CN112553175A

CN112553175A - 糖基转移酶ugt76g1突变体的制备及其应用

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Publication number: CN112553175A
Application number: CN201910918850.2A
Authority: CN
Inventors: 王勇; 孙雨伟; 刘志凤; 陈卓; 李建华; 刘海利; 吕华军
Original assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Current assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Priority date: 2019-09-26
Filing date: 2019-09-26
Publication date: 2021-03-26
Anticipated expiration: 2039-09-26
Also published as: EP4039805A1; CN112553175B; EP4039805A4; US20220275351A1; WO2021057913A1

Abstract

本发明提供了一种糖基转移酶UGT76G1突变体的制备及其应用。本发明针对UGT76G1关键氨基酸残基进行突变以提高黄酮化合物的催化活性的UGT76G1突变体，在此基础上揭示了一组糖基转移酶UGT76G1突变体，它们对黄酮化合物底物的转化活性具有显著性的提高。

Description

糖基转移酶UGT76G1突变体的制备及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及糖基转移酶UGT76G1突变体的制备及其应用。

背景技术

糖基化是天然产物合成中最广泛的修饰之一。许多糖基化修饰反应由UDP依赖型糖基转移酶(UGT)催化，UGT利用UDP活化的糖作为糖基供体，将糖分子特异地转移到受体分子的糖基化位点上。

糖基化修饰能够显著改变天然产物的溶解性，稳定性，毒性以及生理活性。同时，利用糖基化修饰是发展天然产物化学多样性的重要手段之一。黄酮类化合物的糖基化修饰丰富，糖基化位点通常位于苷元的7-OH、3-OH，同时双糖苷、多糖苷也有较多报道。在植物天然产物大家族中，黄酮类化合物一直都是人们比较关注的一类。在中草药中黄酮类作为有效成分，具有抗癌、抗炎、抗氧化损伤、抗致病菌感染、保护心血管系统等多种功效。目前已鉴定的黄酮类天然产物已超过10000种，主要存在于各种蔬菜、水果、植物茎和种子中。

异荭草苷(isoorientin)是以黄酮化合物木犀草素为母核的黄酮碳苷类化合物，存在于单子叶植物水稻、玉米、竹子，以及双子叶豆科、龙胆科等植物的花、叶中。在禾本科植物中，以异荭草苷为结构母核的黄酮碳苷化合物被报道具有抗虫、抗紫外等保护功能。对异荭草苷进行糖基化修饰的糖基转移酶少有报道，玉米中曾被分离出一条氧苷糖基转移酶UGT91L1，能够在异荭草苷的碳苷糖基2位进行鼠李糖基修饰。

因此，本领域亟待找到能够高效地对异荭草苷进行糖基化修饰的糖基转移酶，以开发一些具有例如抗虫、抗紫外等效应的新型化合物，应用于农业等方面。

发明内容

本发明的目的在于提供糖基转移酶UGT76G1突变体、其制备方法及其应用。

在本发明的第一方面，提供糖基转移酶UGT76G1突变体，包括：(1)氨基酸序列对应于SEQ ID NO:1，第87、199、204或379位发生突变的蛋白；(2)(1)蛋白的保守性变异蛋白，其对应于SEQ ID NO:1的第87、199、204或379位的氨基酸与(1)蛋白相应位置突变后的氨基酸相同。

在一个优选例中，所述的保守性变异蛋白包括：(a)将(1)蛋白的氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个；较佳地1-15个；更佳地1-10个，如5个，3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(1)蛋白功能的蛋白；(b)与(1)蛋白的氨基酸序列有80％以上(较佳地85％以上；更佳地90％以上；更佳95％以上，如98％，99％)同源性，且具有(1)蛋白功能的蛋白；或(c)(1)蛋白的活性片段，其包含糖基转移酶UGT76G1空间结构中与糖基供体、糖基受体相互作用的结构，且具有(1)蛋白功能的蛋白。

在另一优选例中，所述第87、199、204或379位突变为具有芳香环侧链取代基的氨基酸残基，较佳地突变为Phe或Trp。

在本发明的另一方面，提供分离的多核苷酸，其编码所述的糖基转移酶UGT76G1突变体。

在本发明的另一方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体，或基因组中整合有所述的多核苷酸。

在一个优选例中，所述宿主细胞包括：原核细胞或真核细胞；较佳地，所述原核宿主细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌等；所述真核宿主细胞包括：真菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。

在本发明的另一方面，提供一种生产所述的糖基转移酶UGT76G1突变体的方法，包括步骤：(1)培养所述的宿主细胞，获得培养物；和(2)从培养物中分离所述的糖基转移酶UGT76G1突变体。

在本发明的另一方面，提供一种提高糖基转移酶UGT76G1的催化活性的方法，包括：将其氨基酸序列中对应于SEQ ID NO:1第87、199、204或379位的氨基酸进行突变。

在一个优选例中，所述的催化活性的提高为具有统计学意义的提高，如提高20％以上、40％以上、60％以上、70％以上或更高。

在另一优选例中，所述第87、199、204或379位突变为具有芳香环侧链取代基的氨基酸残基；较佳地突变为Phe或Trp。

在另一优选例中，所述的提高糖基转移酶UGT76G1的催化活性为提高其催化黄酮化合物的糖基化的活性。

在另一优选例中，所述的黄酮化合物(底物)是具有以下母核结构的化合物：

在另一优选例中，所述的黄酮化合物包括：异荭草苷，荭草苷，芹菜素，木犀草素等。

在本发明的另一方面，提供一种促进黄酮化合物的糖基化的方法，包括以所述的糖基转移酶UGT76G1突变体进行催化；较佳地，所述的糖基化包括：在黄酮化合物中转移入1～3个(较佳地1～2个)糖基。

在本发明的另一方面，提供所述的糖基转移酶UGT76G1突变体的用途，用于催化黄酮化合物的糖基化；较佳地，所述的糖基化包括：在黄酮化合物中转移入1～3个(较佳地1～2个)糖基。

在本发明的另一方面，提供一种用于对底物进行糖基化的组合物，其中含有：所述的糖基转移酶UGT76G1突变体；或含有所述的宿主细胞。

在另一优选例中，所述的组合物中，还包括药学上或工业合成上可接受的载体。

在本发明的另一方面，提供一种用于对底物进行糖基化的试剂盒，其中含有：所述的糖基转移酶UGT76G1突变体；或所述的宿主细胞；或所述的组合物。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、UGT76G1野生型及突变体对于异荭草苷的转化。ST，异荭草苷标准品；WT，野生型UGT76G1转化反应；G87F，UGT76G1突变体G87F转化反应；I199F，UGT76G1突变体I199F转化反应；L204F，UGT76G1突变体L204F转化反应。

图2、化合物2的MS/MS图谱。

图3、化合物3的MS/MS图谱。

图4、突变体G87F、I199F、L204F转化异荭草苷生成糖基化产物的相对产率(以野生型为100％)。

图5、UGT76G1野生型及突变体对于荭草苷的转化。

图6、化合物5、6的LC-MS/MS图谱。(A)化合物5、6的[M-H]^-选择离子流图谱；(B)准分子离子峰m/z 609.15[M-H]^-的二级碎片信息。

图7、UGT76G1野生型及突变体对于芹菜素的转化。

图8、UGT76G1野生型及突变体对于木犀草素的转化。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，针对UGT76G1与底物结合口袋的关键氨基酸残基进行突变，研究提高黄酮化合物的催化活性的UGT76G1突变体，在此基础上揭示了一组特别位置氨基酸残基突变为具有芳香环侧链取代基的氨基酸残基的突变体，特别是G87F、I199F、L204F，所述突变体对黄酮化合物底物的转化活性具有显著性的提高。

如本文所用，除非另外说明，所述的“糖基转移酶UGT76G1突变体”、“突变型糖基转移酶UGT76G1”可互换使用，是指对应于野生型糖基转移酶UGT76G1，在相应于其底物结合口袋附近发生突变后构成的多肽，较佳地相应于其序列第87、199或204位发生突变后构成的多肽。

若需要表示野生型的糖基转移酶UGT76G1，其可以为“氨基酸序列如SEQ ID NO:1的蛋白，或者也可以是该蛋白的同功能变体或活性片段。较佳地，所述的野生型糖基转移酶UGT76G1来源于甜叶菊(Stevia rebaudiana)；但是应理解，本发明中也涵盖来源于其它植物的与之具有同源性且功能相同的UGT76G1同源物。

如本文所用，“分离的糖基转移酶UGT76G1”是指糖基转移酶UGT76G1突变体基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化糖基转移酶UGT76G1突变体。基本上纯的蛋白在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。

如本文所用，“底物结合口袋”是指糖基转移酶UGT76G1的空间结构中与底物发生相互作用(结合)的位置。

本发明的蛋白可以是重组蛋白、天然蛋白、合成蛋白，优选重组蛋白。本发明的蛋白可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。

本发明还包括所述糖基转移酶UGT76G1突变体的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然糖基转移酶UGT76G1突变体相同的生物学功能或活性的蛋白。本发明的蛋白片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的蛋白，或(iii)附加的氨基酸序列融合到此蛋白序列而形成的蛋白(如前导序列或分泌序列或用来纯化此蛋白的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。然而，所述的糖基转移酶UGT76G1突变体及其片段、衍生物和类似物的氨基酸序列中，肯定存在本发明上面所述的突变，也即其空间结构中底物结合口袋附近的氨基酸突变；较佳地，该突变为对应于SEQ IDNO:1中的第87、199、204或379位氨基酸的突变。

在本发明中，术语“糖基转移酶UGT76G1突变体”还包括(但并不限于)：若干个(通常为1-20个，更佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个、1-3个、或1-2个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括糖基转移酶UGT76G1突变体的活性片段和活性衍生物。但是在这些变异形式中，肯定存在本发明上面所述的突变，也即其空间结构中底物结合口袋附近的氨基酸突变；较佳地，该突变为对应于SEQ ID NO:1中的第87、199、204或379位氨基酸的突变。

在本发明中，术语“糖基转移酶UGT76G1突变体”还包括(但并不限于)：与所述的糖基转移酶UGT76G1突变体的氨基酸序列具有80％以上，较佳地85％以上，更佳地90％以上，进一步更佳地95％以上，如98％以上、99％以上序列相同性的保留其蛋白活性的衍生的蛋白。同样地，这些衍生的蛋白中，肯定存在本发明上面所述的突变，也即其空间结构中底物结合口袋附近的氨基酸突变；较佳地，该突变为对应于SEQ ID NO:1中的第87、199、204或379位氨基酸的突变。

本发明还提供了编码本发明糖基转移酶UGT76G1突变体或其保守性变异蛋白的多核苷酸序列。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。

编码所述突变体的成熟蛋白的多核苷酸包括：只编码成熟蛋白的编码序列；成熟蛋白的编码序列和各种附加编码序列；成熟蛋白的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

“编码蛋白的多核苷酸”可以是包括编码此蛋白的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或糖基转移酶UGT76G1突变体编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述蛋白的方法。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列来表达或生产重组的糖基转移酶UGT76G1突变体。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码糖基转移酶UGT76G1突变体的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，糖基转移酶UGT76G1突变体多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含糖基转移酶UGT76G1突变体编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

本发明中，所述的宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌、枯草杆菌、链霉菌、农杆菌；真核细胞如酵母、植物细胞等。在本发明的具体实施例中，以大肠杆菌作为宿主细胞。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

在本发明的具体实施例中，UGT76G1突变体在大肠杆菌中表达、纯化：通过PCR，将野生型UGT76G1基因从克隆载体中扩增并亚克隆至蛋白表达载体pETDuet-1中。以UGT76G1基因表达载体为模板，通过PCR引物引入突变，经过PCR扩增，构建突变体蛋白表达载体。测序正确的突变体在大肠杆菌BL21(DE3)中进行异源表达。蛋白经亲和色谱Ni-NTA纯化后，进行体外酶活性检测，或应用于其它方面。

在本发明的优选方式中，所述的黄酮化合物(底物)是具有以下母核结构的化合物：

在本发明的优选方式中，所述的黄酮化合物(底物)包括：异荭草苷，荭草苷，芹菜素，木犀草素等。

在获得了本发明所述的突变型糖基转移酶UGT76G1的信息后，本领域人员清楚如何运用该突变体来对具有黄酮化合物母核结构的化合物进行糖基化。

突变型糖基转移酶UGT76G1的酶活性检测方法可以运用本领域公知的技术。在本发明的具体实施例中，使用相同条件的酶反应体系对不同突变体蛋白进行体外酶活性测试。反应后经HPLC检测产物生成，通过比较突变体与野生型蛋白对黄酮化合物异荭草苷的相对转换率，分析突变体的催化活性变化。

与现有技术相比，本发明的进步效果在于：本发明所获得的突变型糖基转移酶UGT76G1在体外酶反应中高效特异催化黄酮化合物的糖基化，相比于野生型蛋白，糖基化效率显著性提高。

本发明的突变型糖基转移酶UGT76G1可以被配制于药学上或工业合成上可接受的载体中，获得适于进行催化反应、或适于储存的组合物。

本发明的突变型糖基转移酶UGT76G1也可以被置于试剂盒中，以便于使用或销售，一般而言，所述的试剂盒中还包含使用说明书。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J·萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

材料与仪器设备

PCR胶回收试剂盒，质粒抽提试剂盒为美国Axygen产品。

PCR高保真酶PrimeSTAR Max DNA Polymerase为日本宝生物公司(Takara)产品。

限制性内切酶、T4连接酶均为New England Biolabs(NEB)产品。

无缝克隆试剂盒购自诺唯赞生物科技有限公司(Vazyme biotech)。

大肠杆菌DH10B用于克隆构建，BL21(DE3)用于蛋白表达。

pETDuet-1载体(Novagen)用于基因克隆及蛋白表达。

野生型UGT76G1、EUGT11由金斯瑞生物科技有限公司(南京)合成，经大肠杆菌密码子优化。

Ni-NTA购自Qiagen(Germany)。

标准品化合物异荭草苷购自大连美仑生物技术有限公司。其他试剂为国产分析纯或色谱纯试剂，购自国药集团化学试剂有限公司。

IPTG，MgCl₂，PMSF，氨苄霉素购于生工生物工程(上海)。

DnaseⅠ(10mg/mL)购于上海彦烨生物科技服务中心。

PMSF购自西格玛奥德里奇(Sigma)中国。

PCR使用Arktik Thermal Cycler(Thermo Fisher Scientific)。

真空浓缩使用Concentrator plus浓缩仪(Eppendorf)。

OD₆₀₀使用UV-1200紫外可见分光光度计检测(上海美谱达仪器有限公司)。

细胞破碎使用C3高压细胞破碎仪(Sunnybay Biotech Co.，Canada)。

液相色谱使用Dionex UltiMate 3000液相色谱系统(Thermo FisherScientific)。

高分辨质谱由Thermo Fisher Scientific静电场轨道阱组合质谱Q Exactive测得。

实施例1、野生型UGT76G1表达载体pQZ11构建过程

野生型UGT76G1氨基酸序列如下：

>SrUGT76G1(SEQ ID NO:1)

MENKTETTVRRRRRIILFPVPFQGHINPILQLANVLYSKGFSITIFHTNFNKPKTSNYPHFTFRFILDNDPQDERISNLPTHGPLAGMRIPIINEHGADELRRELELLMLASEEDEEVSCLITDALWYFAQSVADSLNLRRLVLMTSSLFNFHAHVSLPQFDELGYLDPDDKTRLEEQASGFPMLKVKDIKSAYSNWQILKEILGKMIKQTKASSGVIWNSFKELEESELETVIREIPAPSFLIPLPKHLTASSSSLLDHDRTVFQWLDQQPPSSVLYVSFGSSSEVDEKDFLEIARGLVDSKQSFLWVVRPGFVKGSTWVEPLPDGFLGERGRIVKWVPQQEVLAHGAIGAFWTHSGWNSTLESVCEGVPMIFSDFGLDQPLNARYMSDVLKVGVYLENGWERGEIANAIRRVMVDEEGEYIRQNARVLKQKADVSLMKGGSSYESLESLVSYISSL*

以密码子优化的UGT76G1基因克隆载体为模板，使用特异引物对(加载BamHI与HindIII位点，表1)扩增UGT76G1基因。使用T4连接酶将PCR产物连接至BamHI/HindIII双酶切的载体pETDuet1中，所获得的表达载体pQZ11经测序验证。

表1、野生型UGT76G1表达载体构建使用的引物

实施例2、突变体G87F、I199F、L204F、L379W构建

在经过广泛而深入的筛选后，本发明人进行针对三个位点的突变，包括：

第87位G，突变为F；

第199位I，突变为F；

第204位L，突变为F。

第379位L，突变为W。

关键突变体酶氨基酸序列如下：

>SrUGT76G1_G87F(SEQ ID NO:2)

>SrUGT76G1_I199F(SEQ ID NO:3)

>SrUGT76G1_L204F(SEQ ID NO:4)

>SrUGT76G1_L379W(SEQ ID NO:5)

使用含点突变位点的引物(表2)，以野生型UGT76G1表达载体pQZ11为模板，PCR扩增突变体基因，经DpnⅠ酶消化模板质粒后，转化至DH10B，挑选克隆测序验证。

表2、扩增突变体所使用引物

实施例3、突变体蛋白表达纯化

测序正确的突变体表达载体转化至大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)。以1％v/v转接过夜培养的携带突变体表达载体的BL21(DE3)至1L LB培养基(Ampicillin＝100μg/L)中，37℃，200rpm培养1-2h。随后降温降转速至16℃，160rpm继续培养至OD₆₀₀＝1.0左右。使用终浓度0.1mM的IPTG诱导，过夜培养18-20h后收集菌体。使用Buffer A(20mM Tris-HCl，pH8.0，100mM NaCl)重悬细胞，加入1mM PMSF，2mM MgCl₂以及5μg/mL DNase I混匀后，冰上静置30分钟。高压细胞破碎仪裂解细胞后，高速离心(10000rpm，99min)。上清与1mL Ni-NTA纯化树脂旋转孵育(4℃，1h)，25mM咪唑洗脱6-10个柱体积。最后，使用250mM咪唑1mL在4℃孵育10-30分钟后，洗脱目的蛋白。使用BSA法测定目的蛋白的浓度，使用50％甘油保存蛋白(-20℃)。后续利用突变体蛋白进行体外酶活性测试。

实施例4、突变体体外酶反应

酶反应体系(50μL)包括：5μg蛋白，1.5mM UDP-葡萄糖，250μM糖基受体底物异荭草苷(isoorientin)、荭草苷(orientin)、芹菜素(apigenin)或木犀草素(luteolin)，缓冲液Buffer A(20mM Tris-HCl，pH＝8.0，100mM NaCl)。每个突变体蛋白对同一底物的反应均重复三次。反应条件：37℃，过夜。反应结束后，使用等体积的甲醇淬灭反应，剧烈震荡后，12000rpm，离心30min。取上清液进行HPLC检测。检测方法：流动相A(乙腈，含0.1％甲酸)-流动相B(水，含0.1％甲酸)梯度洗脱。使用如下色谱条件：初始5％A，11min内梯度洗脱至50％A，100％A保持洗脱4min，1min内返回5％A平衡4min。计算突变体催化产物峰面积，与野生型UGT76G1的催化产物峰面积比较。

实施例5、突变体催化活性

对于底物异荭草苷的体外功能验证结果如图1的HPLC分析所示，野生型UGT76G1对异荭草苷(化合物1)的转化效率低下，糖基化产物主要包括化合物2和化合物3。而突变体对于异荭草苷的转化具有显著性的促进作用，其中以G87F的转化效率相对最高。化合物2和3的二级质谱碎片信息(图2、图3)提示，它们分别是异荭草苷-O-葡萄糖苷和异荭草苷-O-双葡萄糖苷。

突变体G87F、I199F、L204F的糖基化效率显著增加，化合物2的产率大幅提高至野生型的1381％，799％和285％；化合物3的产率大幅提高至野生型的1235％，278％和159％(图4)。

对于底物荭草苷(化合物4)的体外功能验证结果如图5的HPLC分析所示，野生型UGT76G1对荭草苷(化合物4)有一定转化率，糖基化产物主要包括化合物5和化合物6。突变体L204F能够增加产物5的生成效率，突变体L379W能够增加产物6的生成效率。化合物5和6的LC-MS信息(图6)提示，它们分别是荭草苷-O-葡萄糖苷的两种同分异构体。

对于底物芹菜素(化合物7)的体外功能验证结果如图7的HPLC分析所示，突变体G87F、L204F转化芹菜素(化合物7)的糖基化产物与野生型(WT)以及非芳香侧链突变体(I90L、I199L)相比产生较大差异，提示是产物的糖基化位点不同所致。

对于底物木犀草素(化合物8)的体外功能验证结果如图8的HPLC分析所示，突变体G87F、L204F转化木犀草素(化合物8)的糖基化产物与野生型(WT)以及非芳香侧链突变体(I90L、I199L)相比产生较大差异，推测是产物的糖基化位点不同所致。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院上海生命科学研究院

<120> 糖基转移酶UGT76G1突变体的制备及其应用

<130> 197509

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 458

<212> PRT

<213> Stevia rebaudiana

<400> 1

Met Glu Asn Lys Thr Glu Thr Thr Val Arg Arg Arg Arg Arg Ile Ile

1 5 10 15

Leu Phe Pro Val Pro Phe Gln Gly His Ile Asn Pro Ile Leu Gln Leu

20 25 30

Ala Asn Val Leu Tyr Ser Lys Gly Phe Ser Ile Thr Ile Phe His Thr

35 40 45

Asn Phe Asn Lys Pro Lys Thr Ser Asn Tyr Pro His Phe Thr Phe Arg

50 55 60

Phe Ile Leu Asp Asn Asp Pro Gln Asp Glu Arg Ile Ser Asn Leu Pro

65 70 75 80

Thr His Gly Pro Leu Ala Gly Met Arg Ile Pro Ile Ile Asn Glu His

85 90 95

Gly Ala Asp Glu Leu Arg Arg Glu Leu Glu Leu Leu Met Leu Ala Ser

100 105 110

Glu Glu Asp Glu Glu Val Ser Cys Leu Ile Thr Asp Ala Leu Trp Tyr

115 120 125

Phe Ala Gln Ser Val Ala Asp Ser Leu Asn Leu Arg Arg Leu Val Leu

130 135 140

Met Thr Ser Ser Leu Phe Asn Phe His Ala His Val Ser Leu Pro Gln

145 150 155 160

Phe Asp Glu Leu Gly Tyr Leu Asp Pro Asp Asp Lys Thr Arg Leu Glu

165 170 175

Glu Gln Ala Ser Gly Phe Pro Met Leu Lys Val Lys Asp Ile Lys Ser

180 185 190

Ala Tyr Ser Asn Trp Gln Ile Leu Lys Glu Ile Leu Gly Lys Met Ile

195 200 205

Lys Gln Thr Lys Ala Ser Ser Gly Val Ile Trp Asn Ser Phe Lys Glu

210 215 220

Leu Glu Glu Ser Glu Leu Glu Thr Val Ile Arg Glu Ile Pro Ala Pro

225 230 235 240

Ser Phe Leu Ile Pro Leu Pro Lys His Leu Thr Ala Ser Ser Ser Ser

245 250 255

Leu Leu Asp His Asp Arg Thr Val Phe Gln Trp Leu Asp Gln Gln Pro

260 265 270

Pro Ser Ser Val Leu Tyr Val Ser Phe Gly Ser Ser Ser Glu Val Asp

275 280 285

Glu Lys Asp Phe Leu Glu Ile Ala Arg Gly Leu Val Asp Ser Lys Gln

290 295 300

Ser Phe Leu Trp Val Val Arg Pro Gly Phe Val Lys Gly Ser Thr Trp

305 310 315 320

Val Glu Pro Leu Pro Asp Gly Phe Leu Gly Glu Arg Gly Arg Ile Val

325 330 335

Lys Trp Val Pro Gln Gln Glu Val Leu Ala His Gly Ala Ile Gly Ala

340 345 350

Phe Trp Thr His Ser Gly Trp Asn Ser Thr Leu Glu Ser Val Cys Glu

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Gly Val Pro Met Ile Phe Ser Asp Phe Gly Leu Asp Gln Pro Leu Asn

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Ala Arg Tyr Met Ser Asp Val Leu Lys Val Gly Val Tyr Leu Glu Asn

385 390 395 400

Gly Trp Glu Arg Gly Glu Ile Ala Asn Ala Ile Arg Arg Val Met Val

405 410 415

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420 425 430

Lys Ala Asp Val Ser Leu Met Lys Gly Gly Ser Ser Tyr Glu Ser Leu

435 440 445

Glu Ser Leu Val Ser Tyr Ile Ser Ser Leu

450 455

<210> 2

<211> 458

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> VARIANT

<222> (1)..(458)

<223> 突变体

<400> 2

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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180 185 190

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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195 200 205

Lys Gln Thr Lys Ala Ser Ser Gly Val Ile Trp Asn Ser Phe Lys Glu

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370 375 380

Ala Arg Tyr Met Ser Asp Val Leu Lys Val Gly Val Tyr Leu Glu Asn

385 390 395 400

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<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 6

attctggatc catggaaaac aaaac 25

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<211> 25

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 7

cgcaagcttt taactttaca gagaa 25

<210> 8

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<212> DNA

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ggtccgctgg cgttcatgcg tatcccgatc 30

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<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 9

gaacgccagc ggaccgtggg tcgg 24

<210> 10

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<212> DNA

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<400> 10

gcgtactcta actggcagtt cctgaaagaa atcctggg 38

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<212> DNA

<213> 引物(Primer)

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<210> 12

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<212> DNA

<213> 引物(Primer)

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<211> 30

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

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<211> 35

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

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cttctctgac ttcggttggg accagccgct gaacg 35

<210> 15

<211> 35

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 15

accgaagtca gagaagatca tcggaacacc ttcgc 35

Claims

1.糖基转移酶UGT76G1突变体，包括：

(1)氨基酸序列对应于SEQ ID NO:1，第87、199、204或379位发生突变的蛋白；

(2)(1)蛋白的保守性变异蛋白，其对应于SEQ ID NO:1的第87、199、204或379位的氨基酸与(1)蛋白相应位置突变后的氨基酸相同。

2.如权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述的保守性变异蛋白包括：

(a)将(1)蛋白的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(1)蛋白功能的蛋白；

(b)与(1)蛋白的氨基酸序列有80％以上同源性，且具有(1)蛋白功能的蛋白；

(c)(1)蛋白的活性片段，其包含糖基转移酶UGT76G1空间结构中与糖基供体、糖基受体相互作用的结构，且具有(1)蛋白功能的蛋白。

3.如权利要求1或2所述的糖基转移酶UGT76G1突变体，其特征在于，所述第87、199、204或379位突变为具有芳香环侧链取代基的氨基酸残基；较佳地突变为Phe或Trp。

4.分离的多核苷酸，其编码权利要求1～3任一所述的糖基转移酶UGT76G1突变体。

5.一种载体，其特征在于，它含有权利要求4所述的多核苷酸。

6.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求5所述的载体，或基因组中整合有权利要求4所述的多核苷酸。

7.一种生产权利要求1～3任一所述的糖基转移酶UGT76G1突变体的方法，其特征在于，包括步骤：

(1)培养权利要求6所述的宿主细胞，获得培养物；和

(2)从培养物中分离权利要求1～3任一所述的糖基转移酶UGT76G1突变体。

8.一种提高糖基转移酶UGT76G1的催化活性的方法，包括：将其氨基酸序列中对应于SEQ ID NO:1第87、199、204或379位的氨基酸进行突变。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述第87、199、204或379位突变为具有芳香环侧链取代基的氨基酸残基；较佳地突变为Phe或Trp。

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的提高糖基转移酶UGT76G1的催化活性为提高其催化黄酮化合物的糖基化的活性。

11.一种促进黄酮化合物的糖基化的方法，其特征在于，包括以权利要求1～3任一所述的糖基转移酶UGT76G1突变体进行催化；较佳地，所述的糖基化包括：在黄酮化合物中转移入1～3个糖基。

12.如权利要求7～11任一所述的方法，其特征在于，所述的黄酮化合物是具有以下母核结构的化合物：

13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述的黄酮化合物包括：异荭草苷，荭草苷，芹菜素，木犀草素等；更佳地，所述异荭草苷的糖基化产生异荭草苷-O-葡萄糖苷、异荭草苷-O-双葡萄糖苷、荭草苷-O-葡萄糖苷。

14.权利要求1～3任一所述的糖基转移酶UGT76G1突变体的用途，用于催化黄酮化合物的糖基化；较佳地，所述的糖基化包括：在黄酮化合物中转移入1～3个糖基。

15.如权利要求14所述的用途，其特征在于，所述黄酮化合物是具有以下母核结构的化合物：

16.如权利要求15所述的用途，其特征在于，所述黄酮化合物包括：异荭草苷，荭草苷，芹菜素，木犀草素等；更佳地，所述异荭草苷的糖基化产生异荭草苷-O-葡萄糖苷和异荭草苷-O-双葡萄糖苷。

17.一种用于对底物进行糖基化的组合物，其特征在于，其中含有：

权利要求1～3任一所述的糖基转移酶UGT76G1突变体；或

含有权利要求6所述的宿主细胞。

18.一种用于对底物进行糖基化的试剂盒，其特征在于，其中含有：

权利要求1～3任一所述的糖基转移酶UGT76G1突变体；或

权利要求6所述的宿主细胞；或

权利要求17所述的组合物。