KR101718985B1 - 케토리덕타아제 변이체 - Google Patents

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Abstract

다우노루비신 유도체의 효율적인 생산에 사용할 수 있는 케토리덕타아제 변이체, 상기 변이체를 코드하는 DNA, 상기 DNA가 도입되어 다우노루비신 유도체를 생산하는 형질 전환체 및 상기 형질 전환체를 이용한 다우노루비신 유도체 제조 방법을 공개한다.
상기 케토리덕타아제 변이체는, 클로로레모 마이신 생산균 (Amycolatopsis orientalis)의 케토리덕타아제(EvaE)의 아미노산 서열 중의 42, 149, 153, 270 및 306 번째 아미노산에 상당하는 위치의 아미노산으로 이루어진 군에서 선택되는 1 개 또는 2 개 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기에 의해 치환되게 된다.

Description

케토리덕타아제 변이체{Ketoreductase mutant}
본 발명은 반합성으로 생산되는 다우노루비신(ダウノルビシン) 유도체의 미생물에 의한 발효 생산법에 사용되는 케토리덕타아제(ケトレダクタ-ゼ)의 변이체에 관한 것이다.
안트라사이클린(アントラサイクリン)계 항생 물질은 방향족 폴리케타이드(ポリケタイド)의 일군의 화합물이며, 7,8,9,10-테트라히드로-5,12-나프타센퀴논(ナフタセンキノン) (아래 그림)을 기본 골격으로 하는 아글리콘(アグリコン)부분과 아미노당(糖)을 주체로 한 당류로 구성된 색소 배당체(配糖體) (글리코 시드;グリコシド)이다.
Figure 112012101669606-pct00001
안트라사이클린계 항생 물질은 DNA와 결합하여, 라디칼을 발생하여 DNA 사슬을 절단하거나 또는 토포이소메라아제II를 저해한다. 토포이소메라아제는 DNase와 ligase 활성을 가지고, DNA 사슬의 일시적 절단과 재결합을 촉매하지만, 안트라사이클린 항생 물질은 토포이소메라아제II를 저해함에 의해, DNA 복제에 장애를 주고, 항종양(抗腫瘍) 활성을 발휘한다. 안트라사이클린계 항생 물질은, 축적성 심독(心毒) 작용이 인정되지만, 광범위의 암세포에 대해서 항종양 활성을 나타내는 것 때문에 유용한 항암제로 자리 매김하고 있다.
현재 사용되는 주요한 안트라사이클린계 항암제에는 다우노루비신 등 발효 생산물 유래의 것과, 독소루비신(ドキソルビシン)이나 에피루비신(エピルビシン) 등 다우노루비신을 원료로 한 반합성품이 있다.
Figure 112012101669606-pct00002
Figure 112012101669606-pct00003
에피루비신은 항종양 활성과 독성의 면에서 다우노루비신이나 독소루비신 보다 우수하지만, 아미노 당 부분의 4위 수산기를 반전(反轉)시키기 위한 화학 합성 공정의 수율이 낮아, 현재 상태에서, 다우노루비신을 출발 원료로 해서 에피루비 신이 생산되고 있지만, 제조 비용 측면에서 과제가 많다. 한편 다우노루비신 생합성에 관여하는 케토리덕타아제로는 생성물의 입체 특이성이 다른 케토리덕타아제 (에피형 케토리덕타아제)를 코드(コ-ド)하는 유전자를 다우노루비신 생산균(生産菌)에 도입하여, 다우노루비신 생합성 경로를 개변(改變)시켜 에피다우노루비신을 직접 발효생산시키는 연구가 보고되고 있다 (비특허 문헌 1). 에피다우노루비신은, 아미노 당 부분의 수산기의 입체 배좌(立體配座)가 에피루비신과 동일하기 때문에, 에피루비신을 생산하는데, 에피다우노루비신은 매우 유용한 출발 원료가 될 수 있다. 아베르멕틴(アベルメクチン) 생합성에 관련된 에피형 케토리덕타아제 유전자 (avrE)를 도입할 때 가장 높았다고 보고되고 있지만, 그 생산량은 약 54 μg/mL에 불과해서, 실용화 가능한 수준에는 도달하지 않는다. 또한, 이 연구에서 얻은 에피다우노루비신 생산균을 변이원(變異原) 처리하여, 에피다우노루비신의 생산성을 100 μg/mL 이상으로 향상시켰다는 특허 출원이 이루어지고 있으나(특허 문헌 1), 취득된 변이주(變異株)에 대한 자세한 내용은 실시예에 기재되어 있지 않다. 한편, 본 발명자들은 클로로 레모 마이신(クロロレモマイシン)에 포함된 아미노 당인 에피반코사민(エピバンコサミン) 생합성에 관여하는 케토리덕타아제 유전자 (evaE)를 도입했을 때, avrE 유전자를 도입한 경우와 비교하여 에피다우노루비신 생산량이 2.7 배로 향상하는 것을 발견하여 특허 출원 하였다 (특허 문헌 2).
특허 문헌 1: 국제 공개 제 WO2006/111561호 팜플렛 특허 문헌 2: 국제 공개 제 WO2009/035107호 팜플렛
비특허 문헌 1 : 마즈리 (Madduri, K.)등 저(著), 「네이처·바이오 테크놀로지 (Nature Biotechnology)」, (미국), 1998 년, 제 16 권, p.69-74 비특허 문헌 2: 리프맨 앤드 퍼슨 (Lipman DJ and Pearson WR) 저(著), 「사이언스 (Science)」, (미국), 1985 년, 제 227 권, p.1435-1441 비특허 문헌 3: 리프맨 앤드 퍼슨 (Lipman DJ and Pearson WR) 저(著), 「프로시딩스·오브·더·내셔널 아카데미·오브·더·사이언스·오브·더·유나이티드 스테이트·오브·아메리카 ( Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America)」, (미국), 1988 년, 제 85 권, p.2444-2448 비특허 문헌 4: 슈미트 존 앤드 엔젤스 (Schmitt-John, T.and Engels, JW)저(著) 「어플라이드·마이크로 바이올로지·앤드·바이오 테크놀러지 (Applied Microbiology and Biotechnology)」,(독일), 1992 년, 제 36 권, p.493-498 비특허 문헌 5: 비부 (Bibb, MJ) 등 저(著), 「몰리큘라·마이크로바이올 로지 (Molecular Microbiology)」, (영국), 1994 년, 제 14 권, p.533-545 비특허 문헌 6: 「프렉티컬·스트렙토 마이세스·제네틱스 (Practical Streptomyces Genetics)」, 「더·존·이네스·파운데이션 (The John Innes Foundation)」(영국), 노루위쿠 (Norwick), 2000 년, p.311-338 비특허 문헌 7: 비부 (Bibb, MJ) 등 저(著), 「진 (Gene)」, (영국), 1985 년, 제 38 권, p215-226 비특허 문헌 8: 코미 야마 (Komiyama, T.) 등 저(著), 「더·저널·오브·안티 바이오틱스 (The Journal of Antibiotics) 」, (일본), 1977 년, 제 30 권, p.619-621
본 발명은 미생물에 의한 에피다우노루비신 등의 다우노루비신 유도체의 직접 발효 생산법에 사용되는 케토리덕타아제에 있어서, 다우노루비신 유도체의 생산성을 향상하도록 개변(改變)된 케토리덕타아제 변이체를 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명자들은, 미생물에 의한 다우노루비신 유도체의 직접 발효 생산법에 사용되는 케토리덕타아제로서, 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 케토리덕타아제 (EvaE)의 개변을 예의 검토하여, 42 번째, 149 번째, 153 번째, 270 번째, 그리고 306 번째 아미노산 군에서 선택되는 적어도 1 개소의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 케토리덕타아제 변이체를 사용함에 의해, 다우노루비신 유도체의 생산성이 향상되는 것을 발견하고, 본 발명을 완성시켰다.
즉, 본 발명은, 미생물에 의한 효율 좋은 다우노루비신 유도체의 직접 발효 생산에 사용 가능한 케토리덕타아제 변이체 및 상기 변이체를 코드하는 폴리 뉴클레오티드 (특히 DNA)를 제공하는 것이다. 또한, 본 발명은, 본 발명의 케토리덕타 아제 변이체를 코드하는 DNA에 의한 형질 전환체를 제공함과 함께, 상기 혈질 전환체를 배양하여, 얻은 배양액으로부터 다우노루비신 유도체를 채취하는 공정을 포함하여 된 다우노루비신 유도체의 제조 방법을 제공하는 것이다. 또한 본 발명은, 본 발명의 형질 전환체에 의해 생산되는 다우노루비신 유도체를 제공하는 것이다.
따라서, 본 발명은 다음의 것을 제공한다:
(1) 다우노마이신(ダウノマイシン) 유도체의 발효 생산에 사용 가능한 케토리덕타아제 효소의 변이체이며, 친(親, 모체 또는 근본) 케토리덕타아제(ケトレダクタ-ゼ)의 아미노산 서열에 있어서, 변이가 1 개 또는 복수개의 아미노산이 삽입, 치환 또는 결실되거나, 또는 그것의 일방 또는 양쪽 말단으로의 부가이며, 친(親) 케토리덕타아제를 사용했을 때 보다도 다우노마이신 유도체의 생산성을 향상하는 케토리덕타아제 변이체.
(2) 친(親) 케토리덕타아제가 서열 번호 1의 아미노산 서열과 90 % 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 (1)에 기재된 케토리 덕타아제 변이체.
(3) 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열 중의 42, 149, 153, 270 및 306 번째 아미노산에 상당하는 위치의 아미노산으로 이루어진 군에서 선택되는 1 개 또는 2 개 이상의 아미노산 잔기가, 다른 아미노산 잔기에 의해 치환되게 되는, (2)에 기재된 케토리덕타아제 변이체.
(4) 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열 중의 42 번째 아미노산에 상당하는 위치의 아미노산이 류신(ロイシン)으로 치환되는 것을 특징으로 하는 (3)에 기재된 케 토리덕타아제 변이체.
(5) 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열 중의 149 번째 아미노산에 상당하는 위치의 아미노산이 세린(セリン)으로 치환되는 것을 특징으로 하는 (3)에 기재된 케토리덕타아제 변이체.
(6) 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열 중의 153 번째 아미노산에 상당하는 위치의 아미노산이 프롤린(プロリン) 이외의 아미노산 잔기로 치환되는 것을 특징으로 하는 (3)에 기재된 케토리덕타아제 변이체.
(7) 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열 중의 270 번째 아미노산에 상당하는 위치의 아미노산이 아르기닌(プロリン)으로 치환되는 것을 특징으로 하는 (3)에 기재된 케토리덕타아제 변이체.
(8) 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열 중의 306 번째 아미노산에 상당하는 위치의 아미노산이 아스파라긴(アスパラギン)산으로 치환되는 것을 특징으로 하는 (3)에 기재된 케토리덕타아제 변이체.
(9) 다우노마이신 유도체가 에피다우노마이신임을 특징으로하는 (1) ~ (8)의 어느 한 항에 기재된 케토리덕타아제 변이체.
(10) (1) ~ (9)의 어느 한 항에 기재된 케토리덕타아제 변이체를 코드하는 폴리 뉴클레오티드.
(11) (10)에 기재된 DNA가 본래 다우노마이신을 생산하는 능력을 가지는 방선균(放線菌) 숙주에 도입되어, 다우노마이신 유도체 생산 능력이 부여된 형질 전환체.
(12) 숙주의 방선균이 Streptomyces coeruleorubidus 인 것을 특징으로 하는 (11)에 기재된 형질 전환체.
(13) (12)에 기재된 형질 전환체를 배양하여, 배양액으로부터 다우노마이신 유도체를 채취하는 공정을 포함하는 다우노마이신 유도체의 제조 방법.
(14) (13)에 기재된 제조 방법으로 얻어진 다우노마이신 유도체.
본 발명의 케토리덕타아제 변이체에 의하면, 다우노루비신 유도체의 생산성을 향상시킬 수 있다.
본 발명의 케토리덕타아제 변이체는 친(親) 케토리덕타아제를 변이시킨 결과 얻을 수 있는 것이다. 또한, 본 발명에 있어서는, 이 변이가 케토리덕타아제의 아미노산 서열에 있어서, 1 개 또는 복수개의 아미노산의 삽입, 치환 또는 결실, 또는 그것의 일방 또는 양쪽 말단으로의 부가이며, 또한 케토리덕타아제 변이체를 다우노루비신 유도체의 발효 생산법에 사용한 경우, 친(親) 케토리덕타아제를 사용한 경우와 비교하여 다우노루비신 유도체의 생산성이 향상되는 것임을 의미한다.
본 발명에서 친(親) 케토리덕타아제는, 다우노루비신 유도체의 발효 생산법에 사용 가능한 것이면 한정되지 않지만, 서열 번호 1에 나타난 아미노산 서열에 의해 이루어지는 케토리덕타아제 또는 그의 상동체(相同體)가 바람직하다. 여기서 「그의 상동체」로는, 서열 번호 1에 나타난 아미노산 서열에서, 몇개의 아미노산의 삽입, 치환 또는 결실, 또는 그것의 일방 또는 양쪽 말단으로의 부가가 이루어진 것으로, 서열 번호 1 로 표시되는 아미노산 서열과 90 % 이상의 동일성을 가지며, 그리고 그 케토리덕타아제 활성을 유지하는 것을 말하는 것으로 한다. 여기서 말하는 「동일성」은 당업자에게 공지의 상동성(相同性) 검색 프로그램인 [FASTA3; http://fasta.ddbj.nig.ac.jp/top-j.html] 「Science, 227,1435 -1441 (1985); Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85,2444-2448 (1988) (비특허 문헌 2,3)」에서 디펄트(デフォルト) (초기 설정)의 파라메타를 이용하여 산출되는 수치이다. 또한 케토리덕타아제 활성의 유무는, 후술하는 적절한 숙주에 상동체를 코드하는 유전자를 도입, 발현시켜, 다우노루비신 유도체의 생성 유무를 조사함에 의해 판정할 수 있다. 이러한 「상동체」는, 서열 번호 1에 표시된 서열을 참조하면, 당업자라면 곤란성없이 선택하고, 제조 가능한 것은 분명하다.
본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 친(親) 케토리덕타아제가 서열 번호 1에 나타난 아미노산 서열로 이루어지는 것인 경우, 그 서열 중의 42, 149, 153, 270 및 306 번째 아미노산으로 이루어진 군에서 선택되는 1 개 또는 2 개 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기에 의해 치환되게 되는 변이체가 그것의 구체적인 예로서 들 수 있다.
본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 42 번째 아미노산이 류신에, 149 번째 아미노산이 세린에, 153 번째 아미노산이 프롤린 이외의 아미노산으로, 270 번째 아미노산이 아르기닌에, 306 번째 아미노산이 아스파라긴(アスパラギン)산으로 치환된 것이 바람직한 것으로 꼽힌다. 이러한 변이체는, 다우노루비신 유도체의 발효 생산법에 사용한 경우, 다우노루비신 유도체의 생산성이 향상되는 유리한 특성을 가지고 있다.
또한, 친(親) 케토리덕타아제가 서열 번호 1에 나타난 아미노산 서열의 상동체 인 경우에는, 상기의 42, 149, 153, 270 및 306 번째 아미노산에 상당하는 위치의 아미노산으로 이루어진 군에서 선택되는 1 개 또는 2 개 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기에 의해 치환되는 것이 그것의 구체예로서 들 수 있다. 여기서, 서열 번호 1에 나타난 아미노산 서열로 이루어지는 친(親) 케토리덕타아제의 상동체에서 치환되어야 할 아미노산 잔기의 위치는, 공지 알고리즘에 의한 아미노산 서열을 비교해서 쉽게 선택할 수 있다. 한편, 공지 알고리즘에 의한 아미노산 서열의 비교가 곤란한 경우에 있어서는, 효소의 입체 구조를 비교함에 의해 치환되어야 할 아미노산 잔기의 위치를 특정할 수 있다.
본 발명의 케토리덕타아제 변이체를 코드하는 DNA를, 본래 다우노루비신을 생산하는 능력을 가진 적절한 숙주에 도입함에 의해, 다우노루비신 유도체를 생산하는 형질 전환체를 얻을 수 있다. 바람직한 숙주는 방선균이며, 다우노루비신을 생산하는 방선균으로 스트렙토 마이세스·퓨세티카스 (Streptomyces peuceticus)나 스트렙토 마이세스·케루레오루비다스 (Streptomyces coeruleorubidus)가 알려져 있으며, 이들을 본 발명의 케토리덕타아제 변이체를 코드하는 DNA 도입하기 위한 숙주로서 이용할 수 있다. 또한, 바우마이신(バウマイシン)은 다우노루비신의 아미노 당 (L-다우노사민) 부분이 수식(修飾)된 물질로 다우노루비신이 생합성 중간체이므로, 바우마이신을 생산하는 방선균도 숙주로 이용할 수 있다. 또한 상술한 다우노루비신 또는 바우마이신 생산균에서, 다우노루비신의 L-다우노사민 부분의 4위 수산기 생합성에 관여하는 케토리덕타아제 유전자가 결손함에 의해, 다우노루비신 생산 능력을 잃은 균주를 숙주로 이용하는 것이 바람직하다.
숙주에 유전자를 도입하는 것은, 프로토플라스토(プロトプラスト)와 목적 DNA를 혼합하는 방법, 파지(ファ-ジ)를 이용하는 방법, 접합 전달을 이용하는 방법 등 통상의 수법을 이용할 수 있고, 숙주의 성질을 고려하여 적절한 방법을 선택하여 실시할 수 있다. 유전자가 도입된 균주를 선발하기 위해, 목적하는 에피형 케토리덕타아제 유전자는 선택 마커 유전자를 포함하는 벡터와 함께 도입하는 것이 바람직하다. 선택 마커 유전자는 에피형 케토리덕타아제 유전자가 도입된 균주를 선발할 수 있는 것이면 한정되지 않지만, 카나마이신(カナマイシン) 내성 유전자, 스트렙토마이신(ストレプトマイシン) 내성 유전자, 하이구로마이신(ハイグロマイシン) 내성 유전자, 바이오마이신 내성 유전자 또는 아프라 마이신(アプラマイシン) 내성 유전자 등이 바람직하다. 도입하는 에피형 케톤리덕타아제 유전자에는 숙주로 기능하는 프로모터(プロモ-タ-) 서열을 부가해 두는 것이 바람직하고, 에리스로 마이신(エリスロマイシン) 내성 유전자 유래의 ermE * 프로모터 [슈미트 존 앤드 엔젤스 (Schmitt-John, T.and Engels, JW) 저(著), 「어플라이드·마이크로바이올로지·앤드·바이오 테크놀러지 (Applied Microbiology and Biotechnology)」, (독일), 1992 년, 제 36 권, p.493-498 (비특허 문헌 4)], [비부 (Bibb , MJ) 등 저(著), 「몰리큘라 마이크로바이올 로지 (Molecular Microbiology)」, (영국), 1994 년, 제 14 권, p.533-545 (비특허 문헌 5)] 등이 바람직한 예로서 들 수 있다. 숙주 내에서의 에피형 케토리덕타아제 유전자의 존재 상태로서는, 염색체 외에서 자기 복제 가능한 플라스미드 또는 염색체의 어느 것에 포함되어 있어도 좋다. 또한, 에피형 케토리덕타아제 유전자를, 다우노루비신의 L-다우노사민 부분의 4위 수산기 생합성에 관련된 숙주의 케토리덕타아제 유전자와 치환하는 방법으로 도입하여도 좋다. 유전자를 치환하는 방법으로는 방선균으로 일반적으로 사용되는 방법을 이용할 수 있다 [프렉티컬·스트렙토 마이세스·제네틱스 (Practical Streptomyces Genetics)」, 「더·존·이네스·파운데이션 (The John Innes Foundation)」(영국), 노루위쿠 (Norwick), 2000 년, p.311-338 (비특허 문헌 6).
본 발명의 형질전환체가 생산하는 다우노루비신 유도체는, 다우노루비신의 L-다우노사민 부분의 4위 수산기가 반전한 다우노루비신 유도체이다. 바람직하게는 에피다우노루비신 및 에피루비신이며, 보다 바람직하게는 에피다우노루비신이다.
본 발명의 형질 전환체는 관행의 방법으로 배양하여, 다우노루비신 유도체를 생산할 수 있다. 배지로서는 관용의 성분, 예를 들면 탄소원으로는 글루코스, 슈 크로스, 물엿, 덱스트린, 전분, 글리세롤, 당밀(糖蜜), 동·식물성 기름 등이 사용될 수 있다. 또한 질소원으로는 대두(大豆) 분말, 소맥(小麥) 배아, 옥수수 침지액(コ-ン·スティ-プ·リカ-), 면실박(綿實粕), 고기 엑기스, 폴리펩톤, 마루토 엑기스(マルトエキス), 이스트 엑기스, 황산 암모늄, 질산 나트륨, 요소 등이 사용될 수 있다. 기타 필요에 따라, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 코발트, 염소, 인산 (인산수소 2칼륨 등), 황산 (황산 마그네슘 등) 및 기타 이온을 생성 할 수 있는 무기 염류를 첨가하여도 유효하다. 또한 필요한 경우, 티아민 (티아민 염산염 등) 등의 각종 비타민, 글루타민산 (글루타민산 나트륨 등), 아스파라긴 (DL-아스파라긴 등) 등의 아미노산, 뉴클레오티드 등의 미량 영양소, 항생 물질 등의 선발 약제를 첨가할 수도 있다. 또한 균의 발육을 돕고, 다우노루비신 유도체의 생산을 촉진하도록 하는 유기물 및 무기물을 적당히 첨가할 수 있다.
배지의 pH는, 예를 들면 pH 5.5 ~ pH 8 정도이다. 배양법으로는, 호기적(好氣的) 조건에서의 고체 배양법, 진동(振とう) 배양법, 통기(通氣) 교반 배양법 또는 심부(深部) 호기 배양법으로 할 수 있지만, 특히 심부 호기 배양법이 가장 적합하다. 배양에 적당한 온도는 15 ℃ ~ 40 ℃이지만, 많은 경우 25 ℃ ~ 35 ℃ 부근에서 생육한다. 다우노루비신 유도체의 생산은, 배지 및 배양 조건, 또는 사용한 숙주에 따라 다르지만, 어느 배양법에서도 보통 2 일 ~ 10 일에서 그 축적이 최고에 달한다. 배양 중의 다우노루비신 유도체의 양이 최대가 되었을 때 배양을 중지하고 배양물에서 목적 물질을 단리(單離), 정제한다.
본 발명의 형질 전환체를 배양하여 얻은 배양물에서 다우노루비신 유도체를 채취하기 위해서는, 그 성상(性狀)을 이용한 일반적인 분리 수단, 예를 들면 용제 추출법, 이온 교환 수지법, 흡착 또는 분배 컬럼 크로마토 그래피법, 겔 여과법, 투석법, 침전법, 결정화법 등을 단독으로 또는 적당히 조합하여 추출 정제할 수 있다. 다우노루비신 유도체를 더욱 정제하려면, 실리카겔, 알루미나 등의 흡착제, 세파덱스 LH-20 (파루마시아(ファルマシア)사 제품) 또는 토요펄(トヨパ-ル) HW-40 (도소(東ソ-)사 제품) 등을 이용하는 크로마토 그래피를 수행하면 좋다.
이하에 본 발명의 실시예를 보여 주지만, 이것은 단순한 일예이며 본 발명을 한정하는 것이 아니며, 여기에 예시한 많은 변법(變法) 혹은 수식 수단 모두를 포괄하는 것이다.
실시예 1
클로로 레모 마이신 생산균 (Amycolatopsis orientalis)의 케토리덕타아제 유전자(evaE)로의 변이의 도입
ermE*프로모터를 포함하는 플라스미드 pIJ4070 [비부 (Bibb, MJ) 등의 「진 (Gene)」(영국), 1985년, 제 38권, p215-226 (비특허 문헌 7)]을 EcoRI과 BamHI에서 이중 소화(消化)하고, 전기 영동으로 분획 후, ermE*프로모터를 포함하는 약 0.3kbp의 EcoRI-BamHI 단편을 겔(ゲル)로부터 추출했다. 이 DNA 단편을 플라스미드 pSET152의 EcoRI과 BamHI 부위에 삽입해서 플라스미드 pSET152-E*를 얻었다.
클로로 레모 마이신 생산균 (Amycolatopsis orientalis)의 케토리덕타아제 유전자(evaE)에 있어서는, 서열 번호 2로 표시되는 염기 서열로 이루어진 BamHI-XbaI 단편(斷片)을 전체 합성하고, 플라스미드 pSET152-E*의 BamHI과 XbaI 부위에 삽입하여 플라스미드 pEVA-E를 얻었다. 이 플라스미드 pEVA-E를 주형(鑄型)으로 하고 GeneMorph II Random Mutagenesis Kit (스토라타진(ストラタジ-ン) 사 제품)를 사용하여 첨부 매뉴얼에 따라, 프라이머 pSET153-R (5'-GCGGATAACAATTTCACA-3', 서열 번호 3)과 pSETermE-R (5'- GTGCGGGCCTCTTCGCTATT-3', 서열 번호 4)의 조합에 의해 랜덤 변이를 도입했다.
변이가 도입된 evaE 단편을 BamHI과 XbaI로 이중 소화하고, pSET152-E*의 BamHI과 XbaI 부위에 클로닝하여 게놈 DNA 라이브러리로 했다.
이 게놈 DNA 라이브러리를 가지고 유지하는 대장균 (Escherichia coli) ET12567/pUZ8002 주(株)를 클로람페니콜(クロラムフェニコ-ル), 카나마이신(カナマイシン) 및 아프라마이신(アプラマイシン)을 각각 25 μg/mL, 25 μg/mL 및 50 μg/mL의 농도로 포함하는 100 mL의 LB 액체 배지 [1 % 디프코박토 트립톤(ディフコバクトトリプトン), 0.5 % 디프코이이스트 엑기스트랙트(ディフコイ-ストエキストラクト), 0.5 % NaCl, 0.1 % 글루코스]에 식균(植菌)하고, 37℃에서 하룻밤 배양하여 전배양액(前培養液)을 조제했다. 전배양액을 최종 농도 1 %가 되도록 전배양(前培養)시와 동일한 액체 배지에 식균하고, 37℃에서 약 4 시간 배양 한 후, LB 액체 배지에서 2 회 세정하여, 최종적으로 10 mL의 LB 액체 배지에 현탁하여 대장균액으로 했다.
다우노루비신 생산균의 스트렙토 마이세스·케루레오루비다스 (Streptomyces coeruleorubidus)의 dnmV 유전자 파괴주(破壞株) (특허 문헌 2: 국제 공개 제 WO2009/035107 호 팜플렛)를 MS 한천 배지(2 % S 대두 분말, 2 % 만니톨(マンニト-ル), 2 % 한천)에 도포하고, 28℃에서 4 일 배양했다. 배양 후, 20 % 글리세린 용액 3mL에서 포자를 받아써서, 숙주의 포자액을 조제했다.
상술한 것처럼 해서 조제한 숙주의 포자액 500 μL와 대장균액 500 μL를 혼합하여 집균(集菌)한 후, 최종 농도 10 mmo1/L가 되도록 MgCl2를 첨가한 MS 한천 배지에 도포했다. 28℃, 20 시간 배양 후, 아프라마이신 1mg 및 나리지키신(ナリジキシン)산 1.5 mg을 포함하는 멸균수 1 mL를 중층(重層)하고, 다시 28 ℃, 5 일간 배양하여 아프라마이신 내성주(耐性株)를 얻었다.
이들 주(株)에 있어서, 에피다우노루비신의 생산성을 확인하기 위해, 8분 시험관에 조제한 액체 생산 배지 [고미 야마 (Komiyama, T.) 등의, 「더·저널·오브·안티 바이오틱스 (The Journal of Antibiotics) 」, (일본), 1977 년, 제 30 권, p.619-621 (비특허 문헌 8)] 10 mL에 식균하고, 28 ℃에서 2 일 배양 후, 배양액 1 mL를 250 mL용량(容) 삼각 플라스크에 조제한 동일 액체 생산 배지 20 mL에 식균하고, 32 ℃, 7 일간 진동(振とう) 배양했다. 균체 생산물을 추출하기 위해, 1 mL의 배양액, 1 mL의 메탄올, 70μL의 50 % H2SO4을 15 mL 용량의 원심관에 넣고, 1 시간 진동시킨 후 하룻밤 냉저장하고, 2000 ×g, 10 분간 원심하여 그의 상청을 HPLC 분석에 제공했다.
얻어진 생산성이 높은 클론주(クロ-ン株)로부터 MagExtractor 게놈 DNA 추출 장치 (토요(東洋) 방적 주식회사 제품)를 사용하여 프로토콜에 따라 게놈 DNA를 조제하고, 프라이머 pSET153-R (서열 번호 3)과 pSETermE-R (서열 번호 4 )의 조합으로, PrimeSTAR HS DNA Polymerase (다카라바이오(タカラバイオ) 주식회사 제품)을 사용하여 이하의 사이클 조건에서 실시했다 (98 ℃·10초간, 60 ℃·5 초간, 72 ℃ ·1 분 × 25 회). 그 결과, 약 1 kbp의 증폭 DNA 단편을 얻었다. 이 DNA 단편의 염기 서열을 분석한 결과, 높은 생산성을 보인 클론주에 각각 Q42L (42번째 글루타민이 류신으로 치환), K153T (153 번째 리신이 스레오닌(スレオニン)로 치환), C270R (270 번째 시스테인이 아르기닌으로 치환)의 아미노산 치환이 있는 것으로 밝혀졌다.
Figure 112012101669606-pct00004
실시예 2
플라스미드 pEVA-E로의 새츄레이션(Saturation) 변이 도입
실시예 1에서 만든 플라스미드 pEVA-E를 주형(鑄型)으로 하여, 이하의 프라이머 세트로 PrimeSTAR HS DNA 중합 효소(다카라바이오 주식회사 제품)를 사용하여 (98 ℃·10 초, 68 ℃·7 분) × 25 회의 사이클에 의한 PCR 반응을 수행했다. 프라이머 염기 서열의 대문자의 개소는, 새츄레이션 변이의 도입 부분을 보여준다.
[1] NAC-F
5’-gcggaacagatcctcaagNACgccacggcaaatggccag-3’（서열 번호 ５）
　　NAC-R
5’-ctggccatttgccgtggcGTNcttgaggatctgttccgc-3’（서열 번호 ６）
[2] NCC-F
5’-gcggaacagatcctcaagNCCgccacggcaaatggccag-3’（서열 번호 ７）
　　NCC-R
5’-ctggccatttgccgtggcGGNcttgaggatctgttccgc-3’（서열 번호 ８）
[3] NGC-F
5’-gcggaacagatcctcaagNGCgccacggcaaatggccag-3’（서열 번호 9）
　　NGC-R
5’-ctggccatttgccgtggcGCNcttgaggatctgttccgc-3’（서열 번호 10）
[4] NTC-F
5’-gcggaacagatcctcaagNTCgccacggcaaatggccag-3’（서열 번호 11）
　　NTC-R
5’-ctggccatttgccgtggcGANcttgaggatctgttccgc-3’（서열 번호 12）
[5] VAG-F
5’-gcggaacagatcctcaagVAGgccacggcaaatggccag-3’（서열 번호 13）
　　VAG-R
5’-ctggccatttgccgtggcCTBcttgaggatctgttccgc-3’（서열 번호 14）
[6] TGG-F
5’-gcggaacagatcctcaagTGGgccacggcaaatggccag-3’（서열 번호 15）
　　TGG-R
5’-ctggccatttgccgtggcCCActtgaggatctgttccgc-3’（서열 번호 16）
[7] ATG-F
5’-gcggaacagatcctcaagATGgccacggcaaatggccag-3’（서열 번호 17）
　　ATG-R
5’-ctggccatttgccgtggcCATcttgaggatctgttccgc-3’（서열 번호 18）
얻어진 PCR 산물에 DpnI 1μL (20 units 이하)를 첨가하여, 37 ℃, 1 시간 소화했다. 이후 DpnI 소화물 1μL를 이용해 Escherichia coli DH5α (다카라바이오 주식회사 제품)을 형질 전환하고, 아프라마이신 50 μg/mL 첨가 LB 한천 배지 플레이트에 도포하고, 37 ℃, 하룻밤 배양했다.
생육한 콜로니(コロニ-)를 LaTaq 중합 효소(다카라바이오 주식회사 제품)를 이용하여, 94 ℃·5 분, (94 ℃·30 초, 55 ℃·30 초, 72 ℃·1 분 30 초) × 25 회 사이클에 의한 콜로니 PCR 반응을 실시했다. PCR 반응산물을 고순도(ハイピュア-) PCR 제품 정화 키트(プロダクトピュリフィケ-ションキット) (호크(ハイピュア-)사 제품)를 사용하여 정제하고, 변이 위치를 확인했다. 153 번의 아미노산에 있어서, 모든 아미노산 치환에 대한 변이가 얻어지는 것을 확인한 후, 변이 유전자를 포함한 플라스미드를 QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN 사 제품)를 이용하여 제조하였다.
이들 플라스미드를 이용하여, 접합 전달로 실시예 1에 기재된 dnmV 파괴주에 도입하여, 얻어진 균주에 있어서 에피다우노루비신의 생산성을 확인한 바, 야성주(野性株)에 비해서 프롤린 이외의 아미노산 치환에 의해 생산성이 향상하는 것으로 확인됐다.
Figure 112012101669606-pct00005
실시예 3
K153T 및 Q149S 이중 변이체의 작성과 평가
실시예 1에서 단리(單離)한 가장 생산성이 높았던 K153T의 아미노산 치환을 가지는 클론주의 게놈 DNA에서 프라이머 pSET153-R (서열 번호 3)와 pSETermE-R (서열 번호 4)의 조합으로 PrimeSTAR HS DNA 중합 효소 (다카라바이오 주식회사 제품)를 사용하여 PCR 반응을 다음의 사이클 조건에서 실시했다 (98 ℃·10 초, 60 ℃·5 초, 72 ℃·1 분) × 25 회. 그 결과, 약 1 kbp의 증폭 단편을 얻었다. 증폭 된 단편을 BamHI과 XbaI로 이중 소화하고, 플라스미드 pSET152-E*의 BamHI과 XbaI 부위에 삽입하여 K153T의 아미노산 치환된 evaE을 포함하는 플라스미드 pEVA-E-1을 얻었다. 이 플라스미드 pEVA-E-1에서 프라이머 pSET153-R (서열 번호 3)와 Q149S-R (5'-TTCCGCTGTCAGCTTCTG-3', 서열 번호 19), Q149S-F (5'-TCGATCCTCAAGACGGCCACGGC-3', 서열 번호 20)와 pSETermE-R (서열 번호 4)의 조합으로, 각각 PrimeSTAR HS DNA 중합 효소(다카라바이오 주식회사 제품)를 사용하여 위에서 설명한 바와 같이 PCR 반응을 실시하여,이 PCR 반응 산물을 고순도 PCR 제품 정화 키트 (호크 사 제품)를 사용하여 정제하고, 2 종류의 DNA 용액을 얻었다. 이 2 종류의 DNA 용액을 T4 폴리 뉴클레오티드 키나제(ポリヌクレオチドキナ-ゼ) (일본 진(ジ-ン)사 제품)를 사용하여 인산화(リン酸化)한 후, 플라스미드 pSET152-E*의 BamHI과 XbaI 부위에 삽입하여 Q149S (149 번째 글루타민이 세린으로 치환)과 K153T의 아미노산 치환된 evaE을 포함한 플라스미드 pEVA-E-2를 얻었다.
이 플라스미드를 이용하여, 접합 전달로 실시예 1에 기재된 dnmV 파괴주에 도입하여, 얻어진 균주 evaE-2에 있어서 실시예 1과 마찬가지로 에피다우노루비신의 생산성을 확인한 바, 변이 도입 이전의 주(株)에 비해 생산성이 향상되는 주(株)임이 확인됐다.
Figure 112012101669606-pct00006
실시예 4
K153T 변이체 유전자에 대한 랜덤 변이 도입
실시예 3에 기재된 플라스미드 pEVA-E-1을 주형으로 하여 GeneMorph II Random Mutagenesis Kit (스토라타진(ストラタジ-ン)사 제품)를 사용하여 첨부 매뉴얼에 따라, 랜덤 변이를 도입했다.
변이가 도입된 evaE 단편을 BamHI과 XbaI로 이중 소화하고, pSET152-E*의 BamHI과 XbaI 부위에 클로닝하여 게놈 DNA 라이브러리로 했다.
이들 클로닝한 플라스미드를 이용하여, 접합 전달로 실시예 1에 기재된 dnmV 파괴주에 도입하고, 얻어진 균주에 있어서 실시예 1과 마찬가지로 에피다우노루비 신 생산성을 확인한 바, 생산성이 높은 클론주는 K153T에 부가하여 E306D (306 번째 글루타민산이 아스파라긴산으로 치환)의 아미노산 치환이 있고, 이 클론주를 evaE-3로 했다.
Figure 112012101669606-pct00007
실시예 5
evaE 삼중 변이체 (K153T, C270R, E306D) 및 사중 변이체 (Q42L, K153T, C270R, E306D)의 작성 및 평가
실시예 4에서 단리(單離)한 evaE-3의 게놈 DNA로부터 프라이머 pSET153-R (서열 번호 3)와 T808C-R (5'-GTTCCACACGGGTCACCTCG-3', 서열 번호 21), T808C-F (5'-CGAGGTGACCCGTGTGGAAC- 3', 서열 번호 22)과 pSETermE-R (서열 번호 4)의 조합으로 각각 PrimeSTAR HS DNA 중합 효소 (다카라바이오 주식회사 제품)를 사용하여 실시예 3과 같이 PCR 반응을 실시하고,이 PCR 반응 산물을 고순도 PCR 제품 정화 키트 (호크 사 제)를 사용하여 정제하여, 2 종류의 DNA 용액을 얻었다. 이 2 종류의 DNA 용액을 혼합한 것을 템플레트(テンプレ-ト)로 하여, 프라이머 pSET153-R (서열 번호 3)과 pSETermE-R (서열 번호 4)의 조합으로 PrimeSTAR HS DNA 중합 효소 (다카라바이오 주식회사 제품)을 사용하여 실시예 3과 같이 PCR 반응을 실시하여, 증폭된 단편을 BamHI과 XbaI로 이중 소화하고, 플라스미드 pSET152-E*의 BamHI과 XbaI 부위에 삽입하여 K153T와 C270R와 E306D의 아미노산 치환된 evaE를 포함하는 플라스미드 pEVA-E-4를 얻었다.
플라스미드 pEVA-E-4에서 프라이머 pSET153-R (서열 번호 3)과 A125T-R (5'-ACGGTCGTCTCGGCTAGGCCGGGCG-3', 서열 번호 23), A125T-F (5'-GCCCGCGCCCGGCCTAGCCGAGACG-3', 서열 번호 24)와 pSETermE-R (서열 번호 4)의 조합으로 각각 PrimeSTAR HS DNA 중합 효소(다카라바이오 주식회사 제품)를 사용하여 실시예 3과 같이 PCR 반응을 실시하여, 이 PCR 반응 산물을 고순도 PCR 제품 정화 키트 (호크 사 제품)를 사용하여 정제하여, 2 종류의 DNA 용액을 얻었다. 이 2 종류의 DNA 용액을 혼합한 것을 템플레트로 해서, 프라이머 pSET153-R (서열 번호 3)와 pSETermE-R (서열 번호 4)의 조합으로 PrimeSTAR HS DNA 중합 효소 (다카라바이오 주식회사 제품)를 사용하여 실시예 3과 같이 PCR 반응을 실시하여, 증폭된 단편을 BamHI과 XbaI로 이중 소화하고, 플라스미드 pSET152-E*의 BamHI과 XbaI 부위에 삽입하여 Q42L과 K153T와 C270R과 E306D의 아미노산 치환된 evaE을 포함하는 플라스미드 pEVA-E-5를 얻었다.
이 플라스미드 pEVA-E-5를 이용하여, 접합 전달로 실시예 1에 기재된 dnmV 파괴주에 도입하여, 얻어진 균주 evaE-5에 있어서 실시예 1과 마찬가지로 에피다우노루비신 생산성을 확인한 바, 변이 도입 이전의 주(株)에 비해 생산성이 향상되는 주(株) 임을 확인했다.
Figure 112012101669606-pct00008
이상, 본 발명을 특정 측면에 따라 설명했지만, 당업자에게 자명의 변형이나 개량은 본 발명의 범위에 포함된다.
산업상 이용 가능성
본 발명의 케토리덕타아제 변이체는, 다우노루비신 유도체의 생산에 이용할 수 있다.
이상, 본 발명을 특정 측면에 따라 설명했지만, 당업자에게 자명의 변형이나 개량은 본 발명의 범위에 포함된다.
[서열표 프리테스트]
서열표의 숫자 제목 <223>에는 「Artificial Sequence」의 설명을 기재한다.
서열 번호 2 ~ 24의 각 서열로 표시된 염기 서열은 합성 DNA이다. 서열 번호 5 ~ 12의 기호 「n」은, 각각 임의의 염기를 나타낸다.
<110> Meiji Seika Pharma Co., Ltd. <120> Ketoreductase mutants <130> PI10397 <160> 24 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 325 <212> PRT <213> Amycolatopsis orientalis <400> 1 Met Lys Leu Ile Thr Val Leu Gly Ala Ser Gly Phe Ile Gly Ser Ala 1 5 10 15 Val Thr Arg Ala Leu Ala Gln Gln Pro Ile Arg Leu Arg Ala Val Ala 20 25 30 Arg Arg Gln Phe Thr Pro Ala Pro Gly Gln Ala Glu Thr Thr Val Val 35 40 45 Ala Ala Asp Leu Thr Asp Arg Val Ala Leu Ala Asp Ala Val Ala Gly 50 55 60 Ser Asp Ala Val Val Tyr Leu Leu Leu Ser Asp Gly Gly Trp Arg Ala 65 70 75 80 Val Glu Thr Glu Asp Ala Glu Arg Val Asn Val Gly Val Met Arg Asp 85 90 95 Leu Ile Asp Val Thr Gly Ser Asp Asn Gly Thr Pro Pro Val Val Val 100 105 110 Phe Gly Gly Thr Val Ser Gln Val Gly Val Pro Pro Arg Glu Pro Leu 115 120 125 Asp Gly Ser Glu Pro Asp Asn Pro Ala Thr Pro Tyr Asp Ile Gln Lys 130 135 140 Leu Thr Ala Glu Gln Ile Leu Lys Lys Ala Thr Ala Asn Gly Gln Val 145 150 155 160 Arg Gly Ile Ser Leu Arg Leu Pro Thr Ile Phe Gly Glu Thr Thr Ala 165 170 175 Gln Gly Ala Asn His Asp Arg Gly Val Val Ser Ser Met Ala Arg Arg 180 185 190 Ala Leu Asp Gly Gln Ala Leu Thr Ile Trp Gly Asp Gly Ser Val Arg 195 200 205 Arg Asp Val Val His Val Glu Asp Val Ala Ala Ala Phe Thr Ala Ala 210 215 220 Leu Ala Asn Pro Asp Ser Leu Val Gly Gly His Trp Leu Ile Gly Ala 225 230 235 240 Gly Arg Gly Asp Gln Leu Gly Glu Ile Phe Arg Leu Val Ala Arg Glu 245 250 255 Val Ala Glu Gln Thr Gly Gln Arg Pro Val Glu Val Thr Cys Val Glu 260 265 270 Pro Pro Ser His Ala Pro Glu Met Asp Phe Arg Ser Val Thr Ile Asp 275 280 285 Ser Ser Pro Phe Arg Ala Val Thr Gly Trp Arg Pro Glu Ile Ser Leu 290 295 300 Ser Glu Gly Val Arg Arg Thr Val Ala Ala Leu Thr Thr Ser Val His 305 310 315 320 Gly Lys Ala Arg Ala 325 <210> 2 <211> 1008 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA <400> 2 ggatccagcg aaggaggtgc tgagatgaag ctgatcaccg tgctcggtgc gtcgggcttc 60 atcggctcgg ctgtcacgcg tgcactggcg cagcagccaa tccggctgcg agcggtggcg 120 cgcaggcagt tcacgcccgc gcccggccaa gccgagacga ccgtcgtcgc cgctgatctc 180 accgaccgtg tcgcgctcgc cgacgcggtc gcgggatcgg acgcggtcgt gtacctgctt 240 ctgtcagacg gcggatggcg cgcggtcgag accgaggacg ccgaacgcgt gaacgtgggc 300 gtcatgcggg acctcatcga cgtcaccggc agcgacaacg ggacgccccc ggtggtggtg 360 ttcggcggta ccgtctcgca ggtcggtgtg ccacctcggg agccgctcga cggcagcgag 420 cccgacaacc cggcgactcc ctacgacata cagaagctga cagcggaaca gatcctcaag 480 aaggccacgg caaatggcca ggtgcgcggc atcagcctgc gtctgccgac gatattcggt 540 gaaaccacgg cacaaggcgc gaaccacgac cgcggtgtcg tgtcgtccat ggcgcggcga 600 gcgctcgacg gccaggcact caccatctgg ggcgacggca gcgtgcgacg cgacgtcgtc 660 catgtcgagg acgtcgcggc ggcgttcacc gcggcactgg ccaacccgga ttcccttgtc 720 ggcggccact ggctgatcgg cgcgggccga ggcgatcagc ttggggagat tttccgcctc 780 gtggcacggg aagtggccga gcagaccggg cagcgcccgg tcgaggtgac ctgtgtggaa 840 ccaccgtcgc acgcacctga gatggatttc cgcagcgtca ccatcgattc ctcgccgttc 900 cgggcggtca ccggctggcg cccagagatt tcgctgtccg aaggagtgcg tcgcactgtc 960 gccgcattga cgacatcagt tcatggaaag gctcgcgcat gatctaga 1008 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA <400> 3 gcggataaca atttcaca 18 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA <400> 4 gtgcgggcct cttcgctatt 20 <210> 5 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (19) <223> n stands for any base <400> 5 gcggaacaga tcctcaagna cgccacggca aatggccag 39 <210> 6 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (21) <223> n stands for any base <400> 6 ctggccattt gccgtggcgt ncttgaggat ctgttccgc 39 <210> 7 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA <220> <221> misc_feature <222> (19) <223> n stands for any base <400> 7 gcggaacaga 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synthetic DNA <400> 17 gcggaacaga tcctcaagat ggccacggca aatggccag 39 <210> 18 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA <400> 18 ctggccattt gccgtggcca tcttgaggat ctgttccgc 39 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA <400> 19 ttccgctgtc agcttctg 18 <210> 20 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA <400> 20 tcgatcctca agacggccac ggc 23 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA <400> 21 gttccacacg ggtcacctcg 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA <400> 22 cgaggtgacc cgtgtggaac 20 <210> 23 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA <400> 23 acggtcgtct cggctaggcc gggcg 25 <210> 24 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic DNA <400> 24 gcccgcgccc ggcctagccg agacg 25

Claims (14)

  1. 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열 중의 42, 149, 153, 270 및 306 번째 아미노산으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 잔기가, 다른 아미노산 잔기에 의해 치환되고,
    서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열 중의 42 번째 아미노산이 류신으로 치환되거나,
    서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열 중의 149 번째 아미노산이 세린으로 치환되거나,
    서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열 중의 153 번째 아미노산이 프롤린 이외의 아미노산 잔기로 치환되거나,
    서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열 중의 270 번째 아미노산이 아르기닌으로 치환되거나, 또는
    서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열 중의 306 번째 아미노산이 아스파라긴산으로 치환되어 있는 케토리덕타아제 변이체.
  2. 삭제
  3. 삭제
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  10. 청구항 1에 기재된 케토리덕타아제 변이체를 코드하는 폴리 뉴클레오티드.
  11. 청구항 10에 기재된 폴리 뉴클레오티드가 본래 다우노마이신을 생산하는 능력을 가지는 방선균 숙주에 도입되어, 에피다우노마이신 생산 능력이 부여된 형질 전환체.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 방선균 숙주가 Streptomyces coeruleorubidus인 형질 전환체.
  13. 청구항 12에 기재된 형질 전환체를 배양하고, 배양액에서 에피다우노마이신을 채취하는 공정을 포함하는 에피다우노마이신의 제조 방법.
  14. 삭제
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