CN107541535B

CN107541535B - 发酵培养基及生产表阿霉素的方法

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Publication number: CN107541535B
Application number: CN201610469652.9A
Authority: CN
Inventors: 陈少欣; 王晓茹
Original assignee: Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry; China State Institute of Pharmaceutical Industry
Current assignee: Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry; China State Institute of Pharmaceutical Industry
Priority date: 2016-06-23
Filing date: 2016-06-23
Publication date: 2021-10-29
Anticipated expiration: 2036-06-23
Also published as: CN107541535A

Abstract

本发明公开了一种发酵培养基及生产表阿霉素的方法。该发酵培养基特别适用于特定的波塞链霉菌(Streptomyces peucetius)工程菌发酵生产表阿霉素，其中包括有机碳源、氮源、无机盐和水，按发酵培养基的总体积计，有机碳源含量为50‑250g/L；氮源含量为10‑100g/L；该波塞链霉菌工程菌通过将含有酮基还原酶基因的重组载体转化波塞链霉菌构建而成。本发明的发酵培养基成分简单，其大幅提高了表阿霉素的发酵单位，适用于表阿霉素的规模化生产。

Description

发酵培养基及生产表阿霉素的方法

技术领域

本发明属于工业微生物技术领域，特别涉及一种用于波塞链霉菌工程菌发酵生产表阿霉素的发酵培养基。

背景技术

表阿霉素是一种蒽环类抗生素，分子式为C₂₇H₂₉0₁₁N，是意大利学者Arcamnoe等于1975年通过半合成途径合成得到的，为细胞周期非特异性药，对S期作用最强，对M、G1和G2期也有作用，具有强烈的细胞毒性作用，为广谱抗肿瘤药。表阿霉素与阿霉素的区别只是在氨基糖部分4’位的羟基构型不同，这种立体结构的细微变化导致其心脏、骨髓毒性明显降低，在临床上主要用于多种癌症的治疗，对各种实体瘤，脑瘤，血管瘤等也有不同程度的缓解作用，成为目前临床应用最广泛的抗肿瘤药物之一。

目前在工业上表阿霉素仍采用化学半合成方法得到，以柔红霉素为原料合成表阿霉素大体上可通过两种合成路线：一种方法首先通过醇解将柔红霉素分解成蒽醌环和糖环两部分，分别对两部分进行修饰改造，糖环部分通过胺基保护、羟基氧化、选择性还原以及C4羟基对映异构体的分离等步骤，得到合成表阿霉素所需的糖环结构，葱醌环部分通过溴代、乙酸取代以后与糖环连接，再经过酯水解、保护、脱保护等步骤最终得到表阿霉素。这种化学半合成方法不仅收率低，而且操作繁琐，并会造成环境污染；另一种由阿霉素通过几步化学反应合成表阿霉素。化学合成方法需要经过反应多，总体收率低，而且还要经过分离纯化的过程，操作不易。

文献报道的利用R2YE培养基作为发酵培养基，表阿霉素的产量特别低，只有几个单位。目前通过微生物发酵生产表阿霉素都存在培养基配方复杂，发酵单位低等缺点，所以有必要开发出新的发酵培养基配方和方法，提高产量。

发明内容

本发明要解决的技术问题就是针对现有的培养基培养波塞链霉菌，其发酵生产表阿霉素发酵单位低，而且发酵培养基配方复杂的不足，提供一种发酵培养基以及一种生产表阿霉素的方法，该发酵培养基成分简单，尤其适用于波塞链霉菌(Streptomycespeucetius)工程菌发酵生产表阿霉素，可以大大提高表阿霉素的发酵单位，提高生产效率。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之一是：一种发酵培养基，其用于波塞链霉菌工程菌发酵生产表阿霉素，所述发酵培养基包括有机碳源、氮源、无机盐和水，按发酵培养基的总体积计，所述的有机碳源含量为50-250g/L；所述的氮源含量为10-100g/L；

所述波塞链霉菌工程菌通过将含有酮基还原酶基因的重组载体转化波塞链霉菌(Streptomyces peucetius)构建而成，所述酮基还原酶基因的核苷酸序列分别如序列表SEQ ID No.1～9所示，所述的波塞链霉菌为基因修饰后破坏dnmV基因的dnmV破坏株，所述dnmV破坏株含有dnmV基因破坏用质粒，所述dnmV基因破坏用质粒的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.28所示。

本发明中，核苷酸序列分别如序列表SEQ ID No.1～9所示的所述表位型酮基还原酶基因，分别为chloroeremomycin生产菌(Amycolatopsis orientales)来源的酮基还原酶基因chlE，万古霉素生产菌(Amycolatopsis orientales)来源的酮基还原酶基因vacE、阿维菌素生产菌(Streptomyces avermitilis)来源的酮基还原酶基因aveBIV、Saccharopolyspora erythraea来源的酮基还原酶基因EryBIV、Streptomycesmycarofaciens来源的酮基还原酶基因mycE、Streptomyces olivocromogenes来源的酮基还原酶基因oleU、Amycolatopsis decaplanina来源的酮基还原酶基因AmyE、不可培养的土壤细菌来源的酮基还原酶基因VEG33和不可培养的微生物CA878来源的酮基还原酶基因CA878-36。

本发明中，上述酮基还原酶基因编码的酮基还原酶的氨基酸序列分别如序列表SEQ ID No.10～18所示。

本发明所述的波塞链霉菌(Streptomyces peucetius)为本领域常规的波塞链霉菌，较佳地为保藏号为ATCC 27952的波塞链霉菌(Streptomyces peucetius)。

本发明中，较佳地，所述的重组载体含有Hind III、BamHI、XbaI和NdeI的酶切位点。较佳地，所述重组载体还含有ermE*启动子和/或终止子序列。

本发明所述的重组载体为本领域常规的重组载体，较佳地为质粒Pset152或质粒Pkc1139。

本发明中，较佳地，所述dnmV破坏株由包括以下步骤的制备方法制得：

(1)、扩增获得波塞链霉菌(Streptomyces peucetius)dnmV基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.27所示；构建包含插入终止密码子的dnmV基因的dnmV基因破坏用质粒，所述dnmV基因破坏用质粒的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.28所示；

(2)、将步骤(1)制得的dnmV基因破坏用质粒与波塞链霉菌接合，选择后获得不产阿霉素的dnmV基因破坏株。

本发明所述制备方法中，步骤(1)中，扩增dnmV基因的引物为本领域常规的引物，较佳地为DnmV点-5’和DnmV点-3’，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.29～30所示。获得所述插入终止密码子的dnmV基因的方法为本领域常规的方法，较佳地为重叠PCR法。更佳地，所述重叠PCR法包括三步反应，所使用的引物分别为引物Dau5-HindIII和dnmV3-84、引物dnmV5-84和Dau3-XbaI以及引物Dau5-HindIII和Dau3-XbaI。所述引物Dau5-HindIII、dnmV3-84、dnmV5-84和Dau3-XbaI的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.19～22所示。所述dnmV基因破坏用质粒的载体为本领域常规的载体，较佳地为质粒Pset152或质粒Pkc1139。

本发明所述制备方法中，步骤(2)中，所述接合前，较佳地包括选择安普霉素抗性株的步骤。所述选择使用的安普霉素的浓度为本领域常规的浓度，较佳地为50μg/mL。所述接合后，较佳地包括选择安普霉素敏感性菌株的步骤。所述选择使用的安普霉素的浓度为本领域常规的浓度，较佳地为50μg/mL。

本发明中，较佳地，上述基因工程菌的制备方法，包括以下的步骤：

(2)、将步骤1制得的dnmV基因破坏用质粒与波塞链霉菌接合，选择后获得不产阿霉素的dnmV基因破坏株；

(3)、用XbaI和NdeI双酶切全合成得到ermE*启动子，连接到质粒pET22b(+)的XbaI和NdeI位点，得到质粒pET22b(+)-E*，所述质粒pET22b(+)-E*的核苷酸序列如序列表SEQID No.31所示；用HindIII和BamHI双酶切全合成得到终止子，连接到质粒pSP72的HindIII和BamHI位点，得到质粒pSP72-Ter，所述质粒pSP72-Ter的核苷酸序列如序列表SEQIDNo.32所示；

(4)、得到酮基还原酶基因，所述酮基还原酶基因的核苷酸序列如序列表SEQ IDNo.1～9所示；

(5)、将步骤4所得的酮基还原酶基因用NdeI和HindIII双酶切后，插入到步骤3所得质粒pSP72-Ter，得到中间质粒A；

(6)、将步骤5所得的中间质粒A用NdeI和BamHI双酶切后，分别连接到步骤3所得的质粒pET22b(+)-E*上，得到中间质粒B；

(7)、将步骤6所得的中间质粒B用XbaI-BamHI双酶切后，插入质粒Pset152，得到接合转移质粒；所述质粒Pset152的核苷酸序列如序列表SEQID No.33所示；

(8)、将步骤2所得的不产阿霉素的dnmV基因破坏株作为宿主，采用接合转移的方法导入步骤7所得的接合转移质粒，即得产表阿霉素的基因工程菌。

更佳地，其包括以下的步骤：

1、扩增获得波塞链霉菌(Streptomyces peucetius)dnmV基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.27所示；构建包含插入终止密码子的dnmV基因的dnmV基因破坏用质粒，所述dnmV基因破坏用质粒的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.28所示；

2、将步骤1制得的dnmV基因破坏用质粒与波塞链霉菌接合，选择后获得不产阿霉素的dnmV基因破坏株；

3、用XbaI和NdeI双酶切全合成得到ermE*启动子，连接到质粒pET22b(+)的XbaI和NdeI位点，得到质粒pET22b(+)-E*，所述质粒pET22b(+)-E*的核苷酸序列如序列表SEQ IDNo.31所示；用HindIII和BamHI双酶切全合成得到终止子，连接到质粒pSP72的HindIII和BamHI位点，得到质粒pSP72-Ter，所述质粒pSP72-Ter的核苷酸序列如序列表SEQID No.32所示；

4、全合成得到chloroeremomycin生产菌(Amycolatopsis orientales)的酮基还原酶基因chlE、万古霉素生产菌(Amycolatopsis orientales)的酮基还原酶基因vacE、阿维菌素生产菌(Streptomyces avermitilis)的酮基还原酶基因aveBIV、Saccharopolyspora erythraea的酮基还原酶基因EryBIV、Streptomyces mycarofaciens的酮基还原酶基因mycE、Streptomycesolivocromogenes的酮基还原酶基因oleU、Amycolatopsis decaplanina的酮基还原酶基因AmyE、不可培养的土壤细菌的酮基还原酶基因VEG33或不可培养的微生物CA878的酮基还原酶基因CA878-36，所述酮基还原酶基因chlE、vacE、aveBIV、EryBIV、mycE、oleU、AmyE、VEG33或CA878-36的核苷酸序列如序列表SEQID No.1～9所示；

5、将步骤4所得的酮基还原酶基因用NdeI和HindIII双酶切后，插入到步骤3所得质粒pSP72-Ter，分别得到质粒pSP72-Ter-chlE、pSP72-Ter-vacE、pSP72-Ter-aveBIV，pSP72-Ter-EryBIV、pSP72-Ter-mycE、pSP72-Ter-oleU、pSP72-Ter-AmyE、pSP72-Ter-VEG33或pSP72-Ter-CA878-36，统称中间质粒A；

6、将步骤5所得的中间质粒A用NdeI和BamHI双酶切后，分别连接到步骤3所得的质粒pET22b(+)-E*上，得到pET22b(+)-E*-Ter-chlE、pET22b(+)-E*-Ter-vacE、pET22b(+)-E*-Ter-aveBIV、pET22b(+)-E*-Ter-avrE、pET22b(+)-E*-Ter-EryBIV、pET22b(+)-E*-Ter-mycE、pET22b(+)-E*-Ter-oleU、pET22b(+)-E*-Ter-AmyE、pET22b(+)-E*-Ter-VEG33或pET22b(+)-E*-Ter-CA878-36，统称中间质粒B；

7、将步骤6所得的中间质粒B用XbaI-BamHI双酶切后，插入质粒Pset152，分别得到质粒p-chlE、p-vacE、p-aveBIV、p-avrE、p-EryBIV、p-mycE、p-oleU、p-AmyE、p-VEG33或p-CA878-36，统称接合转移质粒；所述质粒Pset152的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.33所示；

8、将步骤2所得的不产阿霉素的dnmV基因破坏株作为宿主，采用接合转移的方法导入步骤7所得的接合转移质粒，即得产表阿霉素的基因工程菌DoxN-1/p-chlE、DoxN-1/p-vacE、DoxN-1/p-aveBIV、DoxN-1/p-avrE、DoxN-1/p-EryBIV、DoxN-1/p-mycE、DoxN-1/p-oleU、DoxN-1/p-AmyE或DoxN-1/p-VEG33。

本发明的发酵培养基，其特别适用于所述波塞链霉菌工程菌发酵生产表阿霉素，该发酵培养基包括有机碳源、氮源、无机盐和水，按发酵培养基的总体积计，所述的有机碳源含量为50-250g/L；所述的氮源含量为10-100g/L。

其中，所述的有机碳源包括培养基中常用的各种有机碳源，较佳地为豆油、乳糖、甘油、可溶性淀粉、玉米淀粉、蔗糖、麦芽糊精和土豆糊精中的一种或多种，更佳地为麦芽糊精、豆油和土豆糊精中的一种或多种。

在本发明的发酵培养基中，按发酵培养基的总体积计，所述有机碳源的含量较佳地为50-220g/L，更佳地为70-220g/L，最佳地为140-160g/L或者200-210g/L。

其中，所述的氮源包括培养基中常用的各种氮源，较佳地为硫酸铵、硝酸铵、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、黄豆粉、热榨黄豆饼粉、冷榨黄豆饼粉、酵母提取物、酵母粉、棉籽饼粉和麸质粉中的一种或多种，更佳地为酵母粉、黄豆粉、热榨黄豆饼粉、冷榨黄豆饼粉和麸质粉中的一种或多种。

在本发明的发酵培养基中，按发酵培养基的总体积计，所述氮源的含量较佳地为15-50g/L，更佳地为15-45g/L，最佳地为30g/L。

其中，所述的无机盐可以是常规的发酵培养基中所使用的各种矿物盐，如各种可以调节培养基的渗透压、pH、氧化还原电位等的在工业中常用的无机盐，包括硫酸盐、磷酸盐、氯化物和含钾、钠、镁、铁的化合物等，较佳地包括NaCl、CaCl₂和CaCO₃中的一种或多种。按发酵培养基的总体积计，所述无机盐的用量较佳地为8-9g/L。

在本发明的一较佳实施方式中，每升发酵培养基中，所述无机盐包括：2g的NaCl、3g的CaCl₂和3g的CaCO₃。

其中，所述的水较佳地为蒸馏水。

本发明中，所述的发酵培养基的pH值较佳地为5.0-8.5，更佳地为5.5-8.0，最佳地为6.2-6.6。

按本领域常识，本发明的发酵培养基如常规的发酵培养基一样，一般还可以含有消泡剂。

本发明所述的发酵培养基的制备方法为本领域常规，只要将各组分混合，再加以灭菌即可。所述的灭菌较佳地为高温灭菌。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之二是：一种生产表阿霉素的方法，其包括下述步骤：

(1)将前述的波塞链霉菌工程菌活化后，接种到种子培养基中培养，得到种子液；

(2)将种子液接种于所述的发酵培养基中进行液体发酵培养，然后从发酵液中分离出表阿霉素，即可。

在步骤(1)中，所述的波塞链霉菌工程菌活化的方法和条件可为本领域常规的方法和条件。所述波塞链霉菌工程菌活化较佳地为：将平板上的单菌落接种到斜面培养基上，在28℃-30℃的条件下培养5-10天。其中，所述的平板和斜面培养基可为本领域常规使用的斜面培养基。

在步骤(1)中，所述种子培养基可为本领域常规使用的种子培养基。在本发明的一较佳实施方式中，以种子培养基的总体积计，所述种子培养基包括：5g/L的葡萄糖、30g/L的黄豆粉、1g/L NaCl、1g/L KH₂PO₄、1g/LMgSO₄·7H₂O；所述种子培养基的pH值为7.2。

在步骤(1)中，所述的种子液的培养方法和条件可为本领域常规的方法和条件，所述培养的温度较佳地为20℃-40℃，所述培养的时间较佳地为24-72小时。

在步骤(2)中，所述种子液的用量为本领域常规的用量，较佳地为5％-15％，所述的百分比是指种子液的体积与发酵培养基的体积百分比。所述的发酵培养的温度较佳地为25℃-32℃，更佳地为27℃-29℃。所述的发酵培养的时间为本领域常规的培养时间，较佳地为5-10天。

所述从发酵液中分离出表阿霉素的方法可按本领域的常规分离方法进行操作。所述从发酵液中分离出表阿霉素较佳地按下述方式进行：将所述的发酵液进行酸化，用无水乙醇提取，离心取上清液，即可。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

本发明提供了一种培养基成分简单的、有利于波塞链霉菌工程菌高效发酵生产抗生素表阿霉素的发酵培养基以及相应的发酵方法。通过优选发酵培养基的碳源、氮源成分及配比，从而大大提高表阿霉素的产量。本发明提供的表阿霉素的发酵生产方法大幅提高了表阿霉素的发酵单位，适用于表阿霉素的规模化生产。

附图说明

图1为实施例1得到的表阿霉素的HPLC分析图。

具体实施方式

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

准备实验1

阿霉素生物合成基因的酮基还原酶基因(dnmV)的克隆

将能够产阿霉素的波塞链霉菌(Streptomyces peucetius)ATCC 27951接种于25mL TSB培养基(购自上海博微生物科技有限公司)中，28℃、220rpm振荡培养48小时，得培养液。将培养液用12000rpm离心5min，倒出上清，回收菌体。

按照细菌基因组提取方法进行基因组提取(参见《精编分子生物学实验指南》，F.M·奥斯伯等著，科学出版社，2008-05-01)，并进行电泳验证。结果说明，已经提取了该波塞链霉菌的基因组DNA。

合成引物，引物的序列如序列表SEQ ID No.20～21所示。

DnmV-5’：5’-ATGCGGGTCGTGGTTCTGGGG-3’；

DnmV-3’：5’-CTAGGCCGGGGCGCCGTGCG-3’。

PCR：使用约1μg上面提取的波塞链霉菌的基因组DNA和20μmol/L的引物DnmV-5’和DnmV-3’，使用primeSTAR GXL DNA polymerase(购自大连Takara公司)。按以下循环条件进行：98℃3分钟、98℃10秒、68℃1分钟，其中98℃10秒后68℃1分钟的程序循环25次，68℃10分钟。

结果特异性地扩增出约0.9kb的DNA片段，对该DNA片段的碱基序列进行分析(由英潍捷基(上海)贸易有限公司完成)，结果确认是阿霉素生物合成基因的酮基还原酶基因，即dnmV基因，其核苷酸序列如序列表SEQID No.27所示。

准备实验2

dnmV基因破坏用质粒pdnmV-152的构建

以准备实验1中制备的波塞链霉菌的基因组DNA为模板，采用重叠PCR的方法，通过在翻译区域插入终止密码子来破坏dnmV基因，从而得到含有插入终止密码子的dnmV基因的DNA片段。

使用的引物如下，这些引物的序列如序列表SEQ ID No.19～22所示。

Dau5-HindIII：

5’-GGGAAGCTTGATCGCCCTCACGGAACTGCGCAGGCGCGG-3’

dnmV3-84：

5’-CGCAGATGCGACTACGTCATCTCCTCCTCGGTGTCGCC-3’

dnmV5-84：

5’-GGCGACACCGAGGAGGAGATGACGTAGTCGCATCTGCG-3’

Dau3-XbaI：

5’-GGGTCTAGAGCCGGCATGCGGATCGGCATGGAGGTG-3’

(1)重叠PCR的第一步反应：

在50μL的反应体系中，使用引物Dau5-HindIII和dnmV3-84各20μM以及基因组DNA模板1μL，利用primeSTAR GXL DNApolymerase(购自大连Takara公司)按以下循环条件进行：98℃3分钟、98℃10秒、68℃1分钟30秒，并且该98℃10秒后68℃1分钟30秒的程序循环25次，再68℃10分钟。

PCR结束后，使用1％(w/w)琼脂糖凝胶120V下电泳45分钟。结果发现，特异性地扩增了约1.3kb的DNA片段，切胶，使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行胶回收(购自生工生物工程有限公司，并按照说明书的记载进行胶回收)，得第一步反应的PCR产物，最后溶到30μL纯水中。

(2)重叠PCR的第二步反应：

在50μL的反应体系中，使用引物dnmV5-84和Dau3-XbaI各20μM以及基因组DNA模板1μL，利用primeSTAR GXL DNApolymerase(购自大连Takara公司)按以下循环条件进行：98℃3分钟、98℃10秒、68℃2分钟30秒，并且该98℃10秒后68℃2分钟30秒的程序循环25次，再68℃10分钟。

PCR结束后，使用1％(w/w)琼脂糖凝胶120V下电泳45分钟。结果发现，特异性地扩增了约2.2kb的DNA片段，切胶，使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行胶回收(购自生工生物工程有限公司)，得第二步反应的PCR产物，最后溶到30μL纯水中。

(3)重叠PCR的第三步反应：

在50μL的反应体系中，使用引物Dau5-HindIII和Dau3-XbaI各20μM，以第一步反应的PCR产物和第二步反应的PCR产物为模板(各加1μL)，利用primeSTAR GXL DNApolymerase(购自大连Takara公司)按以下循环条件进行：98℃3分钟、98℃10秒、68℃3分钟30秒，并且98℃10秒后68℃3分钟30秒的程序循环25次，再68℃10分钟。

PCR结束后，使用1％(w/w)琼脂糖凝胶120V下电泳45分钟。结果发现，特异性地扩增了约3.5kb的DNA片段，切胶，使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(购自生工生物工程有限公司)进行胶回收，最后溶到30μL纯水中，得纯化的DNA片段A。

将纯化的DNA片段A使用Pmd18-T Vector Cloning Kit得到带有纯化的DNA片段A的质粒(试剂盒购自大连Takara公司，并按照说明书记载的方法获得带有纯化的DNA片段A的质粒)。将带有纯化的DNA片段A的质粒转化DH5α大肠杆菌(Escherichiacoli)感受态(购自北京康为世纪生物科技有限公司)，得携带质粒p153的大肠杆菌ET12567/pUZ8002，即转化体A。其中，转化的方法参见《精编分子生物学实验指南》。

对纯化的DNA片段A的碱基序列进行测序，确定其包含插入有终止密码子的dnmV基因的DNA片段。

将放线菌的接合转移用质粒Pset152(所述质粒Pset152的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.33所示)为模板进行PCR，得到一段长度为3.1kb的DNA片段，即DNA片段B。

使用的引物如下，这些引物的序列如序列表SEQ ID No.23～24所示。

pSET152-XbaⅠ：5’-GACTCTAGAGGATCCGCGGCCG-3’；

pSET152-HindⅢ：5’-AAGCTTCTGCAGGTCGACGGATCTTT-3’

将Pset152来源的约3.1kb的DNA片段B与包含插入终止密码子的dnmV基因的约3.5kb的DNA片段A连接起来，得到了能够进行接合转移的dnmV基因破坏用质粒p153。

dnmV基因破坏用质粒p153的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.28所示。

准备实验3

利用dnmV基因破坏用质粒p153构建dnmV破坏株

(1)将能够产阿霉素的波塞链霉菌(Streptomyces peucetius)ATCC 27951接种于25mL TSB培养基(购自上海博微生物科技有限公司)中，28℃、200rpm培养2天。然后按1％(v/v)的接种量转接到25mL TSB培养基中，28℃、200rpm培养1天，得培养液。将培养液离心、去上清，得菌丝体。用LB液体培养基洗涤菌丝体2次，最终悬浮于2mL的LB液体培养基中，即得宿主液。

(2)将准备实验2制备的转化体A接种到含25μg/mL氯霉素、25μg/mL卡那霉素和50μg/mL安普霉素的5mL LB液体培养基中[其中，该LB液体培养基含有1％(w/w)胰蛋白胨、0.5％(w/w)酵母提取物和1％(w/w)NaCl，pH7.0-7.2]，37℃、200rpm过夜培养。按1％(v/v)的接种量接合转移到25mL相同的LB液体培养基中，37℃培养约4小时后，用该LB液体培养基洗涤2次，最终悬浮于2mL LB液体培养基中，即得大肠杆菌液。

(3)将步骤(1)制得的宿主液和步骤(2)制得的大肠杆菌液按体积比1:1的比例混合于离心管中。充分混合后，涂布于MS琼脂培养基(购自国药集团化学试剂有限公司)28℃培养20小时。再用1mL含50μg/mL安普霉素和50μg/mL奈啶酮酸的无菌水覆盖平板，于28℃培养一周，获得安普霉素抗性株。

(4)按照准备实验1中提取基因组DNA的方法，提取步骤(3)获得的安普霉素抗性株的基因组DNA。以基因组DNA为模板，设计安普抗性基因引物(引物Apr-5’和Apr-3’的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.25～26所示)，通过PCR分析确定dnmV基因破坏用质粒p153已经通过同源重组插入了宿主染色体的同源重组体。

(5)将步骤(4)获得的同源重组体接种于25mL TSB培养基中，28℃、200rpm培养2天得培养液甲，将培养液甲中的1mL再接种于新的25mL TSB培养基中，进行传代培养，重复该操作5～7次，得培养液乙。将培养液乙十倍稀释后涂布于MS琼脂平板培养基，28℃下培养一周。将生长出的菌落挑取接种到含有50μg/mL安普霉素的MS琼脂平板培养基和不含安普霉素的MS平板培养基上，从而挑选出20株在含有50μg/mL安普霉素的MS琼脂平板培养基上无法生长繁育的安普霉素敏感性菌株。

(6)按照准备实验1中提取基因组DNA的方法，提取步骤(5)获得的安普霉素敏感性菌株的基因组DNA，并作为模板。进行PCR反应，获得约0.5kb的DNA扩增片段。

使用的引物如下，这些引物的序列如序列表SEQ ID No.29～30所示。

dnmV点-5’：5’-GGACATGCGGGTCGTGGTTCT-3’；

dnmV点-3’：5’-ATGCGGGCCCGACATGTT-3’

对这些扩增DNA片段的碱基序列进行测序(由英潍捷基(上海)贸易有限公司完成)，结果发现，存在3株已经导入dnmV基因破坏用质粒p153的dnmV基因破坏株，即DoxN-1、dnmV破坏株2和dnmV破坏株3；而有17株仍然保持了原来的碱基序列的正常菌株。

准备实验4

dnmV基因破坏株产阿霉素能力的测定

将准备实验3获得的3株已经导入dnmV基因破坏用质粒p153的dnmV基因破坏株和正常菌株接种于25mL种子培养基(含有5g/L葡萄糖、30g/L黄豆粉、1g/L NaCl、1g/L KH₂PO₄和1g/L MgSO₄·7H₂O，pH值为7.2)中，28℃、200rpm培养2天，得种子液。

将种子液按10％(v/v)的接种量接种到25mL发酵培养基(含有50g/L糊精、30g/L酵母粉、2g/L NaCl、3g/L CaCl₂和3g/L CaCO₃，pH值为6.2)中，28℃、200rpm培养7天，得发酵液。

使用6mol/L HCl将发酵液pH调至1.5～1.8，用无水乙醇稀释5倍于1.5ml离心管中，超声30分钟。12000rpm离心5分钟得上清，上清再用无水乙醇稀释2倍，用于HPLC分析。

HPLC分析条件如下：

A流动相：0.1％(v/v)三氟乙酸水溶液

B流动相：0.1％(v/v)三氟乙酸乙腈溶液

柱子：Agilent Eclipse XDB-C18(购自Agilent)，3.5μm，150×4.6mm

柱温：40℃

波长：254nm

流速：0.8ml/min。

具体的梯度条件如下表所示：

时间(分钟)	A相(v/v％)	B相(v/v％)
			0	75	25
5	70	30
			20	55	45
23	10	90
			24	75	25
30	75	25

检测结果如下表所示：

菌株名称	阿霉素产量(mg/L)
		DoxN-1	0
dnmV破坏株2	0
		dnmV破坏株3	0
正常菌株1	305
		正常菌株2	350
正常菌株3	331

结果表明，3株dnmV破坏株产生阿霉素为0，而正常菌株仍会产阿霉素。

准备实验5

以dnmV破坏株为宿主表达各酮基还原酶基因

(1)通过全合成得到ermE*启动子，用XbaI和NdeI双酶切，电泳后切胶纯化，连接到质粒pET22b(+)的XbaI和NdeI位点，得到质粒pET22b(+)-E*。

通过全合成得到终止子，用HindIII和BamHI双酶切，电泳后切胶纯化，连接到质粒pSP72的HindIII和BamHI位点，得到质粒pSP72-Ter。其中，所述质粒pET22b(+)-E*的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.31所示；所述质粒pSP72-Ter的核苷酸序列如序列表SEQ IDNo.32所示。全合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成，连接等步骤参见《精编分子生物学实验指南》。

(2)通过全合成得到chloroeremomycin生产菌(Amycolatopsis orientales)的酮基还原酶基因chlE、万古霉素生产菌(Amycolatopsis orientales)的酮基还原酶基因vacE和阿维菌素生产菌(Streptomyces avermitilis)的酮基还原酶基因aveBIV，上述基因的核苷酸序列分别如序列表SEQ ID No.1～3所示；上述酮基还原酶的氨基酸序列别如序列表SEQ ID No.10～12所示。全合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

将所得的酮基还原酶基因chlE、酮基还原酶基因vacE和酮基还原酶基因aveBIV用NdeI和HindIII双酶切后，插入到所得质粒pSP72-Ter，分别得到质粒pSP72-Ter-chlE、pSP72-Ter-vacE、pSP72-Ter-aveBIV，统称中间质粒Ⅰ。其中，酶切和插入的步骤参见《精编分子生物学实验指南》。

(3)通过blast氨基酸序列获得其他具有表异构化的酮基还原酶，如下表所示：

全合成法合成EryBIV、mycE、oleU、AmyE、VEG33和CA878-36基因，并在这些基因序列的两端加入NdeI和HindIII酶切位点，得全合成基因片段。其中全合成以及加入酶切位点等步骤由北京唯尚立德生物科技有限公司完成。

上表中基因的核苷酸序列分别如序列表SEQ ID No.4～9所示；上表中基因编码的酮基还原酶的氨基酸序列分别如序列表SEQ ID No.13～18所示。

将全合成基因片段用NdeI和HindIII双酶切后，分别插入步骤(1)所得的质粒pSP72-Ter的NdeI和HindIII位点，从而获得质粒pSP72-Ter-EryBIV、pSP72-Ter-mycE、pSP72-Ter-oleU、pSP72-Ter-AmyE、pSP72-Ter-VEG33和pSP72-Ter-CA878-36，统称中间质粒Ⅱ。

(4)将步骤(2)所得的中间质粒Ⅰ和步骤(3)所得的中间质粒Ⅱ用NdeI和BamHI双酶切后，连接到同样进行NdeI和BamHI双酶切的步骤(1)所得的质粒pET22b(+)-E*上，从而得到pET22b(+)-E*-Ter-chlE、pET22b(+)-E*-Ter-vacE、pET22b(+)-E*-Ter-aveBIV、pET22b(+)-E*-Ter-EryBIV、pET22b(+)-E*-Ter-mycE、pET22b(+)-E*-Ter-oleU、pET22b(+)-E*-Ter-AmyE、pET22b(+)-E*-Ter-VEG33或pET22b(+)-E*-Ter-CA878-36，统称中间质粒Ⅲ。

(5)用XbaI和BamHI分别将步骤(4)所得的中间质粒Ⅲ用XbaI-BamHI双酶切后，连到质粒Pset152的XbaI-BamHI酶切片段上，得到质粒p-chlE、p-vacE、p-aveBIV、p-EryBIV、p-mycE、p-oleU、p-AmyE、p-VEG33或p-CA878-36，统称接合转移质粒；所述质粒Pset152的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.33所示。

(6)将准备实验4中dnmV破坏株DoxN-1作为宿主，采用接合转移的方法导入上述9种接合转移质粒，获得表阿霉素生产菌株DoxN-1/p-chlE、DoxN-1/p-vacE、DoxN-1/p-aveBIV、DoxN-1/p-EryBIV、DoxN-1/p-mycE、DoxN-1/p-oleU、DoxN-1/p-AmyE或DoxN-1/p-VEG33。其中接合转移等步骤参见准备实验3中接合转移的相关步骤。

准备实验6

按准备实验4中的发酵培养、发酵液处理和HPCL检测方法，分析准备实验5所获得的表阿霉素生产菌株DoxN-1/p-chlE、DoxN-1/p-vacE、DoxN-1/p-aveBIV、DoxN-1/p-EryBIV、DoxN-1/p-mycE、DoxN-1/p-oleU、DoxN-1/p-AmyE或DoxN-1/p-VEG33和准备实验4中dnmV破坏株DoxN-1的表阿霉素的生产量。

结果下表所示，从表中可以看出上述表阿霉素生产菌株均高产表阿霉素。其中，导入chloroeremomycin生产菌(Amycolatopsis orientales)的酮基还原酶基因chlE的表阿霉素生产菌株DoxN-1/p-chlE生产表阿霉素的能力最好，将其命名为SIPI-ED01。

菌株	表阿霉素产量(mg/L)
		DoxN-1/p-chlE	201
DoxN-1/p-vacE	110
		DoxN-1/p-aveBIV	80
DoxN-1/p-EryBIV	11
		DoxN-1/p-mycE	23
DoxN-1/p-oleU	15
		DoxN-1/p-AmyE	35
DoxN-1/p-VEG33	17
		DoxN-1/p-CA878-36	15
DoxN-1	0

实施例1

发酵培养基的组成为：50g/L麦芽糊精、30g/L酵母粉、2g/L NaCl、3g/LCaCl2和3g/LCaCO₃，发酵培养基pH为6.2。

种子培养基的组成为：5g/L的葡萄糖、30g/L的黄豆粉、1g/L NaCl、1g/L KH₂PO₄、1g/L MgSO₄·7H₂O，种子培养基的pH值为7.2。

(1)取一株冷冻保存的上述的SIPI-ED01划线于斜面培养基，在28℃培养箱中活化7天，选择生长良好的斜面，得活化的菌株。所述的斜面培养基为ISP2，斜面培养基的pH值为7.0～7.2。

(2)用接种针挑取1cm²步骤(1)所得活化的菌株，接种于种子培养基，然后置于28℃、200rpm的摇床上培养2天得种子液。

(3)将步骤(2)所得的种子液按10％(v/v)的接种量接种于发酵培养基，然后置于28℃、200rpm的摇床上培养7天，得发酵液。

(4)将步骤(3)所得的发酵液用HCl调至pH 1.5～1.8，用无水乙醇超声提取，离心取上清，HPLC检测。HPLC的结果参见图1。

所述的HPLC检测条件如下：

A流动相：0.1％三氟乙酸水溶液。

B流动相：0.1％三氟乙酸乙腈溶液。

柱子：Agilent Eclipse XDB-C18，3.5μm，150×4.6mm。

柱温：40℃。

波长：254nm。

流速：0.8ml/min。

梯度条件：

时间	A相(％)	B相(％)
			0	75	25
5	70	30
			20	55	45
23	10	90
			24	75	25
30	75	25

HPLC检测表阿霉素的产量为125mg/L。

对比例1

发酵培养基(R2YE)的组成为：蔗糖103g/700ml、水解酪蛋白0.1g/700ml、葡萄糖10g/700ml、酵母抽提物5g/700ml、K₂SO₄0.25g/700ml、MgCl₂·6H₂O10.12g/700ml和微量元素溶液2ml。高压灭菌后每70ml培养基中加入KH₂PO₄(0.05％)10ml、CaCl₂(2.78％)10ml、TES(5.73％)10ml、NaOH(1mol/L)0.7ml。

其中，微量元素溶液的中的组分如下：Na₂B₄O₇·10H₂O 100mg/L，ZnCl₂ 400mg/L，(NH₃)Mo₇O₂₄·4H₂O 100mg/L，FeCl₃·6H₂O 2000mg/L，MnCl₂·4H₂O 100mg/L，CuCl₂·2H₂O100mg/L。

其余所有条件均与实施例1完全一致。

HPLC测定所得的发酵液中表阿霉素的发酵单位15mg/L。

可见，实施例1较对比例1相比，表阿霉素的产量提高了733.3％。

此外，经实验发现，前述所得到的各种波塞链霉菌工程菌在对比例1的发酵培养基中发酵培养后所得到的表阿霉素产量，同比都远低于本发明的发酵培养基。

实施例2

本实施例所用的发酵培养基的组成为：50g/L豆油、30g/L酵母粉、2g/LNaCl、3g/LCaCl₂和3g/L CaCO₃，发酵培养基pH为6.2。

将实施例1制得的种子液以10％的接种量接种于发酵培养基中，发酵过程的控制条件均同实施例1。发酵结束，发酵液处理的方法同实施例1，以HPLC测定表阿霉素的含量，为68mg/L。可见，实施例2较对比例1相比，表阿霉素的产量提高了353.3％。

实施例3

本实施例所用的发酵培养基的组成为：50g/L土豆糊精、30g/L酵母粉、2g/L NaCl、3g/L CaCl₂和3g/L CaCO₃，发酵培养基pH为6.2。

将实施例1制得的种子液以10％的接种量接种于发酵培养基中，发酵过程的控制条件均同实施例1。发酵结束，发酵液处理的方法同实施例1，以HPLC测定表阿霉素的含量，为30mg/L。可见，实施例3较对比例1相比，表阿霉素的产量提高了100％。

实施例4

本实施例所用的发酵培养基的组成为：50g/L甘油、30g/L酵母粉、2g/LNaCl、3g/LCaCl₂和3g/L CaCO₃，发酵培养基pH为6.2。

将实施例1制得的种子液以10％的接种量接种于发酵培养基中，发酵过程的控制条件均同实施例1。发酵结束，发酵液处理的方法同实施例1，以HPLC测定表阿霉素的含量，为18mg/L。可见，实施例3较对比例1相比，表阿霉素的产量提高了20％。

实施例5

本实施例所用的发酵培养基的组成为：50g/L淀粉、30g/L酵母粉、2g/LNaCl、3g/LCaCl₂和3g/L CaCO₃，发酵培养基pH为6.2。

将实施例1制得的种子液以10％的接种量接种于发酵培养基中，发酵过程的控制条件均同实施例1。发酵结束，发酵液处理的方法同实施例1，以HPLC测定表阿霉素的含量，为23mg/L。可见，实施例3较对比例1相比，表阿霉素的产量提高了53.3％。

实施例6

本实施例所用的发酵培养基的组成为：50g/L蔗糖、30g/L酵母粉、2g/LNaCl、3g/LCaCl₂和3g/L CaCO₃，发酵培养基pH为6.2。

将实施例1制得的种子液以10％的接种量接种于发酵培养基中，发酵过程的控制条件均同实施例1。发酵结束，发酵液处理的方法同实施例1，以HPLC测定表阿霉素的含量，为19mg/L。可见，实施例3较对比例1相比，表阿霉素的产量提高了26.7％。

实施例7

本实施例所用的发酵培养基的组成为：120g/L麦芽糊精、30g/L氮源、2g/L NaCl、3g/L CaCl₂和3g/L CaCO₃，发酵培养基pH为6.2，其中氮源为酵母粉、硝酸铵、黄豆粉、热榨黄豆饼粉、大豆蛋白或胨麸质粉。

将实施例1制得的种子液以10％的接种量接种于发酵培养基中，发酵过程的控制条件均同实施例1。发酵结束，发酵液处理的方法同实施例1。氮源的具体种类及对应发酵产量见下表：

氮源种类	产量(mg/L)
		酵母粉	227
硝酸铵	39
		黄豆粉	40
热榨黄豆饼粉	104
		大豆蛋白胨	31
麸质粉	51

其中，酵母粉和热榨黄豆饼粉作为氮源，产量相对来说都比较高，尤其是酵母粉，作为单一氮源，进行发酵时，表阿霉素的产量最高。

实施例8

本实施例所用的发酵培养基的组成为：50～220g/L麦芽糊精、30g/L酵母粉、2g/LNaCl、3g/L CaCl₂和3g/L CaCO₃，发酵培养基pH为6.2。

将实施例1制得的种子液以10％的接种量接种于发酵培养基中，发酵过程的控制条件均同实施例1。发酵结束，发酵液处理的方法同实施例1。麦芽糊精的的具体含量及对应发酵产量见下表：

麦芽糊精的含量在50～90g/L时，作为碳源不足以维持整个发酵周期，表阿霉素产量相对较低，但仍高于对比例1。麦芽糊精的含量在100～220g/L时，发酵过程碳源充足，表阿霉素产量相对都比较高，尤其在140～160g/L和200～210g/L时，表阿霉素的产量相对较高。

实施例9

本实施例所用的发酵培养基的组成为：120g/L麦芽糊精、10～60g/L酵母粉、2g/LNaCl、3g/L CaCl₂和3g/L CaCO₃，发酵培养基pH为6.2。

将实施例1制得的种子液以10％的接种量接种于发酵培养基中，发酵过程的控制条件均同实施例1。发酵结束，发酵液处理的方法同实施例1。酵母粉的具体含量及对应发酵产量见下表：

酵母粉含量(g/L)	产量(mg/L)
		10	91
15	133
		20	146
25	206
		30	223
35	218
		40	209
45	184
		50	118
55	52
		60	48

酵母粉的含量在10g/L时，表阿霉素产量相对较低。酵母粉的含量在15～45g/L时，发酵过程氮源充足，表阿霉素产量相对都比较高，尤其在30g/L时，表阿霉素的产量最高。

实施例10

本实施例所用的发酵培养基的组成为：120g/L麦芽糊精、30g/L酵母粉、2g/LNaCl、3g/L CaCl₂和3g/L CaCO₃，发酵培养基分别调节pH至5.0、5.4、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.5、8.0和8.5。

将实施例1制得的种子液以10％的接种量接种于发酵培养基中，发酵过程的控制条件均同实施例1。发酵结束，发酵液处理的方法同实施例1。发酵培养基的pH值及对应发酵产量见下表：

发酵培养基pH	产量(mg/L)
		5.0	88
5.4	93
		5.8	124
6.0	198
		6.2	245
6.4	216
		6.6	207
6.8	185
		7.0	136
7.5	109
		8.0	78
8.5	57

发酵培养基pH在6.2～6.6之间时，表阿霉素的产量较高。

实施例11

本实施例所用的发酵培养基的组成为：120g/L麦芽糊精、30g/L酵母粉、2g/LNaCl、3g/L CaCl₂和3g/L CaCO₃，发酵培养基pH为6.2。

(3)、将步骤(2)所得的二级种子液10％(v/v)的接种量接种于发酵培养基，然后置于200rpm的摇床上培养7天，培养的温度分别控制在23℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、32℃、35℃和37℃，得发酵液。

其余所有条件均与实施例1完全一致。

发酵培养温度在27～29℃时，表阿霉素的产量较高。

应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求数所限定的范围。

Claims

1.生产表阿霉素的方法，其特征在于，其包括下述步骤：

（1）将波塞链霉菌工程菌活化后，接种到种子培养基中培养，得到种子液；

（2）将种子液接种于发酵培养基中进行液体发酵培养，然后从发酵液中分离出表阿霉素，即可；

所述波塞链霉菌工程菌通过将含有酮基还原酶基因的重组载体转化波塞链霉菌（Streptomyces peucetius）构建而成，所述酮基还原酶基因的核苷酸序列分别如序列表SEQ ID No.1~9所示，所述的波塞链霉菌为基因修饰后破坏dnmV基因的dnmV破坏株，所述dnmV破坏株含有dnmV基因破坏用质粒，所述dnmV基因破坏用质粒的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.28所示；

所述发酵培养基包括有机碳源、氮源、无机盐和水，按发酵培养基的总体积计，所述的有机碳源含量为50-220g/L；所述的氮源含量为15-50g/L；所述有机碳源为麦芽糊精；所述氮源为酵母粉和/或热榨黄豆饼粉；

所述的发酵培养基的pH值为5.0-8.5；

在步骤（1）中，所述培养的温度为20℃-40℃，所述培养的时间为24-72小时；

在步骤（2）中，所述的发酵培养的温度为25℃-32℃，所述发酵培养的时间为5-10天。

2.如权利要求1所述的生产表阿霉素的方法，其特征在于，在步骤（1）中，所述波塞链霉菌工程菌活化为：将平板上的单菌落接种到斜面培养基上，在28℃-30℃的条件下培养5-10天。

3.如权利要求1所述的生产表阿霉素的方法，其特征在于，在步骤（1）中，以种子培养基的总体积计，所述种子培养基包括：5g/L的葡萄糖、30g/L的黄豆粉、1g/L NaCl、1g/LKH₂PO₄、1g/L MgSO₄·7H₂O；所述种子培养基的pH值为7.2。

4.如权利要求1所述的生产表阿霉素的方法，其特征在于，在步骤（2）中，所述的种子液的用量为5%-15%，所述的百分比是指种子液的体积与发酵培养基的体积百分比。

5.如权利要求1所述的生产表阿霉素的方法，其特征在于，在步骤（2）中，所述的发酵培养的温度为27℃-29℃。

6.如权利要求1所述的生产表阿霉素的方法，其特征在于，所述从发酵液中分离出表阿霉素按下述方式进行：将所述的发酵液进行酸化，用无水乙醇提取，离心取上清液，即可。

7.如权利要求1所述的生产表阿霉素的方法，其特征在于，所述的无机盐包括NaCl、CaCl₂和CaCO₃中的一种或多种；

和/或，按发酵培养基的总体积计，所述的无机盐的用量为8-9g/L；

和/或，所述的水为蒸馏水。

8.如权利要求7所述的生产表阿霉素的方法，其特征在于，按发酵培养基的总体积计，所述有机碳源的含量为70-220g/L；

和/或，按发酵培养基的总体积计，所述氮源的含量为15-45g/L；

和/或，每升发酵培养基中，所述无机盐包括：2g的NaCl、3g的CaCl₂和3g的CaCO₃；

和/或，所述的发酵培养基的pH值为5.5-8.0。

9.如权利要求8所述的生产表阿霉素的方法，其特征在于，按发酵培养基的总体积计，所述有机碳源的含量为140-160g/L或者200-210 g/L；

和/或，按发酵培养基的总体积计，所述氮源的含量为30g/L；

和/或，所述的发酵培养基的pH值为6.2-6.6。

10.一种发酵培养基，其特征在于，其用于波塞链霉菌工程菌发酵生产表阿霉素，所述发酵培养基包括有机碳源、氮源、无机盐和水，按发酵培养基的总体积计，所述的有机碳源含量为70-220g/L；所述的氮源含量为15-50g/L；

所述有机碳源为麦芽糊精；所述氮源为酵母粉和/或热榨黄豆饼粉；

所述发酵培养基的pH值为5.5-7.5。

11.如权利要求10所述的发酵培养基，其特征在于，所述的无机盐包括NaCl、CaCl₂和CaCO₃中的一种或多种；

和/或，所述的水为蒸馏水。

12.如权利要求11所述的发酵培养基，其特征在于，按发酵培养基的总体积计，所述氮源的含量为15-45g/L；

和/或，每升发酵培养基中，所述无机盐包括：2g的NaCl、3g的CaCl₂和3g的CaCO₃。

13.如权利要求12所述的发酵培养基，其特征在于，按发酵培养基的总体积计，所述有机碳源的含量为140-160g/L或者200-210g/L；

和/或，按发酵培养基的总体积计，所述氮源的含量为30g/L；

和/或，所述的发酵培养基的pH值为6.2-6.6。