WO2011145211A1 - ケトレダクターゼ変異体 - Google Patents

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ketoreductase
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acid sequence
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風介 間塚
崇恵 福島
奈緒美 隅田
耕二 矢内
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明治製菓株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a ketoreductase mutant used in a fermentation production method by microorganisms of a daunorubicin derivative produced semisynthetically.
  • Anthracycline antibiotics are a group of compounds of aromatic polyketides, including aglycone part composed mainly of 7,8,9,10-tetrahydro-5,12-naphthacenequinone (below) and sugars mainly composed of amino sugars. It is a pigment glycoside (glycoside) composed of
  • Anthracycline antibiotics bind to DNA and generate radicals to cleave DNA strands or inhibit topoisomerase II.
  • Topoisomerase has DNase and ligase activity and catalyzes the temporary cleavage and recombination of DNA strands, but anthracycline antibiotics inhibit topoisomerase II, thereby impairing DNA replication and exhibiting antitumor activity.
  • Anthracycline antibiotics are positioned as useful anticancer agents because they exhibit antitumor activity against a wide range of cancer cells, although accumulative cardiotoxic effects are observed.
  • the main anthracycline anticancer agents currently used include those derived from fermented products such as daunorubicin and semi-synthetic products made from daunorubicin such as doxorubicin and epirubicin.
  • Epirubicin is superior to daunorubicin and doxorubicin in terms of antitumor activity and toxicity, but the yield of the chemical synthesis process for reversing the 4-position hydroxyl group of the amino sugar moiety is low, and currently, epirubicin is the starting material for daunorubicin. Although it is produced, there are many problems in terms of manufacturing cost.
  • ketoreductase epi-type ketoreductase
  • the biosynthesis pathway of daunorubicin is altered and epithelial
  • Non-patent Document 1 Since epidaunorubicin has the same conformation of the hydroxyl group of the amino sugar moiety as epirubicin, epidaunorubicin can be a very useful starting material in producing epirubicin.
  • An object of the present invention is to provide a ketoreductase variant modified to improve the productivity of a daunorubicin derivative with respect to the ketoreductase used in the direct fermentation production method of a daunorubicin derivative such as epidaunorubicin by a microorganism. .
  • ketoreductase used in the direct fermentation production method of a daunorubicin derivative by a microorganism
  • the present inventors have intensively studied the modification of ketoreductase (EvaE) comprising the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1, and the 42nd and 149th positions.
  • EtE ketoreductase
  • the productivity of daunorubicin derivatives is improved by using a ketoreductase mutant in which at least one amino acid selected from the 153rd, 270th, and 306th amino acid groups is substituted with another amino acid.
  • the present invention has been completed.
  • the present invention provides a ketoreductase mutant that can be used for direct fermentation production of an efficient daunorubicin derivative by a microorganism and a polynucleotide (particularly DNA) encoding the mutant.
  • the present invention also includes a step of providing a transformant with DNA encoding the ketoreductase mutant of the present invention, culturing the transformant, and collecting a daunorubicin derivative from the obtained culture medium.
  • a method for producing a daunorubicin derivative is provided.
  • the present invention provides a daunorubicin derivative produced by the transformant of the present invention.
  • the present invention provides the following: (1) A mutant of a ketoreductase enzyme that can be used for the fermentation production of a daunomycin derivative, wherein the mutation is an insertion, substitution, or deletion of one or more amino acids in the amino acid sequence of the parent ketoreductase, or A ketoreductase variant that is an addition to one or both ends and improves the productivity of a daunomycin derivative as compared to the use of the parent ketoreductase. (2) The ketoreductase variant according to (1), wherein the parent ketoreductase comprises an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the ketoreductase variant according to (3) wherein the amino acid at the position corresponding to the 153rd amino acid in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 is substituted with an amino acid residue other than proline.
  • the ketoreductase variant according to (3) wherein the amino acid at the position corresponding to the 270th amino acid in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 is substituted with arginine.
  • (10) A polynucleotide encoding the ketoreductase variant according to any one of (1) to (9).
  • (11) A transformant in which the DNA according to (10) is introduced into an actinomycete host originally having the ability to produce daunomycin and imparted with the ability to produce a daunomycin derivative.
  • the transformant according to (11), wherein the actinomycete of the host is Streptomyces coeruleorubidus .
  • (13) A method for producing a daunomycin derivative, comprising a step of culturing the transformant according to (12) and collecting the daunomycin derivative from the culture solution.
  • (14) A daunomycin derivative obtained by the production method according to (13).
  • the productivity of the daunorubicin derivative can be improved.
  • the ketoreductase mutant of the present invention can be obtained as a result of mutating the parent ketoreductase. Further, in the present invention, this mutation is an insertion, substitution, or deletion of one or more amino acids, or addition to one or both ends in the amino acid sequence of ketoreductase, and This means that when the reductase mutant is used in a method for fermentative production of a daunorubicin derivative, the productivity of the daunorubicin derivative is improved as compared with the case where the parent ketoreductase is used.
  • the parent ketoreductase is not limited as long as it can be used in the fermentation production method of a daunorubicin derivative, but ketoreductase consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a homologue thereof is preferable.
  • the “homologue thereof” refers to an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in which several amino acid insertions, substitutions or deletions, or additions to one or both ends thereof are made. And having at least 90% identity with the amino acid sequence represented by the formula (1) and retaining its ketoreductase activity.
  • the parent ketoreductase when the parent ketoreductase consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, it is selected from the group consisting of amino acids 42, 149, 153, 270, and 306 in the sequence Specific examples thereof include mutants in which one or two or more amino acid residues are substituted with other amino acid residues.
  • the amino acid at position 42 is leucine
  • the amino acid at position 149 is serine
  • the amino acid at position 153 is amino acid other than proline
  • the amino acid at position 270 is at arginine
  • the amino acid at position 306 is asparagine.
  • the thing substituted by the acid is mentioned as a preferable thing.
  • the parent ketoreductase is a homologue of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, it is selected from the group consisting of amino acids at positions corresponding to the 42nd, 149, 153, 270, and 306th amino acids. Specific examples thereof include those in which one or two or more amino acid residues are substituted with other amino acid residues.
  • the position of the amino acid residue to be substituted in the homologue of the parent ketoreductase consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 can be easily selected by comparing amino acid sequences using a known algorithm.
  • the position of the amino acid residue to be substituted can be specified by comparing the three-dimensional structure of the enzyme.
  • a transformant producing a daunorubicin derivative can be obtained by introducing a DNA encoding the ketoreductase mutant of the present invention into an appropriate host originally having the ability to produce daunorubicin.
  • a preferred host is actinomycetes, and known actinomycetes that produce daunorubicin are Streptomyces peuceticus and Streptomyces coeruleorubidus , which are ketoreductases of the present invention. It can be used as a host for introducing a DNA encoding a mutant.
  • Baumomycin is a substance in which the amino sugar (L-daunosamine) portion of daunorubicin is modified, and daunorubicin is an intermediate of biosynthesis, so that actinomycetes that produce baumomycin can also be used as hosts.
  • daunorubicin or baumycin-producing bacterium it is preferable to use a strain that has lost daunorubicin-producing ability as a host because it lacks the ketoreductase gene involved in the 4-position hydroxyl group biosynthesis of the L-daunosamine part of daunorubicin.
  • the gene can be introduced into the host using conventional techniques such as mixing protoplasts with the target DNA, using phage, and using conjugative transfer. Can be implemented. In order to select a strain into which the gene has been introduced, it is desirable to introduce the target epitype ketoreductase gene together with a vector containing a selection marker gene.
  • the selection marker gene is not limited as long as it can select a strain into which an epi-type ketoreductase gene has been introduced, but a kanamycin resistance gene, a streptomycin resistance gene, a hygromycin resistance gene, a biomycin resistance gene, an apramycin resistance gene, or the like is preferable.
  • a promoter sequence that functions in the host to the epi type ketoreductase gene to be introduced, and an ermE * promoter derived from an erythromycin resistance gene [Schmitt-John, T. and Engels, JW] "Applied Microbiology and Biotechnology” (Germany), 1992, Vol. 36, p.493-498 (Non-Patent Document 4)], [Bibb MJ) et al., “Molecular Microbiology” (UK), 1994, Vol. 14, pp. 533-545 (Non-patent Document 5)].
  • the presence state of the epi-type ketoreductase gene in the host may be incorporated into either a plasmid or a chromosome capable of self-replication outside the chromosome.
  • the epi-type ketoreductase gene may be introduced by a method of replacing the host ketoreductase gene involved in the 4-position hydroxyl group biosynthesis of the L-daunosamine part of daunorubicin. Methods commonly used in actinomycetes can be used to replace genes [Practical Streptomyces Genetics], The John Innes Foundation ], (UK), Norwick, 2000, p. 311-338 (Non-Patent Document 6)].
  • the daunorubicin derivative produced by the transformant of the present invention is a daunorubicin derivative in which the 4-position hydroxyl group of the L-daunosamine part of daunorubicin is inverted.
  • Epidaunorubicin and epirubicin are preferable, and epidaunorubicin is more preferable.
  • the transformant of the present invention can be cultured by a conventional method to produce a daunorubicin derivative.
  • the medium conventional components such as glucose, sucrose, starch syrup, dextrin, starch, glycerol, molasses, animal / vegetable oil, etc. can be used as the carbon source.
  • the nitrogen source soybean flour, wheat germ, corn steep liquor, cottonseed meal, meat extract, polypeptone, malto extract, yeast extract, ammonium sulfate, sodium nitrate, urea and the like can be used.
  • sodium, potassium, calcium, magnesium, cobalt, chlorine, phosphoric acid (dipotassium hydrogen phosphate, etc.), sulfuric acid (magnesium sulfate, etc.) and other inorganic salts that can generate ions are added as necessary. Is also effective.
  • various vitamins such as thiamine (thiamine hydrochloride, etc.), amino acids such as glutamic acid (sodium glutamate, etc.), asparagine (DL-asparagine, etc.), micronutrients such as nucleotides, antibiotics, etc. are added as necessary. You can also Furthermore, organic substances and inorganic substances that assist the growth of bacteria and promote the production of daunorubicin derivatives can be appropriately added.
  • the pH of the medium is, for example, about pH 5.5 to pH 8.
  • a culture method a solid culture method under aerobic conditions, a shaking culture method, an aeration and agitation culture method or a deep aerobic culture method can be used, and the deep aerobic culture method is particularly suitable.
  • a suitable temperature for culturing is 15 ° C to 40 ° C, but in many cases grows at around 25 ° C to 35 ° C.
  • the production of daunorubicin derivatives varies depending on the medium and culture conditions, or the host used, but in any culture method, the accumulation usually reaches its maximum in 2 to 10 days. When the amount of daunorubicin derivative in the culture reaches the maximum, the culture is stopped, and the target substance is isolated and purified from the culture.
  • the usual separation means utilizing its properties for example, solvent extraction method, ion exchange resin method, adsorption or distribution column chromatography Extraction and purification can be carried out alone or in appropriate combination with a method, gel filtration method, dialysis method, precipitation method, crystallization method and the like.
  • chromatography using an adsorbent such as silica gel or alumina, Sephadex LH-20 (Pharmacia), Toyopearl HW-40 (Tosoh) or the like may be performed. Examples of the present invention will be described below, but this is merely an example and is not intended to limit the present invention, and encompasses all of the many variations or modification means not exemplified here.
  • Plasmid pIJ4070 containing ermE * promoter [Bibb, MJ et al., “Gene”, (UK), 1985 Year 38, p215-226 (Non-patent Document 7)] was double digested with Eco RI and Bam HI, fractionated by electrophoresis, and then an about 0.3 kbp Eco RI- Bam HI fragment containing the ermE * promoter was extracted from the gel. This DNA fragment was inserted into the Eco RI and Bam HI sites of plasmid pSET152 to obtain plasmid pSET152-E *.
  • Chloro about Remo mycin-producing bacterium ketoreductase gene (Amycolatopsis orientalis) (evaE) is a Bam HI- Xba I fragment comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 and total synthesis, plasmid pSET152-E * of Bam HI and The plasmid pEVA-E was obtained by inserting into the Xba I site.
  • primer pSET153-R (5'-GCGGATAACAATTTCACA-3 ', SEQ ID NO: 3) and pSETermE-R (5'- A random mutation was introduced by a combination of GTGCGGGCCTCTTCGCTATT-3 ′ and SEQ ID NO: 4).
  • the evaE fragment mutation is double digested with Bam HI and Xba I, and a genomic DNA library cloned into the Bam HI and Xba I sites of pSET152-E *.
  • Escherichia coli ET12567 / pUZ8002 strain that holds this genomic DNA library was added to 100 mL of LB liquid medium containing chloramphenicol, kanamycin, and apramycin at concentrations of 25 ⁇ g / mL, 25 ⁇ g / mL, and 50 ⁇ g / mL, respectively ( 1% diffcobact tryptone, 0.5% diffco yeast extract, 0.5% NaCl, 0.1% glucose) and cultured at 37 ° C. overnight to prepare a preculture solution.
  • Patent Document 2 International Publication No. WO2009 / 035107 pamphlet
  • MS agar medium 2% S soy flour, 2% mannitol, 2% agar
  • spores were scraped off with 3 mL of 20% glycerin solution to prepare a host spore solution.
  • the cells were collected by mixing 500 ⁇ L of the host spore solution and 500 ⁇ L of the E. coli solution prepared as described above, and then applied to an MS agar medium supplemented with MgCl 2 to a final concentration of 10 mmo1 / L. After culturing at 28 ° C. for 20 hours, 1 mL of sterile water containing 1 mg of apramycin and 1.5 mg of nalidixic acid was overlaid, and further cultured at 28 ° C. for 5 days to obtain an apramycin resistant strain.
  • liquid production medium prepared in 8-minute test tubes [ Komiyama, T. et al., “The Journal of Antibiotics ], (Japan), 1977, Vol. 30, p.619-621 (Non-patent Document 8)] Inoculate 10 mL, incubate at 28 ° C for 2 days, and then prepare 1 mL of the culture solution in a 250 mL Erlenmeyer flask Was inoculated into 20 mL of the same liquid production medium and cultured with shaking at 32 ° C. for 7 days.
  • Genomic DNA was prepared from the resulting highly productive clone using a MagExtractor genomic DNA extraction device (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) according to the protocol, and primers pSET153-R (SEQ ID NO: 3) and pSETermE-R (SEQ ID NO: 4) were prepared. ) And PrimeSTAR-HS-DNA Polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.) under the following cycle conditions (98 ° C., 10 seconds, 60 ° C., 5 seconds, 72 ° C., 1 minute ⁇ 25 times). As a result, an amplified DNA fragment of about 1 kbp was obtained.
  • the amplified fragment was double-digested with Bam HI and Xba I, yielding plasmid pEVA-E-1 containing inserted into Bam HI and Xba I sites of plasmid pSET152-E * is amino acid substitution K153T evaE .
  • PrimeSTAR HS DNA polymerase manufactured by TAKARA BIO INC.
  • Random mutation introduction into K153T mutant gene Random mutation was introduced using the plasmid pEVA-E-1 described in Example 3 as a template and GeneMorph II Random Mutagenesis Kit (Stratagene) according to the attached manual.
  • the evaE fragment mutation is double digested with Bam HI and Xba I, and a genomic DNA library cloned into the Bam HI and Xba I sites of pSET152-E *.
  • primers pSET153-R SEQ ID NO: 3 and A125T-R (5′-ACGGTCGTCTCGGCTAGGCCGGGCG-3 ′, SEQ ID NO: 23), A125T-F (5′-GCCCGCGCCCGGCCTAGCCGAGACG-3 ′, SEQ ID NO: 24) And pSETermE-R (SEQ ID NO: 4) in each case using PrimeSTAR HS DNA polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.) and carrying out a PCR reaction in the same manner as in Example 3. Two types of DNA solutions were obtained by purification using an application kit (Roche).
  • PrimeSTAR HS DNA polymerase manufactured by Takara Bio Inc.
  • primers pSET153-R SEQ ID NO: 3
  • pSETermE-R SEQ ID NO: 4
  • PCR was carried out in the same manner as in example 3, the amplified fragment was double-digested with Bam HI and Xba I, and inserted into the Bam HI and Xba I sites of plasmid pSET152-E * Q42L and K153T and C270R and E306D Plasmid pEVA-E-5 containing evaE with the amino acid substitution was obtained.
  • ketoreductase mutant of the present invention can be used for the production of daunorubicin derivatives.
  • this invention was demonstrated along the specific aspect, the deformation

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Abstract

　ダウノルビシン誘導体の効率的な生産に利用可能なケトレダクターゼ変異体、該変異体をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡが導入されてダウノルビシン誘導体を生産する形質転換体、及び該形質転換体を用いたダウノルビシン誘導体の製造方法を開示する。　前記ケトレダクターゼ変異体は、クロロレモマイシン生産菌（Amycolatopsis orientalis）のケトレダクターゼ（EvaE）のアミノ酸配列中の４２、１４９、１５３、２７０および３０６番目のアミノ酸に相当する位置のアミノ酸からなる群から選択される１個または２個以上のアミノ酸残基が、他のアミノ酸残基により置換されてなる。

Description

ケトレダクターゼ変異体
　本発明は、半合成的に生産されるダウノルビシン誘導体の微生物による発酵生産法に利用されるケトレダクターゼ変異体に関する。
　アントラサイクリン系抗生物質は芳香族ポリケタイドの一群の化合物であり、7,8,9,10-テトラヒドロ-5,12-ナフタセンキノン（下図）を基本骨格とするアグリコン部分とアミノ糖を主体とした糖類とから構成される色素配糖体（グリコシド）である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　アントラサイクリン系抗生物質はDNAと結合し、ラジカルを発生してDNA鎖を切断、あるいはトポイソメラーゼIIを阻害する。トポイソメラーゼはDNaseとligase活性を有し、DNA鎖の一時的な切断と再結合を触媒するが、アントラサイクリン抗生物質はトポイソメラーゼIIを阻害することによって、DNA複製に障害を与え、抗腫瘍活性を発揮する。アントラサイクリン系抗生物質は、蓄積性心毒作用が認められるものの、広範囲のガン細胞に対して抗腫瘍活性を示すことから有用な抗がん剤として位置付けられている。
　現在使用されている主なアントラサイクリン系抗がん剤には、ダウノルビシンといった発酵生産物由来のものと、ドキソルビシンやエピルビシンといったダウノルビシンを原料とした半合成品がある。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　エピルビシンは、抗腫瘍活性と毒性の面からダウノルビシンやドキソルビシンより優れているが、アミノ糖部分の4位水酸基を反転させるための化学合成工程の収率が低く、現状、ダウノルビシンを出発原料としてエピルビシンが生産されているが、製造コストの面で課題が多い。一方、ダウノルビシン生合成に関わるケトレダクターゼとは生成物の立体特異性が異なるケトレダクターゼ（エピ型ケトレダクターゼ）をコードする遺伝子をダウノルビシン生産菌に導入することによって、ダウノルビシンの生合成経路を改変させエピダウノルビシンを直接発酵生産させた研究が報告されている（非特許文献1）。エピダウノルビシンは、アミノ糖部分の水酸基の立体配座がエピルビシンと同一であることから、エピルビシンを生産する上で、エピダウノルビシンは極めて有用な出発原料に成り得る。アベルメクチン生合成に関わるエピ型ケトレダクターゼ遺伝子（avrE）を導入した時に最も高かったと報告されているが、その生産量は約54μg/mLに過ぎず、実用化可能なレベルには達していない。また、この研究で得られたエピダウノルビシン生産菌を変異原処理して、エピダウノルビシンの生産性を100μg/mL以上に向上させたとの特許出願がなされている（特許文献1）が、取得された変異株に関する詳細は実施例に記載されていない。一方、本発明者らはクロロレモマイシンに含まれるアミノ糖であるエピバンコサミン生合成に関わるケトレダクターゼ遺伝子（evaE）を導入した時に、avrE遺伝子を導入した場合と比較してエピダウノルビシンの生産量が2.7倍に向上することを見出し特許出願した（特許文献2）。
国際公開第W02006/111561号パンフレット 国際公開第WO2009/035107号パンフレット
マヅリ（Madduri,K.）ら著,「ネイチャー・バイオテクノロジー（Nature Biotechnology）」,（米国）,1998年,第16巻,p.69-74 リプマンアンドパーソン（Lipman DJ and Pearson WR）著.「サイエンス（Science）」,（米国）,1985年,第227巻,p.1435-1441 リプマンアンドパーソン（Lipman DJ and Pearson WR）著.「プロシ－ディングス・オブ・ザ・ナショナルアカデミー・オブ・ザ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッドステーツ・オブ・アメリカ（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America）」,（米国）,1988年,第85巻,p.2444-2448 シュミットージョーンアンドエンジェルス（Schmitt-John,T.and Engels,J.W.）著,「アプライド・マイクロバイオロジー・アンド・バイオテクノロジー（Applied Microbiology and Biotechnology）」,（独国）,1992年,第36巻,p.493-498 ビブ（Bibb,M.J.）ら著,「モレキュラー・マイクロバイオロジー（Molecular Microbiology）」,（英国）,1994年,第14巻,p.533-545 「プラクティカル・ストレプトマイセス・ジェネティックス（Practical Streptomyces Genetics）」,「ザ・ジョーン・イネス・ファンデーション（The John Innes Foundation）」,（英国）,ノルウィック（Norwick）,2000年,p.311-338 ビブ（Bibb,M.J.）ら著,「ジーン（Gene）」,（英国）,1985年,第38巻,p215-226 コミヤマ（Komiyama,T.）ら著,「ザ・ジャーナル・オブ・アンチバイオティクス（The Journal of Antibiotics）」,（日本）,1977年,第30巻,p.619-621
　本発明は、微生物によるエピダウノルビシン等のダウノルビシン誘導体の直接発酵生産法に使用されるケトレダクターゼについて、ダウノルビシン誘導体の生産性が向上するように改変されたケトレダクターゼ変異体を提供することを課題とする。
　本発明者らは、微生物によるダウノルビシン誘導体の直接発酵生産法に使用されるケトレダクターゼとして、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるケトレダクターゼ（EvaE）の改変を鋭意検討し、42番目、149番目、153番目、270番目、及び306番目のアミノ酸群から選ばれる少なくとも1箇所のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたケトレダクターゼ変異体を使用することによって、ダウノルビシン誘導体の生産性が向上することを発見し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は、微生物による効率の良いダウノルビシン誘導体の直接発酵生産に使用可能なケトレダクターゼ変異体及び該変異体をコードするポリヌクレオチド（特にはDNA）を提供するものである。また、本発明は、本発明のケトレダクターゼ変異体をコードするDNAによる形質転換体を提供するとともに、該形質転換体を培養し、得られた培養液からダウノルビシン誘導体を採取する工程を含んでなるダウノルビシン誘導体の製造方法を提供するものである。さらに、本発明は、本発明の形質転換体により生産されるダウノルビシン誘導体を提供するものである。
　従って、本発明は以下を提供する:
（１）ダウノマイシン誘導体の発酵生産に使用可能なケトレダクターゼ酵素の変異体であって、親ケトレダクターゼのアミノ酸配列において、変異が１個または複数個のアミノ酸の挿入、置換、または欠失、若しくはその一方または両末端への付加であり、親ケトレダクターゼを使用したときよりもダウノマイシン誘導体の生産性が向上するケトレダクターゼ変異体。
（２）親ケトレダクターゼが配列番号１のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とする（１）に記載のケトレダクターゼ変異体。
（３）配列番号１記載のアミノ酸配列中の４２、１４９、１５３、２７０および３０６番目のアミノ酸に相当する位置のアミノ酸からなる群から選択される１個または２個以上のアミノ酸残基が、他のアミノ酸残基により置換されてなる、（２）に記載のケトレダクターゼ変異体。
（４）配列番号１記載のアミノ酸配列中の４２番目のアミノ酸に相当する位置のアミノ酸がロイシンに置換されていることを特徴とする（３）に記載のケトレダクターゼ変異体。
（５）配列番号１記載のアミノ酸配列中の１４９番目のアミノ酸に相当する位置のアミノ酸がセリンに置換されていることを特徴とする（３）に記載のケトレダクターゼ変異体。
（６）配列番号１記載のアミノ酸配列中の１５３番目のアミノ酸に相当する位置のアミノ酸がプロリン以外のアミノ酸残基に置換されていることを特徴とする（３）に記載のケトレダクターゼ変異体。
（７）配列番号１記載のアミノ酸配列中の２７０番目のアミノ酸に相当する位置のアミノ酸がアルギニンに置換されていることを特徴とする（３）に記載のケトレダクターゼ変異体。
（８）配列番号１記載のアミノ酸配列中の３０６番目のアミノ酸に相当する位置のアミノ酸がアスパラギン酸に置換されていることを特徴とする（３）に記載のケトレダクターゼ変異体。
（９）ダウノマイシン誘導体がエピダウノマイシンであることを特徴とする（１）～（８）の何れか一項に記載のケトレダクターゼ変異体。
（１０）（１）～（９）の何れか一項に記載のケトレダクターゼ変異体をコードするポリヌクレオチド。
（１１）（１０）に記載のＤＮＡが本来ダウノマイシンを生産する能力を有した放線菌宿主に導入され、ダウノマイシン誘導体生産能が付与された形質転換体。
（１２）宿主の放線菌がStreptomyces coeruleorubidusであることを特徴とする（１１）に記載の形質転換体。
（１３）（１２）に記載の形質転換体を培養して、培養液からダウノマイシン誘導体を採取する工程を含んでなるダウノマイシン誘導体の製造方法。
（１４）（１３）に記載の製造方法で得られるダウノマイシン誘導体。
　本発明のケトレダクターゼ変異体によれば、ダウノルビシン誘導体の生産性を向上させることができる。
　本発明のケトレダクターゼ変異体は、親ケトレダクターゼを変異させた結果得ることができるものである。さらに、本発明にあっては、この変異が、ケトレダクターゼのアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸の挿入、置換、または欠失、若しくはその一方または両末端への付加であり、かつケトレダクターゼ変異体をダウノルビシン誘導体の発酵生産法に使用した場合に、親ケトレダクターゼを使用した場合と比較してダウノルビシン誘導体の生産性が向上するものであることを意味する。
　本発明において、親ケトレダクターゼは、ダウノルビシン誘導体の発酵生産法に使用可能なものであれば限定されないが、配列番号１に示されるアミノ酸配列よりなるケトレダクターゼまたはその相同体が好ましい。ここで「その相同体」とは、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、幾つかのアミノ酸の挿入、置換または欠失、もしくはその一方または両末端への付加がなされたもので、配列番号1で表されるアミノ酸配列と90%以上の同一性を有し、かつそのケトレダクターゼ活性を保持するものを言うものとする。ここで言う「同一性」とは、当業者に公知の相同性検索プログラムである［FASTA3;http://fasta.ddbj.nig.ac.jp/top-j.html］「Science,227,1435-1441(1985);Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85,2444-2448(1988)（非特許文献2,3）」においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いて算出される数値である。また、ケトレダクターゼ活性の有無は、後述する適切な宿主に相同体をコードする遺伝子を導入、発現させ、ダウノルビシン誘導体の生成の有無を調べることによって判定できる。このような「相同体」は、配列番号１に示される配列を参照すれば、当業者であれば困難性なしに選択し、製造可能であることは明らかである。
　本発明の好ましい態様によれば、親ケトレダクターゼが配列番号１に示されるアミノ酸配列よりなるものである場合、その配列中の４２、１４９、１５３、２７０、および３０６番目のアミノ酸からなる群から選択される１個または２個以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基によって置換されてなる変異体がその具体例として挙げられる。
　本発明の好ましい態様によれば、４２番目のアミノ酸がロイシンに、１４９番目のアミノ酸がセリンに、１５３番目のアミノ酸がプロリン以外のアミノ酸に、２７０番目のアミノ酸がアルギニンに、３０６番目のアミノ酸がアスパラギン酸に置換されたものが好ましいものとして挙げられる。これら変異体は、ダウノルビシン誘導体の発酵生産法に使用した場合に、ダウノルビシン誘導体の生産性が向上するという有利な性質を有している。
　また、親ケトレダクターゼが配列番号１に示されるアミノ酸配列の相同体である場合には、前記の４２、１４９、１５３、２７０、および３０６番目のアミノ酸に相当する位置のアミノ酸からなる群から選択される１個または２個以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基により置換されてなるものがその具体例として挙げられる。ここで、配列番号１に示されるアミノ酸配列よりなる親ケトレダクターゼの相同体において置換されるべきアミノ酸残基の位置は、公知のアルゴリズムによるアミノ酸配列の比較によって容易に選択することができる。一方、公知のアルゴリズムによるアミノ酸配列の比較が困難な場合にあっては、酵素の立体構造を比較することによって置換されるべきアミノ酸残基の位置を特定することができる。
　本発明のケトレダクターゼ変異体をコードするDNAを、本来ダウノルビシンを生産する能力を有した適切な宿主に導入することによって、ダウノルビシン誘導体を生産する形質転換体を得ることができる。好ましい宿主は放線菌であり、ダウノルビシンを生産する放線菌として、ストレプトマイセス・ピューセティカス（Streptomyces peuceticus）やストレプトマイセス・ケルレオルビダス（Streptomyces coeruleorubidus）が知られており、これらを本発明のケトレダクターゼ変異体をコードするDNA導入するための宿主として利用することが出来る。また、バウマイシンはダウノルビシンのアミノ糖（L-ダウノサミン）部分が修飾された物質でダウノルビシンが生合成の中間体であるため、バウマイシンを生産する放線菌も宿主として利用することが出来る。また、上述のダウノルビシン若しくはバウマイシン生産菌において、ダウノルビシンのL-ダウノサミン部分の4位水酸基生合成に関与するケトレダクターゼ遺伝子が欠損することによって、ダウノルビシン生産能を失った菌株を宿主として用いるのが好ましい。
　宿主への遺伝子の導入は、プロトプラストと目的DNAを混合する方法、ファージを利用する方法、接合伝達を利用する方法など通常の手法を利用することができ、宿主の性質を考慮して適切な手法を選択して実施することができる。遺伝子が導入された菌株を選抜するため、目的のエピ型ケトレダクターゼ遺伝子は選択マーカー遺伝子を含むベクターとともに導入するのが望ましい。選択マーカー遺伝子はエピ型ケトレダクターゼ遺伝子が導入された菌株を選抜できるものなら限定はされないが、カナマイシン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、バイオマイシン耐性遺伝子若しくはアプラマイシン耐性遺伝子などが好ましい。導入するエピ型ケトレダクターゼ遺伝子には宿主で機能するプロモーター配列を付加しておくのが好ましく、エリスロマイシン耐性遺伝子由来のermE*プロモーター［シュミットージョーンアンドエンジェルス（Schmitt-John,T.and Engels,J.W.）著,「アプライド・マイクロバイオロジー・アンド・バイオテクノロジー（Applied Microbiology and Biotechnology）」,（独国）,1992年,第36巻,p.493-498（非特許文献4）］、［ビブ（Bibb,M.J.）ら著,「モレキュラー・マイクロバイオロジー（Molecular Microbiology）」,（英国）,1994年,第14巻,p.533-545（非特許文献5）］などが好ましい例として挙げられる。宿主内でのエピ型ケトレダクターゼ遺伝子の存在状態としては、染色体外で自己複製可能なプラスミドもしくは染色体のどちらに組み込まれていても良い。また、エピ型ケトレダクターゼ遺伝子を、ダウノルビシンのL-ダウノサミン部分の4位水酸基生合成に関わる宿主のケトレダクターゼ遺伝子と置換する方法で導入しても良い。遺伝子を置換する方法としては放線菌で一般的に使用される手法が利用できる［プラクティカル・ストレプトマイセス・ジェネティックス（Practical Streptomyces Genetics）」,「ザ・ジョーン・イネス・ファンデーション（The John Innes Foundation）」,（英国）,ノルウィック（Norwick）,2000年,p.311-338（非特許文献6）］。
　本発明の形質転換体が生産するダウノルビシン誘導体は、ダウノルビシンのL-ダウノサミン部分の4位水酸基が反転したダウノルビシン誘導体である。好ましくはエピダウノルビシン及びエピルビシンであり、より好ましくはエピダウノルビシンである。
　本発明の形質転換体は、慣行の方法により培養し、ダウノルビシン誘導体を生産させることができる。培地としては、慣用の成分、例えば炭素源としてはグルコース、シュクロース、水飴、デキストリン、澱粉、グリセロール、糖蜜、動・植物油等が使用できる。また、窒素源としては大豆粉、小麦胚芽、コーン・スティープ・リカー、綿実粕、肉エキス、ポリペプトン、マルトエキス、イーストエキス、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、尿素等が使用できる。その他必要に応じ、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、塩素、リン酸（リン酸水素2カリウム等）、硫酸（硫酸マグネシウム等）及びその他のイオンを生成することのできる無機塩類を添加することも有効である。また、必要に応じてチアミン（チアミン塩酸塩等）等の各種ビタミン、グルタミン酸（グルタミン酸ナトリウム等）、アスパラギン（DL-アスパラギン等）等のアミノ酸、ヌクレオチド等の微量栄養素、抗生物質等の選抜薬剤を添加することもできる。さらに、菌の発育を助け、ダウノルビシン誘導体の生産を促進するような有機物及び無機物を適当に添加することができる。
　培地のpHは、例えばpH5.5～pH8程度である。培養法としては、好気的条件での固体培養法、振とう培養法、通気撹拌培養法又は深部好気培養法により行うことができるが、特に深部好気培養法が最も適している。培養に適当な温度は、15℃～40℃であるが、多くの場合25℃～35℃付近で生育する。ダウノルビシン誘導体の生産は、培地及び培養条件、又は使用した宿主により異なるが、いずれの培養法においても通常2日～10日間でその蓄積が最高に達する。培養中のダウノルビシン誘導体の量が最高になった時に培養を停止し、培養物から目的物質を単離、精製する。
　本発明の形質転換体を培養して得られる培養物からダウノルビシン誘導体を採取するためには、その性状を利用した通常の分離手段、例えば溶剤抽出法、イオン交換樹脂法、吸着又は分配カラムクロマトグラフィー法、ゲル濾過法、透析法、沈殿法、結晶化法等を単独で、又は適宜組み合わせて抽出精製することができる。ダウノルビシン誘導体をさらに精製するには、シリカゲル、アルミナ等の吸着剤、セファデックスLH-20（ファルマシア社製）、又はトヨパールHW-40（東ソー社製）等を用いるクロマトグラフィーを行うと良い。
　以下に本発明の実施例を示すが、これは単なる一例であって本発明を限定するものではなく、ここに例示しなかった多くの変法あるいは修飾手段のすべてを包括するものである。
クロロレモマイシン生産菌（Amycolatopsis orientalis）のケトレダクターゼ遺伝子（evaE）への変異の導入
　ermE*プロモーターを含むプラスミドpIJ4070［ビブ（Bibb,M.J.）ら著,「ジーン（Gene）」,（英国）,1985年,第38巻,p215-226（非特許文献7）］をEcoRI及びBamHIで二重消化し、電気泳動により分画後、ermE*プロモーターを含む約0.3kbpのEcoRI－BamHI断片をゲルより抽出した。このDNA断片をプラスミドpSET152のEcoRI及びBamHI部位に挿入しプラスミドpSET152-E*を得た。
　クロロレモマイシン生産菌（Amycolatopsis orientalis）のケトレダクターゼ遺伝子（evaE）については、配列番号２で表される塩基配列から成るBamHI－XbaI断片を全合成し、プラスミドpSET152-E*のBamHI及びXbaI部位に挿入してプラスミドpEVA-Eを得た。このプラスミドpEVA-Eを鋳型としGeneMorph II Random Mutagenesis Kit（ストラタジーン社製）を用い添付マニュアルに従い、プライマーpSET153-R（5’-GCGGATAACAATTTCACA-3’、配列番号３）とpSETermE-R（5’-GTGCGGGCCTCTTCGCTATT-3'、配列番号４）の組合せによりランダム変異を導入した。
　変異が導入されたevaE断片をBamHI及びXbaIで二重消化し、pSET152-E*のBamHI及びXbaI部位にクローニングしてゲノムDNAライブラリーとした。
　このゲノムDNAライブラリーを保持する大腸菌（Escherichia coli）ET12567/pUZ8002株をクロラムフェニコール、カナマイシン及びアプラマイシンをそれぞれ25μg/mL、25μg/mL及び50μg/mLの濃度で含む100mLのLB液体培地（1%ディフコバクトトリプトン、0.5%ディフコイーストエキストラクト、0.5%NaCl、0.1%グルコース）に植菌し、37℃で一晩培養して前培養液を調製した。前培養液を終濃度1%となるように前培養時と同一の液体培地に植菌し、37℃で約4時間培養した後、LB液体培地で2回洗浄し、最終的に10mLのLB液体培地に懸濁して大腸菌液とした。
　ダウノルビシン生産菌のストレプトマイセス・ケルレオルビダス（Streptomyces coeruleorubidus）のdnmV遺伝子破壊株（特許文献２: 国際公開第WO2009/035107号パンフレット）をMS寒天培地（2%S大豆粉、2%マンニトール、2%寒天）に塗布し、28℃にて4日培養した。培養後、20%グリセリン溶液3mLで胞子をかきとり、宿主の胞子液を調製した。
　上述の通りにして調製した宿主の胞子液500μLと大腸菌液500μLを混合して集菌した後、終濃度10mmo1/LとなるようにMgCl2を添加したMS寒天培地に塗布した。28℃、20時間培養後、アプラマイシン1mg及びナリジキシン酸1.5mgを含む滅菌水1mLを重層し、更に28℃、5日間培養してアプラマイシン耐性株を得た。
　これらの株についてエピダウノルビシンの生産性を確認するため、８分試験管に調製した液体生産培地［コミヤマ（Komiyama,T.）ら著,「ザ・ジャーナル・オブ・アンチバイオティクス（The Journal of Antibiotics）」,（日本）,1977年,第30巻,p.619-621（非特許文献8）］10mLに植菌し、28℃で2日培養後、培養液1mLを250mL容三角フラスコに調製した同液体生産培地20mLに植菌し、32℃、7日間振とう培養した。菌体生産物を抽出するため、1mLの培養液、1mLのメタノール、70μLの50%H2SO4を15mL容の遠心管に入れ、1時間振とうした後一晩冷存し、2000×g、10分間遠心してその上清をHPLC分析に供した。
　得られた生産性の高いクローン株よりMagExtractorゲノムDNA抽出機器（東洋紡績株式会社製）を用いてプロトコールに従ってゲノムDNAを調製し、プライマーpSET153-R（配列番号３）とpSETermE-R（配列番号４）の組合せで、PrimeSTAR HS DNA Polymerase（タカラバイオ株式会社製）を使用して以下のサイクル条件で行った（98℃・10秒間、60℃・5秒間、72℃・1分×25回）。その結果、約1kbpの増幅DNA断片を得た。本DNA断片の塩基配列を解析した結果、高い生産性を示したクローン株にそれぞれQ42L（42番目のグルタミンがロイシンに置換）、K153T（153番目のリシンがスレオニンに置換）、C270R（270番目のシステインがアルギニンに置換）のアミノ酸置換があることが明らかになった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
プラスミドpEVA-Eへのサチュレーション（Saturation）変異導入
　実施例１で作成したプラスミドpEVA-Eを鋳型とし、以下のプライマーセットでPrimeSTAR HS DNAポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社製）を使用して（98℃・10秒、68℃・7分）×25回のサイクルによるPCR反応を行なった。プライマー塩基配列の大文字の箇所は、サチュレーション変異の導入部分を示す。
[1] NAC-F
5’-gcggaacagatcctcaagNACgccacggcaaatggccag-3’（配列番号５）
　　NAC-R
5’-ctggccatttgccgtggcGTNcttgaggatctgttccgc-3’（配列番号６）
[2] NCC-F
5’-gcggaacagatcctcaagNCCgccacggcaaatggccag-3’（配列番号７）
　　NCC-R
5’-ctggccatttgccgtggcGGNcttgaggatctgttccgc-3’（配列番号８）
[3] NGC-F
5’-gcggaacagatcctcaagNGCgccacggcaaatggccag-3’（配列番号９）
　　NGC-R
5’-ctggccatttgccgtggcGCNcttgaggatctgttccgc-3’（配列番号１０）
[4] NTC-F
5’-gcggaacagatcctcaagNTCgccacggcaaatggccag-3’（配列番号１１）
　　NTC-R
5’-ctggccatttgccgtggcGANcttgaggatctgttccgc-3’（配列番号１２）
[5] VAG-F
5’-gcggaacagatcctcaagVAGgccacggcaaatggccag-3’（配列番号１３）
　　VAG-R
5’-ctggccatttgccgtggcCTBcttgaggatctgttccgc-3’（配列番号１４）
[6] TGG-F
5’-gcggaacagatcctcaagTGGgccacggcaaatggccag-3’（配列番号１５）
　　TGG-R
5’-ctggccatttgccgtggcCCActtgaggatctgttccgc-3’（配列番号１６）
[7] ATG-F
5’-gcggaacagatcctcaagATGgccacggcaaatggccag-3’（配列番号１７）
　　ATG-R
5’-ctggccatttgccgtggcCATcttgaggatctgttccgc-3’（配列番号１８）
　得られたPCR産物にDpnI 1μL（20units以下）を添加し、37℃、1時間消化した。その後、DpnI消化物1μLを用いてEscherichia coli DH5α（タカラバイオ株式会社製）を形質転換し、アプラマイシン50μg/mL添加LB寒天培地プレートに塗布し、37℃、一晩培養した。
　生育したコロニーをLaTaqポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社製）を用いて、94℃・5分、（94℃・30秒、55℃・30秒、72℃・1分30秒）×25回のサイクルによるコロニーPCR反応を行なった。PCR反応産物をハイピュアーPCRプロダクトピュリフィケーションキット（ロッシュ社製）を用いて精製し、変異箇所の確認を行った。153番のアミノ酸について全てのアミノ酸置換に対応する変異が得られたことを確認した後、変異遺伝子を含むプラスミドをQIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN社製）を用いて調製した。
　これらのプラスミドを用い、接合伝達で実施例１に記載のdnmV破壊株に導入し、得られた菌株についてエピダウノルビシンの生産性を確認したところ、野性株に比べプロリン以外のアミノ酸置換により生産性が向上していることが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
K153T及びQ149S二重変異体の作成と評価
　実施例１で単離した最も生産性の高かったK153Tのアミノ酸置換を有するクローン株のゲノムDNAからプライマーpSET153-R（配列番号３）とpSETermE-R（配列番号４）の組合せでPrimeSTAR HS DNAポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社製）を使用してPCR反応を以下のサイクル条件で行った（98℃・10秒、60℃・5秒、72℃・1分）×25回。その結果、約1kbpの増幅断片を得た。増幅された断片をBamHI及びXbaIで二重消化し、プラスミドpSET152-E*のBamHI及びXbaI部位に挿入してK153Tのアミノ酸置換されたevaEを含むプラスミドpEVA-E-１を得た。このプラスミドpEVA-E-１からプライマーpSET153-R（配列番号３）とQ149S-R（5’-TTCCGCTGTCAGCTTCTG-3'、配列番号１９）、Q149S-F（5’-TCGATCCTCAAGACGGCCACGGC-3'、配列番号２０）とpSETermE-R（配列番号４）の組合せでそれぞれPrimeSTAR HS DNAポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社製）を使用して上述のようにPCR反応を行い、このPCR反応産物をハイピュアーPCRプロダクトピュリフィケーションキット（ロッシュ社製）を用いて精製し、２種類のDNA溶液を得た。この２種類のDNA溶液をT4ポリヌクレオチドキナーゼ（日本ジーン社製）を用いてリン酸化した後、プラスミドpSET152-E*のBamHI及びXbaI部位に挿入してQ149S（149番目のグルタミンがセリンに置換）とK153Tのアミノ酸置換されたevaEを含むプラスミドpEVA-E-２を得た。
　このプラスミドを用い、接合伝達で実施例１に記載のdnmV破壊株に導入し、得られた菌株evaE-2について実施例１と同様にエピダウノルビシンの生産性を確認したところ、変異導入前の株に比べ生産性が向上している株であることが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
K153T変異体遺伝子に対するランダム変異導入
　実施例３記載のプラスミドpEVA-E-１を鋳型としGeneMorph II Random Mutagenesis Kit（ストラタジーン社製）を用い添付マニュアルに従い、ランダム変異を導入した。
　変異が導入されたevaE断片をBamHI及びXbaIで二重消化し、pSET152-E*のBamHI及びXbaI部位にクローニングしてゲノムDNAライブラリーとした。
　これらのクローニングしたプラスミドを用い、接合伝達で実施例１に記載のdnmV破壊株に導入し、得られた菌株について実施例１と同様にエピダウノルビシンの生産性を確認したところ、生産性の高いクローン株はK153Tに加えてE306D（306番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換）のアミノ酸置換があり、このクローン株をevaE-3とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
evaE三重変異体（K153T,C270R,E306D）および四重変異体（Q42L,K153T,C270R,E306D）の作成と評価
　実施例4で単離したevaE-3のゲノムDNAからプライマーpSET153-R（配列番号３）とT808C-R（5’-GTTCCACACGGGTCACCTCG-3'、配列番号２１）、T808C-F（5’-CGAGGTGACCCGTGTGGAAC-3'、配列番号２２）とpSETermE-R（配列番号４）の組合せでそれぞれPrimeSTAR HS DNAポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社製）を使用して実施例３と同様にPCR反応を行い、このPCR反応産物をハイピュアーPCRプロダクトピュリフィケーションキット（ロッシュ社製）を用いて精製し、２種類のDNA溶液を得た。この２種類のDNA溶液を混合したものをテンプレートとして、プライマーpSET153-R（配列番号３）とpSETermE-R（配列番号４）の組合せでPrimeSTAR HS DNAポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社製）を使用して実施例３と同様にPCR反応を行い、増幅された断片をBamHI及びXbaIで二重消化し、プラスミドpSET152-E*のBamHI及びXbaI部位に挿入してK153TとC270RとE306Dのアミノ酸置換されたevaEを含むプラスミドpEVA-E-４を得た。
　プラスミドpEVA-E-４からプライマーpSET153-R（配列番号３）とA125T-R（5’-ACGGTCGTCTCGGCTAGGCCGGGCG-3'、配列番号２３）、A125T-F（5’-GCCCGCGCCCGGCCTAGCCGAGACG-3'、配列番号２４）とpSETermE-R（配列番号４）の組合せでそれぞれPrimeSTAR HS DNAポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社製）を使用して実施例３と同様にPCR反応を行い、このPCR反応産物をハイピュアーPCRプロダクトピュリフィケーションキット（ロッシュ社製）を用いて精製し、２種類のDNA溶液を得た。この２種類のDNA溶液を混合したものをテンプレートとして、プライマーpSET153-R（配列番号３）とpSETermE-R（配列番号４）の組合せでPrimeSTAR HS DNAポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社製）を使用して実施例３と同様にPCR反応を行い、増幅された断片をBamHI及びXbaIで二重消化し、プラスミドpSET152-E*のBamHI及びXbaI部位に挿入してQ42LとK153TとC270RとE306Dのアミノ酸置換されたevaEを含むプラスミドpEVA-E-５を得た。
　このプラスミドpEVA-E-５を用い、接合伝達で実施例１に記載のdnmV破壊株に導入し、得られた菌株evaE-5について実施例１と同様にエピダウノルビシンの生産性を確認したところ、変異導入前の株に比べ生産性が向上している株であることが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
 　以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
　本発明のケトレダクターゼ変異体は、ダウノルビシン誘導体の生産に利用することができる。
　以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
　配列表の数字見出し<223>には、「Artificial Sequence」の説明を記載する。
　配列番号２～２４の各配列で表される塩基配列は、合成DNAである。配列番号５～１２の記号「n」は、それぞれ、任意の塩基を表す。

Claims (14)

  1. 　ダウノマイシン誘導体の発酵生産に使用可能なケトレダクターゼ酵素の変異体であって、親ケトレダクターゼのアミノ酸配列において、変異が１個または複数個のアミノ酸の挿入、置換、または欠失、若しくはその一方または両末端への付加であり、親ケトレダクターゼを使用したときよりもダウノマイシン誘導体の生産性が向上するケトレダクターゼ変異体。
  2. 　親ケトレダクターゼが配列番号１で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載のケトレダクターゼ変異体。
  3. 　配列番号１で表されるアミノ酸配列中の４２、１４９、１５３、２７０および３０６番目のアミノ酸に相当する位置のアミノ酸からなる群から選択される１個または２個以上のアミノ酸残基が、他のアミノ酸残基により置換されてなる、請求項２に記載のケトレダクターゼ変異体。
  4. 　配列番号１で表されるアミノ酸配列中の４２番目のアミノ酸に相当する位置のアミノ酸がロイシンに置換されている、請求項３に記載のケトレダクターゼ変異体。
  5. 　配列番号１で表されるアミノ酸配列中の１４９番目のアミノ酸に相当する位置のアミノ酸がセリンに置換されている、請求項３に記載のケトレダクターゼ変異体。
  6. 　配列番号１で表されるアミノ酸配列中の１５３番目のアミノ酸に相当する位置のアミノ酸がプロリン以外のアミノ酸残基に置換されている、請求項３に記載のケトレダクターゼ変異体。
  7. 　配列番号１で表されるアミノ酸配列中の２７０番目のアミノ酸に相当する位置のアミノ酸がアルギニンに置換されている、請求項３に記載のケトレダクターゼ変異体。
  8. 　配列番号１で表されるアミノ酸配列中の３０６番目のアミノ酸に相当する位置のアミノ酸がアスパラギン酸に置換されている、請求項３に記載のケトレダクターゼ変異体。
  9. 　ダウノマイシン誘導体がエピダウノマイシンである、請求項１～８のいずれか一項に記載のケトレダクターゼ変異体。
  10. 　請求項１～９のいずれか一項に記載のケトレダクターゼ変異体をコードするポリヌクレオチド。
  11. 　請求項１０に記載のポリヌクレオチドが本来ダウノマイシンを生産する能力を有した放線菌宿主に導入され、ダウノマイシン誘導体生産能が付与された形質転換体。
  12. 　宿主の放線菌がStreptomyces coeruleorubidusである、請求項１１に記載の形質転換体。
  13. 　請求項１２に記載の形質転換体を培養して、培養液からダウノマイシン誘導体を採取する工程を含んでなるダウノマイシン誘導体の製造方法。
  14. 　請求項１３に記載の製造方法で得られるダウノマイシン誘導体。
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