KR20230108128A - 신규 타이로시네이즈 효소 및 이를 이용한 에리오딕티올의 생산 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규한 타이로시네이즈 효소에 관한 것으로서, 바실러스(Bacillus) 속 미생물로부터 분리된 서열번호 1의 아미노산 서열, 또는 서열번호 1과 90% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 타이로시네이즈 효소 및 이를 암호화 하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 타이로시네이즈 효소는 종래의 효소들에 비해 고온에 안정성이 있고 높은 수율의 에리오딕티올을 생산할 수 있는 장점이 있다.

Description

신규 타이로시네이즈 효소 및 이를 이용한 에리오딕티올의 생산 방법 {Novel tyrosinase enzyme and producing method of eriodictyol using the same}

본 발명은 신규한 타이로시네이즈 효소에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 바실러스(Bacillus) 속 미생물 유래의 타이로시네이즈 및 그의 응용에 관한 것이다.

생체촉매(biocatalyst)는 다양한 화학 반응을 촉매할 수 있는 정제된 효소 및 전세포(whole cells)와 같은 생물학적 시스템이다. 효소는 광범위한 분자를 기질로 받아들일 수 있으며, 광범위한 범위의 화학 물질에 대해 높은 촉매 활성을 나타내기 때문에 화학물질의 합성, 바이오센서 및 환경 정화 분야에서 생체촉매로 활용된다. 특히, 효소를 이용한 생물전환 기술은 기존의 화학합성법으로는 합성하기 어려운 입체특이적(stereoselectivity) 및 위치특이적(regioselectivity) 반응을 촉매하여 친환경적으로 고순도의 화학물질을 생산할 수 있다.

이러한 생체촉매 중 타이로시네이즈(tyrosinase)는 활성 부위(active site)에 구리를 함유하고 있는 type-3 구리 효소(monophenol monooxygenase, EC. 1.14.18.1)이며, 미생물, 식물, 동물 등 자연상에 널리 분포되어 있다. 타이로시네이즈는 멜라닌 생합성의 초기단계인 L-타이로신(L-tyrosine)을 L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA)로 전환하고 L-DOPA를 도파퀴논(dopaquinone)으로 변환하는 촉매이며, 반응성이 높은 도파퀴논은 자연적으로 멜라닌으로 전환되며 피부 색소 침착과 과일 및 채소의 갈변에 관여한다.

타이로시네이즈는 상온, 상압의 조건에서 다양한 페놀화합물의 산화 반응을 촉매하며, 이어지는 일련의 산화에 의한 가교반응(cross-linking)에 관여한다. 따라서 타이로시네이즈는 단백질 및 당의 가교, 페놀화합물을 포함하는 오염수의 정화, 페놀화합물의 양을 측정하기 위한 바이오센서뿐만 아니라 페놀화합물 유래 건강 보조 식품, 건강 기능성 식품, 의약품 및 생체재료 등의 생산에 활용될 수 있다.

타이로시네이즈를 기능성 페놀화합물을 생산하기 위한 생체촉매로도 활용할 수 있다. 이를 위해서는 기존 타이로시네이즈의 활성과 기질 특이성 향상 및 추가 산화반응을 억제하여 멜라닌 합성을 차단하는 방법이 요구된다. 이를 해결하기 위해 site-directed 및 random mutagenesis를 사용한 단백질 공학이 시도되었으며, 카테콜, glutathione(GSH), nicotinamide adenine dinucleotide(NADH) 및 아스코르브산 등을 사용하여 타이로시네이즈의 두 번째 산화반응 또는 멜라닌 합성을 억제하는 연구가 진행되고 있다.

현재, 상업적으로 이용 가능한 타이로시네이즈는 simga-aldrich(미국) 회사의 버섯(Agaricus bisporus) 유래 타이로시네이즈가 대표적이며, 버섯에서 직접 효소를 정제해서 제공한다. simga-aldrich에서 구입 가능한 타이로시네이즈는 버섯 원물의 차이에 따라 활성이 일정하지 않으며, 정제 후 laccase, β-glucosidase, β-xylosidase, cellulase, chitinase 또는 xylanase 활성이 남아 있어 산업적 적용이 어렵다. 따라서 고순도 페놀화합물 생산을 위해 산업적으로 적용 가능한 효소활성이 일정하고 불순물이 없는 형태의 타이로시네이즈의 개발이 요구된다.

한편, 타이로시네이즈의 활성과 관련하여, 페놀화합물에서 카테콜화합물로 전환시키는 반응속도보다 카테콜화합물에서 퀴논화합물로 전환시키는 두 번째 산화반응의 속도가 현저히 빠르고, 퀴논화합물에서 멜라닌으로의 전환이 급속도로 이루어지기 때문에, 타이로시네이즈를 생체촉매로 활용하여 목적하는 페놀화합물을 특이적으로 생산하기 위해서는 타이로시네이즈의 산화반응 속도와 멜라닌 합성을 제어하는 기술이 요구된다.

기능성 페놀화합물로서 대표적으로 플라보노이드(flavonoids)를 들 수 있다. 플라보노이드는 과일, 채소 및 천연물 의약품을 포함한 거의 모든 식물에서 발견되는 페놀화합물로, 5000가지가 넘는 플라보노이드가 알려져 있으며 플라보놀(flavonols), 플라본(flavones), 이소플라본(isoflavones), 플라보논(flavanones), 안토시아니딘(anthocyanidins), 그리고 플라바놀(flavanol)로 나눌 수 있다. 그 중, 에리오딕티올(eriodictyol)은 유자를 포함한 감귤류뿐만 아니라 여러 식물에서 발견되는 플라보노이드로서, 플라보논 구조를 갖는다. 에리오딕티올은 항산화, 항염증, 항암, 항비만 효과뿐만 아니라 당뇨병에서 망막보호, 혈장 지질 과산화를 억제하는 효과가 있다고 보고되어 있다.

이처럼 유익한 효과를 지닌 에리오딕티올을 식품첨가물, 건강 보조 식품, 건강 기능성 식품, 의약품, 화장품 및 바이오소재 등에 활용하기 위해 에리오딕티올의 합성 또는 식물 원물로부터의 추출이 필요하다. 복잡한 구조의 폴리페놀화합물인 에리오딕티올은 화학적 방법으로 생산하기 어려우며, 식물 원료에서 추출할 경우 수득율이 낮거나 원료의 수급과 원물의 차이에 따라 수득율이 상이할 수 있고, 단일물질로 정제하기 어려울 수 있다. 따라서 에리오딕티올의 산업적 활용을 위해 고순도의 에리오딕티올을 제공하는 기술이 요구된다.

본 발명에서는, 열 안정성이 우수한 신규 타이로시네이즈를 제공하고 이를 이용하여 화학적으로 합성되기 어려운 플라보노이드 및 그 대사산물을 선택적으로 생산할 수 있는 기술을 제공한다.

상기 과제를 위해, 본 발명에서는 서열번호 1의 아미노산 서열, 또는 서열번호 1과 90% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하며 고온에서 매우 안정적인 타이로시네이즈 효소를 제공다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 타이로시네이즈 효소는 L-타이로신 및 3,4 Dihydroxy L phenylalanine(L-DOPA)를 기질로 하는 것일 수 있다.

본 발명은 또한 서열번호 2의 염기서열로 이루어지며, 본 발명의 신규한 타이로시네이즈 효소를 암호화하는 유전자를 제공한다.

본 발명은 또한 본 발명의 신규한 타이로시네이즈 효소를 유효성분으로 포함하는, 에리오딕티올 생산용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 에리오딕티올 생산용 조성물을 인-비트로(in vitro)에서 나린제닌(naringenin)과 반응시킨 반응 생산물로부터 에리오딕티올을 회수함으로써 에리오딕티올을 생산할 수 있다.

본 발명은 또한, 타이로시네이즈 효소를 생산하는 방법을 제공한다. 구체적으로는, 서열번호 3, 4의 프라이머 쌍을 이용하여 바실러스속 미생물로부터 서열번호 2의 염기서열을 가지는 유전자를 제조하는 단계, 상기 유전자를 PCR로 증폭시키는 단계, 상기 PCR로 증폭시킨 산물을 이용하여 재조합 발현벡터를 제조하는 단계, 상기 재조합 발현벡터를 숙주에 형질전환하는 단계, 상기 형질전환된 형질전환체를 배양하여 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 타이로시네이즈 효소의 과발현을 유도하는 단계, 및 상기 과발현된 타이로시네이즈 효소를 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 타이로시네이즈 효소의 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 바실러스속 미생물은 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium)인 것이 바람직하다.

본 발명의 신규한 타이로시네이즈 효소를 포함한 조성물을 이용하여 나린제닌으로부터 에리오딕티올을 생산함에 있어, 독성물질이나 환경오염을 유발하는 부산물이 발생하지 않으므로, 친환경적으로 에리오딕티올을 제조할 수 있다.

또한, 본 발명의 신규 타이로시네이즈 효소를 포함한 조성물은 에리오딕티올을 특이적으로 생산할 수 있는 공정상의 장점이 있다.

또한, 본 발명의 신규 타이로시네이즈 효소는 특이적으로 정제 가능하고 고온안정적이므로 시중의 버섯 유래 타이로시네이즈의 대안이 될 수 있다.

또한, 본 발명의 신규 타이로시네이즈 효소를 이용한 생물전환 기술은 고가의 보조효소가 요구되지 않으므로 에리오딕티올을 포함한 페놀화합물 유도체 제조 시 경제적이며 산업적 적용이 용이하다.

또한, 본 발명의 신규 타이로시네이즈 효소는 인체에 직접적으로 적용 가능한 페놀화합물을 포함하는 식품첨가물, 건강보조식품, 건강 기능성 식품, 의약품, 화장품, 농약 및 바이오소재 등의 생산과 멜라닌 합성, 페놀화합물 검출을 위한 바이오센서뿐만 아니라 오염수로부터 독성 페놀화합물을 제거하는데 활용될 수 있는 효과가 있다.

도 1은 형질전환체에서 과발현되어 정제 및 분리된 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 SDS-PAGE로 확인한 사진이다.
도 2는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질이 타이로시네이즈 효소로서의 활성을 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 효소 활성에 영향을 미치는 pH의 영향을 확인한 그래프이다.
도 4는 시중에서 판매되는 타이로시네이즈와 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 효소 활성에 영향을 미치는 온도의 영향을 비교한 그래프이다.
도 5는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 이용해 나린제닌으로부터 에리오딕티올의 생산을 나타내는 크로마토그램이다.

본 발명의 일 측면은 서열번호 1의 아미노산 서열, 또는 서열번호 1과 90% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 타이로시네이즈 효소를 제공한다.

또한, 본 발명의 다른 측면은 상기 타이로시네이즈 효소를 암호화하는 타이로시네이즈 효소의 유전자를 제공한다.

본 발명의 타이로시네이즈 효소는 바실러스(Bacillus) 속 미생물로부터 유래한 것일 수 있고, 특히 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium)으로부터 유래한 것이 바람직하다.

본 발명의 타이로시네이즈 효소는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 타이로시네이즈 효소는 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서, 아미노산 잔기의 결실, 삽입, 치환 또는 이들의 조합에 의해서 상이한 서열을 가지는 아미노산의 변이체들, 또는 단편들을 포함할 수 있다. 상기 타이로시네이즈 효소의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드 수준에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 변형될 수 있다. 따라서 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 포함한다.

상기 실질적으로 동일한 단백질이란 90％ 이상, 바람직하게는 93％ 이상, 가장 바람직하게는 95％이상의 아미노산 서열의 상동성을 갖는 것들을 의미하나 이에 한정되지 않으며, 90% 이상의 아미노산 서열의 상동성을 가지며 동일한 효소 활성을 가진다면 본 발명의 범위에 포함된다.

본 발명의 타이로시네이즈 효소를 암호화하는 유전자는 서열번호 2의 염기 서열로 이루어진 것이 바람직하다. 그러나 본 발명의 타이로시네이즈 효소 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 유전자는 암호화 영역으로부터 발현되는 상기 효소 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 암호화 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 암호화 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변이가 이루어질 수 있으며, 이러한 변이 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명은 서열번호 2의 유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열로 이루어진 유전자, 및 상기 유전자의 단편을 포함한다.

상기 실질적으로 동일한 염기서열로 이루어진 유전자란 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 가장 바람직하게는 95％ 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 80% 이상의 서열 상동성을 가지며 암호화된 단백질이 동일한 효소 활성을 가진다면 본 발명에 포함된다. 상기와 같이, 본 발명의 타이로시네이즈 효소의 유전자는 이와 동등한 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 한, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 이들 또한 본 발명의 범위에 포함된다.

상기 타이로시네이즈 효소에 포함되는 서열번호 1의 아미노산 서열은 바람직하게는 서열번호 2의 염기 서열로 이루어진 유전자에 의해 암호화되나, 본 발명은 이에 한정되지 않고, 동일 아미노산 서열을 갖는 본 발명의 단백질을 암호화할 수 있는 한, 서열번호 2의 염기 서열과 실질적으로 동일한 다른 염기 서열로 이루어진 유전자에 의해 암호화될 수도 있다. 이러한 염기 서열은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있으며, DNA 분자 또는 RNA 분자일 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에서, 본 발명자들은 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium)에서 유래한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 기능을 규명하기 위하여, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 분리 및 정제하였고(도 1 참고), 그 활성을 연구한 결과 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질이 타이로시네이즈 효소로서의 활성을 가진다는 것을 확인하였다(도 2 참고).

본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 타이로시네이즈 효소의 유전자가 포함된 재조합 발현 벡터 및 상기 발현 벡터가 도입된 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 재조합 발현 벡터는 상기 타이로시네이즈 효소의 유전자를 포함한다.

상기 발현 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파이지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

상기 재조합 발현 벡터는 본 발명의 타이로시네이즈 효소를 생산하고자하는 숙주 세포의 종류에 따라 프로모터(promoter), 터미네이터(terminator), 인핸서(enhancer) 등과 같은 발현조절서열, 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 목적에 따라 조합할 수 있다.

상기 발현 벡터는 벡터가 도입된 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 추가로 포함할 수 있고, 복제 가능한 발현 벡터인 경우 복제 기원을 포함할 수 있다.

또한, 상기 재조합 발현 벡터는 발현 단백질의 정제를 용이하게 하기 위한 서열을 포함할 수 있으며, 구체적으로 본 발명의 타이로시네이즈 효소를 암호화하는 유전자에 작동 가능하도록 분리정제용 태그를 암호화하는 유전자가 연결될 수 있다. 이때, 상기 분리정제용 태그는 GST, poly-Arg, FLAG, 히스티딘-태그(His-tag) 및 c-myc 등이 단독으로 사용되거나 이들 중 두 개 이상을 순차적으로 연결하여 사용할 수도 있다.

상기 타이로시네이즈 효소를 암호화하는 유전자는 제한효소 절단위치를 통해 클로닝될 수 있으며, 상기 벡터에 단백질 절단효소 인식부위를 암호화하는 유전자가 사용된 경우에는 상기 타이로시네이즈 효소의 유전자와 틀이 맞도록(in frame) 연결되어, 상기 효소를 수득한 후 단백질 절단 효소로 절단 시, 원래 형태의 타이로시네이즈 효소가 생산될 수 있도록 할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는, 본 발명의 타이로시네이즈 효소 유전자를 플라스미드 벡터인 pET28a(+)에 삽입함으로써 재조합 클로닝 벡터를 제조하였다. 상기의 클로닝 벡터의 제조에 이용된 pET28a(+) 이외에도 다양한 원핵세포용 벡터 또는 진핵세포용(pPIC 및 pPICZ 등) 벡터가 알려져 있으므로 발현의 목적에 따라 상기 벡터 이외의 다양한 발현 벡터를 이용할 수 있다.

본 발명의 상기 재조합 발현 벡터는 타이로시네이즈 효소 유전자가 포함되어 있어 이를 생산할 수 있는 벡터로서 유용하게 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 형질전환체에는 타이로시네이즈효소를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터가 도입된다.

본 발명에 따른 상기 재조합 발현 벡터를 발현 목적에 따라 박테리아, 효모, 대장균, 진균류, 식물 세포 및 동물 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 적절한 숙주 세포에 형질 전환시킴으로써 형질전환체를 제조할 수 있다. 예컨대, 상기 숙주 세포는 대장균(E. coli BL21(DE3), DH5α등) 또는 효모 세포 (Saccharomyces 속, Pichia 속 등) 등 일 수 있다. 이때, 숙주 세포의 종류에 따라 적절한 배양 방법 및 배지 조건 등은 당해 분야의 공지 기술로부터 당업자가 용이하게 선택할 수 있다.

본 발명의 형질전환체의 제조를 위한 재조합 발현 벡터의 도입 방법은 공지의 기술, 즉 열 충격법, 전기충격법 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 대장균을 숙주 세포로 하여 본 발명의 타이로시네이즈 효소를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 대장균에 형질 전환시켜 형질전환체를 제조하였다.

상기 형질전환체로부터 발현된 단백질은 타이로시네이즈 효소 활성을 가지는 신규한 서열의 단백질이므로, 상기 형질전환체를 대량 배양하여 상기 유전자를 발현시킴으로써 상기 타이로시네이즈 효소의 대량생산을 용이하게 할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 타이로시네이즈 효소를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터가 도입된 형질전환체를 이용하여 타이로시네이즈 효소를 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명의 타이로시네이즈 효소 생산 방법은 본 발명의 타이로시네이즈 효소를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터가 도입된 형질전환체를 배양하는 단계, 상기 단계에서 배양된 형질전환체에서 상기 타이로시네이즈 효소의 발현을 유도하는 단계 및 상기 두 번째 단계에서 타이로시네이즈 효소의 발현이 유도된 형질전환체의 배양물로부터 타이로시네이즈 효소를 분리하는 단계를 포함한다.

상기의 타이로시네이즈 효소를 암호화하는 유전자의 N-말단에는 분리정제용 태그를 암호화하는 유전자 또는 단백질 절단효소 절단위치가 추가로 연결될 수 있고, 이로 인해 재조합 타이로시네이즈 효소의 정제 또는 원래 형태의 타이로시네이즈 효소의 수득이 가능할 수 있다.

상기의 형질전환체의 배양은 공지된 방법에 따라서 수행될 수 있고, 배양 온도, 배양 시간 및 배지의 pH 등의 조건은 적절하게 조절될 수 있다. 또한, 배양 방법에는 회분식 배양(batch culture), 연속식 배양(continuous culture) 및 유가식 배양(fed-batch culture)이 포함될 수 있다. 사용되는 배양 배지는 특정한 균주의 요구 조건을 적절하게 충족시켜야 한다.

상기의 배양에 의해 생성된 배양물로부터 타이로시네이즈 효소의 분리는 원심분리, 여과 등 당해 분야에서 통상적으로 수행되는 방법을 실시할 수 있다. 또한, 상기 방법으로 분리된 타이로시네이즈 효소는 통상의 방식으로 정제될 수 있으며, 예를 들어, 염석(예를 들어 황산암모늄 침전, 인산나트륨 침전), 용매 침전 (아세톤, 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 침전), 투석, 겔 여과, 이온 교환, 역상 칼럼 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피 및 한외여과 등의 기법을 단독 또는 조합하여 본 발명의 효소를 정제할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 상기와 같이 정제된 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질이 타이로시네이즈 효소의 활성을 나타냄을 확인하였다(도 2 참고). 상기와 같은 결과로부터, 본 발명의 생산 방법에 따라 타이로시네이즈 효소의 대량 생산이 가능함을 알 수 있다.

또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서 상기와 같이 정제된 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질 활성이 pH가 7 이상에서 증가됨을 확인하였으며, 50℃의 고온에서도 활성이 유지된 것을 확인하였다(도 3 및 4 참고). 상기와 같은 결과로부터, 본 발명의 타이로시네이즈 효소는 넓은 범위의 pH 및 온도 조건에서 활성을 갖는다는 것을 알 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 타이로시네이즈 효소를 이용하여 나린제닌으로부터 에리오딕티올을 생산하는 방법 및 생산용 조성물을 제공한다.

본 발명의 에리오딕티올 생산용 조성물은 본 발명의 타이로시네이즈 효소를 포함한다.

또한, 본 발명의 에리오딕티올 생산 방법은 본 발명의 타이로시네이즈 효소를 나린제닌과 반응시키는 단계 및 상기 단계에서의 반응 결과 생성된 반응 생성물로부터 에리오딕티올을 회수하는 단계를 포함한다.

상기 에리오딕티올의 생산 방법 및 에리오딕티올 생산용 조성물은 인-비트로(in vitro)에서 본 발명의 타이로시네이즈 효소의 효소 활성을 이용하는 것이므로, 상기 타이로시네이즈 효소를 이용하여 그 기질인 나린제닌으로부터 에리오딕티올을 생산하는 것이다.

상기의 반응은 20℃ 내지 60℃의 온도 범위, 바람직하게는 20℃ 내지 40℃의 온도 범위, 더욱 바람직하게는 37℃의 온도에서 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다. 또한, 상기의 반응은 pH 4 내지 10의 범위, 바람직하게는 pH 6 내지 8의 범위, 더욱 바람직하게는 pH 7.4에서 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다.

또한, 상기의 반응에는 상기 타이로시네이즈 효소의 활성을 향상시키기 위해 상기 타이로시네이즈 효소와 함께 항산화제가 함께 포함될 수 있다. 상기 항산화제는 L-아스코르브산 또는 D-아스코르브산일 수 있으며, NADH 또는 GSH 등일 수 있다.

상기의 반응에서, 나린제닌은 외부에서 주입되는 것이 바람직하고, 나린제닌은 목적하는 에리오딕티올의 양에 맞추어 충분한 양이 주입되어야 한다. 또한, 상기 나린제닌의 주입은 연속적으로 수행될 수 있다. 특히 나린제닌이 연속적으로 주입되는 경우, 상기 타이로시네이즈 효소에 의하여 에리오딕티올을 지속적으로 생산할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 상기와 같은 타이로시네이즈 효소에 의하여 나린제닌으로부터 에리오딕티올이 생산됨을 확인하였다(도 5 참조).

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다.

[실시예]

[실시예 1] 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 정제

[1-1] 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 클로닝 및 형질전환

바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium)에서 유래한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 얻기 위해 서열번호 2의 염기서열을 기초로 다음 표 1과 같이 서열번호 3과 4의 프라이머를 각각 설계하였다.

서열번호	프라이머 쌍	서열(5’→3’)
3	정방향 프라이머	CCGCGCGGCAGCCATATGAGTAACAAGTATAGAGT
4	역방향 프라이머	GTGGTGGTGCTCGAGTTATGAGGAACGTTTTGATT

바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium)의 genomic DNA를 주형으로 하여 상기와 같이 설계된 서열번호 3, 4의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행함으로써 서열번호 2의 염기 서열을 증폭하였다. 이 PCR 산물을 In-Fusion®HD Cloning Kit(TaKaRa, 일본)을 사용해 pET-28a(+) 벡터(Novagen, 미국)에 삽입하여 재조합 발현벡터를 제작하였다. 서열번호 2의 염기 서열이 발현벡터에 제대로 삽입된 것을 확인하기 위해 마크로젠(대한민국)에 의뢰하여 염기 서열을 확인하였으며, 이를 대장균 C2566 균주(Novagen, 미국)에 형질전환하였다.

[1-2] 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 과발현 및 정제

상기 형질전환체를 카나마이신(50 ㎍/mL)을 포함한 LB 배지 10 mL에 접종하고 37℃에서 12시간 이상 배양하였다. 이 종균 배양액 2.5 mLfmf 카나마이신(50 ㎍/mL)을 포함한 LB 배지 250 mL에 접종하여 37℃에서 배양하였다. 흡광도가 600 nm에서 0.5가 될 때 Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside(IPTG)를 0.5 mM이 되도록 첨가하고 30℃에서 6시간 배양하여 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 과발현을 유도하였다.

서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 과발현이 유도된 형질전환체의 배양액을 4℃에서 4000 rpm으로 20분 동안 원심분리하여 형질전환체 펠렛을 회수하였다. 여기에 equilibrium buffer(20 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 7.4) 40 mL를 넣고 초음파분쇄기로 세포를 파쇄한 후 4℃에서 14000 rpm으로 30분 동안 원심분리하여 형질전환체의 세포 용해물(cell lysate)인 상층액을 수득하였다.

상기 세포 용해물을 HisPur™ Ni-NTA Resin(Thermo Fisher Scientific, 미국)이 충진 된 컬럼에 주입한 후 제조사가 제공하는 실험절차를 따라 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 분리 및 정제하였다(도 1).

[실시예 2] 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 활성 확인

상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질이 하기 반응식 1과 같은 타이로시네이즈 효소로서 활성을 가질 것으로 예상하고 이를 확인하였다.

[반응식 1]

상기 실시예 1에서 정제한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질 5 ㎍을 0.5 mM L-타이로신이 포함된 50 mM potassium phosphate buffer(pH 7)에 넣고 생성되는 도파크롬(dopachrome)을 UV-Vis spectrophotometer(Shimadzu, 일본)를 이용하여 475 nm에서 관찰하였다. 또한 상기 실시예 1에서 정제한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질 2 ㎍을 0.5 mM L-DOPA가 포함된 50 mM potassium phosphate buffer(pH 7)에 넣고 생성되는 도파크롬(dopachrome)을 UV-Vis spectrophotometer(Shimadzu, 일본)를 이용하여 475 nm에서 관찰하였다. 그 결과, 상기 실시예 1에서 정제한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질이 L-타이로신과 L-DOPA로부터 도파크롬을 생성하는 타이로시네이즈 효소로서의 활성을 갖는 것을 확인하였다(도 2).

[실시예 3] 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 효소 활성에 영향을 미치는 조건

상기 실시예 1에서 정제한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 최적 활성 조건을 조사하였다.

[3-1] pH의 영향

상기 실시예 1에서 정제한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질 5 ㎍을 0.5 mM L-타이로신이 포함된 50 mM potassium phosphate buffer(pH 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10)에 넣고 생성되는 도파크롬을 측정하였다. 또한 상기 실시예 1에서 정제한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질 2 ㎍을 0.5 mM L-DOPA가 포함된 50 mM potassium phosphate buffer(pH 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10)에 넣고 생성되는 도파크롬을 측정하였다. 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 효소활성을 구하기 위해 초기반응 속도구간의 기울기와 도파크롬의 molar extinction coefficient 값(ε = 3600 M^-1 cm^-1)으로부터 specific activity(μmole/min/mg)를 계산하였다. 그 결과, L-타이로신과 L-DOPA가 기질일 때 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질이 pH 4 내지 10 모두에서 타이로시네이즈 활성을 나타내었고, L-타이로신이 기질일 때는 pH 8에서, 그리고 L-DOPA가 기질일 때는 pH 9에서 최대 활성을 나타내는 것을 확인하였다(도 3).

[3-2] 온도의 영향

상기 실시예 1에서 정제한 단백질과 시중에 판매되는 타이로시네이즈의 효소활성에 미치는 온도의 영향을 확인하기 위해, 시그마 알드리치(미국)에서 구입한 타이로시네이즈 또는 상기 실시예 1에서 정제한 단백질 2 ㎍을 0.5 mM L-타이로신이 포함된 50 mM potassium phosphate buffer(pH 7)에 넣고 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 및 90℃에서 10분 동안 가열한 후 남아있는 활성을 측정하고 가열하기 전의 효소 활성과 비교하여 백분율로 나타내었다. 그 결과, 시그마 알드리치(미국)에서 구입한 타이로시네이즈는 40℃에서 활성이 50%가 감소하였으며 50℃ 이상에서 활성을 나타내지 않았다. 반면, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질은 40℃에서 가열 후에는 98% 활성이 남아 있었고 70℃에서 가열 후에는 64% 활성이 남아 있었다(도 4). 따라서 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질은 고온 안정성을 나타내는 것으로 확인되었다.

[실시예 4] 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 이용한 에리오딕티올 생산

상기 실시예 1에서 정제한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 이용하여 반응식 2와 같이 나린제닌에서 에리오딕티올을 생산하기 위해 상기 실시예 1에서 정제한 단백질 2 ㎍을 0.2 mM 나린제닌과 10 mM L-아스코르브산이 포함된 50 mM potassium phosphate buffer(pH 7)에 넣고 37℃에서 30분 동안 반응한 후 600 ㎕의 ethyl acetate를 넣고 반응을 종료하였다. 상기 반응액을 4℃에서 3000 rpm으로 10분 동안 원심분리 후 상층액을 새 튜브에 옮겨 질소가스로 용매를 증발시킨 후 180 ㎕의 dimethyl sulfoxide:methanol(1:4) 용매를 넣고 녹여 샘플을 준비하였다. 상기와 같이 준비된 샘플 10 ㎕를 ZORBAX SB-C18 column(4.6×150 mm; Agilent, 미국)과 DAD 검출기(1260 DAD VL; Agilent, 미국)가 장착된 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography(HPLC; Agilent 1260 infinity)에 주입하여 분석하였다. 이동상으로 0.1% 포름산이 함유된 물(이동상 A)과 0.1% 포름산이 함유된 아세토나이트릴(이동상 B)을 사용하였고, 1 mL/분의 유속으로 40분 동안 흘려주었는데, 0-2분 동안은 15% B로, 2-30분 동안은 15-50% B로, 30-32분 동안은 50-100% B로, 32-34분 동안은 100% B로, 34-36분 동안은 100-15% B로, 36-40분 동안은 15% B로 흘려주었으며, 280 nm에서 검출하였다.

그리고 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 생성물을 정량화하기 위해 시판되는 나린제닌과 에리오딕티올을 Sigma-Aldrich(미국)에서 구입하여 스탠다드로 사용하였다.

HPLC 분석 결과, 나린제닌과 에리오딕티올의 스탠다드는 각각 22분과 18분에서 검출되었으며, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 효소반응액의 생성물은 18분에서 검출되었다(도 5). 따라서 본 발명의 신규 타이로시네이즈가 나린제닌으로부터 에리오딕티올을 생산함을 확인하였고, productivity는 87.8 mg/L/h였다.

[반응식 2]

<110> Namhae Garlic Research Institute <120> Novel tyrosinase enzyme <130> PA-D22008 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 297 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tyrosinase <400> 1 Met Ser Asn Lys Tyr Arg Val Arg Lys Asn Val Leu His Leu Thr Val 1 5 10 15 Thr Glu Lys Arg Asp Phe Ile Arg Ala Val Leu Ile Leu Lys Glu Lys 20 25 30 Gly Ile Tyr Asp Arg Tyr Ile Ala Trp His Gly Ala Ala Gly Lys Phe 35 40 45 His Thr Pro Pro Gly Ser Asp Arg Asn Ala Ala His Met Ser Ser Ala 50 55 60 Phe Leu Pro Trp His Arg Glu Tyr Leu Leu Arg Phe Glu Arg Asp Leu 65 70 75 80 Gln Ser Ile Asn Pro Glu Val Thr Ile Pro Tyr Trp Glu Trp Glu Thr 85 90 95 Asp Ala Gln Met Gln Asp Pro Ser Gln Ser Lys Ile Trp Ser Thr Asp 100 105 110 Phe Met Gly Gly Asn Gly Asn Pro Lys Lys Asp Phe Ile Val Asp Thr 115 120 125 Gly Pro Phe Ala Ala Gly Arg Trp Thr Thr Ile Asp Glu Gln Gly Asn 130 135 140 Pro Ala Gly Gly Leu Lys Arg Asn Phe Gly Ala Thr Lys Glu Ala Pro 145 150 155 160 Thr Leu Pro Thr Arg Asp Asp Val Leu Asn Ala Leu Lys Ile Thr Gln 165 170 175 Tyr Asp Thr Pro Pro Trp Asp Met Thr Ser Gln Asn Ser Phe Arg Asn 180 185 190 Gln Leu Glu Gly Phe Ile Asn Gly Pro Gln Leu His Asn Arg Val His 195 200 205 Arg Trp Val Gly Gly Gln Met Gly Val Val Pro Thr Ala Pro Asn Asp 210 215 220 Pro Val Phe Phe Leu His His Ala Asn Val Asp Arg Ile Trp Ala Val 225 230 235 240 Trp Gln Ile Val His Arg Asn Gln Asn Tyr Gln Pro Met Lys Asn Gly 245 250 255 Pro Phe Gly Gln Asn Phe Arg Asp Phe Met Tyr Pro Trp Asp Thr Thr 260 265 270 Pro Lys Asp Val Met Asp His Arg Lys Leu Gly Tyr Val Tyr Asp Ile 275 280 285 Glu Leu Arg Lys Ser Lys Arg Ser Ser 290 295 <210> 2 <211> 894 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA of encoding gene <400> 2 atgagtaaca agtatagagt tagaaaaaac gtattacatc ttaccgtcac ggaaaaaaga 60 gattttattc gtgctgtgct catactaaag gaaaaaggaa tatatgaccg ctatatagca 120 tggcatggcg cagcaggtaa atttcatacg cctccgggca gcgatcgaaa tgcagcacat 180 atgagttctg cttttttgcc atggcatcgt gaataccttt tacgatttga gcgtgacctt 240 cagtcaatca atccagaagt aacgattcct tattgggaat gggaaacgga tgcacaaatg 300 caagatccat cacaatcaaa aatttggagc acagatttta tgggcggaaa cggaaatccc 360 aaaaaagatt ttatcgttga taccggtccg tttgcagctg ggcgctggac gacgatcgat 420 gagcaaggaa atcctgctgg agggttaaaa cgtaattttg gcgcaacgaa agaagcacct 480 acactcccta ctcgagatga tgttcttaat gctttaaaaa taactcaata tgatacgccg 540 ccttgggata tgacgagcca aaacagcttt cgtaatcagc ttgaaggatt tattaacggg 600 ccgcagcttc acaatcgtgt acatcgctgg gtcggcggac agatgggcgt tgttcctact 660 gctccaaatg atccggtttt ctttttacac cacgcaaatg tagatcgtat ttgggctgta 720 tggcaaattg ttcatcgcaa tcaaaactat cagccgatga aaaacgggcc tttcggtcaa 780 aactttagag acttcatgta tccttgggat acaactccaa aagatgttat ggaccatcga 840 aagcttgggt acgtatacga tatagaatta agaaaatcaa aacgttcctc ataa 894 <210> 3 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 3 Cys Cys Gly Cys Gly Cys Gly Gly Cys Ala Gly Cys Cys Ala Thr Ala 1 5 10 15 Thr Gly Ala Gly Thr Ala Ala Cys Ala Ala Gly Thr Ala Thr Ala Gly 20 25 30 Ala Gly Thr 35 <210> 4 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 4 Gly Thr Gly Gly Thr Gly Gly Thr Gly Cys Thr Cys Gly Ala Gly Thr 1 5 10 15 Thr Ala Thr Gly Ala Gly Gly Ala Ala Cys Gly Thr Thr Thr Thr Gly 20 25 30 Ala Thr Thr 35

Claims (5)

1. 서열번호 1의 아미노산 서열, 또는 서열번호 1과 90% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는, 타이로시네이즈 효소.
   
2. 서열번호 2의 염기서열로 이루어지며, 제1항의 타이로시네이즈 효소를 암호화하는 유전자.
   
3. 제1항의 타이로시네이즈 효소를 유효성분으로 포함하는, 에리오딕티올 생산용 조성물.
   
4. 서열번호 3, 4의 프라이머 쌍을 이용하여 바실러스속 미생물로부터 서열번호 2의 염기서열을 가지는 유전자를 제조하는 단계,
   상기 유전자를 PCR로 증폭시키는 단계,
   상기 PCR로 증폭시킨 산물을 이용하여 재조합 발현벡터를 제조하는 단계,
   상기 재조합 발현벡터를 숙주에 형질전환하는 단계,
   상기 형질전환된 형질전환체를 배양하여 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 타이로시네이즈 효소의 발현을 유도하는 단계, 및
   상기 발현된 타이로시네이즈 효소를 분리하는 단계
   를 포함하는 것을 특징으로 하는, 타이로시네이즈 효소의 생산 방법.
   
5. 제3항의 에리오딕티올 생산용 조성물을 나린제닌(naringenin)과 반응시키는 단계를 포함하는, 에리오딕티올의 생산 방법.