KR102207688B1 - 신규 d-트레오닌 생산 효소 및 이를 이용한 d-트레오닌의 생산 방법 - Google Patents

신규 d-트레오닌 생산 효소 및 이를 이용한 d-트레오닌의 생산 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규한 D-트레오닌 생산 효소에 관한 것으로서, 알칼리게네스(Alcaligenes) 속 미생물로부터 분리된 서열번호 1의 아미노산 서열, 또는 서열번호 1과 90% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 D-트레오닌 생산 효소, 및 이를 암호화 하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 D-트레오닌 생산 효소는 종래의 효소들에 비해 친환경적이면서도 높은 수율로 D-트레오닌을 생산할 수 있는 장점이 있다.

Description

신규 D-트레오닌 생산 효소 및 이를 이용한 D-트레오닌의 생산 방법{A Novel Enzyme for Production of D-threonine, and A Method for Preparing D-threonine Using The Same}
본 발명은 신규한 D-트레오닌 생산 효소에 관한 것이다.
자연계에 존재하는 아미노산들은 대부분 광학활성을 나타내는 알파탄소를 가지고 있으며 입체특이성에 따라 L-아미노산과 D-아미노산으로 나뉜다. 자연계에 존재하는 대부분의 단백질은 L-아미노산으로 구성되어 있으나, 예외적으로 미생물의 펩티도글리칸이나 펩티드계 항생물질의 구성성분 및 고등식물의 생리활성물질의 구성성분 등은 D-아미노산으로 구성되어 있다.
현재까지의 연구에 의하면, 상기와 같은 D-아미노산 중에서도 D-트레오닌은 신경전달물질, 백신, 합성감미료, 항생제 및 호르몬 등의 생리활성물질을 합성하는 중간물질 또는 전구체로서 식품과 의약분야에서 널리 이용되고 있으며, 이에 D-트레오닌을 생산하는 방법들이 개발되어 왔다.
D-트레오닌을 생산하는 방법은 크게 화학적 합성법과 효소나 미생물을 이용하는 생물학적 합성법으로 나눌 수 있다. 화학적 합성법에 의한 아미노산의 생산은 D- 또는 L-아미노산이 혼합된 상태(racemic mixture)로 생성물이 얻어지기 때문에, 순수한 D-트레오닌을 얻기 위해서는 또 다른 복잡한 광학적 순수화 과정을 거쳐야 하는 어려움이 있다. 뿐만 아니라, 상기와 같은 화학적 합성 방법은 그 과정에서 발생하는 부산물들로 인해 심각한 환경오염이 유발되는 문제도 있다. 그에 비해, 생물학적인 합성 방법은 광학적으로 순수한 D-트레오닌만을 한 단계로 직접 생산할 수 있기 때문에, 환경오염의 문제점을 가지고 있는 다단계의 화학적 합성법을 대체할 수 있는 저공해 청정생산기술로서 주목 받고 있다.
상기와 같은 생물학적 합성 방법에는 관련 효소의 개발이 필수적이나, 종래 알려진 D-트레오닌 생산 효소의 경우에는 그 활성 및 생산량이 매우 적어서, 산업적으로 이용하기에는 불충분한 문제점이 있다.
이에, 보다 활성이 우수한 신규의 D-트레오닌 합성 효소에 관한 연구ㅇ개발이 더욱 필요한 실정이다.
본 발명의 목적은 종래에 비해 우수한 효율로 D-트레오닌을 생산할 수 있는 신규의 효소와 이를 이용한 D-트레오닌의 생산 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 서열번호 1의 아미노산 서열, 또는 서열번호 1과 90% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 D-트레오닌 생산 효소를 제공한다.
또한, 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다른 측면은 상기 D-트레오닌 생산 효소를 암호화하는 유전자를 제공한다.
또한, 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 또 다른 측면은 상기 유전자가 포함된 재조합 발현벡터 및 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체를 제공한다.
또한, 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 D-트레오닌 생산 효소를 포함하는 상기 D-트레오닌 생산용 조성물, 및 상기 D-트레오닌 생산 효소를 글리신 및 아세트알데히드와 함께 반응시키는 단계를 포함하는 인 비트로(in vitro)에서의 D-트레오닌 생산 방법을 제공한다.
아울러, 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 또 다른 측면은 상기 형질전환체를 글리신 및 아세트알데히드의 존재 하에서 배양하는 단계를 포함하는 인 비보(in vivo)에서의 D-트레오닌 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 D-트레오닌 생산 효소는 글리신과 아세트알데히드를 기질로 D-트레오닌으로 전환함에 있어 독성 물질이나 환경오염을 유발하는 부산물이 발생하지 않을 뿐만 아니라, 특이 활성도(specific activity)가 종래 알려진 효소들에 비하여 현저하게 우수한바, D-트레오닌을 친환경적이면서도 높은 수율로 생산할 수 있는 장점이 있다.
다만, 본 발명의 효과는 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 하기의 기재로부터 당업자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 형질전환체에서 과발현되어 정제 및 분리된 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 SDS-PGAE로 확인한 사진이다.
도 2는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질에 의한 D-트레오닌 전환 정도를 나타낸 그래프이다.
도 3은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 효소 활성에 영향을 미치는 금속 양이온의 종류(A)와 금속 양이온의 농도(B)를 확인한 그래프이다.
도 4는 온도가 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 효소 활성에 미치는 영향을 확인한 그래프이다.
도 5는 pH가 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 효소 활성에 미치는 영향을 확인한 그래프이다.
도 6은 피리독살-5-인산이 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 효소 활성에 미치는 영향을 확인한 그래프이다.
도 7은 기질의 비율이 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질에 의한 D-트레오닌의 생산량에 미치는 영향을 확인한 그래프이다.
먼저, 본 발명의 명세서에서 이용된 용어를 설명한다.
본 발명에서 일컫는 'D-트레오닌 생산 효소'는 하기 반응식과 같이 글리신과 아세트알데히드로부터 D-트레오닌을 생산하는 활성을 가진 효소를 의미한다.
[반응식]
Figure 112018064129814-pat00001
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
1. 신규 D-트레오닌 생산 효소 및 그 유전자
본 발명의 일 측면은 서열번호 1의 아미노산 서열, 또는 서열번호 1과 90% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 D-트레오닌 생산 효소를 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 측면은 상기 D-트레오닌 생산 효소를 암호화하는 D-트레오닌 생산 효소의 유전자를 제공한다.
본 발명의 D-트레오닌 생산 효소는 필로마이크로비움(Filomicrobium) 속 미생물로부터 유래한 것일 수 있고, 특히 필로마이크로비움 마리넘(Filomicrobium marinum)로부터 유래한 것이 바람직하다.
본 발명의 D-트레오닌 생산 효소는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 D-트레오닌 생산 효소는 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서, 아미노산 잔기의 결실, 삽입, 치환 또는 이들의 조합에 의해서 상이한 서열을 가지는 아미노산의 변이체들, 또는 단편들일 수 있다. 상기 D-트레오닌 생산 효소의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드 수준에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 변형될 수 있다. 따라서 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 포함한다. 상기 실질적으로 동일한 단백질이란 90％ 이상, 바람직하게는 93％ 이상, 가장 바람직하게는 95％ 이상의 아미노산 서열의 상동성을 갖는 것들을 의미하나 이에 한정되지 않으며, 90% 이상의 아미노산 서열의 상동성을 가지며 동일한 효소 활성을 가진다면 본 발명의 범위에 포함된다.
상기 D-트레오닌 생산 효소의 유전자는 서열번호 2의 염기 서열로 이루어진 것이 바람직하다. 그러나 본 발명의 D-트레오닌 생산 효소 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 유전자는 암호화 영역으로부터 발현되는 상기 효소 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 암호화 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 암호화 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변이가 이루어질 수 있으며, 이러한 변이 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서 본 발명은 서열번호 2의 유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열로 이루어진 유전자 및 상기 유전자의 단편을 포함한다. 상기 실질적으로 동일한 염기서열로 이루어진 유전자란 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 가장 바람직하게는 95％ 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 80% 이상의 서열 상동성을 가지며 암호화된 단백질이 동일한 효소 활성을 가진다면 본 발명에 포함된다. 상기와 같이, 본 발명의 D-트레오닌 생산 효소의 유전자는 이와 동등한 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 한, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 이들 또한 본 발명의 범위에 포함된다.
상기 D-트레오닌 생산 효소에 포함되는 서열번호 1의 아미노산 서열은 바람직하게는 서열번호 2의 염기 서열로 이루어진 유전자에 의해 암호화되나, 본 발명은 이에 한정되지 않고, 동일 아미노산 서열을 갖는 본 발명의 단백질을 암호화할 수 있는 한, 서열번호 2의 염기 서열과 실질적으로 동일한 다른 염기 서열로 이루어진 유전자에 의해 암호화될 수도 있다. 이러한 염기 서열은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있으며, DNA 분자 또는 RNA 분자일 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 본 발명자들은 필로마이크로비움 마리넘(Filomicrobium marinum)에서 유래한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 기능을 규명하기 위하여 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 분리 및 정제하였고(도 1 참고), 그 활성을 연구한 결과 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질이 D-트레오닌 생산 효소로서의 활성을 가진다는 것을 확인하였다(표 1 및 도 2 참고).
2. D-트레오닌 생산 효소의 발현 벡터 및 형질전환체
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 D-트레오닌 생산 효소의 유전자가 포함된 재조합 발현 벡터 및 상기 발현 벡터가 도입된 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는 상기 D-트레오닌 생산 효소의 유전자를 포함한다.
상기 발현 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파이지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
상기 재조합 발현 벡터는 본 발명의 D-트레오닌 생산 효소를 생산하고자하는 숙주 세포의 종류에 따라 프로모터(promoter), 터미네이터(terminator), 엔핸서(enhancer) 등과 같은 발현조절서열, 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 목적에 따라 조합할 수 있다.
상기 발현 벡터는 벡터가 도입된 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 추가로 포함할 수 있고, 복제 가능한 발현 벡터인 경우 복제 기원을 포함할 수 있다.
또한, 상기 재조합 발현 벡터는 발현 단백질의 정제를 용이하게 하기 위한 서열을 포함할 수 있으며, 구체적으로 본 발명의 D-트레오닌 생산 효소를 암호화하는 유전자에 작동 가능하도록 분리정제용 태그를 암호화하는 유전자가 연결될 수 있다. 이때, 상기 분리정제용 태그는 GST, poly-Arg, FLAG, 히스티딘-태그(His-tag) 및 c-myc 등이 단독으로 사용되거나 이들 중 두 개 이상을 순차적으로 연결하여 사용할 수도 있다.
상기 D-트레오닌 생산 효소를 암호화하는 유전자는 제한효소 절단위치를 통해 클로닝될 수 있으며, 상기 벡터에 단백질 절단효소 인식부위를 암호화하는 유전자가 사용된 경우에는 상기 D-트레오닌 생산 효소의 유전자와 틀이 맞도록(in frame) 연결되어, 상기 효소를 수득한 후 단백질 절단 효소로 절단 시, 원래 형태의 D-트레오닌 생산 효소가 생산될 수 있도록 할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는, 본 발명의 D-트레오닌 생산 효소 유전자를 플라스미드 벡터인 pET28a(+)에 삽입함으로써 재조합 클로닝 벡터를 제조하였다. 상기의 클로닝 벡터의 제조에 이용된 pET28a(+) 이외에도 다양한 원핵세포용 벡터 또는 진핵세포용(pPIC 및 pPICZ 등) 벡터가 알려져 있으므로 발현의 목적에 따라 상기 벡터 이외의 다양한 발현 벡터를 이용할 수 있다.
본 발명의 상기 재조합 발현 벡터는 D-트레오닌 생산 효소 유전자가 포함되어 있어 이를 생산할 수 있는 벡터로서 유용하게 이용될 수 있다.
또한, 본 발명의 형질전환체에는 D-트레오닌 생산 효소를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터가 도입된다.
본 발명에 따른 상기 재조합 발현 벡터를 발현 목적에 따라 박테리아, 효모, 대장균, 진균류, 식물 세포 및 동물 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 적절한 숙주 세포에 형질 전환시킴으로써 형질전환체를 제조할 수 있다. 예컨대, 상기 숙주 세포는 대장균(E. coli BL21(DE3), DH5α등) 또는 효모 세포 (Saccharomyces 속, Pichia 속 등) 등 일 수 있다. 이때, 숙주 세포의 종류에 따라 적절한 배양 방법 및 배지 조건 등은 당해 분야의 공지 기술로부터 당업자가 용이하게 선택할 수 있다.
본 발명의 형질전환체의 제조를 위한 재조합 발현 벡터의 도입 방법은 공지의 기술, 즉 열 충격법, 전기충격법 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 대장균을 숙주 세포로 하여 본 발명의 D-트레오닌 생산 효소를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 대장균에 형질 전환시켜 형질전환체를 제조하였다.
상기 형질전환체로부터 발현된 단백질은 D-트레오닌 생산 효소는 효소 활성을 가지는 신규한 서열의 단백질이므로, 상기 형질전환체를 대량 배양하여 상기 유전자를 발현시킴으로써 상기 D-트레오닌 생산 효소의 대량생산을 용이하게 할 수 있다.
3. D-트레오닌 생산 효소의 생산 방법
아울러, 본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 D-트레오닌 생산 효소를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터가 도입된 형질전환체를 이용하여 D-트레오닌 생산 효소를 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 D-트레오닌 생산 효소 생산 방법은 1) 본 발명의 D-트레오닌 생산 효소를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터가 도입된 형질전환체를 배양하는 단계; 2) 상기 단계 1)에서 배양된 형질전환체에서 상기 D-트레오닌 생산 효소를 암호화하는 유전자의 발현을 유도하는 단계; 및 3) 상기 단계 2)에서 D-트레오닌 생산 효소 유전자의 발현이 유도된 형질전환체의 배양물로부터 D-트레오닌 생산 효소를 분리하는 단계;를 포함한다.
상기 단계 1)의 D-트레오닌 생산 효소를 암호화하는 유전자의 N-말단에는 분리정제용 태그를 암호화하는 유전자 또는 단백질 절단효소 절단위치가 추가로 연결될 수 있고, 이로 인해 재조합 D-트레오닌 생산 효소의 정제 또는 원래 형태의 D-트레오닌 생산 효소의 수득이 가능할 수 있다.
상기 단계 1)의 형질전환체의 배양은 공지된 방법에 따라서 수행될 수 있고, 배양 온도, 배양 시간 및 배지의 pH 등의 조건은 적절하게 조절될 수 있다. 또한, 배양 방법에는 회분식 배양(batch culture), 연속식 배양(continuous culture) 및 유가식 배양(fed-batch culture)이 포함될 수 있다. 사용되는 배양 배지는 특정한 균주의 요구 조건을 적절하게 충족시켜야 한다.
상기 단계 3)의 상기 배양에 의해 생성된 배양물로부터 D-트레오닌 생산 효소의 분리는 원심분리, 여과 등 당해 분야에서 통상적으로 수행되는 방법을 실시할 수 있다. 또한, 상기 방법으로 분리된 D-트레오닌 생산 효소는 통상의 방식으로 정제될 수 있으며, 예를 들어, 염석(예를 들어 황산암모늄 침전, 인산나트륨 침전), 용매 침전(아세톤, 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 침전), 투석, 겔 여과, 이온 교환, 역상 칼럼 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피 및 한외여과 등의 기법을 단독 또는 조합하여 본 발명의 효소를 정제할 수 있다.
본 발명이 구체적인 실시예에서는 상기와 같이 정제된 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질이 D-트레오닌 생산 효소의 활성을 나타냄을 확인하였다(도 2 참고). 상기와 같은 결과로부터, 본 발명의 생산 방법에 따라 D-트레오닌 생산 효소의 대량 생산이 가능함을 알 수 있다.
4. D-트레오닌의 생산 방법 및 D-트레오닌 생산용 조성물
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 D-트레오닌 생산 효소를 이용하여 글리신 및 아세트알데히드로부터 D-트레오닌을 인 비트로(in vitro)에서 생산하는 방법 및 인 비트로(in vitro)에서 D-트레오닌의 생산에 이용되는 D-트레오닌 생산용 조성물을 제공한다.
본 발명의 D-트레오닌 생산용 조성물은 본 발명의 D-트레오닌 생산 효소를 포함한다.
또한, 본 발명의 D-트레오닌의 인 비트로(in vitro) 생산 방법은 1) 본 발명의 D-트레오닌 생산 효소를 글리신 및 아세트알데히드와 반응시키는 단계; 및 2) 상기 단계 1)에서의 반응 결과 생성된 반응 생성물로부터 D-트레오닌을 회수하는 단계를 포함한다.
상기 D-트레오닌의 생산 방법 및 D-트레오닌 생산용 조성물은 인 비트로(in vitro)에서 본 발명의 D-트레오닌 생산 효소의 효소 활성을 이용하는 것이므로, 상기 D-트레오닌 생산 효소를 이용하여 그 기질인 글리신 및 아세트알데히드로부터 D-트레오닌을 생산하는 것이다.
상기 단계 1)의 반응은 20℃ 내지 55℃의 온도 범위, 바람직하게는 22℃ 내지 45℃의 온도 범위, 더욱 바람직하게는 25℃ 내지 40℃의 온도에서 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다. 또한, 상기 단계 1)의 반응은 7 내지 10의 pH 범위, 바람직하게는 8 내지 9.5의 pH 범위, 더욱 바람직하게는 8.5 내지 9의 pH에서 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다.
또한, 상기 단계 1)의 반응에는 상기 D-트레오닌 생산 효소의 활성을 향상시키기 위해 상기 D-트레오닌 생산 효소와 함께 금속 양이온이 함께 포함될 수 있다. 상기 금속 양이온은 2가 금속 양이온일 수 있고, 상기 2가 금속 양이온은 망간 양이온 또는 마그네슘 양이온 등일 수 있고, 망간 양이온인 것이 바람직하다.
또한, 상기 단계 1)의 반응에는 상기 D-트레오닌 생산 효소의 활성을 향상시키기 위해 상기 D-트레오닌 생산 효소와 함께 피리독살-5-인산이 더 포함될 수 있다.
상기 단계 1)의 반응에서, 상기 글리신 및 아세트알데히드는 외부에서 주입되는 것이 바람직하고, 상기 글리신 및 아세트알데히드는 목적하는 D-트레오닌의 양에 맞추어 충분한 양이 주입되어야 한다. 이때 상기 글리신과 아세트알데히드는 0.5:1 내지 30:1의 비율, 바람직하게는 1:1 내지 20:1의 비율, 더욱 바람직하게는 2.5:1 내지 12.5;1의 비율로 공급될 수 있다. 또한, 상기 글리신 및 아세트알데히드의 주입은 연속적으로 수행될 수 있다. 특히 상기 글리신 및 아세트알데히드가 연속적으로 주입되는 경우, 상기 D-트레오닌 생산 효소에 의하여 D-트레오닌을 지속적으로 생산할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 상기와 같은 D-트레오닌 생산 효소에 의하여 글리신 및 아세트알데히드로부터 D-트레오닌이 생산됨을 확인하였고(도 2 참조), 이러한 D-트레오닌 생산 효소의 효소 활성이, 망간 양이온의 첨가에 의해, 35℃에 가까운 온도에서 반응을 수행할수록, 8.5~9.0에 가까운 pH에서 반응을 수행할수록, 피리독살-5-인산이 첨가될수록, 그리고 글리신과 아세트알데히드가 10:1의 비율로 첨가될수록 더욱 향상됨을 확인하였다(도 3 내지 도 7 참고).
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 형질전환체를 이용하여 D-트레오닌을 인 비보(in vivo)에서 생산하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 D-트레오닌의 인 비보(in vivo) 생산 방법은 1) 상기 형질전환체를 글리신 및 아세트알데히드가 공급되는 환경 하에서 배양하는 단계; 및 2) 상기 단계 1)에서의 배양물로부터 D-트레오닌을 회수하는 단계;를 포함한다.
상기 글리신 및 아세트알데히드가 공급되는 환경은 외부에서 인위적으로 글리신 및 아세트알데히드를 공급해 주거나 배양에 이용되는 배지 내에 글리신 및 아세트알데히드를 첨가하여 함께 공급해 주는 것일 수도 있고, 상기 글리신 및 아세트알데히드가 생산되는 환경을 제공해 주는 것일 수도 있다. 상기 글리신 및 아세트알데히드가 생산되는 환경은 상기 글리신 및 아세트알데히드의 생산에 관여하는 적어도 하나의 효소를 암호화하는 유전자들을 함께 형질전환시킴으로써 제공될 수 있다.
상기와 같은 형질전환체의 배양은 본 기술 분야에 알려진 적당한 배지와 배양 조건에 따라 이루어질 수 있다. 통상의 기술자라면 선택되는 형질전환체의 숙주세포의 종류에 따라 배지 및 배양조건을 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 배양 방법은 회분식, 연속식, 유가식, 또는 이들의 조합 배양을 포함할 수 있다.
상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함할 수 있다.
상기 탄소원은, 예를 들면, 포도당, 자당, 유당, 과당, 말토오스, 전분, 셀룰로오스와 같은 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유와 같은 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤 및 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 배양은 글루코스를 탄소원으로 하여 수행될 수 있다. 상기 질소원은, 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액(CSL), 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄과 같은 무기 질소원, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 배지는 인의 공급원으로서, 예를 들면, 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 상응하는 소듐-함유 염, 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있다.
또한, 아미노산, 비타민, 및 적절한 전구체 등이 배지에 포함될 수 있다. 상기 배지 또는 개별 성분은 배양액에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.
또한, 배양 중에 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다.
상기와 같은 형질전환체의 배양은 20℃ 내지 50℃에서 수행될 수 있고, 바람직하게는 25℃ 내지 45℃, 보다 바람직하게는 30℃ 내지 40℃에서 수행될 수 있다. 상기 형질전환체의 배양이 20℃ 미만 또는 50℃ 초과의 온도 범위에서 수행될 경우 충분한 양의 중간 생성물이 생성되지 않아, 결국 최종 생산물인 D-트레오닌의 생산량 또는 충분해지지 못하는 문제가 발생하게 된다.
또한, 상기와 같은 형질전환체의 배양은 pH 5 내지 pH 10에서 수행될 수 있고, 바람직하게는 pH 6 내지 pH 9에서, 더욱 바람직하게는 pH 6.5 내지 pH 8에서 수행될 수 있으나, 이에 한정하지 아니한다. 상기와 같은 형질 전환체의 배양 pH 조건은 형질전환체의 배양 배지에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 첨가함으로써 조정할 수 있다. 형질전환체의 배양 pH 조건이 상기 범위를 벗어나는 경우 형질전환체의 생장하기 어렵기 때문에 D-트레오닌의 발현이 용이하지 않아 D-트레오닌의 합성이 효율적으로 이루어지지 않는 문제점이 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되지 아니한다.
서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 분리
[1-1] 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 클로닝 및 형질전환
필로마이크로비움 마리넘(Filomicrobium marinum)에서 유래한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 얻기 위하여, 서열번호 2의 염기 서열을 기초로, 다음 표 1과 같이 서열번호 3 내지 6의 프라이머를 각각 설계하였다.
서열번호 프라이머 쌍 서열(5'->3')
3 정방향 프라이머 5'-tggtgccgcgcggcagccatatgcgcgcaccagcacggct-3'
4 역방향 프라이머 5'-ggtggtggtggtgctcgagctagaacacacaacctcgcgc-3'
5 정방향 프라이머 5'-gcgcgaggttgtgtgttctagctcgagcaccaccaccacc-3'
6 역방향 프라이머 5'-agccgtgctggtgcgcgcatatggctgccgcgcggcacca-3'
㈜바이오니아에 의뢰하여 서열번호 2의 염기 서열의 유전자를 합성하였고, 상기 합성된 유전자를 주형으로 하여 상기와 같이 설계된 서열번호 3, 4의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행함으로써, 상기 서열번호 2의 염기 서열을 증폭하였다. Gibson assembly (New England Biolabs, 미국)를 이용하여 상기와 같이 증폭된 서열번호 2의 염기 서열을 포함하는 PCR 산물을, 서열번호 5, 6의 프라이머 쌍을 이용하여 증폭한 플라스미드 벡터 pET28a(+) (Novagen, 미국)의 다중 클로닝 자리에 삽입하여 재조합 발현 벡터를 제작하였고, 염기 서열 분석(sequencing)(㈜마크로젠)을 통해 상기 서열번호 2의 염기 서열이 제대로 삽입되었음을 확인하였으며, 이를 대장균 C2566 균주(Novagen, 미국)에 형질전환하였다. 상기와 같이 얻어진 형질전환체는 이용하기 전에 20% 글리세린 용액을 첨가하여 냉동 보관하였다.
[1-2] 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 과발현 및 정제
상기 실시예 [1-1]에서 냉동 보관된 형질전환체를 3㎖의 LK 고체 배지(LB 배지+25㎍/㎖ 카나마이신)에 선조접종하고 37℃에서 10시간 이상 배양하였다. 고체 배지에 나타나는 하나의 콜로니를 단집락 분리 과정으로 3㎖의 LK 고체 배지가 포함된 시험관(test tube)에 접종하고 37℃의 진탕 배양기로 18시간 동안 종균 배양을 실시하였다. 그런 다음, 상기 종균 배양된 배양액 2㎖를 200㎖의 LK 배지가 포함된 1000㎖ 플라스크에 첨가하여 본 배양을 실시하였고, 600㎚에서의 흡광도가 0.6이 될 때 최종 농도 0.1mM이 되도록 IPTG(isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside)를 첨가하여 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 과발현을 유도하였다. 상기와 같이 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 과발현을 유도하는 과정에서, 교반 속도는 200 rpm이, 배양 온도는 37℃가 유지되도록 조정하였고, IPTG를 첨가 후에는 교반 속도를 150 rpm으로, 배양 온도를 18℃로 조정하여 20시간 동안 배양하였다.
또한, 상기와 같이 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 과발현이 유도된 형질전환체의 배양액을 50㎖의 코니칼 튜브(conical tube, SPL Life Sciences Co., Ltd., 한국)에 분주하고, 4℃에서 4000rpm으로 20분 동안 원심분리하여 상등액을 분리해 낸 펠렛에 프로피니아 1X 용해 완충용액(Profinia 1X Lysis buffer, Bio-Rad Laboratories, 미국) 10㎖를 첨가하고, 소니케이션(sonication) 방법으로 세포를 파쇄함으로써, 형질전환체의 세포 용해물(cell lysate)를 수득하였다.
상기와 같이 수득된 세포 용해물을 4℃에서 14000rpm으로 20분 동안 다시 원심분리하여 상층액을 수득하였고, IMAC Kitㄾ His tag 흡착 컬럼(Bio-Rad Laboratories, 미국)이 장착된 고속 단백질 액체 크로마토그라피(Fast Protein Liquid Chromatography)(Bio-Rad Laboratories, 미국)를 이용하여 상기와 같이 수득된 상층액으로부터 과발현된 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 분리하였다.
이렇게 분리된 단백질을 SDS-PAGE를 통해 확인한 결과, 상기와 같은 일련의 과정에 의하여 His-Tag이 붙어 있는 42.22kDa의 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질이 과발현되고, 형질전환체의 세포 용해물로부터 정제 및 분리되었음을 확인하였다(도 1).
서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 활성 확인
본 발명자들은 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질이 하기 반응식과 같은 'D-트레오닌 생산 효소'로서의 활성을 가질 것으로 예상하고, 이를 확인하였다.
[반응식]
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구체적으로, 상기 실시예 [1-2]에서 정제 및 분리한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질 0.25㎎/㎖를 100mM의 글리신 및 100mM의 아세트알데히드과 함께, 100μM의 피리독살-5-인산(pyridoxal-5-phosphate, PLP)과 1mM의 MnCl2가 포함된 50mM의 HEPES 완충용액(pH 7.5)에 첨가하고, 37℃에서 10분 동안 반응시킨 다음, 100℃에서 10분 동안 중탕하여 상기 반응을 종료시킨 다음, 반응이 종료된 완충 용액에서 D-트레오닌의 농도를 측정하였다.
상기 생산된 D-트레오닌은 OPA/NAC 전처리(OPA/NAC derivatization)한 후 HPLC를 통해 분석하였다. 상기 전처리 과정은 8㎎의 OPA(o-phthalaldelhyde)와 10㎎의 NAC(N-acetylcysteine)를 1㎖의 메탄올에 녹여 OPA/NAC 용액을 만들고, 25㎕의 분석할 샘플을 OPA/NAC 용액 50㎕와 0.4M의 붕산나트륨 완충용액(sodium borate buffer)(pH10.4) 175㎕의 혼합물에 넣고 0.2㎛ 필터로 필터링하여 전처리된 샘플을 준비하였다.
상기와 같이 준비된 전처리된 샘플 20㎕을, VWD(variable wavelength detector)와 역상 C18 칼럼(reverse-phase C18 column, Eclipse XDB-C18, 4.6ㅧ150㎜, 3.5㎛)(Agilent)이 장착된 고압 액체 크로마토그래피에 주입하여, D-트레오닌의 농도를 측정하였다. 상기와 같은 고압 액체 크로마토그래피를 수행함에 이용된 이동상은 메탄올(이동상 A)과 50mM의 아세트산나트륨(sodium acetate)(pH 5.9)(이동상 B)으로 구성되고, 유속 1㎖/분의 유속으로 10분 동안 흘려주었는데, 0~3분 동안은 이동상 A와 이동상 B를 3:7의 비율로, 3~10분 동안은 이동상 A와 이동상 B를 7:3의 비율로 유지하였다. 그리고 생산된 D-트레오닌을 정량화하기 위해 시판되는 D-트레오닌(Sigma-aldrich, 미국)과 D-알로-트레오닌(TOKYO CHEMICAL INDUSTRY CO., LTD., 일본)을 스탠다드로 사용하였다.
그 결과, 상기와 같이 반응이 종료된 완충 용액에서는 D-트레오닌과 D-알로-트레오닌이 모두 검출되었고(도 2), 애초에 존재하지도 않았던 D-트레오닌이 위 반응 결과 생성된 결과로부터 상기 실시예 [1-2]에서 정제 및 분리한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질이 글리신과 아세트알데히드로부터 D-트레오닌을 생산하는, D-트레오닌 생산 효소로서의 활성을 가짐을 확인하였다.
서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 효소 활성에 영향을 미치는 조건에 관한 연구
본 발명자들은, 상기 실시예 2에서 확인된 바와 같이, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질이 D-트레오닌 생산 효소로서 작용함에 그 활성에 영향을 미치는 조건들에 대하여 연구를 진행하였고, 그로부터 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 최적 활성 조건을 도출하였다.
[3-1] 금속 양이온의 영향
상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 효소의 활성에 금속 양이온의 종류가 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 실시예 [1-2]에서 정제 및 분리한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질 0.01㎎/㎖, 글리신 100mM, 아세트알데히드 100mM 및 피리독살-5-인산 10μM이 포함된 50mM의 CHES 완충용액(pH 9.0)에 1mM의 EDTA 또는 금속 양이온(Mn2 +, Mg2 +, Co2 +, Zn2 +)과 함께 첨가하여 35℃에서 10분 동안 반응시키고, 상기 반응을 종료시키기 위해 100℃에서 10분 동안 중탕하였다. 그리고 상기 실시예 2에서와 같은 방법으로, 상기와 같이 반응이 종료된 완충 용액에서 D-트레오닌과 D-알로-트레오닌의 농도를 측정하여 그 상대값을 비교하였다.
그 결과, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질은, 여러 종류의 금속 양이온 중 망간 양이온과 마그네슘 양이온이 첨가된 경우에 D-트레오닌 생산 효소의 활성이 향상되었고, 그 중에서도 망간 양이온을 이용한 경우에 D-트레오닌 생산 효소의 활성이 가장 우수한 것으로 확인되었다(도 3의 (A)).
상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 효소의 활성에 금속 양이온의 농도가 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 실시예 [1-2]에서 정제 및 분리한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질 0.01㎎/㎖, 글리신 100mM, 아세트알데히드 100mM 및 피리독살-5-인산 10μM이 포함된 50mM의 CHES 완충용액(pH 9.0)에 망간 양이온을 0mM, 0.1mM, 0.25mM, 0.5mM, 1mM, 2.5mM 및 5mM의 함량으로 각각 첨가하여 35℃에서 10분 동안 반응시키고, 상기 반응을 종료시키기 위해 100℃에서 10분 동안 중탕하였다. 그리고 상기 실시예 2에서와 같은 방법으로, 상기와 같이 반응이 종료된 완충 용액에서 D-트레오닌과 D-알로-트레오닌의 농도를 측정하여 그 상대값을 비교하였다.
그 결과, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질은 망간 양이온이 존재하는 환경에서만 D-트레오닌 생산 효소의 활성을 나타내는 것으로 확인되었다(도 3의 (B)).
[3-2] 온도의 영향
상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 효소 활성에 온도가 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 실시예 [1-2]에서 정제 및 분리한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질 0.01㎎/㎖, 글리신 100mM 및 아세트알데히드 100mM를, 10μM의 피리독살-5-인산 및 1mM의 Mn2 +가 포함된 50mM의 HEPES 완충용액(pH 7.5)에 첨가한 다음, 25℃ 내지 55℃의 온도에서 각각 10분 동안 반응시키고, 상기 반응을 종료시키기 위해 100℃에서 10분 동안 중탕하였다. 그리고, 상기 실시예 2에서와 같은 방법으로, 상기와 같이 반응이 종료된 완충 용액에서 D-트레오닌과 D-알로-트레오닌의 농도를 측정하여 그 상대값을 비교하였다.
그 결과, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 효소 활성은 35℃에 가까울수록 점점 우수해지는 것으로 확인되었다(도 4).
[3-3] pH의 영향
상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 효소 활성에 pH가 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 실시예 [1-2]에서 정제 및 분리한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질 0.01㎎/㎖, 글리신 100mM 및 아세트알데히드 100mM를, 피리독살-5-인산 10μM 및 Mn2 + 1mM와 함께, 각각 pH 6.5 내지 7.5의 MOPS 완충용액, pH 7.5 내지 8.0의 HEPES 완충 용액, pH 8.0 내지 8.5의 EPPS 완충 용액 및 pH 8.5 내지 10의 CHES 완충 용액에 각각 첨가하여, pH 6.5 내지 10의 범위에서 각각 반응시켰다. 상기 효소 반응은 35℃의 온도에서 10분 동안 수행한 뒤, 상기 반응을 종료시키기 위해 100℃에서 10분 동안 중탕하였다. 그리고 상기 실시예 2에서와 같은 방법으로, 상기와 같이 반응이 종료된 완충 용액에서 D-트레오닌과 D-알로-트레오닌의 농도를 측정하여 그 상대값을 비교하였다.
그 결과, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 효소 활성은 pH가 8.5~9.0에 가까울수록 점점 우수해지는 것으로 확인되었다(도 5).
[3-4] 피리독살-5-인산의 영향
상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 효소 활성에 피리독살-5-인산의 존부 및 농도가 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 실시예 [1-2]에서 정제 및 분리한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질 0.01㎎/㎖, 글리신 100mM, 아세트알데히드 100mM 및 Mn2 + 1mM가 포함된 50mM의 CHES 완충용액(pH 9.0)에 피리독살-5-인산을 0μM, 1.0μM, 1.25μM, 2.5μM, 5μM 및 10μM의 함량으로 각각 첨가하여 35℃에서 10분 동안 반응시키고, 상기 반응을 종료시키기 위해 100℃에서 10분 동안 중탕하였다. 그리고 상기 실시예 2에서와 같은 방법으로, 상기와 같이 반응이 종료된 완충 용액에서 D-트레오닌과 D-알로-트레오닌의 농도를 측정하여 그 상대값을 비교하였다.
그 결과, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 효소 활성은 피리독살-5-인산이 존재하는 환경에서 더욱 우수해지고, 1.0μM 수준의 농도에서 최대 활성에 도달하는 것으로 확인되었다(도 6).
[3-5] 기질의 비율의 영향
상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 효소 활성에 피리독살-5-인산의 존부 및 농도가 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 실시예 [1-2]에서 정제 및 분리한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질 0.01㎎/㎖, 아세트알데히드 100mM, 피리독살-5-인산 10μM 및 Mn2 + 1mM가 포함된 50mM의 CHES 완충용액(pH 9.0)에 글리신을 50mM, 75mM, 100mM, 125mM, 250mM, 500mM, 750mM, 1000mM 및 1250mM의 함량으로 각각 첨가하여 35℃에서 10분 동안 반응시키고, 상기 반응을 종료시키기 위해 100℃에서 10분 동안 중탕하였다. 그리고 상기 실시예 2에서와 같은 방법으로, 상기와 같이 반응이 종료된 완충 용액에서 D-트레오닌과 D-알로-트레오닌의 농도를 측정하여 그 상대값을 비교하였다.
그 결과, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 단백질의 D-트레오닌 특이적 합성은 글리신과 아세트알데히드의 비율이 10:1인 경우에 가장 우수한 것으로 확인되었다(도 7).
상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 예시적으로 설명하였으나, 본 발명의 범위는 상기와 같은 특정 실시예에만 한정되지 아니하며, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 특허청구범위에 기재된 범주 내에서 적절하게 변경이 가능할 것이다.
<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF BIOSCIENCE AND BIOTECHNOLOGY <120> A Novel Enzyme for Production of D-threonine, and A Method for Preparing D-threonine Using The Same <130> 2018-DPA-2626 <160> 6 <170> KopatentIn 3.0 <210> 1 <211> 376 <212> PRT <213> Filomicrobium marinum <400> 1 Met Arg Ala Pro Ala Arg Leu Gly Ile Pro Leu Ala Asp Val Asp Thr 1 5 10 15 Pro Ala Leu Ile Leu Asp Leu Asp Ala Phe Glu Arg Asn Leu Gln Thr 20 25 30 Met Ala Asp Trp Ala Lys Ser Lys Asn Val Arg Leu Arg Pro His Ala 35 40 45 Lys Ser His Lys Cys Pro Ala Ile Ala His Arg Gln Met Ala Leu Gly 50 55 60 Ala Val Gly Val Cys Cys Gln Lys Val Ser Glu Ala Glu Val Met Val 65 70 75 80 Asp Ala Gly Ile Thr Asn Val Leu Ile Ser Asn Glu Val Val Gly Arg 85 90 95 Thr Lys Leu Glu Ala Leu Ala Gln Leu Ala Leu Arg Ala Arg Met Gly 100 105 110 Val Cys Val Asp Asp Ile Arg Gln Ile Arg Asp Leu Ser Glu Ala Met 115 120 125 His Ala Ala Gly Ala Thr Ile Asp Val Leu Val Glu Ile Asn Ile Gly 130 135 140 Gly Asn Arg Cys Gly Val Glu Pro Gly Asp Pro Ala Val Arg Leu Gly 145 150 155 160 Ala Ala Val Ala Gln Ala Asp Gly Leu Arg Phe Ala Gly Leu Gln Ser 165 170 175 Tyr Asp Gly Ile Thr Gln His Val Arg Asp Pro Asp Glu Arg Lys Ala 180 185 190 Arg Ala Ala Arg Ala Gly Asp Val Thr Ala Gln Thr Ile Ala Ala Leu 195 200 205 Arg Asp Ile Gly Leu Glu Cys Glu Thr Val Gly Gly Ala Gly Thr Gly 210 215 220 Ser Phe Ala Phe Asp Gly Met Ser Gly Val Trp Asn Glu Leu Gln Pro 225 230 235 240 Gly Ser Tyr Ala Phe Met Asp Ala Asp Tyr Ala Arg Asn Thr Pro Ala 245 250 255 Gly Gly Asp Val Pro Lys Phe Glu His Ala Met Phe Val Trp Ala Ile 260 265 270 Val Met Ser Arg Thr Ser Val Gly Gln Ala Val Val Asp Ala Gly His 275 280 285 Lys Val Leu Pro Ile Asp Ser Gly Met Pro Val Pro Phe Asp Arg Pro 290 295 300 Gly Val Arg Tyr Glu Arg Pro Ser Asp Glu His Gly Cys Leu Val Ala 305 310 315 320 Glu Leu Asp Ser Ala Leu Pro Asp Leu Gly Glu Lys Ile Leu Ile Val 325 330 335 Pro Ser His Val Asp Pro Thr Ala Asn Gln His Asp Phe Phe Ile Gly 340 345 350 Val Arg Gly Met Ala Glu Gly Asp Gly Thr Val Gln Glu Ile Trp Pro 355 360 365 Val Thr Ala Arg Gly Cys Val Phe 370 375 <210> 2 <211> 1131 <212> DNA <213> Filomicrobium marinum <400> 2 atgcgcgcac cagcacggct tggtattccg cttgcagacg tcgatacccc tgctttgatc 60 ctcgatctcg atgcgtttga gcgcaatctc cagacgatgg cggattgggc caaaagcaag 120 aacgtgcgat tgcgcccaca tgcaaaatct cacaaatgcc ccgcgatcgc gcatcgacaa 180 atggcgctcg gagccgtcgg tgtctgctgc cagaaggtct cggaagccga ggtgatggtg 240 gatgctggca taactaatgt gctgatcagc aacgaggtcg tcgggcgcac gaaactagag 300 gcgctggcgc aattggcgct acgagcgcgt atgggtgtgt gtgtcgacga tatccggcaa 360 atcagagatt tgtctgaggc gatgcatgct gctggcgcaa caatagatgt gcttgttgaa 420 atcaatatcg gcgggaaccg ttgcggtgtt gagccgggcg accctgcagt tcggctgggt 480 gcagctgttg cgcaggcgga tggcctgcgt tttgcgggct tacagtctta tgacggaatt 540 acgcagcatg tccgcgatcc ggatgaacgc aaggcgcgtg cggcgcgtgc gggtgatgtt 600 accgcgcaga ccattgcggc gcttcgcgat attgggcttg agtgcgaaac tgtcgggggc 660 gccggaacgg gttccttcgc attcgacggt atgagcggcg tgtggaatga gctgcaaccg 720 gggtcctacg cttttatgga tgccgactat gctcgcaata ccccggcggg tggcgatgtt 780 cccaaatttg agcacgccat gtttgtttgg gcgatcgtca tgagccgtac cagcgttggt 840 caggctgtgg tggatgccgg gcataaagtg ctgcctatcg actcgggtat gccggtcccg 900 tttgatcgtc cgggtgttcg ctatgagcgg ccttcagacg agcacggttg cctggttgcg 960 gaactggact cggcccttcc tgacctaggt gagaaaattc tgatcgtgcc cagtcatgtc 1020 gatccaacgg ccaaccagca cgactttttt atcggtgtgc gtgggatggc cgagggcgat 1080 ggcacagttc aagagatctg gccagttacg gcgcgaggtt gtgtgttcta g 1131 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for SEQ ID No. 2 <400> 3 tggtgccgcg cggcagccat atgcgcgcac cagcacggct 40 <210> 4 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for SEQ ID No. 2 <400> 4 ggtggtggtg gtgctcgagc tagaacacac aacctcgcgc 40 <210> 5 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for pET28a(+) <400> 5 gcgcgaggtt gtgtgttcta gctcgagcac caccaccacc 40 <210> 6 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for pET28a(+) <400> 6 agccgtgctg gtgcgcgcat atggctgccg cgcggcacca 40

Claims (14)

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  9. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 D-트레오닌 생산 효소를 유효성분으로 포함하는 D-트레오닌 생산용 조성물.
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  11. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 D-트레오닌 생산 효소를 글리신 및 아세트알데히드와 함께 반응시키는 단계;를 포함하는 인 비트로(in vitro)에서의 D-트레오닌 생산 방법.
  12. 청구항 11에 있어서,
    상기 D-트레오닌 생산 효소, 글리신 및 아세트알데히드의 반응 생산물로부터 D-트레오닌을 회수하는 단계;를 더 포함하는 인 비트로(in vitro)에서의 D-트레오닌 생산 방법.
  13. 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 발현벡터가 도입된 형질전환체를 글리신 및 아세트알데히드의 존재 하에서 배양하는 단계;를 포함하는 인 비보(in vivo)에서의 D-트레오닌 생산 방법.
  14. 청구항 13에 있어서,
    상기 형질전환체의 배양물로부터 D-트레오닌을 회수하는 단계;를 더 포함하는 인 비보(in vivo)에서의 D-트레오닌 생산 방법.
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Catal Sci Technol.,7:5964-5972(2017.11.1.)*
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