KR102212488B1 - 신규 d-트레오닌 생산 효소 및 이를 이용한 d-트레오닌의 입체특이적 생산 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 D-트레오닌을 생산할 수 있는 신규한 효소에 관한 것으로, 본 발명의 효소를 이용하여 반응을 진행시킬 경우 D-트레오닌와 함께 생산될 수 있는 부분입체 이성질체인 D-알로트레오닌의 비율을 낮추고, 더 높은 순도의 D-트레오닌을 수득할 수 있는 장점이 있다.

Description

신규 D-트레오닌 생산 효소 및 이를 이용한 D-트레오닌의 입체특이적 생산 방법{A Novel Enzyme for Production of D-threonine, and A Method for Sterospecific Preparing D-threonine Using The Same}

본 발명은 신규한 D-트레오닌 생산 효소에 관한 것이다.

자연계에 존재하는 아미노산들은 대부분 광학활성을 나타내는 알파탄소를 가지고 있으며 이의 입체특이성에 따라 L-아미노산과 D-아미노산으로 나뉜다. 자연계에 존재하는 대부분의 단백질은 L-아미노산으로 구성되어 있으나, 예외적으로 미생물의 펩티도글리칸이나 펩티드계 항생물질의 구성성분 및 고등식물의 생리활성물질의 구성성분 등은 D-아미노산으로 구성되어 있다.

한편, 현재까지의 연구에 의하면, 상기와 같은 D-아미노산 중에서도 D-트레오닌은 신경전달물질, 백신, 합성감미료, 항생제, 호르몬 등의 생리활성물질을 합성하는 중간물질 또는 전구체로서 식품과 의약분야에서 널리 이용되고 있으며, 이에 D-트레오닌을 생산하기 위한 방법들이 개발되어 왔다.

D-트레오닌을 생산하는 방법은 크게 화학적 합성법, 그리고 효소나 미생물을 이용하는 생물학적 합성법으로 나눌 수 있다. 화학적 합성법에 의한 트레오닌 생산의 경우, D-트레오닌 및 L-트레오닌이 혼합된 상태(racemic mixture)로 생성물이 얻어지기 때문에, 순수한 D-트레오닌을 얻기 위해서는 또 다른 복잡한 광학적 순수화 과정을 거쳐야 하는 어려움이 있다. 뿐만 아니라, 상기와 같은 화학적 합성 방법은 그 과정에서 발생하는 부산물들로 인해 심각한 환경오염이 유발되는 문제도 있다.

생물학적인 합성법에 의한 트레오닌 생산의 경우, 상기와 같은 다단계의 합성단계의 필요성 문제나 환경오염의 문제는 없으나, D-트레오닌을 특이적으로 생산할 수 있는 종래 알려진 D-트레오닌 생산 효소들은 그 활성이 적고 D-트레오닌의 생산성이 낮아 산업적으로 이용하기에 불충분한 문제점이 있다. 또한, D-트레오닌과 함께 D-알로트레오닌(D-allothreonine)이 거의 1:1의 비율로 혼합된 상태의 생성물을 생산하는 문제점이 있어, 순수한 D-트레오닌만의 생산이 어려운 단점이 있다.

이에, 화학적 합성법을 대체하여 입체특이적으로 D-트레오닌을 환경오염 없이 생산할 수 있으면서도, 활성 및 생산량이 높을 뿐만 아니라 D-알로트레오닌과 같은 불순물의 비율을 획기적으로 감소시켜 순수한 D-트레오닌을 생산할 수 있는 신규한 D-트레오닌 생산 효소의 연구와 개발이 더욱 필요한 실정이다.

본 발명은 L-트레오닌과 D-트레오닌의 혼합물이 아닌 D-트레오닌만을 입체특이적으로 생산할 수 있으면서도, D-알로트레오닌이 함께 생산되는 종래의 문제점을 극복하여 높은 순도로 D-트레오닌을 생산할 수 있는 특징이 있는 신규한 효소와 이를 이용한 D-트레오닌의 생산 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 필로마이크로비움 마리넘(Filomicrobium marinum) 유래 D-트레오닌 알돌라아제(D-threonine aldolase)의 147 번째 아르기닌(arginine), 179 번째 글리신(glycine) 및 312 번째 세린(serine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산이 알라닌(alanine)으로 치환된, D-트레오닌 생산 효소를 제공한다.

또한, 상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 다른 측면은 상기 D-트레오닌 생산 효소를 암호화하는 유전자를 제공한다.

또한, 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터 및 상기 발현벡터가 숙주세포에 도입된 형질전환체를 제공한다.

또한, 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 형질전환체를 배양하는 단계; 및 상기 형질전환체의 배양물로부터 D-트레오닌 생산 효소를 분리하는 단계;를 포함하는 D-트레오닌 생산 효소의 제조 방법을 제공한다.

또한, 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 D-트레오닌 생산 효소를 유효성분으로 포함하는 D-트레오닌 생산용 조성물, 및 상기 D-트레오닌 생산 효소를 글리신 및 아세트알데히드와 함께 반응시키는 단계;를 포함하는, 인 비트로(in vitro)에서의 D-트레오닌 생산 방법을 제공한다.

아울러, 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 형질전환체를 글리신 및 아세트알데히드의 존재 하에서 배양하는 단계를 포함하는, 인 비보(in vivo)에서의 D-트레오닌 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 D-트레오닌 생산 효소는 글리신과 아세트알데히드를 기질로 D-트레오닌으로 전환함에 있어, 함께 생산될 수 있는 D-알로트레오닌의 비율과 생산량을 감소시켜, D-트레오닌을 높은 순도로 생산할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 형질전환체에서 과발현되어 정제 및 분리된, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 분자 질량 특성을 SDS-PGAE(A) 및 젤-여과 크로마토그래피(Gel-filtration chromatography)(B)로 분석한 결과이다.
도 2는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질에 의한 D-트레오닌 전환 정도를 나타낸 그래프이다.
도 3은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 효소 활성에 영향을 미치는 금속 양이온의 종류(A)와 금속 양이온의 농도(B)를 확인한 그래프이다.
도 4는 온도가 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 효소 활성에 미치는 영향을 확인한 그래프이다.
도 5는 pH가 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 효소 활성에 미치는 영향을 확인한 그래프로, 완충 용액으로 MOPS(pH 6.5 내지 7.5), HEPES(pH 7.5 내지 8.0), EPPS(pH 8.0 내지 8.5) 및 CHES(pH 8.5 내지 10) 완충 용액을 각각 이용하여 확인한 것이다.
도 6은 피리독살-5-인산(PLP)이 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 효소 활성에 미치는 영향을 확인한 그래프이다.
도 7은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질 효소의 X-ray 결정구조(A)와 활성부위에서 부분입체 이성질체 비율 변화에 관여할 것으로 예측되는 잔기(B)를 나타내는 사진이다.
도 8은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 야생형 단백질(Wild-type)과 서열번호 49 내지 69의 아미노산 서열을 갖는 각 단백질을 SDS-PAGE로 분석한 결과이다. (각각의 치환 단백질의 명칭을 'X#Y'라고 할 때 '#'는 단백질의 아미노산 번호와 관련하여 치환된 위치를, 'X'는 야생형 단백질의 아미노산 서열의 그 위치에서 발견되는 아미노산을, 'Y'는 그 위치에서의 치환된 아미노산을 의미하며, 이하 동일하다.)
도 9는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 야생형 단백질(WT), 상기 서열번호 1의 아미노산 잔기 하나를 다른 것으로 치환한 각 단백질의 상대 특이 활성도와 부분입체 이성질체(D-트레오닌 및 D-알로트레오닌) 비율 변화를 확인한 그래프이다.
도 10은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 야생형 단백질(Wild-type), 알라닌으로 치환된 서열번호 3, 4, 5, 및 알라닌 외 다른 아미노산으로 치환된 서열을 갖는 각 단백질을 SDS-PAGE로 확인한 결과이다.
도 11은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 야생형 단백질(Wild-type), 알라닌으로 치환된 서열번호 3, 4, 5, 및 알라닌 외 다른 아미노산으로 치환된 서열을 갖는 각 단백질의 상대 특이 활성도와 부분입체 이성질체(D-트레오닌 및 D-알로트레오닌) 비율 변화를 확인한 그래프이다.
도 12는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 야생형 단백질(Wild-type)과 다중 알라닌 치환이 도입된 서열번호 9 내지 11의 아미노산 서열을 갖는 각 단백질을 SDS-PAGE로 확인한 결과이다.
도 13은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 야생형 단백질(Wild-type)과 다중 알라닌 치환이 도입된 서열번호 9 내지 11의 아미노산 서열을 갖는 각 단백질의 상대 특이 활성도와 부분입체 이성질체(D-트레오닌 및 D-알로트레오닌) 비율 변화를 확인한 그래프이다.
도 14의 A는 서열번호 1(WT), B는 서열번호 4(G179A), C는 서열번호 10(G179A+S312A)의 아미노산 서열을 갖는 단백질들에 대해 기질인 글리신의 비율이 D-트레오닌 생산량에 미치는 영향을 확인한 그래프이다.
도 15의 A는 서열번호 1(WT), B는 서열번호 4(G179A), C는 서열번호 10(G179A+S312A)의 아미노산 서열을 갖는 단백질들에 대해 기질인 아세트알데히드의 비율이 D-트레오닌 생산량에 미치는 영향을 확인한 그래프이다.
도 16의 A는 서열번호 1(WT), B는 서열번호 4(G179A), C는 서열번호 10(G179A+S312A)의 아미노산 서열을 갖는 단백질들을 최적 기질조건에서 반응시켜 D-트레오닌 및 D-알로트레오닌의 생산량을 비교한 그래프이다.

먼저, 본 발명의 명세서에서 이용된 용어를 설명한다.

본 발명의 "D-트레오닌 생산 효소"는 하기 반응식과 같이 글리신과 아세트알데히드로부터 D-트레오닌을 생산하는 활성을 가진 효소를 의미한다.

[반응식]

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

1. 신규 D-트레오닌 생산 효소 및 그 유전자

본 발명의 일 측면은 필로마이크로비움 마리넘(Filomicrobium marinum) 유래 D-트레오닌 알돌라아제(D-threonine aldolase)의 147 번째 아르기닌(arginine), 179 번째 글리신(glycine) 및 312 번째 세린(serine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산이 알라닌(alanine)으로 치환된, D-트레오닌 생산 효소를 제공한다.

예를 들어, 상기 D-트레오닌 생산 효소는 상기 D-트레오닌 알돌라아제의 147 번째 아르기닌이 알라닌으로 치환된 것, 179 번째 글리신이 알라닌으로 치환된 것, 312 번째 세린이 알라닌으로 치환된 것, 또는 179 번째 글리신 및 312 번째 세린이 각각 알라닌으로 치환된 것일 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 측면은 상기 D-트레오닌 생산 효소를 암호화하는 D-트레오닌 생산 효소의 유전자를 제공한다.

상기 D-트레오닌 생산 효소는 글리신 및 아세트알데히드를 기질로 하여, D-트레오닌을 생산하는 반응을 촉매할 수 있다.

상기 필로마이크로비움 마리넘(Filomicrobium marinum) 유래 D-트레오닌 알돌라아제는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으며, 상기 D-트레오닌 알돌라아제는 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서, 아미노산 잔기의 결실, 삽입, 치환 또는 이들의 조합에 의해서 상이한 서열을 가지는 아미노산의 변이체들, 또는 단편들일 수 있다. 상기 D-트레오닌 알돌라아제의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드 수준에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 변형될 수 있다. 따라서 상기 D-트레오닌 알돌라아제는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 포함한다. 상기 서열번호 1의 아미노산 서열은 서열번호 2의 염기 서열에 의해 암호화된 것일 수 있다.

본 발명의 D-트레오닌 생산 효소는 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으며, 상기 D-트레오닌 생산 효소는 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서, 아미노산 잔기의 결실, 삽입, 치환 또는 이들의 조합에 의해서 상이한 서열을 가지는 아미노산의 변이체들, 또는 단편들일 수 있다. 본 발명의 D-트레오닌 생산 효소의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드 수준에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 변형될 수 있다. 따라서 본 발명은 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 포함한다.

아미노산 서열에서의 치환된 아미노산과 관련하여 용어 'X#Y'는 본 기술 분야에서 자명하게 인식되는 것으로, '#'는 단백질의 아미노산 번호와 관련하여 치환된 위치를 나타내고, 'X'는 야생형 단백질의 아미노산 서열의 그 위치에서 발견되는 아미노산을 나타내고, 'Y'는 그 위치에서의 치환된 아미노산을 나타낸다.

상기 서열번호 3의 아미노산 서열은 서열번호 1의 아미노산 서열의 312 번째 세린(serine)이 알라닌(alanine)으로 치환된 것(S312A)이다.

상기 서열번호 4의 아미노산 서열은 서열번호 1의 아미노산 서열의 179 번째 글리신(glycine)이 알라닌으로 치환된 것(G179A)이다.

상기 서열번호 5의 아미노산 서열은 서열번호 1의 아미노산 서열의 147 번째 아르기닌(arginine)이 알라닌으로 치환된 것(R147A)이다.

상기 서열번호 9의 아미노산 서열은 서열번호 1의 아미노산 서열의 147 번째 아르기닌이 알라닌으로 치환되고, 179 번째 글리신이 알라닌으로 치환된 것(R147A, G179A)이다.

상기 서열번호 10의 아미노산 서열은 서열번호 1의 아미노산 서열의 179 번째 글리신이 알라닌으로 치환되고, 312 번째 세린이 알라닌으로 치환된 것(G179A, S312A)이다.

상기 서열번호 11의 아미노산 서열은 서열번호 1의 아미노산 서열의 147 번째 아르기닌이 알라닌으로 치환되고, 179 번째 글리신이 알라닌으로 치환되고, 312 번째 세린이 알라닌으로 치환된 것(R147A, G179A, S312A)이다.

본 발명의 D-트레오닌 생산 효소는 D-트레오닌 및 이의 부분입체 이성질체(diastereoisomer)인 D-알로트레오닌을 생산할 수 있다. 본 발명의 D-트레오닌 생산 효소는 상기 반응 생성물 중 D-트레오닌의 비율이 85% 이상이 되도록 D-트레오닌을 생산할 수 있으며, 구체적으로 87.5% 이상, 90% 이상, 92% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 97.5% 이상, 98% 이상, 98.5% 이상, 또는 99% 이상이 되도록 생산할 수 있다.

또한, 상기 D-트레오닌 생산 효소는 하기 식에 의해 계산되는 부분입체 이성질체 과잉률(diastereomeric excess, d.e.)이 75% 이상이 되도록 D-트레오닌을 D-알로트레오닌보다 더 많이 생산할 수 있으며, 구체적으로 d.e.가 77% 이상, 79% 이상, 80% 이상, 82% 이상, 85% 이상, 87% 이상, 90% 이상, 92% 이상, 또는 93% 이상이 되도록 생산할 수 있다.

[식]

d.e. (%) = ('D-트레오닌의 농도' - 'D-알로트레오닌의 농도') × 100 / ('D-트레오닌의 농도' + 'D-알로트레오닌의 농도')

본 발명의 상기 D-트레오닌 생산 효소를 암호화하는 유전자는 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 12, 서열번호 13 및 서열번호 14로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 염기 서열로 이루어진 것일 수 있다. 그러나 본 발명의 D-트레오닌 생산 효소 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 유전자는 암호화 영역으로부터 발현되는 상기 효소 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 암호화 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 암호화 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변이가 이루어질 수 있으며, 이러한 변이 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명은 상기 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 12, 서열번호 13 및 서열번호 14로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 염기 서열로 이루어진 유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열로 이루어진 유전자 및 상기 유전자의 단편을 포함한다. 상기 실질적으로 동일한 염기 서열로 이루어진 유전자란 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 가장 바람직하게는 95％ 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 80% 이상의 서열 상동성을 가지며 암호화된 단백질이 동일한 효소 활성을 가진다면 본 발명에 포함된다. 상기와 같이, 본 발명의 D-트레오닌 생산 효소를 암호화하는 유전자는 이와 동등한 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 한, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 이들 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 상기와 같은 염기 서열들은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있으며, DNA 분자 또는 RNA 분자일 수 있다.

2. D-트레오닌 생산 효소의 발현벡터, 형질전환체 및 이를 이용한 D-트레오닌 생산 효소의 제조 방법

본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 D-트레오닌 생산 효소의 유전자가 포함된 재조합 발현벡터 및 상기 재조합 발현벡터가 도입된 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 재조합 발현벡터는 상기 D-트레오닌 생산 효소를 암호화하는 유전자를 포함하며, 이에 따라 상기 D-트레오닌 생산 효소를 제조할 수 있는 벡터로서 유용하게 이용될 수 있다. 상기 D-트레오닌 생산 효소에 관한 설명은 상기 '신규 D-트레오닌 생산 효소 및 그 유전자'에서 설명한 바와 동일하다.

상기 발현벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파이지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

상기 재조합 발현벡터는 본 발명의 D-트레오닌 생산 효소를 제조하고자하는 숙주세포의 종류에 따라 프로모터(promoter), 터미네이터(terminator), 인핸서(enhancer) 등과 같은 발현조절서열, 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 목적에 따라 조합할 수 있다.

상기 발현벡터는 벡터가 도입된 숙주세포를 선택하기 위한 선택 마커를 추가로 포함할 수 있고, 복제 가능한 발현 벡터인 경우 복제 기원을 포함할 수 있다.

또한, 상기 재조합 발현벡터는 발현 단백질의 정제를 용이하게 하기 위한 서열을 포함할 수 있으며, 구체적으로 본 발명의 D-트레오닌 생산 효소를 암호화하는 유전자에 작동 가능하도록 분리정제용 태그를 암호화하는 유전자가 연결될 수 있다. 이때, 상기 분리정제용 태그는 GST, poly-Arg, FLAG, 히스티딘-태그(His-tag), c-myc 등이 단독으로 사용되거나 이들 중 두 개 이상을 순차적으로 연결하여 사용할 수도 있다.

상기 D-트레오닌 생산 효소를 암호화하는 유전자는 제한효소 절단위치를 통해 클로닝될 수 있으며, 상기 벡터에 단백질 절단효소 인식부위를 암호화하는 유전자가 사용된 경우에는 상기 D-트레오닌 생산 효소의 유전자와 틀이 맞도록(in frame) 연결되어, 상기 효소를 수득한 후 단백질 절단 효소로 절단 시, 원래 형태의 D-트레오닌 생산 효소가 제조될 수 있도록 할 수 있다.

상기 재조합 발현벡터는 D-트레오닌 생산 효소를 암호화하는 유전자를 플라스미드 벡터인 pET28a(+)에 삽입함으로써 제조될 수 있으며, 상기의 클로닝 벡터의 제조에 이용된 pET28a(+) 이외에도 다양한 원핵세포용 벡터 또는 진핵세포용(pPIC 및 pPICZ 등) 벡터가 알려져 있으므로 발현의 목적에 따라 상기 벡터 이외의 다양한 발현벡터를 이용할 수 있다.

본 발명의 형질전환체는 본 발명의 D-트레오닌 생산 효소를 암호화하는 유전자를 포함하는 상기 재조합 발현벡터가 도입된다. 상기 D-트레오닌 생산 효소 및 이의 유전자에 관한 설명은 상기 '신규 D-트레오닌 생산 효소 및 그 유전자'에서 설명한 바와 동일하다.

본 발명에 따른 상기 재조합 발현벡터를 발현 목적에 따라 박테리아, 효모, 대장균, 진균류, 식물 세포 및 동물 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 적절한 숙주 세포에 형질전환시킴으로써 형질전환체를 제조할 수 있다. 예컨대, 상기 숙주세포는 대장균(E. coli BL21(DE3), DH5α등) 또는 효모 세포 (Saccharomyces 속, Pichia 속 등)일 수 있다. 이때, 숙주세포의 종류에 따라 적절한 배양 방법 및 배지 조건 등은 당해 분야의 공지 기술로부터 당업자가 용이하게 선택할 수 있다.

본 발명의 형질전환체의 제조를 위한 재조합 발현벡터의 도입 방법은 공지의 기술, 즉 열 충격법, 전기충격법 등을 사용할 수 있다.

상기 형질전환체로부터 발현된 단백질은 본 발명의 D-트레오닌 생산 효소이므로, 상기 형질전환체를 대량 배양하여 상기 유전자를 발현시킴으로써 상기 D-트레오닌 생산 효소를 용이하게 대량생산 할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 D-트레오닌 생산 효소를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터가 도입된 형질전환체를 이용하여 D-트레오닌 생산 효소를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 D-트레오닌 생산 효소의 제조 방법은 본 발명의 D-트레오닌 생성 효소를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터가 도입된 형질전환체를 배양하는 단계; 및 상기 형질전환체의 배양물로부터 D-트레오닌 생산 효소를 분리하는 단계;를 포함한다.

상기 D-트레오닌 생산 효소의 제조 방법은 상기 배양된 형질전환체에서 상기 D-트레오닌 생산 효소를 암호화하는 유전자의 발현을 유도하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 D-트레오닌 생산 효소를 암호화하는 유전자의 N-말단에는 분리정제용 태그를 암호화하는 유전자가 추가로 연결될 수 있으며, 이로 인해 D-트레오닌 생산 효소의 수득이 가능할 수 있다. 또한, 상기 N-말단에는 단백질 절단효소 절단위치가 추가로 연결될 수 있고, 이로 인해 재조합된 형태의 D-트레오닌 생산 효소의 정제가 가능할 수 있다.

상기 형질전환체의 배양은 공지된 방법에 따라서 수행될 수 있고, 배양 온도, 배양 시간 및 배지의 pH 등의 조건은 적절하게 조절될 수 있다. 또한, 배양 방법에는 회분식 배양(batch culture), 연속식 배양(continuous culture) 및 유가식 배양(fed-batch culture)이 포함될 수 있다. 사용되는 배양 배지는 특정한 균주의 요구 조건을 적절하게 충족시켜야 한다.

상기 형질전환체의 배양물로부터 D-트레오닌 생산 효소의 분리는 원심분리, 여과 등 당해 분야에서 통상적으로 수행되는 방법을 통해 실시할 수 있다. 또한, 상기 방법으로 분리된 D-트레오닌 생산 효소는 통상의 방식으로 정제될 수 있으며, 예컨대 염석(예를 들어 황산암모늄 침전, 인산나트륨 침전), 용매 침전(아세톤, 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 침전), 투석, 겔 여과, 이온 교환, 역상 칼럼 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피, 한외여과 등의 기법을 단독 또는 조합하여 본 발명의 효소를 정제할 수 있다.

3. D-트레오닌 생산용 조성물 및 D-트레오닌의 생산 방법

본 발명의 또 다른 측면은 D-트레오닌을 고순도로 생산하기 위한 D-트레오닌 생산용 조성물을 제공한다.

상기 D-트레오닌 생산용 조성물은 본 발명의 D-트레오닌 생산 효소를 유효성분으로 포함한다. 상기 D-트레오닌 생산 효소에 관한 설명은 상기 '신규 D-트레오닌 생산 효소 및 그 유전자'에서 설명한 바와 동일하며, 상기 D-트레오닌 생산 효소는 D-트레오닌을 높은 순도로 생산할 수 있는 활성이 있는바, 상기 효소를 포함하는 조성물을 D-트레오닌의 효율적인 생산을 위한 용도로 이용할 수 있다.

상기 D-트레오닌 생산용 조성물은, D-트레오닌 생산 효소의 기질인 글리신 및 아세트알데히드를 더 포함할 수 있다. 상기 글리신 및 아세트알데히드는 목적하는 D-트레오닌의 양에 맞추어 충분한 양으로 포함될 수 있으며, 상기 글리신과 아세트알데히드는 1:1 내지 10:1의 비율, 예컨대 2:1 내지 8:1의 비율, 3:1 내지 5:1의 비율, 또는 4:1 내지 4.5:1의 비율로 포함될 수 있다. 또한, 상기 조성물에는 상기 D-트레오닌 생산 효소의 활성을 향상시키기 위해, 상기 D-트레오닌 생산 효소와 함께 금속 양이온 및/또는 피리독살-5-인산이 더 포함될 수 있다. 상기 금속 양이온은 2가 금속 양이온일 수 있고, 상기 2가 금속 양이온은 망간 양이온 또는 마그네슘 양이온일 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 인 비트로(in vitro)에서의 D-트레오닌 생산 방법을 제공한다.

상기 인 비트로(in vitro)에서의 D-트레오닌 생산 방법은 본 발명의 D-트레오닌 생산 효소를 글리신 및 아세트알데히드와 함께 반응시키는 단계를 포함한다. 상기 D-트레오닌 생산 효소에 관한 설명은 상기 '신규 D-트레오닌 생산 효소 및 그 유전자'에서 설명한 바와 동일하다.

상기 반응에서, 상기 글리신 및 아세트알데히드는 외부에서 주입되는 것일 수 있고, 상기 글리신 및 아세트알데히드는 목적하는 D-트레오닌의 양에 맞추어 충분한 양이 주입되어야 한다. 상기 글리신 및 아세트알데히드는 1:1 내지 10:1의 비율로 효소와 반응시키는 것일 수 있고, 예컨대 2:1 내지 8:1의 비율, 3:1 내지 5:1의 비율, 또는 4:1 내지 4.5:1의 비율로 반응시킬 수 있다. 또한, 상기 글리신 및 아세트알데히드의 주입은 연속적으로 수행될 수 있다. 특히 상기 글리신 및 아세트알데히드가 연속적으로 주입되는 경우, 상기 D-트레오닌 생산 효소에 의하여 D-트레오닌을 지속적으로 생성할 수 있다.

상기 D-트레오닌 생산 효소를 글리신 및 아세트알데히드와 함께 반응시키는 단계는, 상기 D-트레오닌 생산 효소의 활성을 향상시키기 위해 상기 D-트레오닌 생산 효소와 함께 금속 양이온 및/또는 피리독살-5-인산을 더 포함하여 반응시키는 것일 수 있다. 상기 금속 양이온은 2가 금속 양이온일 수 있고, 상기 2가 금속 양이온은 망간 양이온 또는 마그네슘 양이온일 수 있다.

상기 반응시키는 단계는 20 ℃ 내지 55 ℃의 온도, 예컨대 22 ℃ 내지 45 ℃의 온도, 또는 25 ℃ 내지 40 ℃의 온도에서 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 반응은 7 내지 10의 pH, 예컨대 8 내지 9.5의 pH, 또는 8.5 내지 9의 pH에서 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 인 비트로(in vitro)에서의 D-트레오닌 생산 방법은 상기 D-트레오닌 생산 효소, 글리신 및 아세트알데히드의 반응 생성물로부터 D-트레오닌을 회수하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 인 비보(in vivo)에서의 D-트레오닌 생산 방법을 제공한다.

상기 인 비보(in vivo)에서의 D-트레오닌 생산 방법은 본 발명의 상기 형질전환체를 글리신 및 아세트알데히드의 존재 하에서 배양하는 단계를 포함한다. 상기 형질전환체에 관한 설명은 상기 'D-트레오닌 생산 효소의 발현벡터, 형질전환체 및 이를 이용한 D-트레오닌 생산 효소의 제조 방법'에서 설명한 바와 동일하다.

상기 형질전환체를 글리신 및 아세트알데히드의 존재 하에서 배양하는 단계에서, 상기 글리신 및 아세트알데히드는 목적하는 D-트레오닌의 양에 맞추어 충분한 양이 존재해야 하며, 1:1 내지 10:1의 비율로 존재할 수 있고, 예컨대 2:1 내지 8:1의 비율, 3:1 내지 5:1의 비율, 또는 4:1 내지 4.5:1의 비율로 존재할 수 있다. 상기 글리신 및 아세트알데히드는 외부에서 인위적으로 공급해 주는 것일 수 있다. 또한, 상기 형질전환체의 배양에 이용되는 배지 내에 글리신 및 아세트알데히드를 첨가하여 함께 공급해 주는 것일 수도 있고, 상기 글리신 및 아세트알데히드가 생산되는 환경을 제공해 주는 것일 수도 있다. 상기 글리신 및 아세트알데히드가 생산되는 환경은 상기 글리신 및 아세트알데히드의 생산에 관여하는 적어도 하나의 효소를 암호화하는 유전자들을 함께 형질전환시킴으로써 제공될 수 있다.

상기와 같은 형질전환체의 배양은 본 기술 분야에 알려진 적당한 배지와 배양 조건에 따라 이루어질 수 있다. 통상의 기술자라면 선택되는 형질전환체의 숙주세포의 종류에 따라 배지 및 배양조건을 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 배양 방법은 회분식, 연속식, 유가식, 또는 이들의 조합 배양을 포함할 수 있다.

상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함할 수 있다.

상기 탄소원은, 예를 들면, 포도당, 자당, 유당, 과당, 말토오스, 전분, 셀룰로오스와 같은 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유와 같은 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤 및 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 배양은 글루코스를 탄소원으로 하여 수행될 수 있다. 상기 질소원은, 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액(CSL), 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄과 같은 무기 질소원, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 배지는 인의 공급원으로서, 예를 들면, 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨을 포함할 수 있고 이에 상응하는 소듐-함유 염, 황산마그네슘, 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있다.

또한, 아미노산, 비타민, 및 적절한 전구체 등이 배지에 포함될 수 있다. 상기 배지 또는 개별 성분은 배양액에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.

또한, 배양 중에 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다.

또한, 형질전환체에 의해 배양되어 제조된 본 발명의 D-트레오닌 생산 효소의 활성을 향상시키기 위해 배지 내에 금속 양이온 및/또는 피리독살-5-인산을 더 포함할 수 있다. 상기 금속 양이온은 2가 금속 양이온일 수 있고, 상기 2가 금속 양이온은 망간 양이온 또는 마그네슘 양이온일 수 있다.

상기와 같은 형질전환체의 배양은 20 ℃ 내지 50 ℃에서 수행될 수 있고, 예컨대 25 ℃ 내지 45 ℃, 또는 30 ℃ 내지 40 ℃에서 수행될 수 있다. 상기 형질전환체의 배양이 20 ℃ 미만 또는 50 ℃ 초과의 온도 범위에서 수행될 경우 충분한 양의 중간 생성물이 생성되지 않아, 결국 최종 생산물인 D-트레오닌의 생산량 또한 충분해지지 못하는 문제가 발생할 수 있다.

또한, 상기와 같은 형질전환체의 배양은 pH 5 내지 pH 10에서 수행될 수 있고, 예컨대 pH 6 내지 pH 9, 또는 pH 6.5 내지 pH 8에서 수행될 수 있으나, 이에 한정하지 않는다. 상기와 같은 형질전환체 배양의 pH 조건은 형질전환체의 배양 배지에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 첨가함으로써 조정할 수 있다. 형질전환체의 배양 pH 조건이 상기 범위를 벗어나는 경우 형질전환체의 생장이 저해되므로 D-트레오닌 생산 효소의 발현이 감소되고, 이에 따른 D-트레오닌의 생산이 감소되는 문제점이 발생할 수 있다.

상기 인 비보(in vivo)에서의 D-트레오닌 생산 방법은 상기 배양된 형질전환체에서 상기 D-트레오닌 생산 효소를 암호화하는 유전자의 발현을 유도하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 인 비보(in vivo)에서의 D-트레오닌 생산 방법은 상기 형질전환체의 배양물로부터 D-트레오닌을 회수하는 단계를 더 포함할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.

서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 분리

[1-1] 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 클로닝 및 형질전환

필로마이크로비움 마리넘(Filomicrobium marinum)에서 유래한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 얻기 위하여, 서열번호 2의 염기 서열을 기초로, 하기와 같은 프라이머를 제작하였다.

㈜바이오니아에 의뢰하여 서열번호 2의 염기 서열의 유전자를 합성하였고, 상기 합성된 유전자를 주형으로 하여 D-트레오닌 서열 증폭을 위해 프라이머를 설계하였다. 정방향 프라이머(5'-tggtgccgcgcggcagccatatgcgcgcaccagcacggct-3'), 역방향 프라이머(5'-ggtggtggtggtgctcgagctagaacacacaacctcgcgc-3') 쌍을 이용하여 PCR을 수행함으로써, 상기 서열번호 2의 염기 서열을 증폭하였다. Gibson assembly(New England Biolabs, 미국)를 이용하여 상기와 같이 증폭된 서열번호 2의 염기 서열을 포함하는 PCR 산물을, 벡터 증폭용 정방향 서열(5'-gcgcgaggttgtgtgttctagctcgagcaccaccaccacc-3')과 역방향 서열(5'-agccgtgctggtgcgcgcatatggctgccgcgcggcacca-3')을 이용하여 증폭한 플라스미드 벡터 pET28a(+)(Novagen, 미국)의 다중 클로닝 자리에 삽입하였다. 염기 서열 분석(sequencing, ㈜마크로젠)을 통해 상기 서열번호 2의 염기 서열이 제대로 삽입되었음을 확인하였으며, 이를 대장균 C2566 균주(Novagen, 미국)에 형질전환하였다. 상기와 같이 얻어진 형질전환체는 이용하기 전에 20% 글리세린 용액을 첨가하여 냉동 보관하였다.

[1-2] 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 과발현 및 정제

상기 실시예 [1-1]에서 냉동 보관된 형질전환체를 3 ㎖의 LK 고체 배지(LB 배지 + 2 μg/㎖ 카나마이신)에 선조접종하고 37 ℃에서 10시간 이상 배양하였다. 고체 배지에 나타나는 하나의 콜로니를, 단집락 분리를 통해 3 ㎖의 LK 고체 배지가 포함된 시험관(test tube)에 접종하고 37 ℃의 진탕 배양기로 12시간 동안 종균 배양을 실시하였다. 그런 다음, 상기 종균 배양된 배양액 2 ㎖를 200 ㎖의 LK 배지가 포함된 1,000 ㎖ 플라스크에 첨가하여 본 배양을 실시하였고, 600 ㎚에서의 흡광도가 0.6이 될 때의 최종 농도가 0.1 mM이 되도록 IPTG(isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside)를 첨가하여 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 과발현을 유도하였다. 상기와 같이 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 과발현을 유도하는 과정에서, 교반 속도는 200 rpm, 배양 온도는 37 ℃가 유지되도록 조정하였고, IPTG를 첨가 후에는 교반 속도를 150 rpm으로, 배양 온도를 18 ℃로 조정하여 20시간 동안 배양하였다.

또한, 상기와 같이 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 과발현이 유도된 형질전환체의 배양액을 50 ㎖의 코니칼 튜브(conical tube, SPL Life Sciences Co., Ltd., 한국)에 분주하고, 4 ℃에서 3,000 rpm으로 20분 동안 원심분리하여 상층액을 분리해 낸 펠렛에 프로피니아 1X 용해 완충용액(Profinia 1X Lysis buffer, Bio-Rad Laboratories, 미국) 10 ㎖를 첨가하고, 소니케이션(sonication) 방법으로 세포를 파쇄함으로써, 형질전환체의 세포 용해물(cell lysate)을 수득하였다.

상기와 같이 수득된 세포 용해물을 4 ℃에서 14,000 rpm으로 20분 동안 다시 원심분리하여 상층액을 수득하였고, IMAC Kit^® His tag 흡착 컬럼(Bio-Rad Laboratories, 미국)이 장착된 고속 단백질 액체 크로마토그래피(Fast Protein Liquid Chromatography, Bio-Rad Laboratories, 미국)를 이용하여 상기와 같이 수득된 상층액으로부터 과발현된 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 분리하였다.

이렇게 분리된 단백질을, 2-머캅토에탄올(2-mercaptoethanol) 100 ㎕ 및 Laemmli Sample Buffer(#1610747, Bio-Rad Laboratories, 미국) 900 ㎕를 혼합한 4X 단백질 염색약과 3:1의 비율로 혼합하고, 끓는 물에 넣어 10분 동안 가열하였다. 이 과정에서 단백질은 변성되어 선형의 아미노산 서열을 가지므로 SDS-PAGE를 통해 분자량에 따라 분리될 수 있다. 상기와 같은 일련의 과정에 의하여 His-Tag이 붙어 있는 40.88 kDa의 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질이 과발현되고, 형질전환체의 세포 용해물로부터 정제 및 분리되었음을 확인하였다(도 1의 A).

한편, 과발현된 단백질이 변성되지 않는 자연 상태를 유지했을 때의 분자량을 측정하기 위해, 젤-여과 컬럼(Zorbax GF-250, Agilent, 미국)과 HPLC (Agilent Infinity 1220, Agilent, 미국)를 이용하였고, 분석 조건은 130 mM 염화나트륨 / 20 mM 인산 수소 나트륨(pH 7.0)의 이동상을 1.0 ㎖/분의 속도로 흘려주었으며, 검출 파장은 210 ㎚ 로 하여 샘플 20 ㎕을 분석하였다. 이 때, 스탠다드 단백질 마커(MWGF1000-1KT, Sigmaaldrich, 미국)는 티로글로불린 (669 kDa), 아포단백질 (443 kDa), 베타-아밀라아제 (200 kDa), 알코올 탈수소효소 (150 kDa), 탄산무수화효소 (29 kDa)를 사용하였고, D-트레오닌 알돌레이즈와 단백질 마커를 상기와 같이 분석한 결과, 접힌 구조의 D-트레오닌 알돌레이즈의 크기는 87 kDa으로 확인되었다(도 1의 B).

앞서 확인했던 SDS-PAGE 결과 및 젤-여과 크로마토그래피의 데이터를 종합하여 비교했을 때, 자연 상태의 D-트레오닌은 이합체 형태임을 확인할 수 있었다.

서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 활성 확인

상기 실시예 1을 통해 정제 및 분리한 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질은 하기 반응식과 같은 ‘D-트레오닌 생산 효소’로서의 활성을 가지는바, 글리신 및 아세트알데히드를 반응시켜 상기 활성을 확인하였다.

[반응식]

구체적으로, 상기 실시예 [1-2]에서 정제 및 분리한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질 0.01 ㎎/㎖를 100 mM의 글리신 및 100 mM의 아세트알데히드와 함께, 100 μM의 피리독살-5-인산(pyridoxal-5-phosphate, PLP)과 1 mM의 MnCl₂가 포함된 50 mM의 CHES 완충용액(pH 9.0)에 첨가하고, 37 ℃에서 10분 동안 반응시킨 다음, 100 ℃에서 10분 동안 중탕하여 상기 반응을 종료시킨 다음, 반응이 종료된 완충 용액에서 D-트레오닌의 농도를 측정하였다.

상기 생성된 D-트레오닌은 OPA/NAC 전처리(OPA/NAC derivatization)한 후 HPLC를 통해 분석하였다. 상기 전처리 과정은 8 ㎎의 OPA(o-phthalaldelhyde)와 10 ㎎의 NAC(N-acetylcysteine)를 1 ㎖의 메탄올에 녹여 OPA/NAC 용액을 만들고, 25 ㎕의 분석할 샘플을 OPA/NAC 용액 50 ㎕와 0.4 M의 붕산나트륨 완충용액(sodium borate buffer, pH10.4) 175 ㎕의 혼합물에 넣고 0.2 ㎛ 필터로 필터링하여 전처리된 샘플을 준비하였다.

상기와 같이 준비된 전처리된 샘플 20 ㎕을, VWD(Variable wavelength detector)와 역상 C18 칼럼(reverse-phase C18 column, Eclipse XDB-C18, 4.6×150 ㎜, 3.5 ㎛, Agilent)이 장착된 고압 액체 크로마토그래피에 주입하여, D-트레오닌의 농도를 측정하였다. 상기와 같은 고압 액체 크로마토그래피를 수행함에 이용된 이동상은 메탄올(이동상 A)과 50 mM의 아세트산나트륨(sodium acetate, pH 5.9)(이동상 B)으로 구성되고, 유속 1 ㎖/분의 유속으로 10분 동안 흘려주었는데, 0~3분 동안은 이동상 A와 이동상 B를 3:7의 비율로, 3~10분 동안은 이동상 A와 이동상 B를 7:3의 비율로 유지하였다. 그리고 생성된 D-트레오닌을 정량화하기 위해 시판되는 D-트레오닌(Sigma-aldrich, 미국)과 D-알로트레오닌(TOKYO CHEMICAL INDUSTRY CO., LTD., 일본)을 스탠다드로 사용하였다.

그 결과, 상기와 같이 반응이 종료된 완충 용액에서는 D-트레오닌과 D-알로트레오닌이 모두 검출되었고(도 2), 애초에 존재하지 않았던 D-트레오닌이 상기 반응에 의해 생성되었는바, 상기 실시예 [1-2]에서 정제 및 분리한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질이 글리신과 아세트알데히드로부터 D-트레오닌을 생성하는, D-트레오닌 생산 효소로서의 활성을 가짐을 확인하였다.

서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 효소 활성에 영향을 미치는 조건 확인

상기 실시예 2에서 확인된 바와 같이, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질이 D-트레오닌 생산 효소로서 작용하므로, 그 활성에 영향을 미치는 조건들을 확인하여 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 최적 활성 조건을 도출하였다.

[3-1] 금속 양이온의 영향

상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 효소의 활성에 금속 양이온의 종류가 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 실시예 [1-2]에서 정제 및 분리한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질 0.01 ㎎/㎖, 글리신 100 mM, 아세트알데히드 100 mM 및 피리독살-5-인산 100 μM이 포함된 50 mM의 CHES 완충용액(pH 9.0)에 1 mM의 EDTA 또는 금속 양이온(Mn²⁺, Mg²⁺, Co²⁺, Zn²⁺)과 함께 첨가하여 35 ℃에서 10분 동안 반응시키고, 상기 반응을 종료시키기 위해 100 ℃에서 10분 동안 중탕하였다. 그리고 상기 실시예 2에서와 같은 방법으로, 상기와 같이 반응이 종료된 완충 용액에서 D-트레오닌과 D-알로트레오닌의 농도를 측정하여 그 상대값을 비교하였다.

그 결과, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질은, 여러 종류의 금속 양이온 중 망간 양이온과 마그네슘 양이온이 첨가된 경우에 D-트레오닌 생산 효소의 활성이 향상되었고, 그 중에서도 망간 양이온을 이용한 경우에 D-트레오닌 생산 효소의 활성이 가장 우수한 것으로 확인되었다(도 3의 A).

상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 효소 활성에 금속 양이온의 농도가 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 실시예 [1-2]에서 정제 및 분리한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질 0.01 ㎎/㎖, 글리신 100 mM, 아세트알데히드 100 mM 및 피리독살-5-인산 100 μM이 포함된 50 mM의 CHES 완충용액(pH 9.0)에 망간 양이온을 0 mM, 0.1 mM, 0.25 mM, 0.5 mM, 1 mM, 2.5 mM 및 5 mM의 함량으로 각각 첨가하여 35 ℃에서 10분 동안 반응시키고, 상기 반응을 종료시키기 위해 100 ℃에서 10분 동안 중탕하였다. 그리고 상기 실시예 2에서와 같은 방법으로, 상기와 같이 반응이 종료된 완충 용액에서 D-트레오닌과 D-알로트레오닌의 농도를 측정하여 그 상대값을 비교하였다.

그 결과, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질은 망간 양이온이 존재하는 환경에서만 D-트레오닌 생산 효소의 활성을 나타내는 것으로 확인되었다(도 3의 B).

[3-2] 온도의 영향

상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 효소 활성에 온도가 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 실시예 [1-2]에서 정제 및 분리한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질 0.01 ㎎/㎖, 글리신 100 mM 및 아세트알데히드 100 mM를, 100 μM의 피리독살-5-인산 및 1 mM의 Mn²⁺가 포함된 50 mM의 CHES 완충용액 (pH 9.0)에 첨가한 다음, 25 ℃ 내지 55 ℃의 온도에서 각각 10분 동안 반응시키고, 상기 반응을 종료시키기 위해 100 ℃에서 10분 동안 중탕하였다. 그리고, 상기 실시예 2에서와 같은 방법으로, 상기와 같이 반응이 종료된 완충 용액에서 D-트레오닌과 D-알로트레오닌의 농도를 측정하여 그 상대값을 비교하였다.

그 결과, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 효소 활성은 35 ℃에 가까울수록 점점 우수해지는 것으로 확인되었다(도 4).

[3-3] pH의 영향

상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 효소 활성에 pH가 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 실시예 [1-2]에서 정제 및 분리한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질 0.01 ㎎/㎖, 글리신 100 mM 및 아세트알데히드 100 mM를, 피리독살-5-인산 100 μM 및 Mn²⁺ 1 mM과 함께, 각각 pH 6.5 내지 7.5의 MOPS 완충용액, pH 7.5 내지 8.0의 HEPES 완충 용액, pH 8.0 내지 8.5의 EPPS 완충 용액 및 pH 8.5 내지 10의 CHES 완충 용액에 각각 첨가하여, pH 6.5 내지 10의 범위에서 각각 반응시켰다. 상기 효소 반응은 35 ℃의 온도에서 10분 동안 수행한 뒤, 상기 반응을 종료시키기 위해 100 ℃에서 10분 동안 중탕하였다. 그리고 상기 실시예 2에서와 같은 방법으로, 상기와 같이 반응이 종료된 완충 용액에서 D-트레오닌과 D-알로트레오닌의 농도를 측정하여 그 상대값을 비교하였다.

그 결과, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 효소 활성은 pH가 8.5~9.0에 가까울수록 점점 우수해지는 것으로 확인되었다(도 5).

[3-4] 피리독살-5-인산의 영향

상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 효소 활성에 피리독살-5-인산의 존부 및 농도가 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 실시예 [1-2]에서 정제 및 분리한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질 0.01 ㎎/㎖, 글리신 100 mM, 아세트알데히드 100 mM 및 Mn²⁺ 1 mM가 포함된 50 mM의 CHES 완충용액(pH 9.0)에 피리독살-5-인산을 0 μM, 0.1 μM, 0.5 μM, 2.5 μM, 5 μM, 25 μM, 50 μM, 100 μM 및 200 μM의 함량으로 각각 첨가하여 35 ℃에서 10분 동안 반응시키고, 상기 반응을 종료시키기 위해 100 ℃에서 10분 동안 중탕하였다. 그리고 상기 실시예 2에서와 같은 방법으로, 상기와 같이 반응이 종료된 완충 용액에서 D-트레오닌과 D-알로트레오닌의 농도를 측정하여 그 상대값을 비교하였다.

그 결과, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 효소 활성은 피리독살-5-인산이 존재하는 환경에서 더욱 우수해지고, 100 μM 수준의 농도에서 최대 활성에 도달하는 것으로 확인되었다(도 6).

서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질 효소의 부분 입체 이성질체 특이성 향상을 위한 효소 개량

상기 실시예 3에서 확인된 바와 같이, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질이 D-트레오닌 생산 효소로서 고활성을 가지는 것을 확인함에 따라 D-트레오닌을 특이적으로 합성하기 위한 목적으로 효소 개량을 진행하였다.

먼저, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질 효소의 결정구조에서 활성 부위 내의 부분입체 이성질체 변화에 관여할 것으로 예측되는 잔기들을 선별하였고, 해당 잔기들을 알라닌으로 치환함으로써 그 활성과 부분입체 이성질체의 비율 변화를 분석하였다. 그 결과, D-트레오닌에 대한 입체특이성을 향상시키는 잔기들을 도출하였고, D-트레오닌으로의 입체 특이성이 99% 이상으로 향상된 것을 확인하였다.

[4-1] 부분입체 이성질체 비율 변화에 관여하는 아미노산 잔기 선별과 해당 단백질들의 클로닝 및 형질전환

상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질 구조는 기존에 보고된 알칼리제너스 자일로속시단스(Alcaligenes xylosoxidans) 유래의 D-트레오닌 알돌레이즈 X-ray 결정구조를 기반으로 확보하였고(도 7), 결정구조의 활성부위에서 기질(글리신 및 아세트알데히드), 피리독살-5-인산 및 망간 이온과 4 옴스트롱 거리에서 상호작용하는 아미노산 잔기들을 선별하였다. 상기와 같이 선별된 잔기들을 알라닌(alanine) 등으로 치환하여 G145Q, S312A, G179A, S312N, G145L, R147A, S90A, S242A, Q71A, H47A, Y250A, T223A, D313A, Q175A, Y177A, H288L, D294E, D341A, H339A, H183 및 K49A의 단일 치환 단백질을 제작하기 위하여, 서열번호 2의 염기 서열을 기초로 프라이머를 각각 설계하고 ㈜마크로젠에 의뢰하여 합성하였다.

상기 서열번호 2의 염기 서열을 포함하는 DNA를 주형(template)으로 하고, 상기 프라이머 쌍 각각을 이용하여 PCR을 수행함으로써 증폭된 각각의 PCR 산물을 Phusion, Q5, KOD 중합효소들을 이용하여 라이게이션/카이네이션 방법으로 염기 서열 말단부위를 각각 연결하였고, 염기 서열 분석(sequencing, ㈜마크로젠)을 통해, 해당 잔기들이 알라닌 등의 아미노산을 암호화하는 염기 서열로 정확히 치환되었음을 확인하였다. 해당 염기 서열들은 각각 대장균 C2566 균주(Novagen, 미국)에 형질전환하였고, 20% 글리세린 용액을 첨가하여 냉동 보관하였다.

[4-2] 단일 치환 단백질 돌연변이들의 과발현 및 정제

상기 실시예 [1-2]와 동일한 방법으로 실시예 [4-1]에서 냉동 보관된 형질전환체를 3 ㎖의 LK 고체 배지(LB 배지+카나마이신 25 μg/㎖)에 선조접종하고 37 ℃에서 10시간 이상 배양하였다. 고체 배지에 나타나는 하나의 콜로니를 단집락 분리 과정으로 3 ㎖의 LK 고체 배지가 포함된 시험관(test tube)에 접종하고 37 ℃의 진탕 배양기로 12시간 동안 종균 배양을 실시하였다. 그런 다음, 상기 종균 배양된 배양액 2 ㎖를, 200 ㎖의 LK 배지가 포함된 1,000 ㎖ 플라스크에 첨가하여 본 배양을 실시하였고, 600 ㎚에서의 흡광도가 0.6이 될 때의 최종 농도가 0.1 mM이 되도록 IPTG(isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside)를 첨가하여 G145Q, S312A, G179A, S312N, G145L, R147A, S90A, S242A, Q71A, H47A, Y250A, T223A, D313A, Q175A, Y177A, H288L, D294E, D341A, H339A, H183A 및 K49A 각각의 단일 치환 단백질의 과발현을 유도하였다. 과발현을 유도하는 과정에서, 교반 속도는 200 rpm, 배양 온도는 37 ℃가 유지되도록 조정하였고, IPTG를 첨가 후에는 교반 속도를 150 rpm으로, 배양 온도를 18 ℃로 조정하여 20시간 동안 배양하였다.

또한, 각각의 상기 단일 치환 단백질의 과발현이 유도된 형질전환체의 배양액을 50 ㎖의 코니칼 튜브(conical tube, SPL Life Sciences Co., Ltd., 한국)에 분주하고, 4 ℃에서 3,000 rpm으로 20분 동안 원심분리하여 상층액을 분리해 낸 펠렛에 프로피니아 1X 용해 완충용액(Profinia 1X Lysis buffer, Bio-Rad Laboratories, 미국) 10 ㎖를 첨가하고, 소니케이션(sonication) 방법으로 세포를 파쇄함으로써, 형질전환체의 세포 용해물(cell lysate)을 수득하였다.

상기와 같이 수득된 세포 용해물을 4 ℃에서 14,000 rpm으로 20분 동안 다시 원심분리하여 상층액을 수득하였고, IMAC Kit^® His tag 흡착 컬럼(Bio-Rad Laboratories, 미국)이 장착된 고속 단백질 액체 크로마토그래피(Fast Protein Liquid Chromatography, Bio-Rad Laboratories, 미국)를 이용하여 상기 상층액으로부터 과발현된 상기 단일 치환 단백질들을 분리하였다.

이렇게 분리된 각각의 단백질을 SDS-PAGE를 통해 확인한 결과, 상기와 같은 일련의 과정에 의하여 His-Tag이 붙어 있는 40.88 kDa의 단일 치환된 단백질이 과발현되고, 형질전환체의 세포 용해물로부터 정제 및 분리되었음을 확인하였다(도 8).

[4-3] 단일 치환 단백질들의 활성 및 부분 입체 이성질체 비율 변화 분석

상기 실시예 [4-1]에서 확보된 각각의 상기 단일 치환 단백질들의 활성, 그리고 이들에 의해 촉매되는 반응 생성물의 부분입체 이성질체 비율 변화를 확인하였다. 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 실시예 [4-1]에서 확보된 0.01 ㎎/㎖의 단백질들을 100 mM의 글리신 및 100 mM의 아세트알데히드과 함께, 100 μM의 피리독살-5-인산(pyridoxal-5-phosphate, PLP) 및 1 mM의 MnCl₂가 포함된 50 mM의 CHES 완충용액(pH 9.0)에 첨가하고, 37 ℃에서 10분 동안 반응시켰다. 100 ℃에서 10분 동안 중탕하여 반응을 종료시킨 다음, 반응이 종료된 완충 용액에서 D-트레오닌의 농도를 측정하였다.

상기 D-트레오닌의 생성량은 OPA/NAC 전처리(OPA/NAC derivatization)한 후 HPLC를 통해 분석하였다. 상기 전처리 과정은 8 ㎎의 OPA(o-phthalaldelhyde)와 10 ㎎의 NAC(N-acetylcysteine)를 1 ㎖의 메탄올에 녹여 OPA/NAC 용액을 만들고, 25 ㎕의 분석할 샘플을 OPA/NAC 용액 50 ㎕와 0.4 M의 붕산나트륨 완충용액(sodium borate buffer, pH 10.4) 175 ㎕의 혼합물에 넣고 0.2 ㎛ 필터로 필터링함으로써 전처리된 샘플을 준비하였다.

상기와 같이 준비된 전처리된 샘플 20 ㎕을, VWD(Variable wavelength detector)와 역상 C18 칼럼(reverse-phase C18 column, Eclipse XDB-C18, 4.6×150 ㎜, 3.5 ㎛, Agilent)이 장착된 고압 액체 크로마토그래피에 주입하여, D-트레오닌의 농도를 측정하였다. 상기와 같은 고압 액체 크로마토그래피를 수행함에 이용된 이동상은 메탄올(이동상 A)과 50 mM의 아세트산나트륨(sodium acetate, pH 5.9)(이동상 B)으로 구성되고, 유속 1 ㎖/분의 유속으로 10분 동안 흘려주었는데, 0 내지 3분 동안은 이동상 A와 이동상 B를 3:7의 비율로, 3 내지 10분 동안은 이동상 A와 이동상 B를 7:3의 비율로 유지하였다. 그리고 생성된 D-트레오닌을 정량화하기 위해, 시판되는 D-트레오닌(Sigma-aldrich, 미국)과 D-알로트레오닌(TOKYO CHEMICAL INDUSTRY CO., LTD., 일본)을 이용하여 정량선을 작성하여 이용하였다.

그 결과, 상기와 같이 반응이 종료된 반응액에서는 D-트레오닌과 D-알로트레오닌의 비율 및 활성에 대한 변화가 관찰되었다(도 9). 부분입체 이성질체 과잉률(Diastereomeric excess) 분석에서, 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 야생형 단백질 효소보다 부분입체 이성질체 과량 비율이 향상된 치환 단백질 돌연변이체를 확인하였다(도 9). 서열번호 5, 4, 3의 아미노산 서열을 갖는 R147A, G179A, S312A는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 야생형에 비해 특이 활성도(Specific activity)가 낮지만, 부분입체 이성질체 과잉률(d.e.)이 야생형 55.4%에 비해 각각 79.5%, 93.2%, 79.5%로 월등히 향상된 것을 확인하였다. 따라서, R147, G179, S312가 부분 입체 이성질체 비율 변화에 관여하는 잔기임을 확인하였다.

[4-4] 알라닌 외 다른 아미노산 치환 단백질들의 활성 및 부분 입체 이성질체 비율 변화에 대한 연구

상기 실시예 [4-3]에서 R147, G179, S312 아미노산 잔기를 알라닌으로 치환한 경우, 부분입체 이성질체 특이성이 향상된 것을 확인하였다. 이에, 해당 잔기들을 크기와 전하에 따라 다른 종류의 아미노산으로 치환함으로써, D-트레오닌 합성에 대한 활성 및 부분입체 이성질체 비율 변화에 대해 더 개선된 효과가 나타나는지 여부를 확인하였다.

상기 위치의 해당 잔기들을 알라닌 외 아미노산 크기 및 전하에 따라 다른 아미노산으로 치환하여 효소 활성 및 부분입체 이성질체 비율 변화 연구를 진행하였다. 서열번호 5, 4, 3의 아미노산 서열을 가지는 R147A, G179A, S312A에서 알라닌을 각각 다른 아미노산으로 치환하여 R147K, R147Q, R147V, G179L, G179V, G179Y, S312K, S312Q, S312T 및 S312V의 치환 단백질을 제작하기 위하여, 서열번호 2의 염기 서열을 기초로 프라이머를 각각 설계하고 ㈜마크로젠에 의뢰하여 합성하였다.

상기 서열번호 2의 염기 서열을 포함하는 DNA를 주형(template)으로 하고, 상기 프라이머 쌍 각각을 이용하여 PCR을 수행함으로써 증폭된 각각의 PCR 산물을 Phusion, Q5, KOD 중합효소들을 이용하여 라이게이션/카이네이션 방법으로 염기 서열 말단부위를 각각 연결하였고, 염기 서열 분석(sequencing, ㈜마크로젠)을 통해, 해당 잔기들이 리신, 글루타민, 발린, 류신, 트레오닌의 아미노산을 암호화하는 염기 서열로 정확히 치환되었음을 확인하였다. 해당 염기 서열들은 각각 대장균 C2566 균주(Novagen, 미국)에 형질전환하였고, 20% 글리세린 용액을 첨가하여 냉동 보관하였다.

상기 방법으로 확보한 알라닌 외 다른 아미노산으로 단일 치환된 각각의 단백질들의 활성과 부분입체 이성질체 비율 변화를 확인하기 위해, 실시예 [4-2], [4-3]과 동일한 방법으로 단백질의 발현 및 정제를 확인하였고(도 10), 효소 반응과 부분입체 이성질체 비율의 분석을 진행하였다. 그 결과, 알라닌 외 다른 아미노산으로의 치환의 경우, 효소 활성과 부분 입체 이성질체 비율이 향상된 것은 확인되지 않았다(도 11). 따라서, R147. G179, S312의 아미노산이 각각 알라닌으로 치환된 경우에 부분입체 이성질체 비율이 향상되는 활성이 나타남을 확인할 수 있었다.

[4-5] 서열번호 9 내지 11의 아미노산 서열을 가지는 알라닌 다중 치환 단백질들의 활성 및 부분 입체 이성질체 비율 변화에 대한 연구

도 9 및 도 11의 결과에 따라 서열번호 5, 4, 3의 아미노산 서열을 갖는 R147A, G179A, S312A에서 D-트레오닌 입체 특이성이 향상된 것을 확인하였으므로, 해당 잔기들 간의 다중 알라닌 치환 도입을 통해 부분입체 이성질체 비율이 더 향상되는지 여부를 추가로 확인하였다.

상기 실시예 [4-1]에서 확보한 R147A, G179A, S312A 단백질을 암호화하는 서열번호 8, 7, 6의 염기 서열을 포함하는 DNA를 주형으로 하고, 상기에서 설계하여 합성한 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 진행함으로써, 해당 잔기들 간에 알라닌이 다중 치환된 PCR 산물을 확보하였다. 상기와 같이 PCR을 통해 증폭시킨 PCR 산물을 Phusion, Q5, KOD 중합효소들을 이용하여 라이게이션/카이네이션 방법으로 염기 서열 말단부위를 각각 연결하였고, 염기 서열 분석(sequencing, ㈜마크로젠)을 통해, 해당 잔기들이 다중의 알라닌을 암호화하는 염기 서열로 정확히 치환되었음을 확인하였다. 해당 염기 서열들은 각각 대장균 C2566 균주(Novagen, 미국)에 형질전환하였고, 20% 글리세린 용액을 첨가하여 냉동 보관하였다.

상기 방법으로 확보한 서열번호 9 내지 11의 아미노산 서열을 갖는 각각의 단백질들의 활성과 부분입체 이성질체 비율 변화를 확인하기 위해, 실시예 [4-2], [4-3]과 동일한 방법으로 단백질의 발현 및 정제를 확인하였고(도 12), 효소 반응과 분석을 진행하여 특이 활성도(Specific activity)로 비교하였다. 그 결과, 두개의 아미노산 잔기 G179와 S312를 알라닌으로 모두 치환한 경우에서 부분입체 이성질체 과잉률(d.e.)이 99.4%까지 증가하여 부분입체 이성질체 특이성이 향상됨을 확인하였다(도 13). 따라서, G179와 S312 아미노산이 모두 알라닌으로 치환된 경우에 D-트레오닌 특이적인 생산 활성이 향상됨을 확인할 수 있었다.

[4-6] 부분 입체 이성질체 비율 변화에 관여하는 잔기들의 동역학 연구

R147, G179, S312의 아미노산 알라닌 치환이 효소의 D-트레오닌 입체특이성에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 반응의 생성물인 D-트레오닌 및 D-알로트레오닌을 역반응의 기질로 이용하여 기질 동역학 연구를 진행하였다.

상기 실시예 [4-3]과 동일한 방법으로 각각의 정제된 서열번호 1, 5, 4, 3의 아미노산 서열을 갖는 0.01 ㎎/㎖의 야생형, R147A, G179A, S312A 효소를 50 mM CHES(pH 9.0), 0.1 mM 피리독살-5-인산, 1 mM 망간이온, 35 ℃의 조건으로 반응시켰으며, 0, 1, 2.5, 5, 10, 25, 50, 및 100 mM의 D-트레오닌 또는 D-알로트레오닌과 10분 동안 반응하였을 때, 이들의 분해 정도를 HPLC로 측정하였다.

그 결과, 서열번호 5, 4, 3의 아미노산 서열을 갖는 R147A, G179A, S312A의 경우, 기질의 전환 정도를 나타내는 지표인 k_cat 수치가 D-알로트레오닌에 대해 그 감소량이 큰 것을 확인하였다(하기 표 1). 이는 R147A, G179A, S312A의 D-알로트레오닌에 대한 입체특이성이 감소하여 나타나는 결과로, D-알로트레오닌으로의 전환량이 감소하면서 상대적으로 D-트레오닌의 비율이 증가된 특징이 있는 것임을 확인할 수 있었다.

단백질	기질	Km(mM)	k cat (sec-1)	k cat / Km(sec-1mM-1)
야생형	D-트레오닌	17.4 ± 0.39	239.0 ± 2.83	13.7 ± 0.64
	D-알로트레오닌	23.1 ± 2.02	206.0 ± 8.30	8.9 ± 0.86
R147A	D-트레오닌	12.0 ± 0.55	152.9 ± 2.18	12.8 ± 0.62
	D-알로트레오닌	3.6 ± 0.24	50.0 ± 0.90	14.0 ± 0.97
G179A	D-트레오닌	91.2 ± 9.04	72.4 ± 4.16	0.8 ± 0.09
	D-알로트레오닌	17.5 ± 2.81	6.1 ± 0.53	0.4 ± 0.06
S312A	D-트레오닌	13.4 ± 0.76	175.1 ± 3.84	13.1 ± 0.80
	D-알로트레오닌	2.6 ± 0.31	43.1 ± 1.82	16.3 ± 2.02

부분 입체 특이성이 개량된 효소를 이용한 D-트레오닌 특이적 생산

상기 실시예 4에서 확인된 바와 같이, 구조 기반의 효소 개량을 통해 D-트레오닌으로의 입체특이성을 향상시키는 잔기를 확인하였고, 그 중에서도 D-트레오닌을 특이적으로 합성하는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 개량 효소(G179A)와 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 개량 효소(G179A+S312A)를 확보하였고, 상기 확보된 개량 효소를 이용한 D-트레오닌의 특이적 생산을 확인하기 위해, 최적의 기질 조건 및 시간에 따른 생산량을 확인하였다.

[5-1] 글리신 비율의 영향

서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 효소(G179A)와 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 효소(G179A+S312A) 활성에, 기질인 글리신의 비율이 미치는 영향을 확인하기 위해 상기 실시예 [4-2]와 동일한 방법으로 정제 및 분리한 야생형 효소 0.01 ㎎/㎖, G179A 효소 0.1 ㎎/㎖, G179A+S312A 효소 0.25 ㎎/㎖와 아세트알데히드 100 mM, 피리독살-5-인산 100 μM 및 Mn²⁺ 1 mM가 포함된 50 mM의 CHES 완충용액(pH 9.0)에 글리신을 0, 50, 75, 100, 125, 250, 및 500 mM로 각각 첨가하여 35 ℃에서 10분 동안 반응시켰다. 상기 반응을 종료시키기 위해 100 ℃에서 10분 동안 중탕하였고 상기 실시예 [4-3]과 동일한 방법인 OPA/NAC 유도체화를 경유하는 HPLC 분석을 통해, 상기 반응액에서 D-트레오닌과 D-알로트레오닌의 농도를 측정하여 그 상대값을 비교하였다.

그 결과, D-트레오닌의 특이적 합성은 글리신과 아세트알데히드의 비율이 4:1인 경우에 가장 우수한 것으로 확인되었다(도 14).

[5-2] 아세트알데히드 비율의 영향

서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 효소(G179A)와 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 효소(G179A+S312A) 활성에, 기질인 아세트알데히드의 비율이 미치는 영향을 확인하기 위해 상기 실시예 [4-2]와 동일한 방법으로 정제 및 분리한 야생형 효소 0.01 ㎎/㎖, G179A 효소 0.1 ㎎/㎖, G179A+S312A 효소 0.25 ㎎/㎖와 글리신 400 mM, 피리독살-5-인산 100 μM 및 Mn²⁺ 1 mM가 포함된 50 mM의 CHES 완충용액(pH 9.0)에 아세트알데히드를 0, 50, 100, 200, 300, 및 400 mM로 각각 첨가하여 35 ℃에서 10분 동안 반응시켰다. 상기 반응을 종료시키기 위해 100 ℃에서 10분 동안 중탕하였고 상기 실시예 [4-3]과 동일한 방법인 OPA/NAC 유도체화를 경유하는 HPLC 분석을 통해, 상기 반응액에서 D-트레오닌과 D-알로트레오닌의 농도를 측정하여 그 상대값을 비교하였다.

그 결과, D-트레오닌의 특이적 합성은 글리신과 아세트알데히드의 비율이 4:1인 경우에 가장 우수한 것으로 확인되었다(도 15).

[5-3] 시간에 따른 D-트레오닌 생산량 변화

도 14 및 도 15의 결과를 통해 확인한 최적의 기질 비율 조건을 이용하여, 서열번호 52, 132 아미노산 서열을 갖는 G179A 및 G179A+S312A 효소의 D-트레오닌의 특이적 생산을 비교하기 위해, 시간에 따른 D-트레오닌의 전환량 및 부분입체 이성질체 과잉률을 확인하였다. 상기 실시예 [4-2]와 동일한 방법으로 정제 및 분리한 야생형 효소 0.01 ㎎/㎖, G179A 효소 0.1 ㎎/㎖, G179A+S312A 효소 0.25 ㎎/㎖와 글리신 400 mM, 아세트알데히드 100 mM, 피리독살-5-인산 100 μM 및 Mn²⁺ 1 mM가 포함된 50 mM의 CHES 완충용액(pH 9.0)을 35℃에서 15, 30, 60, 90, 120, 150, 180분 동안 반응시켰다. 그리고 상기 반응을 종료시키기 위해 100 ℃에서 10분 동안 중탕하였고 상기 실시예 [4-3]과 동일한 방법인 OPA/NAC 유도체화를 경유하는 HPLC 분석을 통해, 상기 반응액에서 D-트레오닌과 D-알로트레오닌의 농도를 측정하여 그 상대값을 비교하였다.

그 결과, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 야생형에 비해 서열번호 4 및 10의 아미노산 서열을 갖는 G179A 효소 및 G179A+S312A 효소에서 D-트레오닌을 특이적으로 생산하는 것을 확인하였고, 그 중에서도 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 G179A+S312A 효소는 60분만에 95%의 부분입체 이성질체 과잉률(Diastereomeric excess)의 비율로 46 mM의 D-트레오닌을 생성하는 것을 확인하였다(도 16).

상기와 같은 실험 결과들로 볼 때, 본 발명의 서열번호 4, 10의 아미노산 서열을 갖는 상기 효소들은 10분만에 각각 16.4 mM, 18.7 mM의 D-트레오닌을, 각각 95%, 98%의 부분입체 이성질체 과잉률로 특이적으로 합성할 수 있다. 그 중에서도 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 효소(G179A+S312A)는 시중에 판매하는 D-트레오닌과 동일한 수준의 순도로 D-트레오닌을 합성할 수 있는 것이며, 이는 기존에 보고된 어떤 효소들보다도 D-트레오닌에 대한 특이성이 가장 우수한 것이다.

상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 예시적으로 설명하였으나, 본 발명의 범위는 상기와 같은 특정 실시예에만 한정되지 아니하며, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 특허청구범위에 기재된 범주 내에서 적절하게 변경이 가능할 것이다.

<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF BIOSCIENCE AND BIOTECHNOLOGY <120> A Novel Enzyme for Production of D-threonine, and A Method for Sterospecific Preparing D-threonine Using The Same <130> 2019-DPA-3220 <160> 14 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 376 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Filomicrobium marinum <400> 1 Met Arg Ala Pro Ala Arg Leu Gly Ile Pro Leu Ala Asp Val Asp Thr 1 5 10 15 Pro Ala Leu Ile Leu Asp Leu Asp Ala Phe Glu Arg Asn Leu Gln Thr 20 25 30 Met Ala Asp Trp Ala Lys Ser Lys Asn Val Arg Leu Arg Pro His Ala 35 40 45 Lys Ser His Lys Cys Pro Ala Ile Ala His Arg Gln Met Ala Leu Gly 50 55 60 Ala Val Gly Val Cys Cys Gln Lys Val Ser Glu Ala Glu Val Met Val 65 70 75 80 Asp Ala Gly Ile Thr Asn Val Leu Ile Ser Asn Glu Val Val Gly Arg 85 90 95 Thr Lys Leu Glu Ala Leu Ala Gln Leu Ala Leu Arg Ala Arg Met Gly 100 105 110 Val Cys Val Asp Asp Ile Arg Gln Ile Arg Asp Leu Ser Glu Ala Met 115 120 125 His Ala Ala Gly Ala Thr Ile Asp Val Leu Val Glu Ile Asn Ile Gly 130 135 140 Gly Asn Arg 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<212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R147A+G179A <400> 12 atgcgtgccc ctgcccgttt gggcatccct cttgctgatg ttgacacacc agccctgatc 60 ttggacttag atgcatttga acgtaatctg cagacaatgg ctgactgggc aaaatcaaaa 120 aatgtacgtc ttcgcccgca cgccaagtcg cacaagtgcc cggcgattgc ccatcgtcag 180 atggctttgg gggccgtggg cgtctgttgc cagaaggtgt cggaggcaga agtcatggtt 240 gatgcgggga ttaccaacgt attgatcagt aacgaagtgg tgggtcgcac gaagttggaa 300 gctctggcac aactggcgct tcgtgcccgc atgggggtat gcgtagatga tattcgtcag 360 attcgcgatc tgtccgaggc catgcacgca gccggagcta ccattgatgt tctggttgaa 420 attaacattg gcggaaacgc gtgtggtgtg gagccggggg atcccgcagt acgtttgggc 480 gctgcggtgg cacaggcgga cgggcttcgc tttgctgggt tgcagagcta tgacgcgatc 540 acgcagcacg tccgtgatcc cgatgaacgt aaagcacgcg cggcgcgcgc tggggatgtt 600 acggcacaaa caatcgcggc cctgcgcgac atcggcttag aatgtgaaac ggttgggggc 660 gccggaacag gctccttcgc cttcgacggg atgtcggggg tatggaatga gttgcaacca 720 ggaagttatg cctttatgga tgccgattac gctcgtaata caccggctgg aggggacgtt 780 ccaaagttcg agcacgcgat 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Claims (16)

1. 필로마이크로비움 마리넘(Filomicrobium marinum) 유래 D-트레오닌 알돌라아제(D-threonine aldolase)에서,
   서열번호 1의 아미노산 서열의 147 번째 아르기닌(arginine)과 대응되는 위치의 아르기닌, 179 번째 글리신(glycine)과 대응되는 위치의 글리신 및 312 번째 세린(serine)과 대응되는 위치의 세린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산이 알라닌(alanine)으로 치환되거나, 또는
   상기 179 번째 글리신(glycine)과 대응되는 위치의 글리신 및 상기 312 번째 세린과 대응되는 위치의 세린이 모두 알라닌으로 치환된, D-트레오닌 생산 효소.
2. 청구항 1에 있어서,
   상기 D-트레오닌 생산 효소는 글리신 및 아세트알데히드를 기질로 하는 것인, D-트레오닌 생산 효소.
3. 삭제
4. 청구항 1에 있어서,
   상기 D-트레오닌 생산 효소는 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것인, D-트레오닌 생산 효소.
5. 청구항 1, 청구항 2 및 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 D-트레오닌 생산 효소는 D-트레오닌 및 D-알로트레오닌을 생산하고, 상기 반응 생성물 중 D-트레오닌의 비율이 85% 이상인 것인, D-트레오닌 생산 효소.
6. 청구항 1의 D-트레오닌 생산 효소를 암호화하는 유전자.
7. 청구항 6에 있어서,
   상기 유전자는 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 13으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 염기 서열로 이루어진 것인, 유전자.
8. 청구항 6 또는 청구항 7의 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터.
9. 청구항 8의 재조합 발현벡터가 숙주세포에 도입된 형질전환체.
10. 청구항 9에 있어서,
    상기 숙주세포는 대장균인, 형질전환체.
11. 청구항 9의 형질전환체를 배양하는 단계; 및
    상기 형질전환체의 배양물로부터 D-트레오닌 생산 효소를 분리하는 단계;를 포함하는 D-트레오닌 생산 효소의 제조 방법.
12. 청구항 1, 청구항 2 및 청구항 4 중 어느 한 항의 D-트레오닌 생산 효소를 유효성분으로 포함하는 D-트레오닌 생산용 조성물.
13. 청구항 1, 청구항 2 및 청구항 4 중 어느 한 항의 D-트레오닌 생산 효소를 글리신 및 아세트알데히드와 함께 반응시키는 단계;를 포함하는, 인 비트로(in vitro)에서의 D-트레오닌 생산 방법.
14. 청구항 13에 있어서,
    상기 글리신 및 아세트알데히드는 1:1 내지 10:1의 비율로 효소와 반응시키는 것인, 인 비트로(in vitro)에서의 D-트레오닌 생산 방법.
15. 청구항 9의 형질전환체를 글리신 및 아세트알데히드의 존재 하에서 배양하는 단계;를 포함하는, 인 비보(in vivo)에서의 D-트레오닌 생산 방법.
16. 청구항 15에 있어서,
    상기 글리신 및 아세트알데히드는 1:1 내지 10:1의 비율로 존재하는 것인, 인 비보(in vivo)에서의 D-트레오닌 생산 방법.

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