CN111349647B - CRISPR/Cas9介导的附加内源RBS的微生物次级代谢产物强化启动系统 - Google Patents

CRISPR/Cas9介导的附加内源RBS的微生物次级代谢产物强化启动系统 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种CRISPR/Cas9介导的附加内源RBS的微生物次级代谢产物强化启动系统，属于基因工程技术领域。本发明基于CRISPR/Cas9基因打靶系统实现了内源核糖体结合位点和外源启动子的联合，构建了附加lRBS的微生物次级代谢产物强化启动系统；同时联合孢子种间结合转移，提高了阳性突变株得率，从而显著提高了微生物次级代谢产物的产量。

Description

CRISPR/Cas9介导的附加内源RBS的微生物次级代谢产物强化 启动系统
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种CRISPR/Cas9介导的附加内源RBS的微生物次级代谢产物强化启动系统。
背景技术
微生物次级代谢产物其结构复杂多样，具有抗细菌、抗真菌、抗肿瘤、抗病毒和免疫抑制等多种生物活性，是微生物药物开发的源泉。由于次级代谢产物不是细胞生长必须的，进化过程中，细胞产生的次级代谢产物的产量只需满足其特殊的生理功能，产量较低。但是，在工业生产时，这种低产量远不能达到产业化要求。
代谢工程是目前提高次级代谢产物产量行之有效的方法。微生物次级代谢产物启动子工程是代谢工程研究中精细调控关键基因表达的重要工具。启动子工程，是借助基因表达元件，调节路径酶的差异表达，实现代谢流平衡，从而提高细胞工厂的生产效率。其中调控核糖体结合位点(RBS)强度是启动子工程常用的路径优化控制策略之一。RBS序列是控制翻译起始和蛋白质表达的关键区域，是多种微生物蛋白质翻译的重要遗传因子，因此决定着翻译水平的高低。研究表明运用合适的RBS可以增强相关蛋白质的表达，调控代谢流，提高目的产物的产量。因此通过改变目标蛋白质编码基因前的RBS序列，获得不同翻译水平的蛋白质或酶，从而可以调控代谢流，获得相应的代谢产物。然而，目前对于来源于次级代谢产物合成基因簇(Biosynthetic gene cluster，简称BGC)的内源性RBS(local RBS，简称lRBS)与来源于外源性强启动子中的RBS相结合，从而形成双重RBS(double-RBS，简称dRBS)的增强效果研究还处于技术空白。
启动子工程为激活原始沉默生物合成基因簇和发现新的天然产物的重要技术。kasO*P是一个构造简单且具有很强的功能的工程启动子，在链霉菌相关次级代谢产物合成基因簇表达中有很多成功案例。虽然启动子工程对微生物次级代谢产物的提升起到了很大的帮助，但是常用的启动子工程的方法对于提高产物的效价还是没有达到一个满意的程度。
目前在稀有放线菌Nonomuraea中，基因编辑仍然存在很多问题。一方面，稀有放线菌Nonomuraea的产孢能力差，目前通常采用菌丝体与大肠杆菌进行接合作用导入外源基因。然而，由于死亡的菌丝体与接合转移子形态相似，因此很难在平板中对阳性突变株进行筛选区分。另一方面，由于Nonomuraea的修饰限制系统作用较强，也造成了外源基因的转化效率极低，从而造成基因打靶失败，构建突变株难度较大。目前，基于CRISPR/Cas9的基因编辑技术已经应用于包括链霉菌在内的多种微生物中，单质粒CRISPR/Cas9-codA(sm)系统是其中一种。它包含了化脓链球菌Cas9基因，靶向特异性sg-RNA，另外codA(sm)作为一种有效的反选择方法可以辅助打靶质粒的丢失，提高获得突变株的效率。但是，目前在稀有放线菌Nonomuraea中尚没有成功案例。
发明内容
针对上述现有技术，本发明基于CRISPR/Cas9基因打靶系统实现了内源核糖体结合位点和外源启动子的联合，构建了附加lRBS的微生物次级代谢产物强化启动系统；然后联合孢子种间结合转移，提高了阳性突变株得率，从而显著提高了微生物次级代谢产物的产量。
本发明的第一方面，提供一种具有sRBS的强启动子kasO*P系统，包括：
含有SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的特异性sg-RNA序列的CRISPR/Cas9基因编辑载体，以及构建于所述CRISPR/Cas9基因编辑载体中的启动子盒；所述启动子盒包含上游同源臂、kasO*P和下游同源臂；所述kasO*P的序列如SEQ ID NO.15所示。
进一步的，所述上游同源臂由SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的引物扩增得到；所述下游同源臂由SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的引物扩增得到。
本发明的第二方面，提供一种含有dRBS的微生物次级代谢产物强化启动系统，包括：
含有SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的特异性sg-RNA序列的CRISPR/Cas9基因编辑载体，以及构建于所述CRISPR/Cas9基因编辑载体中的启动子盒；所述启动子盒包含上游同源臂、kasO*P和下游同源臂；所述kasO*P的序列如SEQ ID NO.15所示。
进一步的，所述上游同源臂由SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的引物扩增得到；所述下游同源臂由SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的引物扩增得到。
上游同源臂和下游同源臂的作用是将启动子kasO*P通过同源重组的方法整合入待启动的代谢产物基因簇上游的特定位置。上游同源臂和下游同源臂的序列根据待启动的目标代谢产物的基因簇序列来确定。
需要说明的是，上述具有sRBS的强启动子kasO*P系统和含有dRBS的微生物次级代谢产物强化启动系统，是基于CRISPR/Cas9基因打靶系统在微生物次级代谢产物合成基因簇(BGC)的上游直接整合入具有sRBS的强启动子kasO*P，或者将内源性RBS与来源于外源性强启动子中的RBS相结合，从而形成双重RBS。因此，上述具有sRBS的强启动子kasO*P系统和含有dRBS的微生物次级代谢产物强化启动系统是基于同一发明构思所设计的。
本发明的第三方面，提供上述具有sRBS的强启动子kasO*P系统和/或含有dRBS的微生物次级代谢产物强化启动系统在如下1)或2)中的应用：
1)提高微生物次级代谢产物中某一特定产物的产量；
2)提高微生物次级产物的总产量。
优选的，所述微生物为稀有放线菌Nonomuraea。
本发明的第四方面，提供一种提高稀有放线菌Nonomuraea对外源基因的转化效率及阳性突变株得率的方法，包括以下步骤：
(1)稀有放线菌Nonomuraea孢子的生成及收集：
将稀有放线菌Nonomuraea菌株接种至AM液体培养基中，培养，获得新鲜的菌丝体；将新鲜的菌丝体涂布至晾干的产孢子培养基中，28-32℃培养8-10天，生长出孢子；将孢子刮下后悬浮于灭菌的2×YT中，反复涡旋震荡冲洗后，除去菌丝体，获得孢子；
(2)CRISPR/Cas9介导的外源基因的导入及阳性突变株的获得：
将以CRISPR/Cas9-codA(sm)为骨架的基因编辑载体导入到大肠杆菌中，然后在LB培养基中活化培养至OD600为0.4-0.6；
将步骤(1)收集的孢子进行热激处理后和活化培养后的大肠杆菌混合，混合后涂在新鲜的含有10mM MgSO4的MS培养基平板上，28-32℃培养16-18h，待长出菌落后，用1mL含有安普霉素抗性的无菌水覆盖表面，28-32℃继续培养6-8天，对接合转移子进行筛选，获得阳性突变株。
优选的，所述热激处理的温度为50℃、热激处理时间为10min。
优选的，步骤(1)中，所述AM液体培养基中含有：可溶性淀粉2.0％，酵母提取物0.5％，牛肉提取物0.3％，胰蛋白酶0.5％，CaCO3 0.2％，CoCl2 0.0001％，MgSO4·7H2O0.05％；均为质量百分比；pH 7.2。
优选的，步骤(1)中，所述产孢子培养基中含有：葡萄糖1.0％，NaCl 0.5％，酵母提取物0.1％，麦芽提取物0.2％，CaCO3 0.2％，琼脂2.0％；均为质量百分比；pH 7.2。
优选的，步骤(1)中，所述2×YT含有：蛋白胨1.6％，酵母提取物1％，NaCl 0.5％，均为质量百分比；pH＝7.0。
本发明的第五方面，提供一种提高微生物次级代谢产物产量的方法，包括以下步骤：
将上述具有sRBS的强启动子kasO*P系统或者含有dRBS的微生物次级代谢产物强化启动系统转化至野生稀有放线菌Nonomuraea内，获得阳性突变菌株；
将阳性突变菌株进行发酵培养，获得次级代谢产物，所述次级代谢产物的产量高于野生稀有放线菌Nonomuraea发酵培养所获得的次级代谢产物的产量。
优选的，发酵培养所采用的培养基的组成为：葡萄糖3.0％，可溶性淀粉6.0％，玉米粉0.3％，棉花种子粉0.6％，酵母提取物0.3％，大豆粉2.0％，(NH4)2SO4 0.1％，CaCO30.3％，K2HPO4 0.1％，MgSO4·7H2O 0.86％，CaCl2 0.01％，FeSO4 0.001％，CoCl2·6H2O0.01％，L-Valine 0.05％；均为质量百分比。
优选的，所述发酵培养的条件为：30℃，220rpm，振荡培养8天。
本发明的有益效果：
(1)本发明通过将内源核糖体结合位点和外源启动子联合后，形成了含有dRBS的微生物次级代谢产物强化启动系统，显著提高了微生物次级代谢产物的产量。
(2)本发明对稀有放线菌Nonomuraea培养基成分和培养条件进行了优化，解决了其难以产生孢子的技术问题，成功获得了丰富的孢子，从而使稀有放线菌Nonomuraea以孢子为材料的外源基因的导入方法得以实施。
(3)本发明采用孢子与CRISPR/Cas9技术联合策略实现了稀有放线菌Nonomuraea体内的高效基因编辑，解决了稀有放线菌Nonomuraea由于修饰限制系统作用强所导致的外源基因转化效率极低、产生阳性突变株少的难题。由于孢子与大肠杆菌菌株作用后，接合转移子在筛选平板中易于分离得到；应用CRISPR/Cas9技术打靶定向准确，阳性重组子得率高，基因正确编辑的效率达80％以上。
附图说明
图1：sRBS启动系统和dRBS强启动系统的示意图。
图2：具有sRBS的强启动子kasO*P系统的构建示意图。
图3：含有dRBS的微生物次级代谢产物强化启动系统的构建示意图。
图4：稀有放线菌Nonomuraea野生菌株和突变菌株中主要的次级代谢产物compA和总代谢产物compT的产量变化比较。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
正如背景技术部分所介绍的，由于次级代谢产物不是细胞生长必须的，进化过程中，细胞产生的次级代谢产物的产量只需满足其特殊的生理功能，产量较低。在工业生产时，这种低产量远不能达到产业化要求。
启动子工程已经成为激活沉默的次级代谢产物生物合成基因簇和发现新的天然产物的重要技术。其中kasO*P是一种简单而明确的强工程启动子，其对链霉菌的代谢产物基因簇过表达十分有效，在各种链霉菌宿主的转录和蛋白水平上都表现出良好的活性，并且成功地在激活了多种次级代谢产物合成基因簇和其相关酶。但目前在稀有放线菌Nonomuraea中，关于启动子工程技术并没有广泛应用。
基于此，在本发明的一种实施方案中，通过在稀有放线菌Nonomuraea中代谢产物compA的合成基因簇上游直接整合入具有sRBS的强启动子kasO*P(如图1所示)，改善了在野生型菌株(wildtype，简称WT)中次级代谢产物compA以及总产代谢物compT产量较低的现状。其次，通过整合代谢产物合成基因簇中的lRBS对启动子工程设计进行优化，设计了dRBS的微生物次级代谢产物强化启动系统(如图1所示)，RBS的质量以及总RBS的数量均有助于增强产物合成基因簇的翻译表达，对产量的提高有很大的帮助。
特别是利用代谢产物合成基因簇的lRBS和外源具有sRBS的强启动子kasO*P同时对次级代谢产物的生物合成发挥作用，将两者整合构建了dRBS的微生物次级代谢产物强化启动系统，这一系统能够有效地加强微生物次级代谢产物合成基因簇的启动效果，对比野生型菌株相对较弱的次级代谢产物生产能力，该合成基因簇强启动系统可以显著地提高次级代谢产物的产量。
但是，由于稀有放线菌Nonomuraea产生孢子的能力较差，通常利用菌丝体与大肠杆菌进行接合作用，实现外源基因的转化从而获得突变株。然而，由于接合转移子与死亡的菌丝体形态相似，很难在平板中对其进行筛选区分；另外，由于Nonomuraea的修饰限制系统作用较强，也造成了外源基因转化效率极低，因此产生阳性突变株较少；从而造成基因编辑效率极低，导致打靶失败。
基于此，在本发明的又一种实施方案中，首先，通过对稀有放线菌Nonomuraea培养基成分和培养条件的优化，解决了其难以产生孢子的技术问题，成功获得了丰富的孢子，使得以孢子为材料的外源基因的导入方法得以实施，为实现外源基因的高效转化提供了材料基础。其次，创新性地将CRISPR/Cas9基因编辑技术成功建立于稀有放线菌Nonomuraea中，利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术与孢子体联合作用的方法，有效地避免了接合转移子与死亡菌丝体表型相似、难识别、难筛选且接合转移子得率极低的种种问题；同时，提高了阳性突变株的得率，实现了对稀有放线菌Nonomuraea基因的定向打靶，最终有效提高了基因编辑的效率。
综上，本发明利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术与稀有放线菌Nonomuraea孢子相结合的手段，在代谢产物合成基因簇上游设计整合lRBS和外源具有sRBS的强启动子kasO*P的启动子工程，这两种创新型技术手段解决了目前已有技术中对于稀有放线菌Nonomuraea基因编辑效率较低，以及次级代谢产物产量低的问题。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。
本发明中所用到的序列如下：
基因编辑中sg-RNA先导序列：
SEQ ID NO.1：GACCGCGCTCAGGAAGGGCAGTTTT
SEQ ID NO.2：TGCCCTTCCTGAGCGCGGTCGCTGG
SEQ ID NO.3：GTCATTTAAGTGGGTTAGCTGTTTT
SEQ ID NO.4：AGCTAACCCACTTAAATGACGCTGG
PCR方法验证突变株所用引物序列：
SEQ ID NO.5：ACTAGTTGTTCACATTCGAACGGTCT
SEQ ID NO.6：AACTCCCCCAGTCCTGCA
SEQ ID NO.7：GCTTGCGGCAGCGTGAAGCTTCGTCCTGGTCGGCGAAC
SEQ ID NO.8：CGTGCAGGACTGGGGGAGTTGTGGGTTTAATTTCTGCTGC
SEQ ID NO.9：CGTGCAGGACTGGGGGAGTTGGGGGATTCGTGGGTTTAA
SEQ ID NO.10：TTCGAATGTGAACAACTAGTCAAGGCAACACGATGTGCG
SEQ ID NO.11：TTCGAATGTGAACAACTAGTCTTGCCAAGGGGCCCTGA
SEQ ID NO.12：GACCTGCAGGCATGCAAGCTTCCGGACCGGCCGAAGAA
SEQ ID NO.13：GTCGTCCCAGCAAACGTCG
SEQ ID NO.14：AGCCCTGTAATCGCCAGGC
kasO*P序列：
SEQ ID NO.15：
TGTTCACATTCGAACGGTCTCTGCTTTGACAACATGCTGTGCGGTGTTGTAAAGTCGTGGCCAGGAGAATACGACAGCGTGCAGGACTGGGGGAGTT
实施例1：具有sRBS的强启动子kasO*P的构建
(1)使用生物信息学分析软件Glimmer对目标代谢产物BGC中的开放阅读框(ORFs)进行分析预测，然后利用BLASTp分析基因簇中每一个基因的功能，定位目标代谢产物BGC中合成起始基因的起始位点。
(2)利用CasOT软件在合成起始基因的起始位点上游附近寻找目的打靶的特异性20bp sg-RNA序列并体外合成。
(3)通过BaeⅠ限制酶酶切位点将目标基因的特异性sg-RNA序列(见序列表SEQ IDNO.1，SEQ ID NO.2)克隆进入CRISPR/Cas9基因编辑载体中。
(4)通过PCR分别扩增获得打靶基因的上游同源臂(扩增引物序列见序列表SEQ IDNO.7，SEQ ID NO.8)、下游同源臂(引物序列见序列表SEQ ID NO.9，SEQ ID NO.10)和启动子基因kasO*P(引物序列见序列表SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.6)。
(5)采用重叠PCR方法组装含有上游同源臂、kasO*P(见序列表SEQ ID NO.15)和下游同源臂的启动子盒，然后通过同源重组融合方法将其构建于上述含有特异性sg-RNA序列的CRISPR/Cas9基因编辑载体中。如图2所示。
实施例2：含有dRBS的微生物次级代谢产物强化启动系统的构建
(1)利用信息学手段来确定lRBS位点，在mRNA的起始密码子上游约8-13核苷酸处，存在一段由4-9个核苷酸组成的共有序列AGGAGG；
(2)利用CasOT软件在合成起始基因的lRBS位点上游附近寻找目的打靶的特异性20bp sg-RNA序列并体外合成；
(3)通过BaeⅠ限制酶酶切位点将目标基因的特异性sg-RNA序列(见序列表SEQ IDNO.3，SEQ ID NO.4)克隆进入CRISPR/Cas9基因编辑载体中；
(4)通过PCR分别扩增获得打靶基因的上游同源臂(引物序列见序列表SEQ IDNO.11，SEQ ID NO.12)、下游同源臂(引物序列见序列表SEQ ID NO.13，SEQ ID NO.14)和启动子基因kasO*P(引物序列见序列表SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.6)；
(5)采用重叠PCR方法组装含有上游同源臂、kasO*P(见序列表SEQ ID NO.15)和下游同源臂的启动子盒，然后通过同源重组融合方法将其构建于上述含有特异性sg-RNA序列的基因组编辑载体中。如图3所示。
实施例3：孢子-CRISPR/Cas9联合基因编辑策略
(1)稀有放线菌Nonomuraea孢子生成及收集
①将稀有放线菌Nonomuraea菌株从甘油保藏管中接种至AM液体培养基(可溶性淀粉2.0％，酵母提取物0.5％，牛肉提取物0.3％，胰蛋白酶0.5％，CaCO3 0.2％，CoCl20.0001％，MgSO4·7H2O 0.05％；pH 7.2)中，30℃培养36h，获得新鲜的菌丝体；
②配制优化好的产孢子培养基(葡萄糖1.0％，NaCl 0.5％，酵母提取物0.1％，麦芽提取物0.2％，CaCO3 0.2％，琼脂2.0％，pH 7.2)，为了尽可能产生更多的孢子，培养基平板使用前需要室温晾置24h；目的是将平板多余水分晾干，使微生物生长环境中湿度不是很大，易于孢子的形成。
③将新鲜的菌丝体涂布至晾干的产孢子培养基中，30℃培养8-10天直至获得丰富的孢子；
④将平板中的孢子用刮刀刮下来，悬浮于灭菌的2×YT(蛋白胨1.6％，酵母提取物1％，NaCl 0.5％，pH＝7.0)中，反复涡旋震荡冲洗后，用棉花过滤装置除去菌丝体，获得孢子。
(2)CRISPR/Cas9介导的外源基因的导入及其阳性突变株的获得。
①将已经构建的以CRISPR/Cas9-codA(sm)为骨架的基因编辑载体导入到大肠杆菌ET12567/pUZ8002中，然后在LB培养基(蛋白胨1.0％，酵母提取物0.5％，NaCl 1.0％，PH＝7.4)中将其活化培养至OD600为0.4-0.6；
②将大肠杆菌细胞和Nonomuraea的孢子以不同比例混合，混合物涂在新鲜的含有10mM MgSO4的MS培养基(2.0％大豆粉，2.0％甘露醇，10mM MgCl2，2.0％琼脂)平板上后，在30℃下培养16-18h；
③用1毫升含有安普霉素和萘啶酮酸的无菌水覆盖平板表面，然后在30℃下培养直至出现接合子；
④挑取单个接合子，在含有50-250μg/mL的5-氟胞嘧啶(5FCR)平板上划线后，在30℃黑暗培养3-4天；
⑤将出现在含有5FCR平板上的阳性菌落分别在含有和不含有安普霉素的平板上影印培养，以确认质粒丢失情况；
⑥挑取安普霉素敏感突变株进行验证，通过PCR以及测序鉴定基因组编辑突变体的正确性。
在所筛选的20个接合转移子中有16为阳性重组子，基因正确编辑的效率高达80％。
实施例4：野生菌株及其突变菌株代谢产物产量的检测
1.试验方法：
①分别按实施例1和实施例2的方法构建强化启动系统，然后按实施例3的方法将构建的强化启动系统转化至稀有放线菌Nonomuraea野生型菌株中，CRISPR/Cas9-codA(sm)为骨架的基因编辑载体进入野生型菌株体内后，和基因组进行了同源重组交换，使得启动子插入基因组中次级代谢产物基因簇前面的指定位置中，构建得到整合有具有sRBS的强启动子kasO*P的突变菌株(sRBS)或整合有含有dRBS的微生物次级代谢产物强化启动系统的突变菌株(dRBS)。
将稀有放线菌Nonomuraea野生菌株(WT)以及整合有具有sRBS的强启动子kasO*P的突变菌株(sRBS)、整合有含有dRBS的微生物次级代谢产物强化启动系统的突变菌株(dRBS)，分别在AM液体培养基中培养，温度为30℃，转速为220rpm，震荡培养48h后获得种子液；
②将上述种子液接种于50毫升发酵培养基(葡萄糖3.0％，可溶性淀粉6.0％，玉米粉0.3％，棉花种子粉0.6％，酵母提取物0.3％，大豆粉2.0％，(NH4)2SO4 0.1％，CaCO30.3％,K2HPO4 0.1％，MgSO4·7H2O 0.86％，CaCl2 0.01％，FeSO4 0.001％，CoCl2·6H2O0.01％，L-Valine 0.05％)中，30℃，220rpm，振荡培养8天；
③以甲醇为萃取剂，对发酵液上清和菌丝体中含有的代谢产物同时进行萃取分离；
④将萃取物经0.22μm滤膜过滤后进行高效液相色谱分析，采用YMC-Pack ODS-A柱(5μm，4.6×250mm，日本)，分别在215和285nm处进行紫外检测，流动相为40％乙腈-水溶液，缓冲液为20mM磷酸钠(pH8.0)；
⑤并使用高效液相色谱分析仪器(Agilent 1290液相系统)对代谢产物的产量进行分析。
2.试验结果：
试验结果如图4所示，结果表明：在突变菌株sRBS中，主要的代谢产物compA的产量为野生型菌株的1.97倍，总代谢产物compT的产量为野生型菌株的1.45倍，改善了在野生型菌株中次级代谢产物compA以及总产代谢物compT产量较低的现状。
在突变菌株dRBS中，次级代谢产物compA的产量为野生型菌株的4.25倍，总代谢产物compT的产量为野生型菌株的1.66倍。值得注意的是，次级代谢产物compA和总代谢产物compT的产量比在只含有外源强启动子的突变菌株sRBS中分别提高了2.33倍和0.21倍。
综上，加入靶基因基因簇中的内源RBS有助于启动子工程中的基因翻译表达水平的提高，从而进一步提高代谢产物的产量。通过整合代谢产物合成基因簇中的lRBS对启动子工程设计进行优化，在代谢产物的生物合成基因簇上游构建了整合有lRBS和外源启动子联合后的dRBS强化启动系统重组菌株dRBS。因此，加入lRBS有助于增强产物合成基因簇的翻译表达，对代谢产物产量的提高有很大的帮助。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
序列表
<110> 陕西师范大学
<120> CRISPR / Cas9介导的附加内源RBS的微生物次级代谢产物强化启动系统
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaccgcgctc aggaagggca gtttt 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgcccttcct gagcgcggtc gctgg 25
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtcatttaag tgggttagct gtttt 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agctaaccca cttaaatgac gctgg 25
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
actagttgtt cacattcgaa cggtct 26
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aactccccca gtcctgca 18
<210> 7
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gcttgcggca gcgtgaagct tcgtcctggt cggcgaac 38
<210> 8
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cgtgcaggac tgggggagtt gtgggtttaa tttctgctgc 40
<210> 9
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cgtgcaggac tgggggagtt gggggattcg tgggtttaa 39
<210> 10
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ttcgaatgtg aacaactagt caaggcaaca cgatgtgcg 39
<210> 11
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ttcgaatgtg aacaactagt cttgccaagg ggccctga 38
<210> 12
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gacctgcagg catgcaagct tccggaccgg ccgaagaa 38
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gtcgtcccag caaacgtcg 19
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
agccctgtaa tcgccaggc 19
<210> 15
<211> 97
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tgttcacatt cgaacggtct ctgctttgac aacatgctgt gcggtgttgt aaagtcgtgg 60
ccaggagaat acgacagcgt gcaggactgg gggagtt 97

Claims (3)

1.含有dRBS的微生物次级代谢产物强化启动系统在提高稀有放线菌Nonomuraea的次级代谢产物中ecumicin的产量中的应用；其特征在于，
所述含有dRBS的微生物次级代谢产物强化启动系统由如下方法构建而成：
(1)利用信息学手段来确定lRBS位点，在mRNA的起始密码子上游8-13核苷酸处，存在一段由4-9个核苷酸组成的共有序列AGGAGG；
(2)利用CasOT软件在合成起始基因的lRBS位点上游附近寻找目的打靶的特异性20bpsg-RNA序列并体外合成；
(3)通过BaeⅠ限制酶酶切位点将目标基因的特异性sg-RNA序列克隆进入CRISPR/Cas9基因编辑载体中；所述特异性sg-RNA序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示；
(4)通过PCR分别扩增获得打靶基因的上游同源臂、下游同源臂和启动子基因kasO*P；
所述上游同源臂由SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的引物扩增得到；所述下游同源臂由SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的引物扩增得到；所述启动子基因kasO*P由SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6所示的引物扩增得到；
(5)采用重叠PCR方法组装含有上游同源臂、kasO*P和下游同源臂的启动子盒，然后通过同源重组融合方法将其构建于步骤(3)的含有特异性sg-RNA序列的基因组编辑载体中。
2.一种提高微生物次级代谢产物ecumicin产量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将含有dRBS的微生物次级代谢产物强化启动系统转化至野生稀有放线菌Nonomuraea内，获得阳性突变菌株；
将阳性突变菌株进行发酵培养，获得次级代谢产物，所述次级代谢产物的产量高于野生稀有放线菌Nonomuraea发酵培养所获得的次级代谢产物ecumicin的产量；
发酵培养所采用的培养基的组成为：葡萄糖3.0％，可溶性淀粉6.0％，玉米粉0.3％，棉花种子粉0.6％，酵母提取物0.3％，大豆粉2.0％，(NH4)2SO4 0.1％，CaCO3 0.3％,K2HPO40.1％，MgSO4·7H2O 0.86％，CaCl2 0.01％，FeSO4 0.001％，CoCl2·6H2O 0.01％，L-Valine 0.05％；
所述含有dRBS的微生物次级代谢产物强化启动系统由如下方法构建而成：
(1)利用信息学手段来确定lRBS位点，在mRNA的起始密码子上游8-13核苷酸处，存在一段由4-9个核苷酸组成的共有序列AGGAGG；
(2)利用CasOT软件在合成起始基因的lRBS位点上游附近寻找目的打靶的特异性20bpsg-RNA序列并体外合成；
(3)通过BaeⅠ限制酶酶切位点将目标基因的特异性sg-RNA序列克隆进入CRISPR/Cas9基因编辑载体中；所述特异性sg-RNA序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示；
(4)通过PCR分别扩增获得打靶基因的上游同源臂、下游同源臂和启动子基因kasO*P；
所述上游同源臂由SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的引物扩增得到；所述下游同源臂由SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的引物扩增得到；所述启动子基因kasO*P由SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6所示的引物扩增得到；
(5)采用重叠PCR方法组装含有上游同源臂、kasO*P和下游同源臂的启动子盒，然后通过同源重组融合方法将其构建于步骤(3)的含有特异性sg-RNA序列的基因组编辑载体中。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵培养的条件为：30℃，220rpm，振荡培养8天。
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