KR20150065439A - 플라보노이드 o-메틸전달효소 및 이를 이용한 플라보노이드의 메틸화 방법 - Google Patents

플라보노이드 o-메틸전달효소 및 이를 이용한 플라보노이드의 메틸화 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 스트렙토마이시스 퍼시셔스(Streptomyces peucetius) ATCC 27952 유래 플라보노이드 O-메틸전달효소(SpOMT2884)에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 상기 O-메틸전달효소(SpOMT2884)를 코딩하는 유전자, 상기 유전자가 도입되어 있는 재조합 미생물, 상기 재조합 미생물을 이용한 O-메틸전달효소(SpOMT2884)의 제조방법 및 상기 효소를 이용한 플라보노이드의 메틸화 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 신규 O-메틸전달효소(SpOMT2884)는 다양한 플라보노이드를 메틸화시켜, 플라보노이드의 라디칼제거, 항염증, 항돌연변이, 항에이즈, 항알레르기, 항혈소판, 산화방지, 항신경퇴화 활성을 증가시켜, 만성질병의 질환 치료제 등 다양한 분야에서 산업적 규모로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

플라보노이드 O-메틸전달효소 및 이를 이용한 플라보노이드의 메틸화 방법 {Flavonoid-O-methyltransferase and Method for methylation of flavones}
본 발명은 스트렙토마이시스 퍼시셔스(Streptomyces peucetius) ATCC 27952 유래 플라보노이드 O-메틸전달효소(SpOMT2884)에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 상기 O-메틸전달효소(SpOMT2884)를 코딩하는 유전자, 상기 유전자가 도입되어 있는 재조합 미생물, 상기 재조합 미생물을 이용한 O-메틸전달효소(SpOMT2884)의 제조방법 및 상기 효소를 이용한 플라보노이드의 메틸화 방법에 관한 것이다.
플라보노이드는 식물에 존재하는 저분자 폴리페놀릭 화합물로, 식물체를 포식자나 병원균, 자외선으로부터 보호하는 역할을 하고 (Dixon et al., Mol. Plant Pathol ., 3:371, 2002), 식물의 성장과 발달에 있어 중요한 역할을 한다 (Frick et al., Phytochem., 56:1, 2001). 또한 라디칼제거, 항염증, 항돌연변이, 항에이즈, 항알레르기, 항혈소판, 산화방지, 항신경퇴화 활성을 포함하는 몇몇의 생물학적 활성을 가지고 있어, 만성질병 예방효과를 나타낸다. (Manach et al., Curr . Opin . Lipidol ., 16:77, 2005; Heo and Lee, J. Agric . Food Chem ., 53:1445, 2005; Heo and Lee, J. Agric . Food Chem., 52:7514, 2004; Mojzisova and Kuchta, Physiol . Res, 50:529 2001; Middleton et al., Pharmacol . Rev ., 52:673, 2000). 플라보노이드에 의해 나타나는 기능적 다양성은 플라본 중심에 있는 수산기에 글루코실트랜스페라아제, 메틸전달효소, 프레닐전달효소, 설포트렌스페라아제와 같은 다양한 수산화효소에 의해 발생되는 핵심 구조의 변형에 의한 것이다 (Martens et al., Phytochem., 71:1040, 2010; Prescott and John, Annual Rev Plant Physiol Plant Mol . Biol., 47:245, 1996). 페놀릭 화합물의 생물학적 역할은 플라보노이드 복합체에 붙는 작용기의 타입과 위치에 따라 규정되며 반응성과, 용해성, 그리고 다른 화학 물질이나 단백질 구조와 상호작용하는 능력을 변화시킨다 (Buer et al., J. Integr . Plant Biol., 52:98, 2010). 메틸전달효소는 천연물의 번역 후 변형 뒤에 중요한 역할을 한다. 효소에 의한 O-메틸화(O-methylation)는 여러 O-메틸전달효소 (O-methyltransferases, OMTs)에 의해 촉매되며, 메틸에테르(methyl ether) 유도체와 S-아데노실-호모시스테인(S-adenosyl-L-homocysteine)을 형성시키면서 S-아데노실-L-메티오닌(S-adenocyl-L-methionine; AdoMet)의 메틸그룹을 수용체 화합물의 특정수산기로 이동시킨다 (Ibrahim et al., Plant Mol . Biol ., 36:1, 1998, Joshi and Chiang, Plant, Mol. Biol., 37:663, 1998). 플라보노이드의 O-메틸화는 페놀릭 수산기의 화학적 반응성을 변화시켜 항균력 (Middleton and Kandaswami, Champman & Hall , London, 619, 1994 (harborne, J.B.(Ed))뿐만 아니라 세포 내 구획을 증가시키고 막 수송 능력을 높여줌으로써 화합물의 흡수가 가능하도록 친유성을 증가시킨다 (Wen and Walle, Drug Metab . Dispos., 34:1786, 2006, Walle, Int . J. Mol . Sci ., 10:5002, 2009).
한편 스트렙토마이시스 퍼시셔스는 스트렙토마이시스 속의 박테리아로, 유전체 DNA는 말단에 역 반복 부위를 포함하여 약 8Mb로 길고, 5' 말단에는 말단단백질이 공유결합하고 있다. 스트렙토마이시스 게놈은 대장균과 고초균과 같이 잘 알려진 미생물의 서열을 비교하였을 때 높은 GC함량 (>70%)을 포함하면서 아주 큰 크기로 특유하다 (Bentley et al., Nature, 417:141, 2002). 또한 이 종은 천연물로 추정되는 것을 암호화하고 있는, 많은 수수께끼 유전자를 보유하고 있으며 (Bentley et al., Nature, 417:141, 2002; Ikeda et al., Nat . Biotechnol ., 21:526, 2003), 항생물질과 같이 2차 대사산물의 생성과 같은 복잡한 생리적 분화를 이행한다 (Yoon et al., J.Microbiol. Biotechnol ., 20:1359, 2010).
이에, 본 발명자들은 플라보노이드를 효율적으로 메틸화시킬 수 있는 새로운 효소를 개발 하고자 예의 노력한 결과, 스트렙토마이시스 퍼시셔스에서 분리한 신규 O-메틸전달효소(SpOMT2884)가 in vivo 및 in vitro에서 다양한 플라보노이드를 메틸화된 산물로 전환하는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 플라보노이드를 효율적으로 메틸화시킬 수 있는 신규 O-메틸전달효소(SpOMT2884) 및 상기 효소를 코딩하는 유전자를 제공하는데 있다. 본 발명의 다른 목적은 상기 유전자가 도입되어 있는 재조합 미생물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 O-메틸전달효소를 이용한 플라보노이드의 메틸화 방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 O-메틸전달효소(SpOMT2884) 및 상기 효소를 코딩하는 유전자를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 유전자를 포함하는 있는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 유전자 또는 재조합 벡터가 숙주세포에 도입되어 있는 O-메틸전달효소(SpOMT2884) 생산능을 가지는 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 상기 재조합 미생물을 배양하여 재조합 O-메틸전달효소(SpOMT2884)를 생성하는 단계; 및 (b) 생성된 재조합 O-메틸전달효소(SpOMT2884)를 회수하는 단계를 포함하는 재조합 O-메틸전달효소(SpOMT2884)의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 O-메틸전달효소(SpOMT2884) 또는 상기 재조합 미생물 존재하에 플라보노이드 및 메틸공여체를 반응시켜 메틸화된 플라보노이드를 제조하는 것을 특징으로 하는 플라보노이드의 메틸화 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 신규 O-메틸전달효소(SpOMT2884)는 다양한 플라보노이드를 메틸화시켜, 플라보노이드의 라디칼제거, 항염증, 항돌연변이, 항에이즈, 항알레르기, 항혈소판, 산화방지, 항신경퇴화 활성을 증가시켜, 만성질병의 질환 치료제 등 다양한 분야에서 산업적 규모로 유용하게 이용될 수 있다.
도 1의 (A)는 새로운 화합물인 7-하이드록시-8-메톡시-플라본(7-hydroxy-8-methoxy-flavone)을 생산하기 위하여 O-메틸전달효소(SpOMT2884)에 의해 S-아데노실-L-메티오닌(S-adenosyl-L-methionine)의 메틸그룹이 7,8-디하이드록시플라본(7,8-dihydroxyflavone, 7,8-DHF)으로 이동하는 경로를 나타낸 것이다. 도 1의 (B)는 본 발명에서 사용된 각기 다른 플라보노이들의 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 정제된 O-메틸전달효소(SpOMT2884)의 SDS-PAGE 분석결과를 나타낸 것이다. (M: 마커, 1: 정제된 SpOMT2884, 2: 불용성 부분, 3: 가용성 부분)
도 3의 (A)는 본 발명에 따른 O-메틸전달효소 아미노산 서열의 상동성 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 3의 (B)는 본 발명에 따른 O-메틸전달효소(SpOMT2884)의 계통도를 나타낸 것이다.
도 4는 O-메틸전달효소(SpOMT2884)를 사용하여 (A) 루테올린, (B) 퀘세틴, (C) 나린제닌, (D) 포모노네틴, (E) 루틴, (F) 다이드제인의 HPLC-PDA-QTOF-ESI-MS와 SAM결과를 나타낸 것이다.
도 5는 7,8-DHF의 생전환 반응 추출물의 얇은 막 크로마토그래피 분석 결과를 나타낸 것이다. (1: 조추출물, 2: 컨트롤 반응, 3: 표준 7,8-DHF)
도 6의 (A)는 O-메틸전달효소(SpOMT2884)에 의한 7,8-DHF 반응산물의 HPLC결과를 나타낸 것이다. 도 6의 (B)는 7,8-DHF와 O-메틸전달효소 (SpOMT2884)의 반응산물의 HPLC-PDA-QTOF-ESI-MS 분석한 결과를 나타낸 것이다. SAM은 메틸화된 7,8-DHF의 유도체를 나타낸 것이다.
도 7의 (A)는 메틸화된 산물의 1H NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다. 도 7의 (B)는 메틸화된 산물의 13C NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 8의 (A)는 메틸화된 산물과 표준 7,8-DHF의 1H NMR 스펙트럼을 비교한 것을 나타낸 것이다. 도 8의 (B)는 메틸화된 산물의 HMQC 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 9는 O-메틸전달효소(SpOMT2884) 대사산물의 이종핵의 다중 결합 상관 관계(heteronuclear multiple bond correlation, HMBC) 스펙트럼을 나타낸 것이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 일 관점에서, 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 O-메틸전달효소 및 그 유전자에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 O-메틸전달효소(SpOMT2884)는 스트렙토마이시스 퍼시셔스(Streptomyces peucetius)유래인 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 효소는 S-아데노실-호모시스테인(S-adenosyl-L-methionine)을 형성시키면서 S-아데노실-L-메티오닌(S-adenocyl-L-methionine)의 메틸 그룹을 수용체 화합물의 특정 수산기로 이동시킨다 (Ibrahim et al., Plant Mol . Biol ., 36:1, 1998, Joshi and Chiang, Plant, Mol. Biol., 37:663, 1998). 상기 O-메틸전달효소(SpOMT2884)에 의한 플라노보이드의 O-메틸화는 페놀릭 수산기의 화학적 반응성을 변화시켜 항균력 (Middleton and Kandaswami, Champman & Hall , London, 619, 1994 (harborne, J.B.(Ed))뿐만 아니라 세포 내 구획을 증가시키고 막 수송능력을 높여줌으로써 화합물의 흡수가 가능하도록 친유성을 증가시킨다 (Wen and Walle, Drug Metab . Dispos., 34:1786, 2006, Walle, Int . J. Mol . Sci ., 10:5002, 2009).
본 발명의 일 실시예에서는 상기 스트렙토마이시스 퍼시셔스유래의 O-메틸전달효소 서열과 스트렙토마이시스 에버밀리티스, 벌코데리아 세노세파시아, 스트렙토아마이스 베네수엘라, 스트렙토마이시스 콜리너스, 사카로모노스포라 비리디스, 메틸박테리움 노듈란스 유래의 O-메틸전달효소 서열의 상동성을 분석한 결과, 각각 81%, 81%, 80%, 77%, 74%, 73%의 유사성을 확인하였다.
본 발명에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 O-메틸전달효소(SpOMT2884)를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.
본 발명의 일 실시예에서는 상기 O-메틸전달효소(SpOMT2884)를 코딩하는 유전자를 스트렙토마이시스 퍼시셔스의 유전체 DNA로부터 수득하여 pET28a(+) 벡터에 클론하여 pET28-SpOMT2884를 제작하였으며, 리스트릭션 멥핑, PCR, PCR 증폭산물의 서열확인을 통해 입증했다.
본 발명은 또 다른 관점에서, O-메틸전달효소(SpOMT2884)를 코딩하는 유전자 또는 상기 재조합 벡터가 숙주세포에 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 O-메틸전달효소(SpOMT2884) 생산능을 가지는 재조합 미생물에 관한 것이다.
본 발명의 일 양태에서는 상기 O-메틸전달효소(SpOMT2884)를 생산하기 위해 O-메틸전달효소(SpOMT2884)를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터, pET28-SpOMT2884를 대장균(Escherichia coli) BL21(DE3)에 형질전환시켜, 재조합 미생물을 만들었다. 상기 재조합 미생물에 의해 발현된 O-메틸전달효소(SpOMT2884)는 SDS-PAGE 상에 과 발현된 25kDa의 O-메틸전달효소 단백질 밴드를 통해 확인하였고, 이는 상기 재조합 미생물은 O-메틸전달효소(SpOMT2884)의 생산능을 갖는다는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 상기 재조합 미생물은 통상의 방법에 따라 상기 유전자를 미생물의 염색체(chromosome) 상에 삽입시키거나, 상기 재조합 벡터를 미생물의 플라스미드(plasmid) 상에 도입시킴으로써 제조할 수 있다.
본 발명에서 “벡터 (vector)”는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 “플라스미드 (plasmid)” 및 “벡터 (vector)”는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 그러나, 본 발명은 당 업계에 알려진 또는 알려지게 되는 바와 동등한 기능을 갖는 벡터의 다른 형태를 포함한다.
상기 벡터에 의해 형질전환 또는 형질감염된 숙주세포는 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다. 본 발명에서 사용된 용어 “형질전환”은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다. 이는 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행될 수 있다. 이러한 방법에는 전기충격유전자전달법(electroporation), 원형질 융합, 인산 칼슘(CaPO4) 침전, 염화 칼슘(CaCl2) 침전, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반, 아그로 박테리아 매개된 형질전환, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 발명의 숙주 세포는 원핵 또는 진핵생물 세포일 수 있다. 또한, DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현효율이 높은 숙주가 통상 사용된다. 대장균, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 진균, 효모와 같은 주지의 진핵 및 원핵 숙주들, 스포도프테라 프루기페르다(SF9)와 같은 곤충 세포, CHO 및 생쥐 세포같은 동물 세포, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40 및 BMT 10과 같은 아프리카 그린 원숭이 세포, 및 조직배양 된 인간 세포는 사용될 수 있는 숙주 세포의 예이다.
물론 모든 벡터가 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담 없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다. 발현 조절 서열을 선정함에 있어서도, 여러 가지 인자들을 고려하여야만 한다. 예를 들어, 서열의 상대적 강도, 조절가능성 및 본 발명의 DNA 서열과의 상용성 등, 특히 가능성있는 이차 구조와 관련하여 고려하여야 한다. 단세포 숙주는 선정된 벡터, 본 발명의 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물의 독성, 분비 특성, 단백질을 정확하게 폴딩시킬 수 있는 능력, 배양 및 발효 요건들, 본 발명 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물을 숙주로부터 정제하는 것의 용이성 등의 인자를 고려하여 선정되어야만 한다. 이들 변수의 범위 내에서, 당업자는 본 발명의 DNA 서열을 발효 또는 대규모 동물 배양에서 발현시킬 수 있는 각종 벡터/발현 조절 서열/숙주 조합을 선정할 수 있다. 발현 클로닝에 의해 NSP 단백질의 cDNA를 클로닝 하려고 할 때의 스크리닝법으로서 바인딩법(binding법), 페닝법(panning법), 필름에멀션법(film emulsion 법) 등이 적용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 미생물은 Agrobacterium 속, Aspergillus 속, Acetobacter 속, Aminobacter 속, Agromonas 속, Acidphilium 속, Bulleromyces 속, Bullera 속, Brevundimonas 속, Cryptococcus 속, Chionosphaera 속, Candida 속, Cerinosterus 속, Escherichia 속, Exisophiala 속, Exobasidium 속, Fellomyces 속, Filobasidium 속, Geotrichum 속, Graphiola 속, Gluconobacter 속, Kockovaella 속, Curtzmanomyces 속, Lalaria 속, Leucospoidium 속, Legionella 속, Psedozyma 속, Paracoccus 속, Petromyc 속, Rhodotorula 속, Rhodosporidium 속, Rhizomonas 속, Rhodobium 속, Rhodoplanes 속, Rhodopseudomonas 속, Rhodobacter 속, Sporobolomyces 속, Spridobolus 속, Saitoella 속, Schizosaccharomyces 속, Sphingomonas 속, Sporotrichum 속, Sympodiomycopsis 속, Sterigmatosporidium 속, Tapharina 속, Tremella 속, Trichosporon 속, Tilletiaria 속, Tilletia 속, Tolyposporium 속, Tilletiposis 속, Ustilago 속, Udenlomyce 속, Xanthophilomyces 속, Xanthobacter 속, Paecilomyces 속, Acremonium 속, Hyhomonus 속, Rhizobium 속 등을 예시할 수 있으며, 대장균(Escherichia coli)인 것이 바람직하다.
본 발명은 또 다른 관점에서 (a) 상기 재조합 O-메틸전달효소(SpOMT2884) 생산능을 가지는 재조합 미생물을 배양하여 재조합 O-메틸전달효소(SpOMT2884)를 생성하는 단계; 및 (b) 생성된 재조합 O-메틸전달효소(SpOMT2884)를 회수하는 단계를 포함하는 재조합 O-메틸전달효소(SpOMT2884)의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기의 재조합 O-메틸전달효소(SpOMT2884) 생산능을 가지는 재조합 미생물을 배양하여 O-메틸전달효소(SpOMT2884)를 생산하였으며, 생성된 재조합 O-메틸전달효소(SpOMT2884)는 히스티딘텍과 니켈-NTA와의 친화성을 이용한 친화성 크로마토그래피(Affinity chromatography)를 통해 정제하였다. 정제된 재조합 O-메틸전달효소(SpOMT2884)는 SDS-PAGE 상에 25kDa의 O-메틸전달효소의 단일 단백질 밴드를 통해 확인하였고, 이는 상기 재조합 미생물은 O-메틸전달효소(SpOMT2884)의 생산능을 갖는다는 것을 의미한다.
본 발명은 또 다른 관점에서 상기 O-메틸전달효소(SpOMT2884) 또는 상기 재조합 미생물 존재하에 플라보노이드 및 메틸공여체를 반응시켜 메틸화된 플라보노이드를 제조하는 것을 특징으로 하는 플라보노이드의 메틸화방법에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 플라보노이드는 7,8-dihydroxyflavone, 루테올린, 퀘세틴, 나린제닌, 피세틴, 폴모노네틴, 루틴 및 다이드제인으로 구성된 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정된 것은 아니다. 또한 상기 메틸공여체는 메틸기가 전이되면서 S-아데노실-L-호모시스테인으로 변하며, S-아데노실-L-메티오닌, 콜린, 베타인, 5-메틸테르아히드로엽산, 디메틸테틴으로 구성된 군 중에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 한다. 본 발명에서는 바람직하게 S-아데노실-L-메티오닌을 사용하였다.
본 발명의 실시예에서 상기 플라보노이드로 7,8-dihydroxyflavone, 루테올린, 퀘세틴, 나린제닌, 피세틴, 폴모노네틴, 루틴 및 다이드제인으로 구성된 군에서 선택될 수 있으며, 상기 O-메틸전달효소(SpOMT2884) 또는 상기 재조합미생물과 반응시킨 결과, 질량분석을 통해 메틸 그룹이 더해진 것과 상응하는 14Da의 분자량 증가를 확인하였다. 또한 메틸화된 산물로의 전환 비율을 확인한 결과 각각 91%, 87%, 86%, 85.92%, 77.8%, 66.41%, 55%, 44.4%로 나타났으며, 이는 상기 O-메틸전달효소(SpOMT2884)가 7,8-dihydroxyflavone을 가장 효과적으로 메틸화시키며, 7,8-dihydroxyflavone은 O-메틸전달효소(SpOMT2884)의 기질일 확률이 높다는 것을 의미한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
실시예 1: O - 메틸전달효소 ( SpOMT2884 )를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 재조합 미생물 제작
1-1: O - 메틸전달효소(SpOMT2884)를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 제작
본 실시예에서 사용된 O-메틸전달효소(SpOMT2884)를 코딩하는 유전자는 항종양제 독소루비신을 생산하는 균주인 스트렙토마이시스 퍼시셔스(Streptomyces peucetius) ATCC 27952에서 분리한 것이다.
SpOMT2884 유전자(GenBank Accession No. KF420279)를 분리하기 위하여, 스트렙토마이시스 퍼시셔스의 유전체 DNA를 주형으로 하여, SpOMT2884-F'(서열번호 3) 및 SpOMT2884-R'(서열번호 4)의 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행함으로써 O-메틸전달효소(SpOMT2884)유전자를 DNA를 증폭시켰다:
[서열번호 3] SpOMT2884-F-5'-TCCGGATCCATGACTCAGGATCAA-3' BamHI
[서열번호 4] SpOMT2884-R-5'-ATTAAGCTTTCAGGCAATCACCCG-3' HindIII
(밑줄 친 부분은 제한효소 부위를 나타낸다).
증폭한 PCR산물과 서열번호 1의 염기서열과 비교한 결과 서열이 일치함을 확인하였고, 증폭한 SpOMT2884의 염기 단편은 pGEM®-T 벡터(프로메가, Madison, WI, 미국)의 BamHI/HindIII 자리로 서브클론하였고, 대장균 발현 벡터 pET28a (+)(노바젠, Gibbstown, NJ, 미국)의 BamHI/HindIII 자리에 다시 클로닝 하고, 재조합 벡터 pET28-SpOMT2884를 제작하였다. 상기 벡터는 리스트릭션 멥핑, PCR, PCR 증폭산물의 서열확인을 통해 입증하였다.
1-2: 재조합 O - 메틸전달효소 ( SpOMT2884 ) 생산능을 가지는 재조합 미생물 제작
재조합 O-메틸전달효소(SpOMT2884)의 생산을 위해 SpOMT2884를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 재조합 미생물을 제작하였다. DNA 염기서열이 확인된 재조합 벡터(pET28-SpOMT2884)를 대장균(Escherichia coli ) BL21(DE3)로 형질전환시켰다. pET28-SpOMT2884를 함유한 E. coli BL21(DE3)를 50ug/㎖의 카나마이신(Kanamycine)이 함유된 LB 배지에 37℃에서 흔들어 배양하였다. 배양액의 흡광도가 600nm에서 0.6에 이를 때, 최종농도 0.5mM이 되도록 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(IPTG)를 첨가였다. 그 후 20℃에서 15시간을 더 배양 한 후 세포를 수득하였다. 수득 된 세포는 Tris-HCL(pH 7.5)버퍼로 세척한 후, -20℃에서 사용 전까지 보관하였다.
실시예 2: 재조합 O - 메틸전달효소(SpOMT2884)의 분리정제
실시예 1-2에서 제작된 재조합 미생물을 카나마이신이 함유된 LB 배지에서 IPTG 주입 후 15시간 동안 배양하여 제조합 O-메틸전달효소(SpOMT2884)를 제조하였다. 상기 배양된 cell pellet을 Tris-HCL(pH 7.5)버퍼로 현탁시킨 후, 초음파처리하여 용해시키고, 30분 동안 12,000rpm으로 원심분리 후 세포 용해물을 분리하였다. 용해 후 남은 상층액에 있는 히스티딘이 붙은 재조합 단백질을 분리 및 정제하기 위하여 니켈-NTA를 사용한 친화성 크로마토그래피법(Affinity chromatography)을 사용하였다. 상층액에 니켈-NTA 아가로스(퀴아젠, Hilden, 독일)를 혼합하고, 제조업자의 설명에 따라 정제하였다. 발현 및 분리된 단백질은 12% SDS-PAGE를 통하여 SpOMT2884 단백질의 뚜렷한 25 kDa 밴드를 확인하였으며 (도 2), Amicon Ultra-15 (밀리포어, 10kDa, Billerica, MA, 미국)을 이용하여 농축하였다. 정제된 단백질은 사용 전까지 100mM Tris-Cl(pH 8.0) 및 10 % [v/v] 글리세롤을 함유한 완충액에 보관하였다. 단백질의 농도는 브래드포드 어세이(Bradford)를 통하여 결정하였다.
실시예 3: 재조합 O - 메틸전달효소(SpOMT2884)의 시퀀스 얼라이먼트와 계통발생의 분석
Clustal X를 사용하여 미생물 유래 메틸전달효소와 관련된 단백질과 O-메틸전달효소(SpOMT2884)의 단백질 시퀀스의 상동성을 분석하였다 (Thompson et al., Nucleic Acid Res., 25:4876, 1997). 공통 계통수는 MEGA ver.5로 인접결합방법에 의해 만들었다 (Tamura et al., Mol . Biol . Evol., 24:1596, 2007). 공백과 손실된 데이터를 포함한 모든 데이터는 데이터 세트로부터 제거하였고, 백분율로 나타낸 부트스트랩 값(70 % 이상만 나타냄)은 노드에 나타나며, 부트스트랩을 1,000번 되풀이하여 구하였다. 스케일바는 0.02의 추산된 아미노산 변화를 나타낸다
이 전에 연구된 스트렙토마이시스 퍼시셔스의 유전자 DNA에 포함된 몇가지 O-메틸전달효소 유전자 중 SpOMT2884가 E. coli에서 발현이 잘 이루어지기 때문에 선택하였고, 이 SpOMT2884는 개방 판독 프레임 코드가 672bp이며, 단백질 크기는 25kDa이다. SpOMT2884의 일차서열과 몇몇 O-메틸전달효소의 서열을 비교한 결과, 스트렙토마이시스 퍼시셔스 유래 오매틸전달효소는 스트렙토마이시스 에버밀리티스와 벌코데리아 세노세파시아 유래 O-메틸전달효소와 81%, 스트렙토아미이스 베네수엘라와 80%, 스트렙토마이시스 콜리너스와 77%, 사카로모노스포라 비리디스와 74%, 메틸박테리움 노듈란스와 73%의 유사성을 보였으며, 마그네슘이온, AdoMet 및 기질 결합부위 또한 보존되었다는 것을 확인하였다 (도 3의 (A)). 계통발생론 분석을 위해 ClustalX를 사용하여 미생물과 관련된 O-메틸전달효소 단백질과 SpOMT2884의 단백질 서열을 정렬하였으며 (도 3의 (B)), 그 결과 스트렙토마이시스 베네수엘라의 O-메틸전달효소(GenBank Accession No. CCA55336.1)가 SpOMT2884와 가장 가까웠다.
실시예 4: 정제된 재조합 SpOMT2884 를 이용한 효소반응
얇은 막 크로마토그래피(TLC)는 실리카겔 60 F254 plate(머크, Darmstadt, 독일)를 사용하여 분석을 수행하였다. 본 실시예에서 기질로 사용되는 화합물은 메틸화시키기 위하여 클로로포름과 메탄올 [9:1 (v/v)]의 용액에 녹였고, 자외선 254nm에서 검출하였다. 또한 고성능 액체 크로마토그래피-포토다이오드 분석 탐지기 시스템(HPLC-PDA, 시마즈, Tokyo, 일본; SPD-M20A detector)은 역상 C18 컬럼(칸토 케미칼, Toko, 일본; Mightysil RP-18 GP, 250 x 4.6mm)을 사용하여 분석을 수행하였다. 이동상은 0.05%의 트리플루오로아트산을 포함한 HPLC등급의 H2O와 아세토니트릴(ACN)으로 구성하였다. 메틸화 반응 혼합물 분석을 위하여 기울기 시스템에서 1분당 1㎖의 흐름을 유지하였다(0-10min, 20-50% ACN; 10-20min, 50-90% ACN). 용리액은 PDA 검출기(시마즈, Tokyo, 일본; SPD-20A, UV/VIS)를 이용하여 270nm에서 관찰 하였고, 화합물은 UV 검출기 (270nm)와 연결된 C18 컬럼(YMC-Pack ODS-AQ (250 x 20mm I. D.,10㎛)에 ACN 20% (0-5분), 40% (5-10분), 40% (10-15분), 90% (15-25분), 90% (25-30분), 10% (30-35분)의 이성분 프로그램으로 36분 동안 분당 10㎖씩 흘려 프렙 HPLC로 정제하였다.
생산물의 분자량은 엑체 크로마토그래피-정량적 비과시간 전자 분무 이온화 직렬 질량분광계 [LC-quantitative time-of-flight electrospray ionization-tandem MS; QTOF-ESI-MS/MS (워터스 코퍼레이션, Milford, MA, 미국; Acquity-SYNAPT G2-S)]로 결정하였고, 정제된 산물은 동결건조기를 사용하여 완전히 건조시켜 구조해명에 사용하였다. 디메틸 술폭시드-d6 (DMSO, 시그마-알드리치, 미국) 아래의 핵자기공명분광학(NMR spectroscopy)은 적절할 때 500MHz Bruker BioSpin을 사용하여 얻어냈으며, 모든 NMR 데이터는 MestNeRova 소프트웨어를 사용하여 진행하였다.
정제 된 재조합 SpOMT2884에 대한 효소반응을 확인했다. 최종 농도 100ug/㎖의 정제된 재조합 O-메틸전달효소(SpOMT2884) 20㎕와 메틸 공여체인 2mM의 S-아데노실-L-메티오닌(시그마-알드리치, St. Louis, Mo, 미국), 5mM MgSO4 및 2mM의 수용기질을 포함하는 Tris-HCl(pH 7)에 최종 부피 100㎕이 되도록 만들고 37℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 냉각시킨 메탄올 400㎕를 첨부하여 반응을 종결시켰고, 반응물은 몇 분 동안 흔든 후, 5분 동안 12,000rpm으로 원심분리하였다. 상층액은 새로운 튜브로 옮겨 얇은 막 크로마토그래피(TLC), 고성능 액체 크로마토그래피-포토다이오드 분석 탐지기 시스템(HPLC-PDA), 질량분석법(Mass spectrospory)에 사용하였다.
플라보노이드 7,8-DHF를 정제된 단백질에 첨가하여 O-메틸전달효소 반응을 테스트하였다 (도 1). 반응 혼합물의 HPLC-PDA 분석결과, 메틸화된 7,8-DHF의 형성 (retention time (tR): 17,1 min)을 확인하였고, HPLC-PDA-QTOF-ESI/MS 분석 (m/z +~[M+H]+ 269.0818)으로 추가 확인하였다. 사전에 효소가 SAM에서 7,8-DHF로 메틸 그룹을 이동시킨 것을 질량분석을 통해 확인하였고, 본 실험에서 사용된 다른 기질도 같은 방법을 적용한 결과, SpOMT2884는 플라보노이드의 O-메틸전달효소라는 것을 증명하였다 (도 1의 (B)).
실시예 5: 전체 세포의 생촉매 작용
5-1: in vivo 테스트를 위한 SpOMT2884 발현
pET28a-SpOMT2884를 함유한 E. coli BL21(DE3)가 전체 세포 생 촉매작용 분석을 위하여 사용하였다. 배양접종물은 적절한 항생제가 포함된 3㎖의 액체배지로 준비하였고, 37℃에서 200rpm으로 밤새 배양한 후, 200㎕만 항생제가 포함된 50㎖의 LB 액체배지에 접종시켰다. 흡광도가 600nm에서 약 0.6에 이를 때까지, 37℃에서 배양한 후, IPTG를 최종 농도가 0.5mM이 되도록 넣고 20℃에서 3시간 동안 배양하였다. 7,8-DHF, 퀘세틴, 루테올린, 루틴, 나린제닌, 다이드제인, 폴모노네틴을 분리된 배양물에 각각 최종농도 200uM이 되도록 첨부하였고, 20℃에서 60시간 동안 220rpm으로 흔들어 배양하였다. 배양 후, 배양균을 모으고, 2배의 초산에틸을 넣어 추출하였다. 유기물 층은 따로 모아 증발시켜 농축시키고, 300㎕의 메탄올에 녹여, TLC, HPLC 및 다른 분석에 사용하였다.
5-2: SpOMT2884 의 기질 특이성
본 실시예에서 in vivo에서 7,8-DHF를 메틸화시키기 위하여 재조합 O-메틸전달효소(SpOMT2884)를 과발현시키는 Ecoli. BL21(DE3)를 사용하였다. 메틸화 산물은 TCL과 HPLC, 질량분석을 통하여 메틸화된 7,8-DHF 유도체를 확인하였고, 이러한 이유로 다른 플라보노이드의 생변환을 확인하기 위하여 플라보놀(퀘세틴, 루틴), 플라본(루테올린), 플라바논(나린제닌), 이소플라보노이드(다이드제인, 폴모노네틴), 2,5-디하이드록시-벤조산염(시그마-알드리키, St. Louis, Mo, 미국)을 사용하여 추가 실험을 실시하였다. 아무 산물도 확인되지 않은 2,5-디하이드록시-벤조산염을 제외하고 각각의 기질에서 메틸화된 유도체 산물을 확인하였다. 각 기질의 전환 패턴은 다양했으며(표 1), 정확한 질량분석을 통해 메틸그룹이 더해진 것과 상응하는 14Da의 분자량 상승을 확인하였다 (도 4, 표 2).
Figure pat00001
Figure pat00002
7,8-DHF, 루테올린, 퀘세틴, 나린제닌, 피세틴, 폴모노네틴, 루틴, 다이드제인의 변환 비율은 각각 91%, 87%, 86%, 85.92%, 77.8%, 66.41%, 55%, 44.4%로 확인되었다. 이러한 결과는 다른 기질과 비교하여 7,8-DHF가 재조합 SpOMT2884에 의해 더 효과적으로 메틸화되는 것을 보여주며, SpOMT2884의 기질일 확률이 높다는 것을 증명하였다.
5-2: 메틸화된 7,8- DHF 산물의 특성
본 발명자들은 in vivo에서 메틸화된 7,8-DHF의 생산을 위한 생체촉매로써 SpOMT2884를 발현시키는 E. coli BL21(DE3)을 사용하여 7,8-DHF의 메틸화를 실시하였다. pET28-SpOMT2884를 발현시키는 E. coli BL21(DE3) 배양액에 0.2mM의 7,8-DHF를 첨부하여 메틸화된 7,8-DMF 산물을 얻어내었고, TLC(retention factor (Rf): 0.7) (도 5), HPLC(t R : 17.1 min) (도 6의 (A)), HPLC-PDA-QTOF-ESI/MS (도 6의 (B)), 핵자기공명 분광학 (도 7)을 통하여 추가적으로 확인하였다. 메틸화된 산물은 prep-HPLC를 이용하여 분리하였고, SpOMT2884 반응산물과 7,8-DHF의 1H NMR 스펙트라를 비교하였을 때, 방향족 범위에서 화학적 이동이 변하는 것과 3.96ppm에서 새로운 단일 피크가 생긴 것이 확인되었다 (도 8의 (A), 표 3).
Figure pat00003
이 새로운 프로톤 피크는 이종핵의 다중 결합 상관 관계의 61.5ppm에서 나타내는 탄소 피크와 바로 연결되기 때문에 메톡시 프로톤에 대한 것이며 (도 8의 (B)), 생산물의 메틸화 자리를 결정하기 위하여 이종핵의 다중 결합 상관 관계 (Heteronuclear multiple bond correlation; HMBC) 실험을 실시한 결과, 프로톤산물이 HMBC 스펙트럼에서 C8와 강한 연관성을 갖는다는 것을 보여줌으로써 (도 9), 이 산물이 7-하이드록시-8-메톡시플라본이라는 것을 증명하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> SUNMOON UNIVERSITY INDUSTRY- UNIVERSITY COOPERATION FOUNDATION <120> Flavonoid-O-methyltransferase and Method for methylation of flavones <130> P13-B292 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 672 <212> DNA <213> Streptomyces peucetius ATCC 27952 O-methyltransferase (OMT2884) <400> 1 atgactcagg atcaatggca ggcggtggac gcctacatca gcgatctcct cgtccccgag 60 gacgacgctc tggccgaagc cctcaccgcg agcgacgcgg cggggctgcc gcggatcaac 120 gtggcaccca accagggcaa gctgctgcat ctgctggcgc gtgtgcaggg cgcgcgcacg 180 gccctggaga tcggcacgct cggcggctac agcacgatct ggctggcgcg ggcgctgcct 240 gcggacggcc ggctgatctc gctcgagtac gacccggccc acgcggaggt cgcccgggcg 300 aacatcgcgc gggccggcct ggacaaggtc gtcgaggtcc gcacgggcgc ggccctcgac 360 accctcccgc gcatcgcggc ggaaccgggc gcgggcccct tcgacctggt cttcatcgac 420 gcggacaagc gcaacaacgc gcgctacgtg gagtgggccc tgcgcctcac gcgcccgggc 480 agcgtgatca tcgtcgacaa cgtggtgcgg ggcggggccg tcgtcgacgg ctcgagcgag 540 gacccgtcga tcgtcgggac gcgcgagatg ttcgaactcg tggcgcgcga ggcacggctg 600 gaggcgacgg cggtgcagac cgtgggggtg aaggggtacg acgggatgtt ggtcgcgcgg 660 gtgattgcct ga 672 <210> 2 <211> 223 <212> PRT <213> Streptomyces peucetius ATCC 27952 O-methyltransferase (OMT2884) <400> 2 Met Thr Gln Asp Gln Trp Gln Ala Val Asp Ala Tyr Ile Ser Asp Leu 1 5 10 15 Leu Val Pro Glu Asp Asp Ala Leu Ala Glu Ala Leu Thr Ala Ser Asp 20 25 30 Ala Ala Gly Leu Pro Arg Ile Asn Val Ala Pro Asn Gln Gly Lys Leu 35 40 45 Leu His Leu Leu Ala Arg Val Gln Gly Ala Arg Thr Ala Leu Glu Ile 50 55 60 Gly Thr Leu Gly Gly Tyr Ser Thr Ile Trp Leu Ala Arg Ala Leu Pro 65 70 75 80 Ala Asp Gly Arg Leu Ile Ser Leu Glu Tyr Asp Pro Ala His Ala Glu 85 90 95 Val Ala Arg Ala Asn Ile Ala Arg Ala Gly Leu Asp Lys Val Val Glu 100 105 110 Val Arg Thr Gly Ala Ala Leu Asp Thr Leu Pro Arg Ile Ala Ala Glu 115 120 125 Pro Gly Ala Gly Pro Phe Asp Leu Val Phe Ile Asp Ala Asp Lys Arg 130 135 140 Asn Asn Ala Arg Tyr Val Glu Trp Ala Leu Arg Leu Thr Arg Pro Gly 145 150 155 160 Ser Val Ile Ile Val Asp Asn Val Val Arg Gly Gly Ala Val Val Asp 165 170 175 Gly Ser Ser Glu Asp Pro Ser Ile Val Gly Thr Arg Glu Met Phe Glu 180 185 190 Leu Val Ala Arg Glu Ala Arg Leu Glu Ala Thr Ala Val Gln Thr Val 195 200 205 Gly Val Lys Gly Tyr Asp Gly Met Leu Val Ala Arg Val Ile Ala 210 215 220 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SpOMT2884-F <400> 3 tccggatcca tgactcagga tcaa 24 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SpOMT2884-R <400> 4 attaagcttt caggcaatca cccg 24

Claims (14)

  1. 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 O-메틸전달효소(SpOMT2884).
  2. 제1항에 있어서, 상기 O-메틸전달효소(SpOMT2884)는 스트렙토마이시스 퍼시셔스(Streptomyces peucetius) ATCC 27952 유래인 것을 특징으로 하는 O-메틸전달효소(SpOMT2884).
  3. 제1항의 O-메틸전달효소(SpOMT2884)를 코딩하는 유전자.
  4. 제3항에 있어서, 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 유전자.
  5. 제3항의 유전자를 함유하는 재조합 벡터.
  6. 제3항의 유전자 또는 제5항의 재조합 벡터가 숙주세포에 도입되어 있는 O-메틸전달효소(SpOMT2884) 생산능을 가지는 재조합 미생물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 숙주세포는 대장균(Escherichia coli)인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  8. 다음의 단계를 포함하는 재조합 O-메틸전달효소(SpOMT2884)의 제조방법;
    (a) 제6항의 재조합 미생물을 배양하여 재조합 O-메틸전달효소(SpOMT2884)를 생성하는 단계; 및
    (b) 생성된 재조합 O-메틸전달효소(SpOMT2884)를 회수하는 단계.
  9. 다음의 단계를 포함하는 메틸화 플라보노이드의 제조:
    (a) 제1항의 O-메틸전달효소(SpOMT2884) 존재하에 플라보노이드 및 메틸공여체를 반응시켜 메틸화된 플라보노이드를 생산하는 단계; 및
    (b) 생성된 메틸화된 플라보노이드를 수득하는 단계.
  10. 제9항에 있어서, 상기 플라보노이드는 7,8-디하이드록시플라본, 루테올린, 퀘세틴, 나린제닌, 피세틴, 폴모노네틴, 루틴 및 다이드제인으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 메틸공여체는 S-아네도실-L-메티오닌, 콜린, 베타인, 5-메틸테르아히드로엽산 및 디메틸테틴으로 구성된 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 플보노이드의 메틸화 방법
  12. 다음의 단계를 포함하는 메틸화 플라보노이드의 제조:
    (a) 제6항의 재조합미생물 존재하에 플라보노이드 및 메틸공여체를 반응시켜 메틸화된 플라보노이드를 생산하는 단계; 및
    (b) 생성된 메틸화된 플라보노이드를 수득하는 단계.
  13. 제12항에 있어서, 상기 플라보노이드는 7,8-디하이드록시플라본, 루테올린, 퀘세틴, 나린제닌, 피세틴, 폴모노네틴, 루틴 및 다이드제인으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제12항에 있어서, 상기 메틸공여체는 S-아네도실-L-메티오닌, 콜린, 베타인, 5-메틸테르아히드로엽산 및 디메틸테틴으로 구성된 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 플보노이드의 메틸화 방법

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN116634860A (zh) * 2020-11-18 2023-08-22 三得利控股株式会社 黄酮4’-o-甲基转移酶基因及其应用

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