CN102906258B - 酮还原酶突变体 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了可用于柔红霉素(Daunorubicin)衍生物的有效生产的酮还原酶(Ketoreductase)突变体、编码该突变体的DNA、导入了该DNA的生产柔红霉素衍生物的转化体、以及使用该转化体的柔红霉素衍生物制造方法。所述酮还原酶突变体中,氯伊瑞霉素生产菌(Amycolatopsis orientalis)的酮还原酶(EvaE)的氨基酸序列中的选自42、149、153、270和306位的氨基酸相当的位置的氨基酸中的1个或2个以上的氨基酸残基被其他氨基酸残基取代。
Description
技术领域
本发明涉及酮还原酶突变体,该酮还原酶突变体可用于利用微生物对半合成生产的柔红霉素衍生物进行发酵生产的方法。
背景技术
蒽环类抗生素是芳香族聚酮的一群化合物,是由以7,8,9,10-四氢-5,12-四并苯醌(下图)作为基本骨架的糖苷配基部分与以氨基糖为主体的糖类构成的色素糖苷(glycoside)。
[化学式1]
蒽环类抗生素与DNA结合,产生自由基,切断DNA链,或者抑制拓扑异构酶II。拓扑异构酶具有DNA酶(DNase)和连接酶(ligase)活性,催化DNA链的暂时切断与再结合,蒽环抗生物质通过抑制拓扑异构酶II,阻碍DNA复制,发挥抗肿瘤活性。蒽环类抗生素虽确认具有蓄积性心毒作用,但因其对广范围的癌细胞显示出抗肿瘤活性,所以仍被认为是有用的抗癌剂。
现在使用的主要蒽环系抗癌剂包括:发酵产物来源的,例如柔红霉素;以柔红霉素作为原料的半合成品,例如多柔比星、表柔比星。
[化学式2]
[表1]
R1 | R2 | R3 | |
柔红霉素 | CH3 | H | OH |
多柔比星 | CH2OH | H | OH |
表柔红霉素 | CH3 | OH | H |
表柔比星 | CH2OH | OH | H |
从抗肿瘤活性与毒性层面来看,表柔比星优于柔红霉素、多柔比星,但是,用于将氨基糖部分的4位羟基反转的化学合成步骤的收率低,现状是虽然可以以柔红霉素作为初始原料来生产表柔比星,但制造成本方面存在许多问题。另一方面,有报告称进行了下述研究:通过将编码与柔红霉素生物合成相关的酮还原酶产物立体特异性不同的酮还原酶(表位型酮还原酶(epitypeketoreductase))的基因导入柔红霉素生产菌,对柔红霉素的生物合成途径进行修饰,来直接发酵生产表柔红霉素(非专利文献1)。表柔红霉素的氨基糖部分的羟基的立体构象与表柔比星相同,因而,在表柔比星的生产方面,表柔红霉素是极有用的初始原料。有报告称,在导入了除虫菌素生物合成相关的表位型酮还原酶基因(avrE)时,表柔红霉素的生产量是最高的,但其生产量也仅仅不过是约54μg/mL,尚未达到可实用化的水平。此外,有专利申请称,对该研究中所得的表柔红霉素生产菌进行突变原处理,将表柔红霉素的生产性提高到100μg/mL以上(专利文献1),但实施例中并未记载所取得的突变株的具体情况。另一方面,本发明人发现在导入了氯伊瑞霉素(chloroeremomycin)中所含的氨基糖——表万古胺的生物合成相关的酮还原酶基因(evaE)时,与导入了avrE基因的情况相比,表柔红霉素的生产量提高至2.7倍,并进行了专利申请(专利文献2)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:国际公开第W02006/111561号小册子
专利文献2:国际公开第WO2009/035107号小册子
非专利文献
非专利文献1:Madduri,K.等著,Nature Biotechnology,(美国),1998年,第16卷,p.69-74
非专利文献2:Lipman DJ and Pearson WR著.Science,(美国),1985年,第227卷,p.1435-1441
非专利文献3:Lipman DJ and Pearson WR著.Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America,(美国),1988年,第85卷,p.2444-2448
非专利文献4:Schmitt-John,T.and Engels,J.W.著,AppliedMicrobiology and Biotechnology,(独国),1992年,第36卷,p.493-498
非专利文献5:Bibb,M.J.等著,Molecular Microbiology,(英国),1994年,第14卷,p.533-545
非专利文献6:Practical Streptomyces Genetics,The John InnesFoundation,(英国),Norwick,2000年,p.311-338
非专利文献7:Bibb,M.J.等著,Gene,(英国),1985年,第38卷,p215-226
非专利文献8:Komiyama,T.等著,The Journal of Antibiotics,(日本),1977年,第30卷,p.619-621
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的课题是提供:对于利用微生物进行的表柔红霉素等柔红霉素衍生物的直接发酵生产方法中使用的酮还原酶,进行修饰使得柔红霉素衍生物的生产性提高而得到的酮还原酶突变体。
解决问题的方法
本发明人等作为利用微生物进行的柔红霉素衍生物的直接发酵生产方法中使用的酮还原酶,对由SEQ ID NO:1所述的氨基酸序列组成的酮还原酶(EvaE)的修饰进行了深入研究发现:通过使用将选自42位、149位、153位、270位、以及306位的氨基酸中的至少1个位置的氨基酸取代成其他氨基酸而得到的酮还原酶突变体,能够提高柔红霉素衍生物的生产性,从而完成了本发明。
即,本发明提供能够在利用微生物进行的效率好的柔红霉素衍生物的直接发酵生产中使用的酮还原酶突变体以及编码该突变体的多核苷酸(特别是DNA)。此外,本发明在提供基于编码本发明的酮还原酶突变体的DNA的转化体的同时,还提供包括该培养转化体、并从所得培养液收集柔红霉素衍生物的步骤的柔红霉素衍生物的制造方法。进一步,本发明提供利用本发明的转化体生产的柔红霉素衍生物。
因此,本发明提供以下方面:
(1)一种酮还原酶突变体,其是可用于柔红霉素衍生物的发酵生产的酮还原酶的突变体,其中,突变是在亲本酮还原酶的氨基酸序列中插入、取代、或缺失或者在其一个或两个末端添加1个或多个氨基酸,且与使用亲本酮还原酶的情况相比,柔红霉素衍生物的生产性提高。
(2)(1)所述的酮还原酶突变体,其中,亲本酮还原酶包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有90%以上的同一性的氨基酸序列。
(3)(2)所述的酮还原酶突变体,其中,选自与SEQ ID NO:1所述的氨基酸序列中的42、149、153、270和306位的氨基酸相当的位置的氨基酸中的1个或2个以上的氨基酸残基被其他氨基酸残基取代。
(4)(3)所述的酮还原酶突变体,其中,与SEQ ID NO:1所述的氨基酸序列中的42位的氨基酸相当的位置的氨基酸被亮氨酸取代。
(5)(3)所述的酮还原酶突变体,其中,与SEQ ID NO:1所述的氨基酸序列中的149位的氨基酸相当的位置的氨基酸被丝氨酸取代。
(6)(3)所述的酮还原酶突变体,其中,与SEQ ID NO:1所述的氨基酸序列中的153位的氨基酸相当的位置的氨基酸被脯氨酸以外的氨基酸残基取代。
(7)(3)所述的酮还原酶突变体,其中,与SEQ ID NO:1所述的氨基酸序列中的270位的氨基酸相当的位置的氨基酸被精氨酸取代。
(8)(3)所述的酮还原酶突变体,其中,与SEQ ID NO:1所述的氨基酸序列中的306位的氨基酸相当的位置的氨基酸被天冬氨酸取代。
(9)(1)~(8)中任一项所述的酮还原酶突变体,其中,柔红霉素衍生物是表柔红霉素。
(10)编码(1)~(9)中任一项所述的酮还原酶突变体的多核苷酸。
(11)将(10)所述的DNA导入本来具有生产柔红霉素的能力的放线菌宿主而得到的、赋予了柔红霉素衍生物生产能力的转化体。
(12)(11)所述的转化体,其中,宿主放线菌是天蓝淡红链霉菌(Streptomyces coeruleorubidus)。
(13)一种柔红霉素衍生物的制造方法,其包括培养(12)所述的转化体、并从培养液收集柔红霉素衍生物的步骤。
(14)通过(13)所述的制造方法得到的柔红霉素衍生物。
发明的效果
根据本发明的酮还原酶突变体,能够提高柔红霉素衍生物的生产性。
发明的具体实施方式
本发明的酮还原酶突变体可以作为对亲本酮还原酶进行突变的结果而得到。而且,在本发明中,该突变是指:在酮还原酶的氨基酸序列中插入、取代、或缺失或者其一个或两个末端添加1个或多个氨基酸,且将酮还原酶突变体使用于柔红霉素衍生物的发酵生产方法的情况与使用亲本酮还原酶的情况相比,柔红霉素衍生物的生产性提高。
在本发明中,对亲本酮还原酶没有限制,可用于柔红霉素衍生物的发酵生产方法即可,优选由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列构成的酮还原酶或其同源体。这里,“其同源体”是指:在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中插入、取代或缺失、或其在其一个或两个末端添加数个氨基酸而得到,且与SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列具有90%以上的同一性,且保持其酮还原酶活性。这里所称的“同一性”是指:在本领域技术人员公知的同源性检索程序[FASTA3;http://fasta.ddbj.nig.ac.jp/top-j.html](Science,227,1435-1441(1985);Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85,2444-2448(1988)(非专利文献2,3))中,采用默认(初始设定)参数计算出的数值。此外,酮还原酶活性的有无可以通过在后述的适当宿主中导入编码同源体的基因,使之表达,并考察有无柔红霉素衍生物生成,来进行判定。应该清楚的是,对于这样的“同源体”,本领域技术人员能够参照SEQ ID NO:1所示序列毫无困难地选择来进行制造。
根据本发明的优选方面,在亲本酮还原酶由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列构成的情况下,作为具体例子,可以列举出选自该序列中的42、149、153、270、和306位的氨基酸中的1个或2个以上的氨基酸残基被其他氨基酸残基取代而得到的突变体。
根据本发明的优选方面,优选可以列举出将42位的氨基酸取代成亮氨酸而得到的、将149位的氨基酸取代成丝氨酸而得到的,将153位的氨基酸取代成脯氨酸以外的氨基酸而得到的,将270位的氨基酸取代成精氨酸而得到的,将306位的氨基酸取代成天冬氨酸而得到的。这些突变体具有用于柔红霉素衍生物的发酵生产方法中的情况下,柔红霉素衍生物的生产性提高这样的有利性质。
此外,在亲本酮还原酶是SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的同源体的情况下,作为具体例子可以列举出选自与所述的42、149、153、270、和306位的氨基酸相当的位置的氨基酸中的1个或2个以上的氨基酸残基被其他氨基酸残基取代而得到的。这里,在由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列构成的亲本酮还原酶的同源体中应取代的氨基酸残基的位置可以通过基于公知算法的氨基酸序列比较容易地选择。另一方面,在基于公知算法的氨基酸序列比较有困难的情况下,可以通过比较酶的立体结构来确定应取代的氨基酸残基的位置。
通过将本编码发明的酮还原酶突变体的DNA导入本来具有生产柔红霉素的能力的适当宿主,能够得到生产柔红霉素衍生物的转化体。优选的宿主是放线菌,作为生产柔红霉素的放线菌,已知有Streptomyces peuceticus、天蓝淡红链霉菌(Streptomyces coeruleorubidus),它们可以用作用于导入编码本发明的酮还原酶突变体的DNA的宿主。此外,巴龙霉素(baumycin)是用柔红霉素的氨基糖(L-柔红糖胺(L-daunosamine))部分被修饰而得到的物质生物合成柔红霉素的中间体,因而生产巴龙霉素的放线菌也可以作为宿主加以利用。此外,优选使用在上述的柔红霉素或巴龙霉素生产菌中,通过缺损与柔红霉素的L-柔红糖胺部分的4位羟基生物合成相关的酮还原酶基因,从而丧失了柔红霉素生产能力的菌株作为宿主。
将基因导入宿主可以利用混合原生质体和目的DNA的方法、利用噬菌体的方法、利用接合转移的方法等常规方法,可以在考虑宿主性质的基础上选择适当的方法来实施。为了挑选导入了基因的菌株,希望将作为目标的表位型酮还原酶基因与包含选择标记基因的载体一起导入。对于选择标记基因没有限定,只要能够挑选出导入了表位型酮还原酶基因的菌株,优选卡那霉素抗性基因、链霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、紫霉素抗性基因或者安普霉素(apramycin)抗性基因等。优选在导入的表位型酮还原酶基因中添加能够在宿主中发挥功能的启动子序列,红霉素抗性基因来源的ermE*启动子[Schmitt-John,T.and Engels,J.W.著,“Applied Microbiology andBiotechnology”,(德国),1992年,第36卷,p.493-498(非专利文献3)]、[Bibb,M.J.等著,“Molecular Microbiology”,(英国),1994年,第14卷,p.533-545(非专利文献4)]等是优选的例子。作为表位型酮还原酶基因在宿主内的存在状态,可以将其导入可在染色体外自主复制的质粒,或者将其导入染色体中。此外,还可以采用以表位型酮还原酶基因取代宿主的与柔红霉素的L-柔红糖胺部分的4位羟基生物合成相关的酮还原酶基因的方法来进行导入。作为取代基因的方法,可以利用在放线菌中通常使用的方法[Practical StreptomycesGenetics,“The John Innes Foundation”,(英国),Norwick,2000年,p.311-338(非专利文献5)]。
本发明的转化体所生产的柔红霉素衍生物是将柔红霉素的L-柔红糖胺部分的4位羟基反转而得到的柔红霉素衍生物。优选为表柔红霉素以及表柔比星,更优选为表柔红霉素。
采用常规方法培养本发明的转化体,可以生产柔红霉素衍生物。在培养基方面,作为常规成分例如碳源,可以使用葡萄糖、蔗糖、水饴(水飴)、糊精、淀粉、甘油、糖蜜、动植物油等。此外,作为氮源,大豆粉、小麦胚芽、玉米浸出液、棉子粕、肉提取物、多蛋白胨、麦芽提取物、酵母提取物、硫酸铵、硝酸钠、尿素等。此外,视需要添加能够产生钠、钾、钙、镁、钴、氯、磷酸(磷酸氢二钾等)、硫酸(硫酸镁等)以及其它离子的无机盐类也是有效的。此外,视需要还可以添加硫胺(硫胺盐酸盐等)等各种维生素,谷氨酸(谷氨酸钠等)、天冬酰胺(DL-天冬酰胺等)等氨基酸,核苷酸等微量营养素,抗生素等选择药物。而且,可以适当添加能够帮助菌体发育、促进柔红霉素衍生物生产的有机物和无机物。
培养基的pH为例如pH5.5~pH8左右。作为培养方法,可以采用需氧条件下的固体培养法、振荡培养法、通气搅拌培养法或深层需氧培养法来进行,特别是,深层需氧培养法是最为合适的。培养中的适当温度是15℃~40℃,多数情况下在25℃~35℃左右进行生长。柔红霉素衍生物的生产因培养基和培养条件、或所使用的宿主而异,在任何培养法中,蓄积通常均是在2天~10天达到最高。当培养中的柔红霉素衍生物的量达到最高时停止培养,然后从培养物分离、纯化目的物质。
为了从培养本发明的转化体所得的培养物收集柔红霉素衍生物,可以单独或适当组合使用利用了其性状的常规分离手段、例如溶剂抽提法、离子交换树脂法、吸附或分配柱层析法、凝胶过滤法、透析法、沉淀法、结晶化法等来进行抽提纯化。为了进一步纯化柔红霉素衍生物,可以使用硅胶、氧化铝等吸附剂、Sephadex LH-20(Pharmacia公司制造)或TOYOPEARLHW-40(东曹公司制造)等来进行层析。
以下示出本发明的实施例,但这仅仅是一些例子,而非对本发明的限定,本发明还包括未在这里示例的全部的许多改变或修饰。
实施例1
对氯伊瑞霉素生产菌(Amycolatopsis orientalis,东方拟无枝酸菌)的酮还原酶基因(evaE)的导入突变
将含ermE*启动子的质粒pIJ4070[Bibb,M.J.等著,Gene,(英国),1985年,第38卷,p215-226(非专利文献7)]用EcoRI以及BamHI双重消化,电泳分级后,用凝胶抽提含ermE*启动子的约0.3kbp的EcoRI-BamHI片段。将该DNA片段插入质粒pSET152的EcoRI以及BamHI部位,得到了质粒pSET152-E*。
对于氯伊瑞霉素生产菌(东方拟无枝酸菌)的酮还原酶基因(evaE),全合成了由SEQ ID NO:2所示的碱基序列构成的BamHI-XbaI片段,将其插入质粒pSET152-E*的BamHI以及XbaI部位,得到了质粒pEVA-E。以该质粒pEVA-E作为模板,使用GeneMorph II Random Mutagenesis Kit(Stratagene公司制造)按照附带的说明书通过引物pSET153-R(5’-GCGGATAACAATTTCACA-3’、SEQ ID NO:3)和pSETermE-R(5’-GTGCGGGCCTCTTCGCTATT-3'、SEQ ID NO:4)的组合导入了随机突变。
将导入了突变的evaE片段用BamHI以及XbaI双重消化,克隆至pSET152-E*的BamHI以及XbaI部位,以此作为基因组DNA文库。
将保持该基因组DNA文库的大肠杆菌(Escherichia coli)ET12567/pUZ8002株接种于按氯霉素、卡那霉素以及安普霉素分别为25μg/mL、25μg/mL以及50μg/mL的浓度的100mL的LB液体培养基(1%DIFCO细菌用胰蛋白胨、0.5%DIFCO酵母提取物、0.5%NaCl、0.1%葡萄糖),37℃培养过夜,制备了前培养液。将前培养液接种于与前培养时相同的液体培养基中使得其终浓度为1%,37℃培养约4小时后,用LB液体培养基洗涤2次,最终将其悬浮于10mL的LB液体培养基中,作为大肠杆菌液。
将作为柔红霉素生产菌的天蓝淡红链霉菌(Streptomyces coeruleorubidus)的dnmV基因破坏株(专利文献2:国际公开第WO2009/035107号小册子)涂布于MS琼脂培养基(2%S大豆粉、2%甘露醇、2%琼脂),28℃培养4日。培养后,用20%甘油溶液3mL洗下孢子,制备了宿主的孢子液。
将如上述制备的宿主的孢子液500μL与大肠杆菌液500μL混合并收集菌体后,涂布于添加有终浓度10mmo1/L的MgCl2的MS琼脂培养基。28℃、培养20小时后,重层含安普霉素1mg以及萘啶酸1.5mg的灭菌水1mL,再于28℃培养5天,得到了安普霉素抗性株。
为了对这些株确认表柔红霉素的生产性,在8分试管中接种制备的液体生产培养基[Komiyama,T.等著,The Journal of Antibiotics,(日本),1977年,第30卷,p.619-621(非专利文献8)]10mL,28℃培养2日后,将培养液1mL接种于制备于250mL容量三角烧瓶的同液体生产培养基20mL中,32℃振荡培养7天。为了抽提菌体产物,将1mL的培养液、1mL的甲醇、70μL的50%H2SO4装入15mL容量的离心管,振荡1小时后,冷藏过夜,2000×g离心10分钟,将其上清供HPLC分析。
从所得生产性高的克隆株使用MagExtractor基因组DNA抽提机器(东洋纺绩株式会社制造)按规程制备基因组DNA,通过引物pSET153-R(SEQ IDNO:3)与pSETermE-R(SEQ ID NO:4)的组合,使用PrimeSTAR HS DNAPolymerase(TaKaRaBio株式会社制造)按以下的循环条件进行了PCR反应(98℃-10秒、60℃-5秒、72℃-1分×25次)。其结果,得到了约1kbp的扩增DNA片段。对本DNA片段的碱基序列进行了解析,结果可知:显示高生产性的克隆株中分别存在Q42L(42位的谷氨酰胺取代成亮氨酸)、K153T(153位的赖氨酸取代成苏氨酸)、C270R(270位的半胱氨酸取代成精氨酸)的氨基酸取代。
[表2]
菌株 | 表柔红霉素生产量(相对比%) |
evaE | 100 |
evaE/Q42L | 117 |
evaE/K153T | 154 |
evaE/C270R | 137 |
实施例2
对质粒pEVA-E导入饱和(Saturation)突变
以实施例1中制作的质粒pEVA-E作为模板,通过以下的引物组使用PrimeSTAR HS DNA聚合酶(TaKaRaBio株式会社制造),进行了(98℃-10秒、68℃-7分)×25次循环的PCR反应。引物碱基序列的大写文字的位置表示饱和突变的导入部分。
[1]NAC-F
5’-gcggaacagatcctcaagNACgccacggcaaatggccag-3’(SEQ ID NO:5)
NAC-R
5’-ctggccatttgccgtggcGTNcttgaggatctgttccgc-3’(SEQ ID NO:6)
[2]NCC-F
5’-gcggaacagatcctcaagNCCgccacggcaaatggccag-3’(SEQ ID NO:7)
NCC-R
5’-ctggccatttgccgtggcGGNcttgaggatctgttccgc-3’(SEQ ID NO:8)
[3]NGC-F
5’-gcggaacagatcctcaagNGCgccacggcaaatggccag-3’(SEQ ID NO:9)
NGC-R
5’-ctggccatttgccgtggcGCNcttgaggatctgttccgc-3’(SEQ ID NO:10)
[4]NTC-F
5’-gcggaacagatcctcaagNTCgccacggcaaatggccag-3’(SEQ ID NO:11)
NTC-R
5’-ctggccatttgccgtggcGANcttgaggatctgttccgc-3’(SEQ ID NO:12)
[5]VAG-F
5’-gcggaacagatcctcaagVAGgccacggcaaatggccag-3’(SEQ ID NO:13)
VAG-R
5’-ctggccatttgccgtggcCTBcttgaggatctgttccgc-3’(SEQ ID NO:14)
[6]TGG-F
5’-gcggaacagatcctcaagTGGgccacggcaaatggccag-3’(SEQ ID NO:15)
TGG-R
5’-ctggccatttgccgtggcCCActtgaggatctgttccgc-3’(SEQ ID NO:16)
[7]ATG-F
5’-gcggaacagatcctcaagATGgccacggcaaatggccag-3’(SEQ ID NO:17)
ATG-R
5’-ctggccatttgccgtggcCATcttgaggatctgttccgc-3’(SEQ ID NO:18)
在所得PCR产物中添加DpnI 1μL(20units以下),37℃消化1小时。然后,用DpnI消化物1μL转化大肠杆菌DH5α(TaKaRaBio株式会社制造),涂布于添加了安普霉素50μg/mL的LB琼脂培养基平板上,37℃培养过夜。
对于生长出的菌落,使用LaTaq聚合酶(TaKaRaBio株式会社制造)进行了94℃-5分、(94℃-30秒、55℃-30秒、72℃-1分30秒)25次循环的菌落PCR反应。将PCR反应产物用High Pure PCR Product Purification Kit(Roche公司制造)纯化,进行了突变位置的确认。在确认了对于153位的氨基酸得到了对应于所有氨基酸取代的突变后,用QIAprep Spin MiniprepKit(QIAGEN公司制造)制备了包含突变基因的质粒。
使用这些质粒,通过接合转移将其导入实施例1所述的dnmV破坏株,对于所得菌株确认了表柔红霉素的生产性,结果确认:与野生型株相比,通过脯氨酸以外的氨基酸取代,生产性有提高。
[表3]
氨基酸 | 表柔红霉素生产量(相对比%) |
异亮氨酸 | 175 |
缬氨酸 | 136 |
苯丙氨酸 | 124 |
亮氨酸 | 150 |
天冬酰胺 | 176 |
天冬氨酸 | 132 |
组氨酸 | 153 |
酪氨酸 | 107 |
苏氨酸 | 179 |
脯氨酸 | 12 |
丝氨酸 | 165 |
丙氨酸 | 152 |
半胱氨酸 | 153 |
精氨酸 | 172 |
甘氨酸 | 162 |
谷氨酸 | 164 |
谷氨酰胺 | 142 |
甲硫氨酸 | 154 |
色氨酸 | 129 |
赖氨酸(野生型) | 100 |
实施例3
K153T以及Q149S双重突变体的制作和评价
对于实施例1中分离的生产性最高的具有K153T的氨基酸取代的克隆株,从其基因组DNA通过引物pSET153-R(SEQ ID NO:3)与pSETermE-R(SEQ ID NO:4)的组合,使用PrimeSTAR HS DNA聚合酶(TaKaRaBio株式会社制造)按以下的循环条件进行了PCR反应(98℃-10秒、60℃-5秒、72℃-1分)×25次。其结果,得到了约1kbp的扩增片段。将扩增的片段用BamHI以及XbaI双重消化,插入质粒pSET152-E*的BamHI以及XbaI部位,得到了包含K153T的氨基酸取代的evaE的质粒pEVA-E-1。对于该质粒pEVA-E-1,通过引物pSET153-R(SEQ ID NO:3)与Q149S-R(5’-TTCCGCTGTCAGCTTCTG-3'、SEQ ID NO :19)、Q149S-F(5’-TCGATCCTCAAGACGGCCACGGC-3'、SEQ ID NO:20)与pSETermE-R(SEQ ID NO:4)的组合,分别使用PrimeSTAR HS DNA聚合酶(TaKaRaBio株式会社制造)如上述地进行PCR反应,将该PCR反应产物用High Pure PCR Product Purification Kit(Roche公司制造)纯化,得到了2种DNA溶液。将该2种DNA溶液用T4多核苷酸激酶(日本Gene公司制造)磷酸化后,插入质粒pSET152-E*的BamHI以及XbaI部位,得到了包含Q149S(149位的谷氨酰胺取代成丝氨酸)与K153T的氨基酸取代的evaE的质粒pEVA-E-2。
使用该质粒,通过接合转移将其导入实施例1所述的dnmV破坏株,对于所得菌株evaE-2,像实施例1那样确认了表柔红霉素的生产性,可以确认:该株的生产性比突变导入前的株有所提高。
[表4]
菌株 | 表柔红霉素生产量(相对比%) |
evaE/K153T | 100 |
evaE-2 | 110 |
实施例4
对K153T突变体基因导入随机突变
以实施例3记载的质粒pEVA-E-1作为模板,用GeneMorph II RandomMutagenesis Kit(Stratagene公司制造)按照附带的说明书,导入随机突变。
将导入了突变的evaE片段用BamHI以及XbaI双重消化,克隆至pSET152-E*的BamHI以及XbaI部位,作为基因组DNA文库。
使用这些克隆的质粒,通过接合转移将其导入实施例1所述的dnmV破坏株,对于所得菌株,像实施例1那样确认了表柔红霉素的生产性,生产性高的克隆株中除了存在K153T以外,还存在E306D(306位的谷氨酸取代成天冬氨酸)的氨基酸取代,以该克隆株为evaE-3。
[表5]
菌株 | 表柔红霉素生产量(相对比%) |
evaE/K153T | 100 |
evaE-3 | 110 |
实施例5
evaE三重突变体(K153T,C270R,E306D)和四重突变体(Q42L,K153T,C270R,E306D)的制作与评价
对于实施例4中分离的evaE-3的基因组DNA,通过引物pSET153-R(SEQID NO:3)与T808C-R(5’-GTTCCACACGGGTCACCTCG-3'、SEQ ID NO:21)、T808C-F(5’-CGAGGTGACCCGTGTGGAAC-3'、SEQ ID NO:22)与pSETermE-R(SEQ ID NO:4)的组合,分别使用PrimeSTAR HS DNA聚合酶(TaKaRaBio株式会社制造)像实施例3那样进行PCR反应,将该PCR反应产物用High Pure PCR Product Purification Kit(Roche公司制造)纯化,得到了2种DNA溶液。将该2种DNA溶液混合作为模板,通过引物pSET153-R(SEQID NO:3)与pSETermE-R(SEQ ID NO:4)的组合,使用PrimeSTAR HS DNA聚合酶(TaKaRaBio株式会社制造),像实施例3那样进行PCR反应,将扩增得到的片段用BamHI以及XbaI双重消化,插入质粒pSET152-E*的BamHI以及XbaI部位,得到了包含K153T、C270R与E306D的氨基酸取代的evaE的质粒pEVA-E-4。
对于质粒pEVA-E-4,通过引物pSET153-R(SEQ ID NO:3)与A125T-R(5’-ACGGTCGTCTCGGCTAGGCCGGGCG-3'、SEQ ID NO:23)、A125T-F(5’-GCCCGCGCCCGGCCTAGCCGAGACG-3'、SEQ ID NO:24)与pSETermE-R(SEQ ID NO:4)的组合,分别使用PrimeSTAR HS DNA聚合酶(TaKaRaBio株式会社制造),像实施例3那样进行PCR反应,将该PCR反应产物用High Pure PCR Product Purification Kit(Roche公司制造)纯化,得到了2种DNA溶液。将该2种DNA溶液混合作为模板,通过引物pSET153-R(SEQ ID NO:3)与pSETermE-R(SEQ ID NO:4)的组合,使用PrimeSTAR HS DNA聚合酶(TaKaRaBio株式会社制造)像实施例3那样进行PCR反应,将扩增得到的片段用BamHI以及XbaI双重消化,插入质粒pSET152-E*的BamHI以及XbaI部位,得到了包含Q42L、K153T、C270R和E306D的氨基酸取代的evaE的质粒pEVA-E-5。
使用该质粒pEVA-E-5,通过接合转移导入实施例1所述的dnmV破坏株,对于所得菌株evaE-5,像实施例1那样进行了表柔红霉素的生产性的确认,可以确认:与突变导入前的株相比,该株的生产性提高。
[表6]
菌株 | 表柔红霉素生产量(相对比%) |
evaE/K153T | 100 |
evaE-5 | 126 |
以上,通过特定方面对本发明进行了说明,本领域技术人员显而易见的变形、改良包含在本发明的范围中。
工业实用性
本发明的酮还原酶突变体可以用于柔红霉素衍生物的生产。
以上,通过特定方面对本发明进行了说明,本领域技术人员显而易见的变形、改良包含在本发明的范围中。
序列表的数字<223>项记载了“人工序列”的说明。
SEQ ID NO:2~24的各序列所示的碱基序列是合成DNA。SEQ ID NO:5~12的符号“n”分别表示任意的碱基。
Claims (6)
1.一种提高了柔红霉素衍生物生产性的酮还原酶突变体,其选自下述突变体(1)~(6)中的任意一种:
(1)在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中,42位的谷氨酰胺被取代为亮氨酸而成的突变体;
(2)在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中,270位的半胱氨酸被取代为精氨酸而成的突变体;
(3)在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中,153位的赖氨酸被取代为脯氨酸以外的氨基酸而成的突变体,所述脯氨酸以外的氨基酸选自异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、组氨酸、酪氨酸、苏氨酸、丝氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、精氨酸、甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸或色氨酸;
(4)在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中,149位的谷氨酰胺被取代为丝氨酸,且153位的赖氨酸被取代为苏氨酸而成的突变体;
(5)在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中,153位的赖氨酸被取代为苏氨酸,且306位的谷氨酸被取代为天冬氨酸而成的突变体;
(6)在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中,42位的谷氨酰胺被取代为亮氨酸、153位的赖氨酸被取代为苏氨酸、270位的半胱氨酸被取代为精氨酸、且306位的谷氨酸被取代为天冬氨酸而成的突变体。
2.权利要求1所述的酮还原酶突变体,其中,柔红霉素衍生物是表柔红霉素。
3.编码权利要求1或2所述的酮还原酶突变体的多核苷酸。
4.将权利要求3所述的多核苷酸导入本来具有生产柔红霉素的能力的放线菌宿主而得到的、赋予了柔红霉素衍生物生产能力的转化体。
5.权利要求4所述的转化体,其中,宿主放线菌是天蓝淡红链霉菌(Streptomyces coeruleorubidus)。
6.一种柔红霉素衍生物的制造方法,其包括培养权利要求5所述的转化体,并从培养液收集柔红霉素衍生物的步骤。
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