可以用氨基酸序列进行进一步分析。

本发明的活性多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、植物)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是脱水缩合的，也可以是非脱水缩合的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括所述多肽的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持所述多肽相同的生物学功能或活性的多肽。

本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基、团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

所述的多肽优选序列为SEQ ID NO:1所示的多肽，该术语还包括具有与所示多肽具有相同功能的SEQ ID NO:1序列的变异形式及衍生多肽。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。

例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括本发明南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)的活性片段和活性衍生物。本发明还提供所述多肽的类似物。

这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

本发明蛋白的氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可以用于本发明。例如，所述的标签可以是FLAG、HA、HA1、c-Myc、Poly–His、Poly-Arg、Strep-TagII、AU1、EE、T7、4A6、ε、B、gE、以及Ty1。这些标签可用于对蛋白进行纯化。

为了使翻译的蛋白分泌表达(如分泌到细胞外)，还可在所述南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)的氨基酸氨基末端添加上信号肽序列，如pelB信号肽等。信号肽在多肽从细胞内分泌出来的过程中可被切去。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ IDNOs.:1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:1的蛋白质，但与SEQ ID NO:2所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO:1的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件(或严紧条件)下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO:1所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和或分离编码南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)蛋白的多聚核苷酸。

本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。本发明的南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)多肽。一般来说有以下步骤：

用本发明的编码南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；在合适的培养基中培养的宿主细胞；从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。

在另一优选例中，合适的宿主细胞包括革兰氏阳性细菌如枯草芽孢杆菌，革兰氏阴性细菌如大肠杆菌，放线菌如链霉菌，酵母如酿酒酵母，真菌如曲霉菌，它们的细胞均是常用的重组载体的宿主细胞。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

应用

本发明还提供了本发明南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)的应用，尤其是在催化使式(Ⅰ)化合物进行环化缩和反应，从而形成内酯产物。代表性地，本发明的南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)可用于制备δ-十二内酯、γ-癸内酯等化合物。

南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)催化生成的δ-十二内酯是一种具有特殊香味的香精。本发明的南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)可催化生成δ-十二内酯。

由于本发明的某些突变的南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)对4-羟基癸酸钠、5-羟基十二烷酸钠的催化活性显著提高(如E188Q/I189F)，因此可用于体外酶法合成γ-癸内酯、δ-十二内酯。

典型地，本发明提供了一种使用本发明的南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)和突变体在体外合成相应内酯的方法。在本发明方法中，以5-羟基十二烷酸钠原料，在南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)的催化作用下可直接生成相应的产物δ-十二内酯。以4-羟基癸酸钠原料，在南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)的催化作用下可直接生成相应的产物γ-癸内酯。

优选地，所述南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)或上述第二方面所提供的南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)突变体。在优化后的条件下，南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)突变体催化5-羟基十二烷酸钠生成δ-十二内酯反应的转化率为99.53％。

优选地，所述底物浓度为0.5-2mM底物。

优选地，所述反应体系为混合有机溶剂体系。

优选地，所述有机溶剂的种类无特别限制，对本反应底物及产物无影响即可。

优选地，所述混合反应体系中的有机溶剂的终浓度为80％-95％

优选地，所述温度为37℃-52℃。

优选地，所述反应时间为11h-15h。

合成内酯类化合物的方法

在本发明中，还提供了一种使用本发明南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)和突变体体外合成内酯类化合物的方法。

典型的，该方法包括：以5-羟基十二烷酸钠为原料，在南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)的催化作用下可直接生成δ-十二内酯；以4-羟基癸酸钠原料，在南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)的催化作用下可直接生成相应的产物γ-癸内酯。

实验结果表明，本发明的酶特别适合用于通过体外酶法转化合成δ-十二内酯及γ-癸内酯。在未优化实验条件时，较佳地，南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)突变体E188Q/I189F催化19h后合成δ-十二内酯的转化率为75.4％，是野生型(WT)的2.75倍。南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)突变体E188Q/I189F催化19h后合成γ-癸内酯的转化率为41.3％，是野生型(WT)的1.79倍。在优化后的条件下，南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)突变体催化5-羟基十二烷酸钠生成δ-十二内酯反应的转化率为99.53％。

优选地，所述底物浓度为0.5-2mM底物。

优选地，所述反应体系为混合有机溶剂体系。

优选地，所述有机溶剂的种类无特别限制，对本反应底物及产物无影响即可。

优选地，所述混合反应体系中的有机溶剂的终浓度为80％-95％

优选地，所述温度为37℃-52℃。

优选地，所述反应时间为11h-15h。

本发明的主要优点包括：

(a)用本发明所述的南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)及其突变体的催化作用成功实现了在体外酶法合成δ-十二内酯、γ-癸内酯等内酯类化合物。

(b)南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)突变体E188Q/I189F催化底物5-羟基十二烷酸钠19h后合成δ-十二内酯的转化率为75.4％，是野生型(WT)的2.75倍。

(c)南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)突变体E188Q/I189F催化底物4-羟基癸酸钠19h后合成γ-癸内酯的转化率为41.3％，是野生型(WT)的1.79倍。

(d)利用本发明所述的南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)突变体及条件优化后的反应体系在体外酶法合成相应的δ-十二内酯，转化率可达99.53％。

下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人分子克隆：实验室手册(NewYork:ColdSpring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和分数是重量百分比和重量分数。

材料和试剂

本发明所述的生物材料的来源的一般性说明：

引物合成：本发明中所使用的引物均由华大基因公司合成制备。

实验中所使用的PrimeSTARMaxDNA聚合酶购自TakaRa公司；使用的DNA胶回收试剂盒及质粒小提试剂盒均购自Axygen公司。

实施例1南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)的构建

具体地，在本实施例中，本发明基于南极假丝酵母脂肪酶B(CalB)及其编码序列。其氨基酸序列如SEQ ID No:1所示：LPSGSDPAFSQPKSVLDAGLTCQGASPSSVSKPILLVPGTGTTGPQSFDSNWIPLSTQLGYTPCWISPPPFMLNDTQVNTEYMVNAITALYAGSGNNKLPVLTWSQGGLVAQWGLTFFPSIRSKVDRLMAFAPDYKGTVLAGPLDALAVSAPSVWQQTTGSALTTALRNAGGLTQIVPTTNLYSATDEIVQPQVSNSPLDSSYLFNGKNVQAQAVCGPLFVIDHAGSLTSQFSYVVGRSALRSTTGQARSADYGITDCNPLPANDLTPEQKVAAAALLAPAAAAIVAGPKQNCEPDLMPYARPFAVGKRTCSGIVTP(SEQ ID No：1)

对CalB基因经过密码子优化后，以便于在大肠杆菌中表达。优化后的编码序列如SEQ ID No:2所示：

CTACCTTCCGGTTCGGACCCTGCCTTTTCGCAGCCCAAGTCGGTGCTCGATGCGGGTCTGACCTGCCAGGGTGCTTCGCCATCCTCGGTCTCCAAACCCATCCTTCTCGTCCCCGGAACCGGCACCACAGGTCCACAGTCGTTCGACTCGAACTGGATTCCCCTCTCAACGCAGTTGGGTTACACACCCTGCTGGATCTCACCCCCGCCGTTCATGCTCAACGACACCCAGGTCAACACGGAGTACATGGTCAACGCCATCACCGCGCTCTACGCTGGTTCGGGCAACAACAAACTTCCCGTGCTTACCTGGTCCCAGGGTGGTCTGGTTGCACAGTGGGGTCTGACCTTCTTCCCCAGTATCAGGTCCAAGGTCGATCGACTTATGGCCTTTGCGCCCGACTACAAGGGCACCGTCCTCGCCGGCCCTCTCGATGCACTCGCGGTTAGTGCACCCTCCGTATGGCAGCAAACCACCGGTTCGGCACTCACCACCGCACTCCGAAACGCAGGTGGTCTGACCCAGATCGTGCCCACCACCAACCTCTACTCGGCGACCGACGAGATCGTTCAGCCTCAGGTGTCCAACTCGCCACTCGACTCATCCTACCTCTTCAACGGAAAGAACGTCCAGGCACAGGCCGTGTGTGGGCCGCTGTTCGTCATCGACCATGCAGGCTCGCTCACCTCGCAGTTCTCCTACGTCGTCGGTCGATCCGCCCTGCGCTCCACCACGGGCCAGGCTCGTAGTGCAGACTATGGCATTACGGACTGCAACCCTCTTCCCGCCAATGATCTGACTCCCGAGCAAAAGGTCGCCGCGGCTGCGCTCCTGGCGCCGGCAGCTGCAGCCATCGTGGCGGGTCCAAAGCAGAACTGCGAGCCCGACCTCATGCCCTACGCCCGCCCCTTTGCAGTAGGCAAAAGGACCTGCTCCGGCATCGTCACCCCCTGA(SEQ ID NO：2)

通过全基因合成方法合成SEQ ID No:2所示的序列，两端添加了酶切位点NcoⅠ和XhoⅠ，将该全长序列克隆入至市售的pET-22b(+)质粒的NcoⅠ、XhoⅠ酶切位点。

实施例2南极假丝酵母脂肪酶B表达与纯化

将上述筛选基因的重组表达质粒热休克转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞，进行基因表达及蛋白纯化。培养重组菌至OD₆₀₀为0.6-0.8时，添加IPTG至终浓度为0.01mM，在低温15℃、220rpm条件下诱导培养过夜。

离心收集菌体，将细胞重悬于20mM Tris-HCl缓冲液中(pH8.0，500mM NaCl，20mM咪唑)。250mL的培养细胞最终重悬于40mL的缓冲液中，使用高压细胞破碎仪(4～6℃，700pa)进行细胞破碎，然后细胞破碎液以12000rpm高速离心30min(4℃)，收集上清液再次重复12000rpm离心30min(4℃)，收集上清利用Ni-NTA柱亲和纯化蛋白，使用20mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0，500mM NaCl，50mM咪唑)洗脱杂蛋白，最后使用200mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0，500mM NaCl，200mM咪唑)洗脱目标蛋白，洗脱目标蛋白液经过浓缩除盐得到纯化的蛋白。

纯化的蛋白保存于50mMTris-HCl缓冲液中(pH8.0)，使用12％SDS-PAGE对纯化后的蛋白进行电泳检测，使用Bradford蛋白浓度测定试剂盒(上海生工生物)测定蛋白浓度。

结果如图1所示。结果表明，在约35kDa处得到一条清晰的条带，这表明目标蛋白CalB已得到纯化。

实施例3南极假丝酵母脂肪酶B突变体的构建及其催化合成δ-十二内酯时的酶活测定

在本实施例中，针对南极假丝酵母脂肪酶B具有催化合成δ-十二内酯的活性特征，基于SCA.SIM共进化分析方法，通过理性设计选择位点，对该酶进行定向进化改造以获得能高效催化合成δ-十二内酯的突变体。

以重组质粒pET-22b(-)-CalB为模板，以带有突变位点为简并碱基(NNK)的一对互补寡核苷酸作引物，用Primestar高保真酶进行全质粒PCR扩增，获得具有特定突变位点的重组质粒。

引物序列如下：对应于SEQ NO:2中第188位谷氨酸和189位异亮氨酸被其它19种氨基酸取代的突变体：E188/I189-FTCGGCGACCGACNNKNNKGTTCAGCCTCAG(SEQ ID No:4)。E188/I189-RGGCTGAACMNNMNNGTCGGTCGCCGAGTAG(SEQ ID No:5)

扩增体系为：重组质粒模板20ng、引物(10μM)各1ul、PrimeSTAR Max DNA聚合酶25ul、补充双蒸水至50ul。扩增条件为：98℃预变性3分钟，98℃变性15秒，72℃延伸2分钟，共25个循环，最后72℃彻底延伸10min。反应结束后，以1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。产物经PCR产物纯化试剂盒纯化回收，用DpnⅠ酶(NEB公司)在37℃条件下消化回收产物2小时，降解初始模板。消化产物转化至E.coliRosetta(DE3)感受态细胞，涂布到含有100μg/mL氨苄青霉素和340μg/mL氯霉素的LB琼脂平板上，37℃过夜培养，筛选阳性克隆，测序验证。得到南极假丝酵母脂肪酶B指定位点的饱和突变体重组菌。

按照实施例2的方法得到南极假丝酵母脂肪酶B指定位点的饱和突变体纯化蛋白。

突变体酶活测定反应体系为1000μL，包括1.5mg/mL突变体纯酶、1mM 5-羟基十二烷酸钠，溶剂为甲苯/Tris-HCl(9：1，v/v)。反应在37℃下以220rpm的速度振荡孵育19小时。然后，旋蒸干燥，并使用气相色谱法(GC)进行分析。

将处理后的反应产物重新溶解在正己烷中并以12,000rpm离心40分钟。然后，将1μL样品注入HP-5毛细管柱(30m×0.32mm×0.25μm)。典型的GC操作条件如下：进样口和检测器的温度分别为250和300℃；载气为氮气，流量为1mL·min-1；烘箱的起始温度设置为150℃并保持5分钟。然后，烘箱温度以3℃·min^-1的速率升高到180℃，然后以5℃·min^-1的速率升高，直到最终温度达到240℃，然后保持5分钟。为了计算反应的转化率，使用δ-十二内酯作为标准参考对反应产物进行量化。

结果如表1、图2所示。结果表明，在188位点和189位点的饱和突变体中，多个突变体展现了高于野生型的转化率，其中突变体E188Q/I189F催化19h后δ-十二内酯的转化率为75.4％，是野生型(WT)的2.75倍。该位点是影响CalB催化活性的关键位点。

表1在野生型CalB或其不同突变体的存在下合成十二内酯的转化率

如图3所示，气相色谱-质谱联用(GC-MS)检测结果显示产物为δ-十二内酯，与报道一致。

实施例4南极假丝酵母脂肪酶B突变体合成γ-癸内酯时的酶活测定

突变体酶活测定反应体系为1000μL，包括1.5mg/mL突变体纯酶、1mM 4-羟基癸酸钠，溶剂为甲苯/Tris-HCl(9：1，v/v)。反应在37℃下以220rpm的速度振荡孵育19小时。然后，旋蒸干燥，并使用气相色谱法(GC)进行分析。

将处理后的反应产物重新溶解在正己烷中并以12,000rpm离心40分钟。然后，将1μL样品注入HP-5毛细管柱(30m×0.32mm×0.25μm)。典型的GC操作条件如下：进样口和检测器的温度分别为250和300℃；载气为氮气，流量为1mL·min-1；烘箱的起始温度设置为150℃并保持5分钟。然后，烘箱温度以3℃·min-1的速率升高到180℃，然后以5℃·min-1的速率升高，直到最终温度达到240℃，然后保持5分钟。为了计算反应的转化率，使用γ-癸内酯作为标准参考对反应产物进行量化。

结果如表2、图4所示。在188位点和189位点的饱和突变体中，多个突变体展现了高于野生型的转化率，其中突变体E188Q/I189F催化19h后γ-癸内酯的转化率为41.3％，是野生型(WT)的1.79倍。该位点是影响CalB催化活性的关键位点。

表2在野生型CalB或其不同突变体的存在下合成γ-癸内酯的转化率

实施例4南极假丝酵母脂肪酶B突变体合成δ-十二内酯的条件优化

针对合成δ-十二内酯的反应条件进行优化，5-羟基十二烷酸钠的浓度为1mM，分别在不同温度(25℃、30℃、37℃、42℃和51℃)、不同溶剂(甲苯、苯、氯仿和二氯甲烷)和不同酶载量(0.5mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL、3mg/mL和4mg/mL)的条件下反应，以220rpm的速度振荡孵育不同时间(4h、8h、13h、19h、24h和37h)。然后，进行旋蒸干燥，并使用气相色谱法(GC)进行分析。

结果如图5所示。结果表明，在5-羟基十二烷酸钠的浓度为1mM，酶载量1.5mg/mL，有机溶剂为甲苯，转化率最高，可达75.4％。

如图6所示，5-羟基十二烷酸钠的浓度为1mM，有机溶剂为甲苯，酶载量1.5mg/mL，随着温度和时间的变化，转化率以较慢的速度增加，直到在37小时达到99.51％。

如图7所示，酶载量3mg/mL时，反应13h，能获得高转化率达99.53％。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种体外环化缩合方法，其特征在于，包括步骤：

在南极假丝酵母脂肪酶B或其突变体的存在下，使得式(Ⅰ)化合物发生环化缩合反应，从而形成式(Ⅱ)化合物：

其中，R₁为H或甲基；

R₂为H、Na或K；

n＝2或3。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，当n＝2时，产物为式(Ⅱa)化合物γ-癸内酯：

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，当n＝3时，产物为式(Ⅱb)化合物δ-十二内酯：

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的突变体在选自下组的位点具有突变：188位、189位或其组合，其中所述位点基于SEQ ID No:1所示的野生型南极假丝酵母脂肪酶B序列；

优选地，所述的突变体具有选自下组的188位的突变：E188Q、E188D、E188R；

优选地，所述的突变体具有以下突变：I189F、I189Y、I189M；

优选地，所述的突变体具有选自下组的突变：E188Q/I189F、E188D/I189F、E188Q/I189F、E188D/I189Y、E188D/I189F、E188D/I189M、E188R/I189F。

5.一种分离的或纯化的南极假丝酵母脂肪酶B突变体，其特征在于，所述的突变体在选自下组的位点具有两个突变：E188Q、E188D、E188R、I189F、I189Y、I189M；其中所述位点基于SEQ ID No:1所示的野生型南极假丝酵母脂肪酶B序列；

优选地，所述的突变体具有选自下组的突变：E188Q/I189F、E188D/I189F、E188Q/I189F、E188D/I189Y、E188D/I189F、E188D/I189M、E188R/I189F。

6.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸编码权利要求5所述的南极假丝酵母脂肪酶B突变体。

7.一种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求6所述的多核苷酸。

8.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有权利要求7所述的载体，或其基因组中整合权利要求6所述的多核苷酸。

9.一种权利要求5所述的南极假丝酵母脂肪酶B突变体的用途，其特征在于，它被用于催化环化缩和反应，或被用于制备催化环化缩和反应的催化制剂。

10.一种进行环化缩和反应的反应体系，其特征在于，所述的反应体系包括：

(S0)权利要求5所述的南极假丝酵母脂肪酶B或其突变体；

(S1)式(Ⅰ)化合物：

其中，R₁为H或甲基；

R₂为H、Na或K；

n＝2或3；和

(S2)有机溶剂/Tris-HCl双相溶剂体系。