KR20230077068A - CYP153A33 효소 변이체, 및 이를 이용한 α,ω-디올 화합물의 생산 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 CYP153A33 효소 변이체에 관한 것으로, 마리노박터(Marinobacter) 속 미생물 유래의 서열번호 1의 아미노산 서열에서 136번째 프롤린(proline, P)이 다른 아미노산으로 치환된 CYP153A33 효소 변이체, 이를 암호화하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 CYP153A33 효소 변이체는 야생형의 CYP153A33 효소들에 비해 과산화 활성이 감소되어 α,ω-디올 화합물을 보다 높은 수율로 생산할 수 있는 장점이 있다.

Description

CYP153A33 효소 변이체, 및 이를 이용한 α,ω-디올 화합물의 생산 방법{A Mutants of CYP153A33 Enzyme, and A Method for Preparing α,ω-diol Compounds Using The Same}

본 발명은 CYP153A33 효소 변이체에 관한 것이다.

바이오플랫폼 화합물은 바이오매스 유래 원료를 기반으로 하여 생물학적 또는 화학적 전환을 통해 생산된 것으로, 고분자 모노머, 신소재 등의 합성에 사용되고 있다.

바이오플랫폼 화합물 중 α,ω-디올 화합물은 폴리에스테르의 단량체로 사용되는 물질로서, 폴리에스테르는 그 뛰어난 성질로부터 섬유용, 필름용, 병용을 비롯해 널리 여러 가지 용도로 사용되고 있다. 예를 들면, 에틸렌글리콜과 테레프탈산의 중축합으로 얻어지는 폴리에틸렌테레프탈레이트는 기계적 강도, 화학 특성 등에 뛰어나서 많은 용도에 사용되고 있고, 의료용(衣料用)으로 가장 적합한 합성 섬유로서 전세계에서 대량 생산되고 있다. 또한, 1,3-프로판디올과 테레프탈산을 원료로 하는 폴리트리메틸렌테레프탈레이트는 최근 저렴한 1,3-프로판디올 합성법이 개발된 것도 있어서 시장은 증가 경향에 있고, 신장탄성 회복성이 뛰어나고, 영률이 낮은 폴리머 특성을 살린 소프트한 촉감의 의료 용도로서의 전개가 기대된다. 아울러, 최근에는 석유 자원의 고등(高騰)·고갈을 우려하여 바이오매스 자원 유래의 폴리에스테르가 주목받고 있다.

α,ω-디올 화합물을 생산하는 방법은 크게 화학적 합성법과 효소나 미생물을 이용하는 생물학적 합성법으로 나눌 수 있다. 화학적 합성법에 따른 알코올의 산화에 의한 α,ω-디올 화합물의 제조 과정의 경우에는 산화가 과하게 진행되게 의한 카르복시산이 생성되는 것을 방지하기 위해 생성된 α,ω-디올 화합물을 즉시 반응계 외에 취출하거나, α,ω-디올 화합물을 즉시 안정적이고 재생하기 쉬운 유도체로 바꾸거나, 또는 불활성 용매 중에서 산화 반응을 수행하는 등의 과정이 필요하고, 위험한 시약이나 고가의 촉매를 이용하여야 할 뿐만 아니라, 반응 조건이 엄격하다는 등의 문제점이 있었다. 그에 비해, 생물학적인 합성 방법은 α,ω-디올 화합물을 간단한 공정으로 직접 생산할 수 있어, 위와 같은 문제점을 가지고 있는 화학적 합성법을 대체할 수 있는 생산기술로 주목받고 있다.

상기와 같은 생물학적 합성 방법에는 관련 효소의 개발이 필수적이라고 할 것인데, 이에 관여하는 효소의 하나로 알코올을 산화시켜 α,ω-디올 화합물로 전환시키는 활성을 갖는 촉매인 CYP153A33 효소가 있다. 그런데, 위와 같은 CYP153A33 효소는 알코올을 산화시켜 α,ω-디올 화합물로 전환시키기도 하지만, 이 역시 생성된 α,ω-디올 화합물을 ω-히드록시알칸산 화합물이나 α,ω-알칸이산 화합물로 과산화시켜 α,ω-디올 화합물만을 높은 수율로 얻는 데는 한계가 있어서 종래의 CYP153A33 효소를 적용한 생물학적 합성 방법은 산업적으로 이용하기에는 불충분하였다.

이에, 보다 과산화 활서이 감소된 신규의 CYP153A33 효소 변이체에 관한 연구·개발이 더욱 필요한 실정이다.

본 발명의 목적은 야생형 CYP153A33 효소에 비해 과산화 활성이 감소된 CYP153A33 효소 변이체와 이를 이용하여 α,ω-디올 화합물을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 서열번호 1의 아미노산 서열에서, 136번째 프롤린(proline, P)이 다른 아미노산으로 치환된 CYP153A33 효소 변이체를 제공한다.

또한, 상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 다른 측면은 상기 CYP153A33 효소 변이체를 암호화하는 유전자를 제공한다.

또한, 상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터, 및 상기 재조합 발현 벡터가 숙주세포에 도입된 형질전환체를 제공한다.

또한, 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 CYP153A33 효소 변이체를 포함하는 상기 α,ω-디올 화합물 생산용 조성물, 및 상기 CYP153A33 효소 변이체를 알코올과 함께 반응시키는 단계를 포함하는 인 비트로(in vitro)에서의 α,ω-디올 화합물 생산 방법을 제공한다.

아울러, 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 형질전환체를 알코올이 존재하는 환경에서 배양하는 단계를 포함하는 인 비보(in vivo)에서의 α,ω-디올 화합물 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 CYP153A33 효소 변이체는 야생형의 CYP153A33 효소에 비해 과산화 활성이 감소되어 있어서 알코올로부터 특히 α,ω-디올 화합물을 생산해 내는데 이용될 수 있고, 알코올을 기질로 α,ω-디올 화합물을 생성함에 있어 독성 물질이나 환경오염을 유발하는 부산물이 발생하지 않기 때문에, α,ω-디올 화합물을 친환경적이면서도 높은 수율로 생산할 수 있는 장점이 있다.

다만, 본 발명의 효과는 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 하기의 기재로부터 당업자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.

도 1은 본 발명의 CYP153A33 효소 변이체가 도입된 형질전환체와 야생형의 CYP153A33 효소가 도입된 형질전환체에 10mM의 1-도데칸올(1-dodecanol)을 기질로 공급하고 시간의 경과에 따라 배양물 내에 존재하는 α,ω-도데칸디올(α,ω-dodecanediol)(A), α,ω-도데칸디카르복시산(α,ω-dodecanoic acid)(B) 및 ω-히드록시도데칸카르복시산(ω-hydroxydodecanoic acid)(C)의 생성량을 확인한 결과이다.
도 2는 본 발명의 CYP153A33 효소 변이체가 도입된 형질전환체와 야생형의 CYP153A33 효소가 도입된 형질전환체에 10mM의 1-헥산올(1-hexanol, C6), 1-노난올(1-nonanol, C9), 1-데칸올(1-decanol, C10), 1-운데칸올(1-undecanol, C10), 1-테트라데칸올(1-tetradecanol, C14) 및 1-헥사데칸올(1-hexadecanol, C16)을 공급하면서 각각 배양한 후, 배양물 내에 존재하는 α,ω-알칸디올(A)과 과산화물인 α,ω-알칸디카르복시산(B)의 생성량을 확인한 결과이다.

먼저, 본 발명의 명세서에서 이용된 용어를 설명한다.

본 발명에서 일컫는 'CYP153A33 효소'는 기본적으로 하기 반응식과 같이 α-알칸올(A)의 ω-위치를 산화시켜 히드록시기기(-OH)를 도입하여 α,ω-알칸디올(α,ω-alkanediol) 화합물(B)을 생성하거나, 또는 α-위치의 히드록시기를 과산화시켜 카르복실기(-COOH)를 도입하여 α-알칸산(α-alkanoic acid) 화합물(C)을 생성하는 활성을 가진 효소를 의미한다. 한편, 상기 CYP153A33 효소는 상기 α,ω-알칸디올(α,ω-alkanediol) 화합물(B)의 ω-위치의 히드록시기를 과산화시켜 카르복실기(-COOH)를 도입하거나 또는 상기 α-알칸산(α-alkanoic acid) 화합물(C)의 ω-위치를 산화시켜 히드록시기기(-OH)를 도입하여 ω-히드록시알칸산(ω-hydroyalkanoic acid) 화합물(D)을 생성하거나, 나아가 상기 ω-히드록시알칸산(ω-hydroyalkanoic acid) 화합물(D)의 ω-위치의 히드록시기를 과산화시켜 카르복실기(-COOH)를 도입하여 α,ω-알칸이산(α,ω-alkanoic acid) 화합물을 생성하기도 한다.

[반응식]

본 발명에서 일컫는 '과산화' 활성은 화합물 내에 존재하는 히드록시기를 산화시켜 화합물 내에 카르복실기를 도입하는 활성을 의미한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

1. CYP153A33 효소 변이체

본 발명의 일 측면은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 적어도 하나의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 CYP153A33 효소 변이체를 제공한다.

상기 서열번호 1의 아미노산 서열은 마리노박터(Marinobacter) 속 미생물, 보다 구체적으로는 마리노박터 아쿠애올레이(Marinobacter aquaeolei)로부터 유래한 것으로서, CYP153A33 효소의 활성을 갖는 단백질이다.

본 발명의 CYP153A33 효소 변이체는 상기 서열번호 1의 아미노산 서열에서 136번째 프롤린(proline, P)이 다른 아미노산으로 치환된 것이다.

상기 변이체에서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열 중 136번째 프롤린은 글리신(glycine, G), 알라닌(alanine, A), 발린(valine, V), 류신(leucine, L) 및 이소류신(isoleucine, I)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로 치환될 수 있다. 특히, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열 중 136번째 프롤린은 글리신, 알라닌 또는 발린으로, 예컨대 알라닌으로 치환될 수 있다. 구체적으로, 상기 변이체는 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지는 것일 수 있다.

상기 변이체들은 기본적으로 CYP153A33 효소로서의 활성을 가진다. 따라서 상기 변이체는 알코올을 α,ω-디올 화합물로 변환할 수 있고, 이 과정에서 α-알칸산(α-alkanoic acid) 화합물, ω-히드록시알칸산(ω-hydroyalkanoic acid) 화합물 및 α,ω-알칸이산(α,ω-alkanoic acid) 화합물이 함께 생성되기도 한다. 그러나, 상기 변이체들은 종래의 CYP153A33 효소, 예컨대 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 CYP153A33 효소에 비해 과산화 활성이 감소되어 있어서, α-위치나 ω-위치에 히드록시기를 도입하는 활성은 우수하지만 α-위치나 ω-위치에 존재하는 히드록시기를 추가적으로 산화시켜 카르복시산을 도입하는 활성은 낮다. 따라서 상기 변이체들을 알코올과 반응시키면 특히 α,ω-디올 화합물을 보다 높은 비율로 생산할 수 있다.

상기 알코올은 중쇄 또는 장쇄의 지방 알코올일 수 있고, 예컨대 상기 지방 알코올은 α-알칸올일 수 있고, 특히 상기 지방 알코올은 탄소수가 12 내지 14인 것일 수 있다.

또한, 상기 변이체들은 상기와 같은 감소된 과산화 활성에 관한 특성에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 추가적으로 변형될 수 있다. 상기와 같은 특성에 영향을 미치지 않는 단백질 또는 펩티드 수준에서의 변형은 당해 분야에 공지되어 있고, 예컨대 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 변형될 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 마리노박터 아쿠애올레이(Marinobacter aquaeolei)에서 유래한 서열번호 1의 아미노산 서열의 136번째 프롤린을 알라닌으로 치환한 변이체(P136A)를 제작하였고, 상기 변이체가 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 야생형의 CYP153A33 효소에 비해 감소된 과산화 활성을 나타내고, 그로 인해 야생형의 CYP153A33 효소에 비해 α,ω-디올 화합물을 훨씬 높은 비율로 생성할 수 있음을 확인하였다(도 1 및 도 2 참고).

2. CYP153A33 효소 변이체의 유전자, 발현 벡터 및 형질전환체

본 발명의 다른 측면은 상기 CYP153A33 효소 변이체를 암호화하는 CYP153A33 효소 변이체의 유전자를 제공한다.

예컨대, 상기 CYP153A33 효소 변이체의 유전자는 서열번호 3의 아미노산 서열을 암호화하는 것일 수 있고, 특히 서열번호 4의 염기 서열로 이루어지는 것일 수 있다. 그러나 상기 CYP153A33 효소 변이체의 유전자는 암호화 영역으로부터 발현되는 상기 변이체의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 암호화 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 암호화 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변이가 이루어질 수 있다. 결국, 상기 CYP153A33 효소 변이체의 유전자는 이와 동등한 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 한, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 이러한 변이 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다.

본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 CYP153A33 효소 변이체의 유전자가 포함된 재조합 발현 벡터 및 상기 발현 벡터가 도입된 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 재조합 발현 벡터는 상기 CYP153A33 효소 변이체의 유전자를 포함한다.

상기 발현 벡터는 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 박테리오파지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

상기 재조합 발현 벡터는 본 발명의 CYP153A33 효소 변이체를 발현 또는 생산하고자 하는 숙주 세포의 종류에 따라 프로모터(promoter), 터미네이터(terminator), 엔핸서(enhancer) 등과 같은 발현조절서열, 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 목적에 따라 조합할 수 있다.

상기 발현 벡터는 벡터가 도입된 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 추가로 포함할 수 있고, 복제 가능한 발현 벡터인 경우 복제 기원을 포함할 수 있다.

또한, 상기 재조합 발현 벡터는 발현 단백질의 정제를 용이하게 하기 위한 서열을 포함할 수 있으며, 구체적으로 본 발명의 CYP153A33 효소 변이체를 암호화하는 유전자에 작동 가능하도록 분리정제용 태그를 암호화하는 유전자가 연결될 수 있다. 이때, 상기 분리정제용 태그는 GST, poly-Arg, FLAG, 히스티딘-태그(His-tag) 및 c-myc 등이 단독으로 사용되거나 이들 중 두 개 이상을 순차적으로 연결하여 사용할 수도 있다.

상기 CYP153A33 효소 변이체를 암호화하는 유전자는 제한효소 절단 위치를 통해 클로닝될 수 있으며, 상기 벡터에 단백질 절단효소 인식 부위를 암호화하는 유전자가 사용된 경우에는 상기 CYP153A33 효소 변이체의 유전자와 틀이 맞도록(in frame) 연결되어, 상기 효소를 수득한 후 단백질 절단효소로 절단 시, 원래 형태의 CYP153A33 효소 변이체가 생산될 수 있도록 할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는, 본 발명의 CYP153A33 효소 변이체의 유전자를 플라스미드 벡터인 pET24ma에 삽입함으로써 재조합 클로닝 벡터를 제조하였다. 상기의 클로닝 벡터의 제조에 이용된 pET24ma 이외에도 다양한 원핵세포용 벡터 또는 진핵세포용(pPIC 및 pPICZ 등) 벡터가 알려져 있으므로 발현의 목적에 따라 상기 벡터 이외의 다양한 발현 벡터를 이용할 수 있다.

본 발명의 상기 재조합 발현 벡터는 CYP153A33 효소 변이체의 유전자가 포함되어 있어 이를 생산할 수 있는 벡터로서 유용하게 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 형질전환체에는 CYP153A33 효소 변이체를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터가 도입된다.

본 발명에 따른 상기 재조합 발현 벡터를 발현 목적에 따라 박테리아, 효모, 대장균, 진균류, 식물 세포 및 동물 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 적절한 숙주 세포에 형질 전환시킴으로써 형질전환체를 제조할 수 있다. 예컨대, 상기 숙주 세포는 대장균(E. coli BL21(DE3), DH5α, BW25113, BW25113ΔfadD 등) 또는 효모 세포 (Saccharomyces 속, Pichia 속 등) 등일 수 있다. 이때, 숙주 세포의 종류에 따라 적절한 배양 방법 및 배지 조건 등은 당해 분야의 공지 기술로부터 당업자가 용이하게 선택할 수 있다.

본 발명의 형질전환체 제조를 위한 재조합 발현 벡터의 도입 방법은 공지의 기술, 즉 열 충격법, 전기충격법 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 대장균을 숙주 세포로 하여 본 발명의 CYP153A33 효소 변이체를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 대장균에 형질 전환 시켜 형질전환체를 제조하였다.

상기 형질전환체로부터 발현된 단백질은 신규의 변이체이므로, 상기 형질전환체를 대량 배양하여 상기 유전자를 발현시킴으로써 상기 CYP153A33 효소 변이체의 대량 생산을 용이하게 할 수 있다.

3. CYP153A33 효소 변이체의 생산 방법

아울러, 본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 CYP153A33 효소 변이체를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터가 도입된 형질전환체를 이용하여 CYP153A33 효소 변이체를 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명의 CYP153A33 효소 변이체의 생산 방법은 1) 본 발명의 CYP153A33 효소 변이체를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터가 도입된 형질전환체를 배양하는 단계; 2) 상기 단계 1)에서 배양된 형질전환체에서 상기 CYP153A33 효소 변이체를 암호화하는 유전자의 발현을 유도하는 단계; 및 3) 상기 단계 2)에서 CYP153A33 효소 변이체의 유전자 발현이 유도된 형질전환체의 배양물로부터 CYP153A33 효소 변이체를 분리하는 단계;를 포함한다.

상기 단계 1)의 CYP153A33 효소 변이체를 암호화하는 유전자의 N-말단에는 분리정제용 태그를 암호화하는 유전자 또는 단백질 절단효소 절단 위치가 추가로 연결될 수 있고, 이로 인해 재조합 CYP153A33 효소 변이체의 정제 또는 원래 형태의 CYP153A33 효소 변이체의 수득이 가능할 수 있다.

상기 단계 1)의 형질전환체의 배양은 공지된 방법에 따라서 수행될 수 있고, 배양 온도, 배양 시간 및 배지의 pH 등의 조건은 적절하게 조절될 수 있다. 또한, 배양 방법에는 회분식 배양(batch culture), 연속식 배양(continuous culture) 및 유가식 배양(fed-batch culture)이 포함될 수 있다. 사용되는 배양 배지는 특정한 균주의 요구 조건을 적절하게 충족시켜야 한다.

상기 단계 3)의 상기 배양에 의해 생성된 배양물로부터 CYP153A33 효소 변이체의 분리는 원심분리, 여과 등 당해 분야에서 통상적으로 수행되는 방법을 실시할 수 있다. 또한, 상기 방법으로 분리된 CYP153A33 효소 변이체는 통상의 방식으로 정제될 수 있으며, 예를 들어, 염석(예를 들어 황산암모늄 침전, 인산나트륨 침전), 용매 침전(아세톤, 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 침전), 투석, 겔 여과, 이온 교환, 역상 칼럼 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피 및 한외여과 등의 기법을 단독 또는 조합하여 본 발명의 CYP153A33 효소 변이체를 정제할 수 있다.

4. α,ω-디올 화합물의 생산 방법 및 α,ω-디올 화합물 생산용 조성물

본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 CYP153A33 효소 변이체를 이용하여 알코올로부터 α,ω-디올 화합물을 인 비트로(in vitro)에서 생산하는 방법 및 인 비트로(in vitro)에서 α,ω-디올 화합물의 생산에 이용되는 α,ω-디올 화합물 생산용 조성물을 제공한다.

본 발명의 α,ω-디올 화합물 생산용 조성물은 본 발명의 CYP153A33 효소 변이체를 포함한다.

또한, 본 발명의 α,ω-디올 화합물의 인 비트로(in vitro) 생산 방법은 1) 본 발명의 CYP153A33 효소 변이체를 알코올과 반응시키는 단계, 및 2) 상기 단계 1)에서의 반응 결과 생성된 반응 생성물로부터 α,ω-디올 화합물을 회수하는 단계를 포함한다.

상기 α,ω-디올 화합물의 생산 방법 및 α,ω-디올 화합물 생산용 조성물은 인 비트로(in vitro)에서 본 발명의 CYP153A33 효소 변이체의 효소 활성을 이용하는 것이므로, 상기 CYP153A33 효소 변이체를 이용하여 그 기질인 알코올로부터 α,ω-디올 화합물을 생성하는 것이다. 따라서 상기 기질로 이용되는 알코올의 종류에 따라 생성되는 α,ω-디올 화합물의 종류 또한 달라지는 것이고, 중쇄 또는 장쇄의 알코올을 기질로 이용하는 경우 중쇄 또는 장쇄의 α,ω-디올 화합물이 생성된다. 예컨대, 기질로 α-도데칸올이 이용되는 경우에는 α,ω-디올 화합물로 α,ω-도데칸디올이 생성되고, 기질로 α-테트라데칸올이 이용되는 경우에는 α,ω-디올 화합물로 α,ω-테트라데칸디올가 생성되는 것이다.

상기 단계 1)의 반응은 20℃ 내지 55℃의 온도 범위, 바람직하게는 22℃ 내지 45℃의 온도 범위, 더욱 바람직하게는 25℃ 내지 40℃의 온도에서 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다. 또한, 상기 단계 1)의 반응은 7 내지 10의 pH 범위, 바람직하게는 8 내지 9.5의 pH 범위, 더욱 바람직하게는 8.5 내지 9의 pH에서 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다.

상기 단계 1)의 반응에서, 기질인 상기 알코올은 중쇄 또는 장쇄의 지방 알코올일 수 있고, 예컨대 상기 지방 알코올은 α-알칸올일 수 있고, 특히 상기 지방 알코올은 탄소수가 12 내지 14인 것일 수 있다. 또한, 상기 알코올은 외부에서 주입되는 것이 바람직하고, 상기 알코올은 목적하는 α,ω-디올 화합물의 양에 맞추어 충분한 양이 주입되어야 한다. 상기 알코올의 주입은 연속적으로 수행될 수 있다. 특히 상기 알코올이 연속적으로 주입되는 경우, 상기 CYP153A33 효소 변이체에 의하여 α,ω-디올 화합물을 지속적으로 생성할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 형질전환체를 이용하여 α,ω-디올 화합물을 인 비보(in vivo)에서 생산하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명의 α,ω-디올 화합물의 인 비보(in vivo) 생산 방법은 1) 상기 형질전환체를 알코올이 존재하는 환경에서 배양하는 단계, 및 2) 상기 단계 1)에서의 배양물로부터 α,ω-디올 화합물을 회수하는 단계를 포함한다.

상기 인 비보(in vivo)에서의 α,ω-디올 화합물의 생산 방법은 형질전환체 내에서 발현되는 본 발명의 CYP153A33 효소 변이체의 효소 활성을 이용하는 것이므로, 상기 CYP153A33 효소 변이체를 이용하여 그 기질인 알코올로부터 α,ω-디올 화합물을 생성하는 것이다. 따라서 상기 기질로 이용되는 알코올의 종류에 따라 생성되는 α,ω-디올 화합물의 종류 또한 달라지는 것이고, 중쇄 또는 장쇄의 알코올을 기질로 이용하는 경우 중쇄 또는 장쇄의 α,ω-디올 화합물이 생성된다. 예컨대, 기질로 α-도데칸올이 이용되는 경우에는 α,ω-디올 화합물로 α,ω-도데칸디올이 생성되고, 기질로 α-테트라데칸올이 이용되는 경우에는 α,ω-디올 화합물로 α,ω-테트라데칸디올가 생성되는 것이다.

상기 단계 1)의 반응에서, 기질인 상기 알코올은 중쇄 또는 장쇄의 지방 알코올일 수 있고, 예컨대 상기 지방 알코올은 α-알칸올일 수 있고, 특히 상기 지방 알코올은 탄소수가 12 내지 14인 것일 수 있다. 또한, 상기 알코올이 공급되는 환경은 외부에서 인위적으로 알코올을 공급해 주거나 배양에 이용되는 배지 내에 알코올을 첨가하여 함께 공급해 주는 것일 수도 있고, 상기 알코올이 생산되는 환경을 제공해 주는 것일 수도 있다. 상기 알코올이 생산되는 환경은 상기 알코올의 생산에 관여하는 적어도 하나의 효소를 암호화하는 유전자들을 함께 형질전환시킴으로써 제공될 수 있다.

상기와 같은 형질전환체의 배양은 본 기술 분야에 알려진 적당한 배지와 배양 조건에 따라 이루어질 수 있다. 통상의 기술자라면 선택되는 형질전환체의 숙주세포의 종류에 따라 배지 및 배양조건을 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 배양 방법은 회분식, 연속식, 유가식, 또는 이들의 조합 배양을 포함할 수 있다.

상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함할 수 있다.

상기 탄소원은, 예를 들면, 포도당, 자당, 유당, 과당, 말토오스, 전분, 셀룰로오스와 같은 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유와 같은 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤 및 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 배양은 글루코스를 탄소원으로 하여 수행될 수 있다. 상기 질소원은, 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아추출물, 옥수수 침지액(CSL), 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄과 같은 무기 질소원, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 배지는 인의 공급원으로서, 예를 들면, 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 상응하는 소듐-함유 염, 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있다.

또한, 아미노산, 비타민, 및 적절한 전구체 등이 배지에 포함될 수 있다. 상기 배지 또는 개별 성분은 배양액에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.

또한, 배양 중에 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다.

상기와 같은 형질전환체의 배양은 20℃ 내지 60℃에서 수행될 수 있고, 바람직하게는 25℃ 내지 55℃, 보다 바람직하게는 30℃ 내지 50℃에서 수행될 수 있다. 상기 형질전환체의 배양이 20℃ 미만 또는 60℃ 초과의 온도 범위에서 수행될 경우 충분한 양의 중간 생성물이 생성되지 않아, 결국 최종 생산물인 α,ω-디올 화합물의 생성량 또는 충분해지지 못하는 문제가 발생하게 된다.

또한, 상기와 같은 형질전환체의 배양은 pH 5 내지 pH 10에서 수행될 수 있고, 바람직하게는 pH 8.5 내지 pH 10에서 수행될 수 있으나, 이에 한정하지 아니한다. 상기와 같은 형질전환체의 배양 pH 조건은 형질전환체의 배양 배지에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 첨가함으로써 조정할 수 있다. 형질전환체의 배양 pH 조건이 상기 범위를 벗어나는 경우 형질전환체의 생장하기 어렵기 때문에 α,ω-디올 화합물의 발현이 용이하지 않아 α,ω-디올 화합물의 합성이 효율적으로 이루어지지 않는 문제점이 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 본 발명의 변이체들의 경우, 종래의 CYP153A33 효소, 특히 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 야생형의 CYP153A33 효소에 비해 과산화 활성이 훨씬 감소된 것으로 확인되므로(도 1 내지 도 2 참고), 상기 CYP153A33 효소 변이체를 이용하는 본 발명의 α,ω-디올 화합물의 생산 방법에 의하면 α,ω-디올 화합물을 효과적으로 대량생산할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되지 아니한다.

CYP153A33 효소 변이체의 제조

[1-1] 서열번호 4의 염기 서열을 갖는 유전자의 클로닝 및 형질전환

서열번호 1의 아미노산 서열에서, 136번째 프롤린을 알라닌으로 치환한 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 P136A 변이체의 단백질을 얻기 위하여, 서열번호 2의 염기 서열을 갖는 유전자를 주형으로 하기 표 1에 기재된 바와 같은 프라이머 쌍으로 1차 PCR을 수행하였고, 상기 1차 PCR에 의해 얻어진 증폭 산물을 하기 표 2에 기재된 바와 같은 프라이머 쌍으로 2차 PCR을 수행하여, 제한효소 자리를 NdeI 및 XhoI이 되도록 하였다. 상기 2차 PCR에 의해 얻어진 증폭 산물은 pET24ma 발현 벡터에 삽입하여 재조합 발현 벡터를 제작하였다.

증폭대상	프라이머 쌍	서열(5'->3')
P136A	정방향 프라이머	CAGCCCCTCCGCAGGGTCACCGAG
P136A	역방향 프라이머	CTCGGTGACCCTGCGGAGGGGCTG

증폭대상	프라이머 쌍	서열(5'->3')
P136A	정방향 프라이머	AAACATATGATGCCAACACTGCCCAGA
P136A	역방향 프라이머	AAACTCGAGTTAACTGTTCGGTGTCAG

한편, CYP 촉매 작용을 위한 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 유래의 푸티다레독신(putidaredoxin) camB와 푸티다레독신 환원효소(putidaredoxin reductase) camA의 유전자를 pETdeut-1 발현 벡터에, 그리고 장쇄 지방산 수송자(transporter)인 대장균 유래의 fadL 유전자를 pCDFduet MCS1에 각각 클로닝하고, 이들을 상기 재조합 PET24ma 발현 벡터와 함께, Park et al.(2020)의 문헌(Park et al., Biochemical Engineering Journal, 156 (2020) 107524)에서와 동일한 전-세포 형질전환 시스템을 이용하여 E. coli BW25113ΔfadD에 형질전환하였다. 상기와 같이 얻어진 형질전환체는 이용하기 전에 20% 글리세린 용액을 첨가하여 냉동 보관하였다.

[1-2] 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 단백질이 발현된 형질전환체의 제작

상기 실시예 [1-1]에서 냉동 보관된 형질전환체를, 카나마이신, 앰피실린 및 스펙티노마이신이 함유된 LB 배지를 이용하여 37℃에서 200rpm으로 9시간 동안 진탕배양한 다음, 동일한 항생제가 포함된 50㎖의 TB(Terrific Broth) 배지를 이용하여 37℃에서 약 4시간 동안 배양하여 600㎚에서의 흡광도가 2.4가 되도록 하였다. 그런 다음, 0.5mM의 ALA(5-aminolevulinic acid), 0.25mM의 IPTG(sopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside) 및 0.1mM의 황산제2철(iron (II) sulfate)을 첨가하고 30℃에서 200rpm으로 10시간 동안 진탕배양하여 상기 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 발현을 유도하였다.

그런 다음, 상기 배양액을 8,000rpm으로 10분 동안 원심분리하고, 0.1M의 인산 칼륨 완충용액(potassium phosphate buffer, PPB)(pH7.0)으로 2회 세척하여 세포를 수확하였고, 상기와 같이 수확된 세포 펠렛을 1%(w/v)의 D-글루코오스가 암유된 PPB 0.1M로 재현탁하고, 600㎚에서의 흡광도가 30이 되도록 희석하였다.

CYP153A33 효소 변이체의 효소 활성 확인

[2-1] 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 과산화 활성 확인

상기 실시예 [1-2]에서 제작된 형질전환체에, 10mM의 1-도데칸올(1-dodecanol)을 기질로 공급하고 30℃에서 200rpm으로 진탕배양하면서, 1, 3, 5, 7 및 21시간이 경과한 시점에 각각 배양액의 상층액을 추출하여 가스 크로마토그래피로 생성되는 α,ω-도데칸디올(α,ω-dodecanediol), α,ω-도데칸디카르복시산(α,ω-dodecanoic acid) 및 ω-히드록시도데칸카르복시산(ω-hydroxydodecanoic acid)의 생성량을 확인하였다.

구체적으로, 상기 배양액의 상층액을 50℃에서 동량의 에틸 아세테이트로 추출하고, 원심분리하여 분리한 다음, 70℃에서 40분 동안 N,O-비스(트리메틸실릴)트리플루오로아세타미드(N,O-bis(trimethylsilyl) trifluoroacetamide)로 유도체화(derivatized)하였다. 상기와 같이 유도체화된 샘플을 Agilent J&W GC 컬럼(CP-Sil 5 CB, 30m, 0.25mm i.d.; 0.25μm film thickness)이 장착된 6500 GC 가스 크로마토그래피 시스템(영림기계)으로 분석하였고, α,ω-도데칸디올(α,ω-dodecanediol), α,ω-도데칸디카르복시산(α,ω-dodecanoic acid) 및 ω-히드록시도데칸카르복시산(ω-hydroxydodecanoic acid)의 검출을 위한 구체적인 조건은 Park et al.(2020)의 문헌(Park et al., Biochemical Engineering Journal, 156 (2020) 107524)에서와 동일하게 설정하였다.

그 결과, 도 1에 도시된 바와 같이, 야생형 CYP153A33 효소에 비하여, 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 단백질이 발현된 형질전환체에서, 1-도데칸올의 과산화물인 α,ω-도데칸디카르복시산의 생산량도 소폭 증가되기는 하였지만(도 1의 (B)), α,ω-도데칸디올이 주생성물(major product)로 생성될 뿐만 아니라, 그 생산성 역시 3배 이상 향상되는 것으로 확인되었다(도 1의 (A)).

[2-2] 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 기질 특이성 확인

나아가, 상기 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 기질 특이성을 확인하였다. 이를 위하여, 상기 실시예 [1-2]에서 제작된 형질전환체에, 10mM의 1-헥산올(1-hexanol, C6), 1-노난올(1-nonanol, C9), 1-데칸올(1-decanol, C10), 1-운데칸올(1-undecanol, C10), 1-테트라데칸올(1-tetradecanol, C14) 및 1-헥사데칸올(1-hexadecanol, C16)을 공급하면서 각각 배양하였고, 상기 실시예 [2-1]에서와 동일한 방법으로 α,ω-알칸디올과 과산화물인 α,ω-알칸디카르복시산의 생성량을 확인하였다.

그 결과, 도 2에 도시된 바와 같이, 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 단백질은 C9 내지 C16의 α-알칸올에 대하여 전반적으로 야생형 CYP153A33 효소에 비해 저하된 과산화 활성을 나타내는 한편(도 2의 (B)), 특히 C12 내지 C14의 α-알칸올에 대하여 야생형 CYP153A33 효소에 비해 향상된 디올 생성능을 나타내는 것으로 확인되었다(도 2의 (A)).

상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 예시적으로 설명하였으나, 본 발명의 범위는 상기와 같은 특정 실시예에만 한정되지 아니하며, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 청구범위에 기재된 범주 내에서 적절하게 변경이 가능할 것이다.

<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF BIOSCIENCE AND BIOTECHNOLOGY AJOU UNIVERSITY <120> A Mutants of CYP153A33 Enzyme, and A Method for Preparing a,w-diol Compounds Using The Same <130> 2021-DPA-4432 <160> 8 <170> KopatentIn 3.0 <210> 1 <211> 470 <212> PRT <213> Marinobacter sp. <400> 1 Met Pro Thr Leu Pro Arg Thr Phe Asp Asp Ile Gln Ser Arg Leu Ile 1 5 10 15 Asn Ala Thr Ser Arg Val Val Pro Met Gln Arg Gln Ile Gln Gly Leu 20 25 30 Lys Phe Leu Met Ser Ala Lys Arg Lys Thr Phe Gly Pro Arg Arg Pro 35 40 45 Met Pro Glu Phe Val Glu Thr Pro Ile Pro Asp Val Asn Thr Leu Ala 50 55 60 Leu Glu Asp Ile Asp Val Ser Asn Pro Phe Leu Tyr Arg Gln Gly Gln 65 70 75 80 Trp Arg Ala Tyr Phe Lys Arg Leu Arg Asp Glu Ala Pro Val His Tyr 85 90 95 Gln Lys Asn Ser Pro Phe Gly Pro Phe Trp Ser Val Thr Arg Phe Glu 100 105 110 Asp Ile Leu Phe Val Asp Lys Ser His Asp Leu Phe Ser Ala Glu Pro 115 120 125 Gln Ile Ile Leu Gly Asp Pro Pro Glu Gly Leu Ser Val Glu Met Phe 130 135 140 Ile Ala Met Asp Pro Pro Lys His Asp Val Gln Arg Ser Ser Val Gln 145 150 155 160 Gly Val Val Ala Pro Lys Asn Leu Lys Glu Met Glu Gly Leu Ile Arg 165 170 175 Ser Arg Thr Gly Asp Val Leu Asp Ser Leu Pro Thr Asp Lys Pro Phe 180 185 190 Asn Trp Val Pro Ala Val Ser Lys Glu Leu Thr Gly Arg Met Leu Ala 195 200 205 Thr Leu Leu Asp Phe Pro Tyr Glu Glu Arg His Lys Leu Val Glu Trp 210 215 220 Ser Asp Arg Met Ala Gly Ala Ala Ser Ala Thr Gly Gly Glu Phe Ala 225 230 235 240 Asp Glu Asn Ala Met Phe Asp Asp Ala Ala Asp Met Ala Arg Ser Phe 245 250 255 Ser Arg Leu Trp Arg Asp Lys Glu Ala Arg Arg Ala Ala Gly Glu Glu 260 265 270 Pro Gly Phe Asp Leu Ile Ser Leu Leu Gln Ser Asn Lys Glu Thr Lys 275 280 285 Asp Leu Ile Asn Arg Pro Met Glu Phe Ile Gly Asn Leu Thr Leu Leu 290 295 300 Ile Val Gly Gly Asn Asp Thr Thr Arg Asn Ser Met Ser Gly Gly Leu 305 310 315 320 Val Ala Met Asn Glu Phe Pro Arg Glu Phe Glu Lys Leu Lys Ala Lys 325 330 335 Pro Glu Leu Ile Pro Asn Met Val Ser Glu Ile Ile Arg Trp Gln Thr 340 345 350 Pro Leu Ala Tyr Met Arg Arg Ile Ala Lys Gln Asp Val Glu Leu Gly 355 360 365 Gly Gln Thr Ile Lys Lys Gly Asp Arg Val Val Met Trp Tyr Ala Ser 370 375 380 Gly Asn Arg Asp Glu Arg Lys Phe Asp Asn Pro Asp Gln Phe Ile Ile 385 390 395 400 Asp Arg Lys Asp Ala Arg Asn His Met Ser Phe Gly Tyr Gly Val His 405 410 415 Arg Cys Met Gly Asn Arg Leu Ala Glu Leu Gln Leu Arg Ile Leu Trp 420 425 430 Glu Glu Ile Leu Lys Arg Phe Asp Asn Ile Glu Val Val Glu Glu Pro 435 440 445 Glu Arg Val Gln Ser Asn Phe Val Arg Gly Tyr Ser Arg Leu Met Val 450 455 460 Lys Leu Thr Pro Asn Ser 465 470 <210> 2 <211> 1413 <212> DNA <213> Marinobacter sp. <400> 2 atgccaacac tgcccagaac atttgacgac attcagtccc gactgattaa cgccacctcc 60 agggtggtgc cgatgcagag gcaaattcag ggactgaaat tcttaatgag cgccaagagg 120 aagaccttcg gcccacgccg accgatgccc gaattcgttg aaacacccat cccggacgtt 180 aacacgctgg cccttgagga catcgatgtc agcaatccgt ttttataccg gcagggtcag 240 tggcgcgcct atttcaaacg gttgcgtgat gaggcgccgg tccattacca gaagaacagc 300 cctttcggcc ccttctggtc ggtaactcgg tttgaagaca tcctgttcgt ggataagagt 360 cacgacctgt tttccgccga gccgcaaatc attctcggtg accctccgga ggggctgtcg 420 gtggaaatgt tcatagcgat ggatccgccg aaacacgatg tgcagcgcag ctcggtgcag 480 ggagtagtgg caccgaaaaa cctgaaggag atggaggggc tgatccgatc acgcaccggc 540 gatgtgcttg acagcctgcc tacagacaaa ccctttaact gggtacctgc tgtttccaag 600 gaactcacag gccgcatgct ggcgacgctt ctggattttc cttacgagga acgccacaag 660 ctggttgagt ggtcggacag aatggcaggt gcagcatcgg ccaccggcgg ggagtttgcc 720 gatgaaaatg ccatgtttga cgacgcggca gacatggccc ggtctttctc caggctttgg 780 cgggacaagg aggcgcgccg cgcagcaggc gaggagcccg gtttcgattt gatcagcctg 840 ttgcagagca acaaagaaac gaaagacctg atcaatcggc cgatggagtt tatcggtaat 900 ttgacgctgc tcatagtcgg cggcaacgat acgacgcgca actcgatgag tggtggcctg 960 gtggccatga acgaattccc cagggaattt gaaaaattga aggcaaaacc ggagttgatt 1020 ccgaacatgg tgtcggaaat catccgctgg caaacgccgc tggcctatat gcgccgaatc 1080 gccaagcagg atgtcgaact gggcggccag accatcaaga agggtgatcg agttgtcatg 1140 tggtacgcgt cgggtaaccg ggacgagcgc aaatttgaca accccgatca gttcatcatt 1200 gatcgcaagg acgcacgaaa ccacatgtcg ttcggctatg gggttcaccg ttgcatgggc 1260 aaccgtctgg ctgaactgca actgcgcatc ctctgggaag aaatactcaa gcgttttgac 1320 aacatcgaag tcgtcgaaga gcccgagcgg gtgcagtcca acttcgtgcg gggctattcc 1380 aggttgatgg tcaaactgac accgaacagt taa 1413 <210> 3 <211> 470 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP153A33 P136A <400> 3 Met Pro Thr Leu Pro Arg Thr Phe Asp Asp Ile Gln Ser Arg Leu Ile 1 5 10 15 Asn Ala Thr Ser Arg Val Val Pro Met Gln Arg Gln Ile Gln Gly Leu 20 25 30 Lys Phe Leu Met Ser Ala Lys Arg Lys Thr Phe Gly Pro Arg Arg Pro 35 40 45 Met Pro Glu Phe Val Glu Thr Pro Ile Pro Asp Val Asn Thr Leu Ala 50 55 60 Leu Glu Asp Ile Asp Val Ser Asn Pro Phe Leu Tyr Arg Gln Gly Gln 65 70 75 80 Trp Arg Ala Tyr Phe Lys Arg Leu Arg Asp Glu Ala Pro Val His Tyr 85 90 95 Gln Lys Asn Ser Pro Phe Gly Pro Phe Trp Ser Val Thr Arg Phe Glu 100 105 110 Asp Ile Leu Phe Val Asp Lys Ser His Asp Leu Phe Ser Ala Glu Pro 115 120 125 Gln Ile Ile Leu Gly Asp Pro Ala Glu Gly Leu Ser Val Glu Met Phe 130 135 140 Ile Ala Met Asp Pro Pro Lys His Asp Val Gln Arg Ser Ser Val Gln 145 150 155 160 Gly Val Val Ala Pro Lys Asn Leu Lys Glu Met Glu Gly Leu Ile Arg 165 170 175 Ser Arg Thr Gly Asp Val Leu Asp Ser Leu Pro Thr Asp Lys Pro Phe 180 185 190 Asn Trp Val Pro Ala Val Ser Lys Glu Leu Thr Gly Arg Met Leu Ala 195 200 205 Thr Leu Leu Asp Phe Pro Tyr Glu Glu Arg His Lys Leu Val Glu Trp 210 215 220 Ser Asp Arg Met Ala Gly Ala Ala Ser Ala Thr Gly Gly Glu Phe Ala 225 230 235 240 Asp Glu Asn Ala Met Phe Asp Asp Ala Ala Asp Met Ala Arg Ser Phe 245 250 255 Ser Arg Leu Trp Arg Asp Lys Glu Ala Arg Arg Ala Ala Gly Glu Glu 260 265 270 Pro Gly Phe Asp Leu Ile Ser Leu Leu Gln Ser Asn Lys Glu Thr Lys 275 280 285 Asp Leu Ile Asn Arg Pro Met Glu Phe Ile Gly Asn Leu Thr Leu Leu 290 295 300 Ile Val Gly Gly Asn Asp Thr Thr Arg Asn Ser Met Ser Gly Gly Leu 305 310 315 320 Val Ala Met Asn Glu Phe Pro Arg Glu Phe Glu Lys Leu Lys Ala Lys 325 330 335 Pro Glu Leu Ile Pro Asn Met Val Ser Glu Ile Ile Arg Trp Gln Thr 340 345 350 Pro Leu Ala Tyr Met Arg Arg Ile Ala Lys Gln Asp Val Glu Leu Gly 355 360 365 Gly Gln Thr Ile Lys Lys Gly Asp Arg Val Val Met Trp Tyr Ala Ser 370 375 380 Gly Asn Arg Asp Glu Arg Lys Phe Asp Asn Pro Asp Gln Phe Ile Ile 385 390 395 400 Asp Arg Lys Asp Ala Arg Asn His Met Ser Phe Gly Tyr Gly Val His 405 410 415 Arg Cys Met Gly Asn Arg Leu Ala Glu Leu Gln Leu Arg Ile Leu Trp 420 425 430 Glu Glu Ile Leu Lys Arg Phe Asp Asn Ile Glu Val Val Glu Glu Pro 435 440 445 Glu Arg Val Gln Ser Asn Phe Val Arg Gly Tyr Ser Arg Leu Met Val 450 455 460 Lys Leu Thr Pro Asn Ser 465 470 <210> 4 <211> 1413 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP153A33 P136A <400> 4 atgccaacac tgcccagaac atttgacgac attcagtccc gactgattaa cgccacctcc 60 agggtggtgc cgatgcagag gcaaattcag ggactgaaat tcttaatgag cgccaagagg 120 aagaccttcg gcccacgccg accgatgccc gaattcgttg aaacacccat cccggacgtt 180 aacacgctgg cccttgagga catcgatgtc agcaatccgt ttttataccg gcagggtcag 240 tggcgcgcct atttcaaacg gttgcgtgat gaggcgccgg tccattacca gaagaacagc 300 cctttcggcc ccttctggtc ggtaactcgg tttgaagaca tcctgttcgt ggataagagt 360 cacgacctgt tttccgccga gccgcaaatc attctcggtg accctgcgga ggggctgtcg 420 gtggaaatgt tcatagcgat ggatccgccg aaacacgatg tgcagcgcag ctcggtgcag 480 ggagtagtgg caccgaaaaa cctgaaggag atggaggggc tgatccgatc acgcaccggc 540 gatgtgcttg acagcctgcc tacagacaaa ccctttaact gggtacctgc tgtttccaag 600 gaactcacag gccgcatgct ggcgacgctt ctggattttc cttacgagga acgccacaag 660 ctggttgagt ggtcggacag aatggcaggt gcagcatcgg ccaccggcgg ggagtttgcc 720 gatgaaaatg ccatgtttga cgacgcggca gacatggccc ggtctttctc caggctttgg 780 cgggacaagg aggcgcgccg cgcagcaggc gaggagcccg gtttcgattt gatcagcctg 840 ttgcagagca acaaagaaac gaaagacctg atcaatcggc cgatggagtt tatcggtaat 900 ttgacgctgc tcatagtcgg cggcaacgat acgacgcgca actcgatgag tggtggcctg 960 gtggccatga acgaattccc cagggaattt gaaaaattga aggcaaaacc ggagttgatt 1020 ccgaacatgg tgtcggaaat catccgctgg caaacgccgc tggcctatat gcgccgaatc 1080 gccaagcagg atgtcgaact gggcggccag accatcaaga agggtgatcg agttgtcatg 1140 tggtacgcgt cgggtaaccg ggacgagcgc aaatttgaca accccgatca gttcatcatt 1200 gatcgcaagg acgcacgaaa ccacatgtcg ttcggctatg gggttcaccg ttgcatgggc 1260 aaccgtctgg ctgaactgca actgcgcatc ctctgggaag aaatactcaa gcgttttgac 1320 aacatcgaag tcgtcgaaga gcccgagcgg gtgcagtcca acttcgtgcg gggctattcc 1380 aggttgatgg tcaaactgac accgaacagt taa 1413 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1st Forward Primer for CYP153A33 P136A <400> 5 cagcccctcc gcagggtcac cgag 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1st Reverse Primer for CYP153A33 P136A <400> 6 ctcggtgacc ctgcggaggg gctg 24 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2nd Forward Primer for CYP153A33 P136A <400> 7 aaacatatga tgccaacact gcccaga 27 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2nd Reverse Primer for CYP153A33 P136A <400> 8 aaactcgagt taactgttcg gtgtcag 27

Claims (17)

1. 서열번호 1의 아미노산 서열에서 136번째 프롤린(proline, P)이 다른 아미노산으로 치환된 CYP153A33 효소 변이체.
2. 청구항 1에 있어서,
   상기 136번째 프롤린이 글리신(glycine, G), 알라닌(alanine, A), 발린(valine, V), 류신(leucine, L) 및 이소류신(isoleucine, I)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로 치환된 것인 CYP153A33 효소 변이체.
3. 청구항 2에 있어서,
   상기 136번째 프롤린이 글리신, 알라닌 및 발린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로 치환된 것인 CYP153A33 효소 변이체.
4. 청구항 3에 있어서,
   상기 136번째 프롤린이 알라닌으로 치환된 것인 CYP153A33 효소 변이체.
5. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 CYP153A33 효소 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 CYP153A33 효소에 비해 알코올에 대한 과산화 활성이 감소된 것인 CYP153A33 효소 변이체.
6. 청구항 5에 있어서,
   상기 알코올은 α-알칸올인 것인 CYP153A33 효소 변이체.
7. 청구항 1의 CYP153A33 효소 변이체를 암호화하는 유전자.
8. 청구항 7의 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터.
9. 청구항 8의 재조합 발현 벡터가 숙주세포에 도입된 형질전환체.
10. 청구항 9의 형질전환체를 배양하는 단계; 및
    상기 형질전환체의 배양물로부터 CYP153A33 효소를 분리하는 단계;를 포함하는 CYP153A33 효소 변이체의 생산 방법.
11. 청구항 1의 CYP153A33 효소 변이체를 유효성분으로 포함하는 α,ω-디올 화합물 생산용 조성물.
12. 청구항 1의 CYP153A33 효소 변이체를 알코올과 함께 반응시키는 단계;를 포함하는 인 비트로(in vitro)에서의 α,ω-디올 화합물의 생산 방법.
13. 청구항 12에 있어서,
    상기 CYP153A33 효소 변이체와 알코올의 반응 생성물로부터 α,ω-디올 화합물을 회수하는 단계;를 더 포함하는 인 비트로(in vitro)에서의 α,ω-디올 화합물의 생산 방법.
14. 청구항 9의 형질전환체를 배양하는 단계;를 포함하는 인 비보(in vivo)에서의 α,ω-디올 화합물의 생산 방법.
15. 청구항 14에 있어서,
    배양은 중쇄 또는 장쇄의 지방 알코올이 존재하는 환경에서 수행되는 것인 α,ω-디올 화합물의 생산 방법.
16. 청구항 15에 있어서,
    상기 지방 알코올은 α-알칸올인 것인 α,ω-디올 화합물의 생산 방법.
17. 청구항 16에 있어서,
    상기 지방 알코올은 탄소수 12 내지 14인 것인 α,ω-디올 화합물의 생산 방법.

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