WO2016189988A1 - マンノース転移酵素遺伝子、組換えベクター、形質転換体、１－Ｏ－β－マンノシルエリスリトールリピッドの製造方法 - Google Patents

マンノース転移酵素遺伝子、組換えベクター、形質転換体、１－Ｏ－β－マンノシルエリスリトールリピッドの製造方法 Download PDF

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mel
seq
gene
amino acid
mannose
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友岳 森田
浩 羽部
北本　大
英明 小池
徳馬 福岡
周平 山本
岸本　高英
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国立研究開発法人産業技術総合研究所
東洋紡株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters

Definitions

  • the present invention includes a mannose transferase gene encoding mannose transferase, a DNA constituting the gene, a protein obtained by translating such a gene or DNA, a recombinant vector into which the mannose transferase gene has been introduced, the group
  • the present invention relates to a transformant transformed with a replacement vector, and a method for producing 1-O- ⁇ -mannosylerythritol lipid using the transformant.
  • Biosurfactant is a natural surfactant produced by microorganisms, has high biodegradability, low toxicity, is environmentally friendly, and has a new physiological function. If used in the food industry, cosmetics industry, pharmaceutical industry, chemical industry, environmental field, etc., it is meaningful in realizing an environmentally harmonious society.
  • a biosurfactant there has conventionally been a mannosyl alditol lipid in which alditol is bonded to ⁇ -glycosides to mannose to form mannosyl erythritol (hereinafter also referred to as ME), and a fatty acid is ester-bonded.
  • MEL mannosyl erythritol lipid
  • Patent Document 1 A compound in which alditol is erythritol is called mannosyl erythritol lipid (hereinafter also referred to as MEL) (Patent Document 1).
  • MEL mannosyl erythritol lipid
  • Patent Document 1 Pseudozyma Hubayiensis KM-59 strain is cultured in a medium supplemented with soybean oil, glucose or the like to obtain MEL.
  • MEL contains erythritol as a constituent sugar alcohol, but since it is synthesized without adding erythritol to the medium, it grows as a nutrient source by assimilating soybean oil or glucose added to the medium, and is produced as a by-product at that time. It is understood that erythritol is used to produce MEL.
  • Some microorganisms that biosynthesize MEL have a MEL biosynthetic gene cluster.
  • the seventh chromosome of Ustilago maydis has a mannosyltransferase (Emt1p) that catalyzes the reaction of binding mannose and erythritol to produce ME, and acyltransferases (Mac1p, Mac2p) that bind lipids to ME.
  • Emt1p mannosyltransferase
  • Mac1p, Mac2p acyltransferases
  • FIG. 7 shows a structural formula of MEL in which a hydrogen atom, an acetyl group, or a fatty acid residue having 3 to 18 carbon atoms is represented by R 1 to R 5 .
  • MEL has various structures in which the position and number of fatty acid residues and acetyl groups to be bonded are different.
  • a structure in which R 3 and R 4 are acetyl groups is MEL-A
  • a structure in which R 4 is an acetyl group is MEL-B
  • MEL-D A structure in which MEL-C, R 3 and R 4 are hydrogen is defined as MEL-D.
  • Different MELs are produced depending on the microorganism and medium composition.
  • Pseudozyma antarctica and Pseudozyma aphidis are cultured in a medium containing soybean oil, glucose, or n-alkane, and then MEL-A MEL containing MEL-B and MEL-C as a main component is produced (Non-patent Document 1).
  • Pseudozyma yeast lacking the MEL biosynthetic pathway has also been developed (Patent Document 3). Since pseudozyma produces a large amount of MEL, it consumes a large amount of energy for MEL biosynthesis. By losing the MEL biosynthetic pathway, the energy consumed by the MEL biosynthetic system is directed to the production of heterologous proteins.
  • Pseudozyma Antactica is used, and a gene encoding mannose transferase (hereinafter also referred to as PaEMT1 gene) that catalyzes the synthesis reaction of ME, which is a sugar skeleton of MEL, is deleted by homologous gene recombination.
  • PaEMT1 gene mannose transferase
  • MEL biosynthetic gene-deficient Pseudozyma yeast has been obtained.
  • Pseudozyma antarctica produces MEL when cultured in a medium containing soybean oil or glucose, but said MEL biosynthetic gene-deficient Pseudozyma yeast does not produce MEL even when cultured under the same conditions.
  • erythritol is a sugar alcohol having 4 carbon atoms shown in FIG. 8A, and has CH 2 OH groups at both ends of the carbon chain. According to DL notation, erythritol has the same structure as DL. However, depending on whether the hydroxymethyl group of erythritol bonded to mannose is derived from the 1st carbon or the 4th carbon, the structure of the obtained ME is as shown in FIGS. 8 (b) and (c). Is different.
  • Pseudozyma Huveyensis KM-59 described in Patent Document 1 is a 4-O- ⁇ -D-mannopyranosyl-erythritol (hereinafter referred to as 4-O- ⁇ ) shown in FIG. -Also referred to as ME)).
  • the resulting 4-O- ⁇ -D-mannopyranosyl-erythritol Lipid is also referred to as 4-O- ⁇ -MEL.
  • 1-O- ⁇ -D-mannopyranosyl-erythritol is a sugar skeleton.
  • 1-O- ⁇ -ME is a microorganism that produces 1-O- ⁇ -D-mannopyranosyl-erythritol Lipid
  • Patent Document 2 this compound is also referred to as 1-O- ⁇ -MEL.
  • Pseudozyma tsukubaensis was cultured in a medium containing olive oil
  • 1-O- ⁇ -MEL was produced.
  • This 1-O- ⁇ -MEL has improved hydration properties compared to 4-O- ⁇ -MEL and has a high vesicle-forming ability, which makes it a promising biomaterial as a skin care agent.
  • 1-O- ⁇ -MEL is more hydratable than 4-O- ⁇ -MEL means that the properties of MEL differ depending on the three-dimensional structure of erythritol bound to mannose. Furthermore, since the hydration properties of MEL vary depending on the number of fatty acid residues constituting 1-O- ⁇ -MEL and the position of acetyl group introduction, various applications can be developed if various MELs can be produced freely. It becomes. However, although various improvements based on culture conditions have been repeated as a technique for producing MEL using yeast, it basically depends on the producing bacteria and has a limited productivity.
  • mannosyltransferase that catalyzes the reaction of binding mannose and erythritol to produce ME is an enzyme directly involved in the production of 1-O- ⁇ -MEL. If a gene encoding mannosyltransferase capable of biosynthesizing 1-O- ⁇ -MEL is used, 1-O- ⁇ -MEL can be biosynthesized using a conventional microorganism. Therefore, it is desired to develop a mannose transferase gene for biosynthesis of 1-O- ⁇ -MEL, a DNA constituting the gene, and a protein obtained by translating such a gene or DNA.
  • a recombinant vector into which such a mannose transferase gene has been introduced a transformant obtained by transforming using the recombinant vector, and a 1-O— obtained by culturing the transformant.
  • Development of a method for producing ⁇ -MEL is desired.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and provides a mannose transferase gene involved in 1-O- ⁇ -MEL biosynthesis, a DNA constituting the gene, and a protein obtained by translating such a gene or DNA.
  • the purpose is to do.
  • the present invention relates to a recombinant vector introduced with the mannose transferase gene, a transformant obtained by transforming using the recombinant vector, and 1-O- ⁇ - obtained by culturing the transformant. It aims at providing the manufacturing method of MEL.
  • the present invention is a gene encoding a mannose transferase that biosynthesizes 1-O- ⁇ -D-mannopyranosylerythritol represented by the following formula from mannose and erythritol, comprising 60%
  • a mannose transferase gene comprising a gene encoding an amino acid sequence having the above identity is provided.
  • the present invention also provides the mannose transferase gene, wherein the mannose transferase comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 and / or SEQ ID NO: 8.
  • the present invention also provides a recombinant vector into which the mannose transferase gene has been introduced.
  • the present invention also provides a non-producing 4-O- ⁇ -MEL produced by inactivating the mannose transferase activity of a bacterium that biosynthesizes 4-O- ⁇ -ME represented by the following formula, using the above recombinant vector:
  • the present invention provides a transformant characterized by being transformed in this manner.
  • the present invention also provides the transformant, wherein the bacterium that biosynthesizes 4-O- ⁇ -ME is a bacterium that produces 4-O- ⁇ -MEL represented by the following formula: To do.
  • R 1 to R 4 represent a hydrogen atom, an acetyl group, or a saturated or unsaturated fatty acid residue having 3 to 18 carbon atoms, which may be the same as or different from each other, and R 5 Represents a hydrogen atom or a saturated or unsaturated fatty acid residue having 3 to 18 carbon atoms.
  • the present invention provides a method for producing 1-O- ⁇ -MEL represented by the following formula, wherein the transformant is cultured.
  • R 1 to R 4 represent a hydrogen atom, an acetyl group, or a saturated or unsaturated fatty acid residue having 3 to 18 carbon atoms, which may be the same as or different from each other, and R 5 Represents a hydrogen atom or a saturated or unsaturated fatty acid residue having 3 to 18 carbon atoms.
  • the present invention provides a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and a protein characterized by having 90% or more identity with SEQ ID NO: 1.
  • the present invention also provides DNA comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 and DNA characterized by having 90% or more identity with SEQ ID NO: 2.
  • a mannose transferase gene capable of producing 1-O- ⁇ -MEL is provided.
  • a recombinant vector containing the mannose transferase gene was prepared, and mannose transferase activity that biosynthesizes 4-O- ⁇ -ME was inactivated by the recombinant vector.
  • Non-production of 4-O- ⁇ -MEL By transforming the bacterium, 1-O- ⁇ -MEL can be produced using a 4-O- ⁇ -MEL-producing bacterium.
  • FIG. 4 is a TLC diagram showing that Pseudozyma antarctica has MEL-producing ability, and a non-MEL-producing strain in which the gene encoding the mannose transferase of Pseudozyma antarctica has been disrupted has lost MEL-producing ability.
  • Reference numeral 1 indicates a product of MEL-producing bacteria
  • reference numeral 2 indicates a product of non-MEL-producing bacteria.
  • FIG. 2 is a diagram showing the structure of a gene expression vector pUXV1-PtEMT1. It is a figure which shows that the MEL non-producing strain transformed with the gene expression vector pUXV1-PtEMT1 has recovered the production ability of MEL.
  • FIG. 4 is a diagram showing 1 H-NMR analysis results of MEL produced by 4-O- ⁇ -MEL-producing bacteria and MEL produced by transformants.
  • FIG. 6 is a diagram showing 13 C-NMR analysis results of MEL produced by 4-O- ⁇ -MEL-producing bacteria and MEL produced by transformants. It is a figure explaining the structure of MEL.
  • the first of the present invention is a gene encoding a mannose transferase that biosynthesizes 1-O- ⁇ -ME from mannose and erythritol, and an amino acid sequence having at least 60% identity with SEQ ID NO: 1.
  • a mannose transferase gene comprising a coding gene, a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and a protein having 90% or more identity to SEQ ID NO: 1, and DNA comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 and DNA characterized by having 90% or more identity with SEQ ID NO: 2.
  • the second aspect of the present invention is a recombinant vector introduced with the mannose transferase gene, a transformant transformed with the recombinant vector, and 1-O- ⁇ -MEL using the transformant. It is a manufacturing method.
  • the present invention will be described in detail.
  • 1-O- ⁇ -MEL 1-O- ⁇ -MEL produced in the present invention is represented by the following formula. It is a compound in which 1 to 4 fatty acids are ester-bonded to 1-O- ⁇ -ME in which erythritol is ⁇ -glycosidically bonded to mannose.
  • R 1 to R 4 represent a hydrogen atom, an acetyl group, or a saturated or unsaturated fatty acid residue having 3 to 18 carbon atoms, which may be the same as or different from each other
  • R 5 represents Represents a hydrogen atom or a saturated or unsaturated fatty acid residue having 3 to 18 carbon atoms.
  • a structure in which R 3 and R 4 are acetyl groups is MEL-A
  • a structure in which R 3 is a hydrogen atom and R 4 is an acetyl group is a structure in which MEL-B and R 3 are acetyl groups.
  • a structure in which R 4 is a hydrogen atom is referred to as MEL-C
  • a structure in which R 3 and R 4 are hydrogen is referred to as MEL-D.
  • 1-O- ⁇ -MEL has been mainly produced by Pseudozyma tsukubaensis, but 1-O- ⁇ -MEL produced by Pseudozyma tsukubaensis was limited to MEL-B.
  • 1-O- ⁇ -MEL fatty acid residues contained in 1-O- ⁇ -MEL produced by Pseudozyma tsukubaensis were limited to 2 or 3, and no fatty acid residue was present.
  • 1-O- ⁇ -MEL produced in the present invention is not limited to 2 or 3 fatty acid residues, and the arrangement of acetyl groups is not limited to MEL-B. Therefore, a fatty acid residue that does not exist in the past is a 3-chain 1-O- ⁇ -MEL-A or 1-O- ⁇ -MEL-C, a fatty acid residue is a single-chain 1-O- ⁇ -MEL, etc. New compounds are also included.
  • R 1 to R 4 represent a hydrogen atom, an acetyl group, or a saturated or unsaturated fatty acid residue having 3 to 18 carbon atoms, which may be the same as or different from each other, and R 5 Represents a hydrogen atom or a saturated or unsaturated fatty acid residue having 3 to 18 carbon atoms.
  • R 5 Represents a hydrogen atom or a saturated or unsaturated fatty acid residue having 3 to 18 carbon atoms.
  • 1-O- ⁇ -ME is a sugar skeleton.
  • MEL-producing bacteria are presumed to produce 1-O- ⁇ -ME or 4-O- ⁇ -ME by recognizing the three-dimensional structure of erythritol when ⁇ -glycosidically bonding erythritol to mannose.
  • a mannose transferase that biosynthesizes ME by binding mannose and erythritol is selected from genes constituting the MEL biosynthesis gene cluster, and 1-O- ⁇ -MEL is selected. Used as a gene for production.
  • SEQ ID NO: 1 shows the amino acid sequence of Pseudozyma tsukubaensis mannose transferase. This mannose transferase catalyzes a reaction for biosynthesis of 1-O- ⁇ -ME from mannose and erythritol.
  • the present invention has 60% or more, preferably 65% or more, more preferably 90% or more, particularly preferably 95% or more identity with SEQ ID NO: 1 in addition to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • a gene encoding an amino acid sequence comprising an amino acid sequence having it can be preferably used.
  • the amino acid sequence of the mannose transferase preferably differs from the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • at least one amino acid residue in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is preferably substituted with another amino acid residue.
  • the identity of amino acid sequences can be calculated using commercially available analysis tools (for example, software such as FASTA, BLAST, PSI-BLAST, SSEARCH, etc.) available through the Internet.
  • identity can be measured by performing a BLAST search under initial conditions.
  • the initial conditions for the BLAST search are, for example, as follows. That is, in Advanced BLAST 2.1, blastp is used for the program, Expect value is 10, Filter is all OFF, BLOSUM62 is used for Matrix, Gap existence cost, Per idresidue gap ⁇ cost, and Lambda ratio are 11, 1, 0.85, respectively.
  • amino acid sequence having 60% or more identity with SEQ ID NO: 1 can be selected by assembling with analysis software from various known databases in which amino acid sequences relating to various proteins are stored.
  • amino acid sequences having 60% or more identity with SEQ ID NO: 1 include, for example, the UHOR 04876 protein, Melanopsisium pennsylvanicum and Sporisorium reilianum from Ustilago hordei
  • Examples include derived proteins, erythritol-mannosyl-transferase from Ustyago Mydis, mannosyltransferase from Pseudozyma aphidis, glycosyltransferase from Pseudozyma hubeiensis and pseudozyma antarctica. These are all proteins having an amino acid sequence of 600 to 620 amino acids.
  • SEQ ID NO: 1 When the amino acid on the N-terminal side of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is the first amino acid, SEQ ID NO: 6 is the 271st to 300th amino acid sequence from the N terminus, and SEQ ID NO: 7 is the 369th to 398th amino acid sequence SEQ ID NO: 8 corresponds to the 569th to 612th amino acid sequence.
  • SEQ ID NO: 8 corresponds to the 569th to 612th amino acid sequence.
  • a protein having at least 60% identity with SEQ ID NO: 1 and having at least one of the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, and SEQ ID NO: 8 is obtained by binding erythritol to ⁇ -glycosidic mannose.
  • the possibility of biosynthesis of 1-O- ⁇ -ME is extremely high.
  • the mannose transferase gene used in the present invention may be a gene encoding the same amino acid sequence as SEQ ID NO: 1, and it is possible to biosynthesize 1-O- ⁇ -ME by binding erythritol to ⁇ -glycosides to mannose.
  • a gene encoding a gene having at least 60% identity with SEQ ID NO: 1, more preferably a gene containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 and / or SEQ ID NO: 8 can be widely used. Even if one or more amino acids are added or deleted in the amino acid sequences of SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, and SEQ ID NO: 8, erythritol is ⁇ -glycosidically bonded to mannose and 1-O- ⁇ - As long as ME can be biosynthesized, the gene encoding the amino acid sequence is included in the mannose transferase gene of the present invention.
  • the enzyme that catalyzes the synthesis of 4-O- ⁇ -ME has 60% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and the first to 270th, In the 301st to 368th and the 399th to 568th positions, at least one amino acid residue is preferably substituted, deleted, disabled and / or deleted.
  • the number of amino acid residues into which such mutations are introduced is not particularly limited, but for example, 50 or less, 40 or less, 30 or less, 20 or less, 10 or less, 5 or less, 4 or less, It can be set to three or less, two or less, or one.
  • the amino acid residue mutation is preferably amino acid residue substitution.
  • the type of amino acid residue substitution is not particularly limited, but conservative amino acid substitution is preferred from the standpoint of not having a significant effect on enzyme activity. “Conservative amino acid substitution” refers to substitution of an amino acid residue with an amino acid residue having a side chain of similar properties.
  • a basic side chain eg lysine, arginine, histidine
  • an acidic side chain eg aspartic acid, glutamic acid
  • an uncharged polar side chain eg glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine
  • Cysteine eg alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan
  • ⁇ -branched side chains eg threonine, valine, isoleucine
  • aromatic side chains eg tyrosine, phenylalanine, Like tryptophan and histidine.
  • a conservative amino acid substitution is preferably a substitution between amino acid residues within the same family.
  • the positions where SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 are inserted are preferably in the vicinity of positions corresponding to these sequences of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • an amino acid sequence having 60% or more identity with SEQ ID NO: 1 is common in that it contains an ENH sequence from the N-terminal to the 268th to 270th amino acid sequence. Therefore, in the present invention, one containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 after the ENH sequence can be preferably used.
  • an amino acid sequence having 60% or more identity with SEQ ID NO: 1 is common in that all KLN sequences are included in the 350th to 360th positions from the N-terminus.
  • amino acid sequence having 60% or more identity with SEQ ID NO: 1 is common in that it contains an AAA sequence at positions 540 to 560 from the N-terminus.
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 after the AAA sequence is used.
  • the amino acid sequences of SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, and SEQ ID NO: 8 may be present immediately after the above-described unique sequences, and include an ENH sequence and SEQ ID NO: 6, a KLN sequence and SEQ ID NO: 7, AAA. It may further contain 7 to 20 amino acids between the sequence and SEQ ID NO: 8.
  • the 271st to 305th amino acid sequence from the N-terminus of the amino acid sequence of Ustyago Holdi's UHOR 04876 protein is replaced by SEQ ID NO: 6, and the 373rd to 308th amino acid sequence is SEQ ID NO: 7 And the amino acid sequence of the 568th and subsequent amino acids is substituted with SEQ ID NO: 8.
  • mannose transferase gene of the present invention it is easy for those skilled in the art to obtain a derivative having the function of the mannose transferase gene of the present invention by addition, deletion, insertion, substitution, or the like of amino acids or DNA using ordinary gene recombination techniques. . Therefore, a mannose transferase gene capable of biosynthesizing 1-O- ⁇ -ME obtained by such conventional means is also included in the scope of the present invention.
  • the protein of the present invention is a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is an amino acid sequence of a mannose transferase that biosynthesizes 1-O- ⁇ -ME from mannose and erythritol derived from Pseudozyma tsukubaensis.
  • the protein of the present invention can catalyze a mannose transfer reaction that biosynthesizes 1-O- ⁇ -ME from mannose and erythritol, and can be used as a mannose transferase. However, it is not limited to mannose transfer activity, but includes cases having other catalytic activities.
  • the protein of the present invention may be a protein having 90% or more identity with SEQ ID NO: 1, more preferably 95% or more.
  • the DNA of the present invention preferably has the base sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the base acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is DNA encoding mannose transferase that biosynthesizes 1-O- ⁇ -ME from mannose and erythritol. Therefore, the DNA of the present invention can be used in the same manner as the above mannose transferase gene that biosynthesizes 1-O- ⁇ -ME from mannose and erythritol.
  • the base sequence of the DNA of the present invention is arbitrary as long as it encodes the above-described mannose transferase that biosynthesizes 1-O- ⁇ -ME.
  • SEQ ID NO: 2 and 60% or more, 70% or more may be DNA having an identity of 80% or more, 90% or more, more preferably 95% or more.
  • the DNA encoding mannose transferase that biosynthesizes 1-O- ⁇ -ME preferably has a base sequence different from the base sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the homology of the base sequence can be calculated using an analysis tool that is commercially available or available through a telecommunication line (Internet), and is calculated using software such as FASTA, BLAST, PSI-BLAST, SSEARCH, etc.
  • the initial conditions are, for example, as follows. That is, in Advanced® BLAST® 2.1, the homology value (%) of nucleotide sequences can be calculated by performing a search using blastn as a program and setting various parameters to default values.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is the amino acid sequence of Pseudozyma tsukubaensis mannose transferase.
  • the gene encoding this amino acid sequence includes, for example, DNA encoding mannose transferase that obtains the entire genome sequence information of Pseudozyma tsukubaensis, estimates the entire gene region, and biosynthesizes 4-O- ⁇ -ME. It can be prepared by comparing identities and selecting genes with high identity.
  • a gene group involved in 1-O- ⁇ -MEL production is expressed by culturing in a medium containing fatty acid, and mRNA having a high expression level is selected.
  • a gene with high sequence identity may be selected by referring to gene genome information of mannose transferase synthesizing - ⁇ -ME.
  • the DNA constituting such a gene may be chemically synthesized based on the DNA sequence encoding SEQ ID NO: 1. Based on the sequence information disclosed herein, DNA encoding mannose transferase can be obtained by using chemical DNA synthesis, standard genetic engineering techniques, molecular biological techniques, or biochemical techniques.
  • amino acid sequence of 271 to 305 from the N-terminal of the amino acid sequence of Ustyago Holdi UHOR 04876 protein described above is substituted with SEQ ID NO: 6, and the amino acid sequence of 373 to 308 of the same.
  • Such a gene is prepared by obtaining whole genome sequence information from Ustyago Holdi, selecting DNA encoding UHOR 04876 protein, and appropriately substituting with DNA corresponding to SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, and SEQ ID NO: 8. can do.
  • the selected gene encodes mannose transferase is introduced into a non-MEL-producing strain lacking mannose transferase activity described below, and cultured under MEL production conditions to produce MEL. This can be confirmed by analyzing the structure of the obtained MEL and detecting 1-O- ⁇ -MEL.
  • a mannose transferase gene can be introduced into an appropriate expression vector and used as a recombinant vector.
  • a recombinant vector can be prepared by inserting the mannose transferase gene downstream of the expression vector promoter, and can be constructed based on conventionally known genetic engineering.
  • a plasmid, a cosmid, a virus-derived one or the like can be used as an expression vector to be used.
  • the expression vectors used are pUXV1 ATCC 77463, pUXV2 ATCC 77464, pUXV5 ATCC 77468, pUXV6 ATCC 77469, pUXV7 ATCC 77470.
  • the above is only an example of the recombinant vector of the present invention, and a person skilled in the art can construct a recombinant vector for biosynthesis of various 1-O- ⁇ -MELs according to conventional means in the art. it can. Except for the mannose transferase gene to be introduced into the expression vector, the promoter and other conditions can be appropriately selected from known ones.
  • a transformant can be produced by introducing the recombinant vector into a non-producing strain of 4-O- ⁇ -MEL.
  • the “4-O- ⁇ -MEL non-producing bacterium” is a bacterium that can originally biosynthesize 4-O- ⁇ -MEL (hereinafter also referred to as 4-O- ⁇ -MEL-producing bacterium).
  • it means a bacterium in which mannose transferase activity that binds mannose and erythritol to biosynthesize 4-O- ⁇ -ME is inactivated.
  • any 4-O- ⁇ -MEL of MEL-A, MEL-B, MEL-C, and MEL-D may be produced.
  • the name is not limited to “fungus”, and may be a eukaryotic microorganism such as yeast or mold, or a cell of another higher organism, provided that it has the ability to produce 4-O- ⁇ -MEL. Examples of such higher organism cells include animal cells and cultured plant cells.
  • 4-O- ⁇ -MEL producing bacteria include Saccharomyces strains (for example, Saccharomyces cerevisiae) and Pseudozyma strains (for example, Pseudozyma antarctica).
  • host cells having DNA encoding a mannose transferase that catalyzes the synthesis of 1-O- ⁇ -ME are not limited to 4-O- ⁇ -MEL non-producing bacteria, and can be arbitrarily selected depending on the purpose. Can be selected.
  • the non-producing 4-O- ⁇ -MEL used in the present invention is a conventional culture condition in which 4-O- ⁇ -MEL-producing mannose transferase is inactivated and 4-O- ⁇ -ME is biosynthesized.
  • 4-O- ⁇ -MEL cannot be biosynthesized.
  • 4-O- ⁇ -MEL since only mannose transferase that binds mannose and erythritol is inactivated, for example, 4-O- ⁇ -MEL may be biosynthesized when cultured in a medium containing ME.
  • the 4-O- ⁇ -MEL non-producing bacterium used in the present invention can be prepared by inactivating the mannose transferase of 4-O- ⁇ -MEL-producing bacterium, and such a method is known. For example, it can be prepared by the method described in Patent Document 3.
  • MEL biosynthesized by microorganisms has a number of fatty acid residues introduced into MEL in the range of 1 to 3 . Different MELs can be biosynthesized by the same microorganism depending on the culture conditions. Table 1 shows part of the relationship between conventionally known types of MEL and producing bacteria. As shown in FIG. 7, mannose has OR 1 , OR 2 , OR 3 and OR 4, but MEL having one fatty acid residue is any one of R 1 to R 4.
  • Is the fatty acid residue and the other three locations are acetyl group types, and any one of R 1 to R 4 is a fatty acid residue and the other three locations are hydrogen atom types. unknown.
  • Table 1 was created based on the currently known structure.
  • microorganisms shown in Table 1 can be preferably used as 4-O- ⁇ -MEL producing bacteria.
  • 4-O- ⁇ -MEL-producing bacteria that can be used in the present invention are not limited to the following.
  • Such a microorganism can also be used when a microorganism producing a MEL having a hydrogen atom at one site and an acetyl group at the other site is known.
  • a transformant can be obtained by transforming a non-producing 4-O- ⁇ -MEL using the above-described recombinant vector.
  • a method for transforming by introducing the recombinant vector into a non-producing strain of 4-O- ⁇ -MEL and a method for selecting a transformant can be performed using a conventionally known method. For example, it can be easily transformed by electroporation, and a transformant can be selected using hygromycin B or the like.
  • the obtained transformant is a 4-O- ⁇ -MEL-producing bacterium before transformation except that it recognizes the three-dimensional structure of erythritol and binds erythritol to mannose to produce 1-O- ⁇ -ME.
  • the characteristics are maintained.
  • the 4-O- ⁇ -MEL-producing bacterium is a 4-O- ⁇ -MEL-A-producing bacterium
  • the transformant can produce 1-O- ⁇ -MEL-A.
  • 4-O- ⁇ -MEL having 1 fatty acid residue is biosynthesized
  • 1-O- ⁇ -MEL having 1 fatty acid residue can be biosynthesized.
  • a corresponding 4-O- ⁇ -MEL-producing bacterium can be selected based on the structure of 1-O- ⁇ -MEL produced by the transformant. For example, when producing 1-O- ⁇ -MEL-C having 1 fatty acid residue, a pseudozyma antarctica that produces 4-O- ⁇ -MEL-C having 1 fatty acid residue is used. Thus, a 4-O- ⁇ -MEL non-producing bacterium can be prepared and transformed.
  • the transformant of the present invention has been modified so that 1-O- ⁇ -MEL can be biosynthesized.
  • This transformant is cultured, and 1-O- ⁇ -MEL is collected from the culture containing the transformant.
  • the culture conditions the culture conditions for 4-O- ⁇ -MEL-producing bacteria can be preferably used.
  • the 4-O- ⁇ -MEL-producing bacterium belongs to the genus Pseudozyma, it is generally cultured at pH 5 to 8, preferably pH 6, temperature 20 to 35 ° C., preferably 22 to 28 ° C. for 3 to 7 days.
  • 1-O- ⁇ -MEL can be recovered from the culture medium according to a conventional method.
  • MEL has different surface active effects, vesicle-forming ability, hydration properties, etc., if the acetyl group binding position, the number of fatty acid residues contained, the steric structure of erythritol, etc. are different.
  • the present invention by culturing a transformant under the same culture conditions as those for 4-O- ⁇ -MEL biosynthesis, the characteristics of 4-O- ⁇ -MEL biosynthesis can be maintained and 1 -O- ⁇ -MEL can be produced.
  • the product biosynthesized from the transformant can be easily estimated, and MEL can be efficiently biosynthesized under conventional culture conditions.
  • 1-O- ⁇ -MEL has a hydrophilic sugar skeleton and a lipophilic fatty acid residue, and 1-O- ⁇ -MEL depends on the number of fatty acid residues. Have different hydrophilicity. Therefore, various 1-O- ⁇ -MELs produced can be used for surfactants, pharmaceuticals, cosmetics, foods and the like depending on their properties.
  • Example 1 Culture of MEL-producing bacteria Pseudozyma tsukubaensis strain preserved in a preservation medium (malt extract 3 g / L, yeast extract 3 g / L, peptone 5 g / L glucose 10 g / L, agar 30 g / L) 1 platinum in a test tube containing 4 mL of liquid medium (a) containing L, yeast extract 1 g / L, sodium nitrate 3 g / L, potassium dihydrogen phosphate 0.3 g / L, and magnesium sulfate 0.3 g / L Inoculated by ear and cultured with shaking at 25 ° C. to obtain a bacterial cell culture solution (a).
  • a bacterial cell culture solution
  • a Sakaguchi flask containing 20 mL was inoculated and cultured at 25 ° C. with shaking to obtain a bacterial cell culture solution (b).
  • FIG. M is a marker, which is a sample of 4-O- ⁇ -MEL shown in FIG. 8 (d). 1 indicates a culture of 4-O- ⁇ -MEL-producing bacteria, and 2 indicates a culture of 4-O- ⁇ -MEL non-producing strains.
  • Pseudozyma antarctica T-34 which is a 4-O- ⁇ -MEL-producing bacterium represented by 1, produces MEL-A, but a non-producing 4-O- ⁇ -MEL strain represented by 2 None of the MELs could be produced under the culture conditions.
  • a primer having a BamHI site (ggatcc) introduced upstream of the initiation codon shown in SEQ ID NO: 4 and a BamHI site introduced downstream of the termination codon shown in SEQ ID NO: 5 were designed.
  • PCR was performed using a pair of primers and a primer to amplify the selection gene described above.
  • the amplified gene was ligated to the cloning site of pUXV1, an expression vector for filamentous fungi (Ustilago maydis), and a gene recombinant vector pUXV1-PtEMT1 in which this gene is expressed under the control of the gap promoter was constructed.
  • the structure of the recombinant vector is shown in FIG.
  • Fwd gtttggatccatgaaagtggcactgctttc (SEQ ID NO: 4)
  • Rvs cgggatcccatgagggaactgatgtgcg (SEQ ID NO: 5)
  • the gene recombination vector pUXV1-PtEMT1 was introduced into the non-producing 4-O- ⁇ -MEL strain derived from Pseudozyma antarctica T-34 by electroporation.
  • the vector pUXV1 containing no insert was used as a control and the same operation was performed. Subsequently, transformants were selected using G418.
  • FIG. 5 shows the result of 1 H-NMR analysis of this purified product
  • FIG. 6 shows the result of 13 C-NMR analysis
  • FIG. 5 (A) shows the result of 1 H-NMR analysis of MEL-A produced by Pseudozyma antarctica used in preparing non-MEL-producing bacteria
  • FIG. 5 (B) shows the transformant. Is the 1 H-NMR analysis result of MEL-A produced.
  • a transformant expressing a mannose transferase derived from Pseudozyma tsukubaensis is H-4a characteristic of 1-O- ⁇ -MEL.
  • H-4b were confirmed to be 1-O- ⁇ -MEL.
  • FIG. 6 (A) shows the results of 13 C-NMR analysis of MEL-A produced by Pseudozyma antarctica used in preparing non-MEL-producing bacteria
  • FIG. 6 (B) shows transformation.
  • 13 shows the result of 13 C-NMR analysis of MEL-A produced by the body.
  • 1-O- ⁇ -MEL could be produced using a 4-O- ⁇ -MEL-producing bacterium.
  • the 4-O- ⁇ -MEL producing bacterium used is Pseudozyma antarctica which mainly produces 4-O- ⁇ -MEL-A.
  • 1-O- ⁇ -MEL-A could be produced from the transformant using mannose transferase derived from Pseudozyma tsukubaensis that biosynthesizes MEL-B.
  • the mannose transferase gene for biosynthesis of 1-O- ⁇ -ME is one of the target genes for controlling the sugar structure of MEL biosynthesized by microorganisms, and is transformed with a recombinant vector using the gene. It was shown that 1-O- ⁇ -MEL biosynthesis ability can be imparted to conventional microorganisms by conversion. This technology can be expected to improve the production technology of 1-O- ⁇ -MEL, which is more adaptable to water and superior in practicality, and to develop new biomaterials by microbial processes using gene recombination technology. .
  • mannose transferase gene of the present invention makes it possible to produce various 1-O- ⁇ -MELs, which are useful for use in medicine, the environment and other industries.

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Abstract

マンノース転移酵素遺伝子、当該遺伝子を構成するＤＮＡ、このような遺伝子やＤＮＡが翻訳されてなるタンパク質、前記マンノース転移酵素遺伝子が導入された組換えベクター、前記組換えベクターで形質転換された形質転換体、および前記形質転換体を用いた１－Ｏ－β－マンノシルエリスリトールリピッドの製造方法を提供する。 マンノースとエリスリトールとから１－Ｏ－β－ＭＥを生合成する、配列番号１と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子を含むマンノース転移酵素遺伝子を使用する。この遺伝子を導入して組換えベクターを作成し、４－Ｏ－β－ＭＥＬ非生産菌を形質転換する。得られた形質転換体を培養すると、１－Ｏ－β－ＭＥＬが生産される。

Description

マンノース転移酵素遺伝子、組換えベクター、形質転換体、１－Ｏ－β－マンノシルエリスリトールリピッドの製造方法
　本発明は、マンノース転移酵素をコードするマンノース転移酵素遺伝子、当該遺伝子を構成するＤＮＡ、このような遺伝子やＤＮＡが翻訳されてなるタンパク質、前記マンノース転移酵素遺伝子が導入された組換えベクター、前記組換えベクターで形質転換された形質転換体、および前記形質転換体を用いた１－Ｏ－β－マンノシルエリスリトールリピッドの製造方法に関する。
　バイオサーファクタントは微生物が生産する天然の界面活性剤であり、生分解性が高く、低毒性で環境に優しく、新規な生理機能も有する。食品工業、化粧品工業、医薬品工業、化学工業、環境分野等で使用すれば、環境調和型の社会を実現する上で有意義である。このようなバイオサーファクタントとして、従来から、マンノースにアルジトールがβグリコシド結合してマンノシルエリスリトール（以下、ＭＥとも称す。）を形成し、更に脂肪酸がエステル結合したマンノシルアルジトールリピッドが存在する。アルジトールがエリスリトールである化合物は、マンノシルエリスリトールリピッド（以下、ＭＥＬとも称す。）と称されている（特許文献１）。特許文献１では、大豆油やグルコースなどを添加した培地でシュードザイマ・ヒュベイエンシスＫＭ－５９株を培養し、ＭＥＬを得ている。ＭＥＬは、構成する糖アルコールとしてエリスリトールを含むが、培地にエリスリトールを添加することなく合成されるため、培地に添加した大豆油やグルコースを資化して栄養源として生育し、その際に副生されたエリスリトールを利用してＭＥＬを生産すると理解される。
　ＭＥＬを生合成する微生物の中には、ＭＥＬ生合成遺伝子クラスターを有するものがある。例えば、ウスティラゴ・マイディス（Ustilago maydis）の第７染色体には、マンノースとエリスリトールを結合してＭＥを生成する反応を触媒するマンノシルトランスフェラーゼ（Ｅｍｔ１ｐ）、脂質をＭＥに結合させるアシルトランスフェラーゼ（Ｍａｃ１ｐ、Ｍａｃ２ｐ）、アセチル基をＭＥに結合させるアセチルトランスフェラーゼ（Ｍａｔ１ｐ）、ＭＥＬを菌体外に分泌する推定トランスポーター（ｍｍｆ１）をコードする遺伝子で構成される遺伝子クラスターが存在する（非特許文献１）。
　図７に、水素原子、アセチル基、または炭素数３～１８の脂肪酸残基をＲ１～Ｒ５で示したＭＥＬの構造式を示す。ＭＥＬには結合する脂肪酸残基やアセチル基の位置や数等が相違する種々の構造が存在する。Ｒ３およびＲ４がアセチル基である構造物はＭＥＬ－Ａ、Ｒ３が水素原子でありＲ４がアセチル基である構造物はＭＥＬ－Ｂ、Ｒ３がアセチル基でありＲ４が水素原子である構造物はＭＥＬ－Ｃ、Ｒ３およびＲ４が水素である構造物はＭＥＬ－Ｄと定義されている。微生物や培地組成によって生成するＭＥＬが異なり、例えば、シュードザイマ・アンタークティカ（Pseudozyma antarctica）やシュードザイマ・アフィディス（Pseudozyma aphidis）は、大豆油、グルコース、またはｎ－アルカンを含む培地で培養するとＭＥＬ－Ａを主成分とし、その他ＭＥＬ－ＢおよびＭＥＬ－Ｃを含むＭＥＬを生産する（非特許文献１）。
　一方、ＭＥＬ生合成経路を欠損させたシュードザイマ（Pseudozyma）属酵母も開発されている(特許文献３）。シュードザイマ属は、ＭＥＬを多量に生産するためＭＥＬ生合成に消費されるエネルギーが大きい。ＭＥＬ生合成経路を欠損させることで、ＭＥＬ生合成系の消費エネルギーを異種タンパク質の生産に振り向けさせるというものである。実施例では、シュードザイマ・アンタークティカを使用し、ＭＥＬの糖骨格であるＭＥの合成反応を触媒するマンノーストランスフェラーゼをコードする遺伝子（以下、ＰａＥＭＴ１遺伝子とも称する。）を相同遺伝子組換法により欠損させ、ＭＥＬ生合成系遺伝子欠損型シュードザイマ属酵母を得ている。シュードザイマ・アンタークティカは、大豆油やグルコースを含有する培地で培養するとＭＥＬを生産するが、前記ＭＥＬ生合成系遺伝子欠損型シュードザイマ属酵母は、同条件で培養してもＭＥＬを生産しないという。
　ここで、エリスリトールは、図８（ａ）に示す炭素数４の糖アルコールであり、炭素鎖の両端にＣＨ２ＯＨ基を有している。ＤＬ表記法によれば、エリスリトールはＤＬ同一構造である。ただし、マンノースと結合するエリスリトールのヒドロキシメチル基が１位の炭素に由来するか、４位の炭素に由来するかによって、得られるＭＥの構造は、図８（ｂ）、（ｃ）に示すように相違する。前記特許文献１に記載されるシュードザイマ・ヒュベイエンシスＫＭ－５９株は、同図（ｂ）に示される、４－Ｏ－β－Ｄ－ｍａｎｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ－ｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ（以下、この化合物を４－Ｏ－β－ＭＥとも称する。）を糖骨格とする化合物を生成する。得られる４－Ｏ－β－Ｄ－ｍａｎｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ－ｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ　Ｌｉｐｉｄを４－Ｏ－β－ＭＥＬとも称する。
　上記した４－Ｏ－β－ＭＥに対し、図８（ｃ）に示すように、１－Ｏ－β－Ｄ－ｍａｎｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ－ｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ（以下、１－Ｏ－β－ＭＥとも称する。）を糖骨格とする１－Ｏ－β－Ｄ－ｍａｎｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ－ｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ　Ｌｉｐｉｄを製造する微生物もある（特許文献２）。便宜のため、この化合物を１－Ｏ－β－ＭＥＬとも称する。シュードザイマ・ツクバエンシス（Pseudozyma tsukubaensis）を、オリーブ油を含む培地で培養したところ、１－Ｏ－β－ＭＥＬが生成されたという。この１－Ｏ－β－ＭＥＬは、４－Ｏ－β－ＭＥＬと比べて水和性が向上し、ベシクル形成能も高く、スキンケア剤などとして有望なバイオ素材となるという。
特許第４９７８９０８号公報 特開２０１１－１８２７４０号公報 特開２０１１－１７２５２６号公報
Ｍｏｒｉｔａ　ｅｔ　ａｌ．，　"Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍａｎｎｏｓｙｌｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ　ｌｉｐｏｉｄｓ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ"，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２０１３），Ｖｏｌ．９７，Ｐ．４６９１－４７００
　１－Ｏ－β－ＭＥＬが４－Ｏ－β－ＭＥＬよりも水和性に優れることは、マンノースに結合するエリスリトールの立体構造によってＭＥＬの特性が相違することを意味する。更に、１－Ｏ－β－ＭＥＬを構成する脂肪酸残基の数、アセチル基の導入位置などによって、ＭＥＬの水和性も異なるため、種々のＭＥＬを自在に製造できれば更なる用途の開発が可能となる。しかしながら、酵母を用いたＭＥＬの製造技術として培養条件に基づく種々の改良が重ねられているが、基本的に生産菌に依存するものであり、生産性に限界がある。特に１－Ｏ－β－ＭＥＬを生産しうる微生物は少なく、シュードザイマ・ツクバエンシスに依存しているのが現状である。しかも、シュードザイマ・ツクバエンシスは、ＭＥＬ－Ｂを主生成物とするが、ＭＥＬ－Ａはほとんど生合成することができない。従来の微生物を使用して目的のＭＥＬを生産するために、１－Ｏ－β－ＭＥＬを生合成しうる技術の開発が望まれる。
　ＭＥＬ生合成遺伝子クラスターを構成する遺伝子の中で、１－Ｏ－β－ＭＥＬの生産に直接関与する酵素として、マンノースとエリスリトールを結合してＭＥを生成する反応を触媒するマンノシルトランスフェラーゼがある。１－Ｏ－β－ＭＥＬを生合成できるマンノシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を使用すれば、従来の微生物を使用して１－Ｏ－β－ＭＥＬを生合成させることができる。したがって、１－Ｏ－β－ＭＥＬを生合成するための、マンノース転移酵素遺伝子、当該遺伝子を構成するＤＮＡ、このような遺伝子やＤＮＡが翻訳されてなるタンパク質の開発が望まれる。
　更に、このようなマンノース転移酵素遺伝子が導入された、組換えベクターや、前記組換えベクターを用いて形質転換してなる形質転換体、更には前記形質転換体を培養してなる１－Ｏ－β－ＭＥＬの製造方法の開発が望まれる。
　本発明は上記事情に鑑みなされたもので、１－Ｏ－β－ＭＥＬ生合成に関与するマンノース転移酵素遺伝子、当該遺伝子を構成するＤＮＡ、このような遺伝子やＤＮＡが翻訳されてなるタンパク質を提供することを目的とする。
　更に、本発明は、前記マンノース転移酵素遺伝子を導入した組換えベクター、前記組換えベクターを用いて形質転換してなる形質転換体、および前記形質転換体を培養してなる１－Ｏ－β－ＭＥＬの製造方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、ＭＥＬ生合成のための微生物の培養条件およびＭＥＬ生合成遺伝子クラスター、並びにＭＥＬ生産菌のマンノース転移酵素を詳細に検討した結果、１－Ｏ－β－ＭＥＬを生産するシュードザイマ・ツクバエンシスのマンノース転移酵素には、特有のアミノ酸配列が存在すること、このようなアミノ酸配列を有するマンノース転移酵素をコードする遺伝子は、１－Ｏ－β－ＭＥＬを生合成するためのマンノース転移酵素遺伝子として使用できること、このような遺伝子を導入して組換えベクターを作成し、この組換えベクターを用いて４－Ｏ－β－ＭＥＬ生産菌を形質転換すると、４－Ｏ－β－ＭＥＬ生産菌の特性を維持しつつ、４－Ｏ－β－ＭＥＬに代えて１－Ｏ－β－ＭＥＬを生産しうることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち本発明は、マンノースとエリスリトールとから、下記式に示す１－Ｏ－β－Ｄ－マンノピラノシルエリスリトールを生合成するマンノース転移酵素をコードする遺伝子であって、配列番号１と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子を含むことを特徴とする、マンノース転移酵素遺伝子を提供するものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　また、本発明は、前記マンノース転移酵素が、配列番号６、配列番号７および／または配列番号８に示すアミノ酸配列を含むことを特徴とする、上記マンノース転移酵素遺伝子を提供するものである。
　また、本発明は、上記マンノース転移酵素遺伝子が導入された、組換えベクターを提供するものである。
　また本発明は、下記式で示される４－Ｏ－β－ＭＥを生合成する菌のマンノース転移酵素活性を失活させた４－Ｏ－β－ＭＥＬ非生産菌を、上記組換えベクターを用いて形質転換したことを特徴とする形質転換体を提供するものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　また、本発明は、前記４－Ｏ－β－ＭＥを生合成する菌が、下記式で示す４－Ｏ－β－ＭＥＬを生産する菌であることを特徴とする、前記形質転換体を提供するものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
（式中、Ｒ１～Ｒ４は、互いに同一であっても異なっていてもよい、水素原子、アセチル基、又は炭素原子数３～１８の飽和若しくは不飽和の脂肪酸残基を示し、Ｒ５は、水素原子または炭素原子数３～１８の飽和若しくは不飽和の脂肪酸残基を示す。）
　更に本発明は、前記形質転換体を培養することを特徴とする、下記式で示す１－Ｏ－β－ＭＥＬの製造方法を提供するものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
（式中、Ｒ１～Ｒ４は、互いに同一であっても異なっていてもよい、水素原子、アセチル基、又は炭素原子数３～１８の飽和若しくは不飽和の脂肪酸残基を示し、Ｒ５は、水素原子または炭素原子数３～１８の飽和若しくは不飽和の脂肪酸残基を示す。）
　加えて本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、および前記配列番号１と９０％以上の同一性を有することを特徴とするタンパク質を提供するものである。
　また本発明は、配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ、および前記配列番号２と９０％以上の同一性を有することを特徴とするＤＮＡを提供するものである。
　本発明によって、１－Ｏ－β－ＭＥＬを生産できるマンノース転移酵素遺伝子が提供される。前記マンノース転移酵素遺伝子を含有する組換えベクターを調製し、該組換えベクターにより、４－Ｏ－β－ＭＥを生合成するマンノース転移酵素活性を失活させた４－Ｏ－β－ＭＥＬ非生産菌を形質転換することで、４－Ｏ－β－ＭＥＬ生産菌を用いて１－Ｏ－β－ＭＥＬを製造することができる。
シュードザイマ・アンタークティカがＭＥＬ生産能を有し、当該シュードザイマ・アンタークティカのマンノース転移酵素をコードする遺伝子を破壊したＭＥＬ非生産株がＭＥＬ生産能を欠失したことを示すＴＬＣの図である。符号１は、ＭＥＬ生産菌の生産物を、符号２は、ＭＥＬ非生産菌の生産物を示す。 遺伝子発現ベクターｐＵＸＶ１－ＰｔＥＭＴ１の構造を示す図である。 遺伝子発現ベクターｐＵＸＶ１－ＰｔＥＭＴ１で形質転換されたＭＥＬ非生産株が、ＭＥＬの生産能を回復したことを示す図である。 遺伝子発現ベクターｐＵＸＶ１－ＰｔＥＭＴ１で形質転換されたＭＥＬ非生産菌から生産されたＭＥＬ精製物を薄層クロマトグラフィーで検出した結果を示す図である。 ４－Ｏ－β－ＭＥＬ生産菌が生産したＭＥＬと、形質転換体が生産したＭＥＬの１Ｈ－ＮＭＲ解析結果を示す図である。 ４－Ｏ－β－ＭＥＬ生産菌が生産したＭＥＬと、形質転換体が生産したＭＥＬの１３Ｃ－ＮＭＲ解析結果を示す図である。 ＭＥＬの構造を説明する図である。 エリスリトールの構造と、１位のＣＨ２ＯＨ基、または４位のＣＨ２ＯＨ基とマンノースとがβグリコシド結合した場合に、ＭＥＬの糖骨格の立体構造が異なることを説明する図である。
　本発明の第一は、マンノースとエリスリトールとから、１－Ｏ－β－ＭＥを生合成するマンノース転移酵素をコードする遺伝子であって、配列番号１と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子を含むことを特徴とするマンノース転移酵素遺伝子、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、および前記配列番号１と９０％以上の同一性を有することを特徴とするタンパク質、並びに、配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ、および前記配列番号２と９０％以上の同一性を有することを特徴とするＤＮＡである。また、本発明の第二は、前記マンノース転移酵素遺伝子を導入した組換えベクター、前記組換えベクターで形質転換された形質転換体、および前記形質転換体を用いた１－Ｏ－β－ＭＥＬの製造方法である。以下、本発明を詳細に説明する。
　（１）１－Ｏ－β－ＭＥＬ
　本発明で製造される１－Ｏ－β－ＭＥＬは、下記式で示される。エリスルトールがマンノースにβグリコシド結合した１－Ｏ－β－ＭＥに、１～４個の脂肪酸がエステル結合してなる化合物である。式中、Ｒ１～Ｒ４は、互いに同一であっても異なっていてもよい、水素原子、アセチル基、又は炭素原子数３～１８の飽和若しくは不飽和の脂肪酸残基を示し、Ｒ５は、水素原子または炭素原子数３～１８の飽和若しくは不飽和の脂肪酸残基を示す。なお、本願明細書において、Ｒ３およびＲ４がアセチル基である構造物をＭＥＬ－Ａ、Ｒ３が水素原子でありＲ４がアセチル基である構造物をＭＥＬ－Ｂ、Ｒ３がアセチル基でありＲ４が水素原子である構造物をＭＥＬ－Ｃ、Ｒ３およびＲ４が水素である構造物をＭＥＬ－Ｄと称する。１－Ｏ－β－ＭＥＬは、主としてシュードザイマ・ツクバエンシスによって製造されてきたが、シュードザイマ・ツクバエンシスが生産する１－Ｏ－β－ＭＥＬはＭＥＬ－Ｂに限定されていた。また、シュードザイマ・ツクバエンシスが生産する１－Ｏ－β－ＭＥＬに含まれる脂肪酸残基は２または３に限定され、脂肪酸残基が１のものは存在しなかった。しかしながら、本発明で製造される１－Ｏ－β－ＭＥＬは、脂肪酸残基数が２または３に限定されず、かつアセチル基の配置もＭＥＬ－Ｂに限定されない。したがって、従来存在しない脂肪酸残基が３本鎖の１－Ｏ－β－ＭＥＬ－Ａや１－Ｏ－β－ＭＥＬ－Ｃ、脂肪酸残基が１本鎖の１－Ｏ－β－ＭＥＬなどの新規化合物も含まれる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　（式中、Ｒ１～Ｒ４は、互いに同一であっても異なっていてもよい、水素原子、アセチル基、又は炭素原子数３～１８の飽和若しくは不飽和の脂肪酸残基を示し、Ｒ５は、水素原子または炭素原子数３～１８の飽和若しくは不飽和の脂肪酸残基を示す。）
　（２）マンノース転移酵素遺伝子
　エリスリトールは炭素鎖の両端にＣＨ２ＯＨ基を有するため、何れのＣＨ２ＯＨ基とマンノシル基とがβ結合するかによって生産されるＭＥＬの立体構造が相違する。シュードザイマ・ヒュベイエンシスＫＭ－５９株が生成するＭＥＬは、図８（ｂ）に示される４－Ｏ－β－ＭＥを糖骨格とし、シュードザイマ・ツクバエンシスが生成するＭＥＬは、図８（ｃ）１－Ｏ－β－ＭＥを糖骨格とする。これらＭＥＬ生産菌は、マンノースにエリスルトールをβグリコシド結合する際に、エリスリトールの立体構造を認識して、１－Ｏ－β－ＭＥまたは４－Ｏ－β－ＭＥを生産すると推定される。一実施形態において、本発明では、ＭＥＬ生合成遺伝子クラスターを構成する遺伝子の中から、マンノースとエリスリトールとを結合してＭＥを生合成するマンノース転移酵素を選択し、１－Ｏ－β－ＭＥＬを製造するための遺伝子として使用する。
　配列番号１に、シュードザイマ・ツクバエンシスのマンノース転移酵素のアミノ酸配列を示す。このマンノース転移酵素は、マンノースとエリスリトールとから１－Ｏ－β－ＭＥを生合成する反応を触媒する。一実施形態において、本発明では、配列番号１に示すアミノ酸配列の他、配列番号１と６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるアミノ酸配列をコードする遺伝子を好ましく使用することができる。一実施形態において、前記マンノース転移酵素が有するアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列とは異なることが好ましい。例えば、一実施形態において、前記マンノース転移酵素が有するアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列において少なくとも１つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されていることが好ましい。
　　アミノ酸配列の同一性は、市販の又はインターネットを通じて利用可能な解析ツール（例えば、FASTA、BLAST、PSI-BLAST、SSEARCH等のソフトウェア）を用いて計算することができる。例えば、BLAST検索を初期条件で行うことにより同一性を測定することができる。BLAST検索の初期条件とは、例えば、次の通りである。即ち、Advanced BLAST 2.1において、プログラムにblastpを用い、Expect値を10、Filterは全てOFFにして、MatrixにBLOSUM62を用い、Gap existence cost、Per residue gap cost、及びLambda ratioをそれぞれ 11、1、0.85（デフォルト値）にして、他の各種パラメータもデフォルト値に設定して検索を行うことにより、アミノ酸配列の同一性の値（％）を算出することができる。
　配列番号１と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列は、各種タンパク質に関するアミノ酸配列が保存されている各種公知のデータベースから、解析ソフトにてアッセンブルを行い選択することができる。配列番号１と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列として、例えば、ウスティラゴ・ホルデイ（Ustilago hordei）のＵＨＯＲ　０４８７６タンパク質、メラノプシディウム・ペンシルバニカム（Melanopsichium pennsylvanicum）やスポリソリウム・レイリアヌム（Sporisorium reilianum）由来タンパク質、ウスティラゴ・マイディスのエリスリトール－マンノシル－トランスフェラーゼや、シュードザイマ・アフィディスのマンノシルトランスフェラーゼ、シュードザイマ・ヒュベイエンシス（Pseudozyma hubeiensis）やシュードザイマ・アンタークティカのグリコシルトランスフェラーゼ等がある。これらはいずれもアミノ酸数６００～６２０のアミノ酸配列のタンパク質である。
　上記した配列番号１と６０％以上の同一性を有するタンパク質の各アミノ酸配列を詳細に比較検討したところ、配列番号１で示すシュードザイマ・ツクバエンシス由来のマンノース転移酵素には、４－Ｏ－β－ＭＥを生合成する微生物のマンノース転移酵素と相違する、特徴的なアミノ酸配列が含まれることが判明した。このアミノ酸配列を配列番号６、配列番号７、配列番号８に示す。同一性評価のための検索結果は、データベースによって選択された各タンパク質のアミノ酸配列が相互に近似するように、適宜「－」が挿入された配列で表示される。配列番号１で示すアミノ酸配列のＮ末端側のアミノ酸を第１アミノ酸とすると、配列番号６は、Ｎ末端から第２７１～３００番目のアミノ酸配列であり、配列番号７は、同第３６９～３９８番目のアミノ酸配列であり、配列番号８は、同第５６９～６１２番目のアミノ酸配列に相当する。配列番号１と６０％以上の同一性を有するタンパク質のアミノ酸配列は複数存在するが、前記３つの領域以外のアミノ酸配列（即ち、Ｎ末端から第２７０番目までのアミノ酸配列、同３０１～３６８番目、および同第３９９～５６８番目までのアミノ酸配列）は相互に極めて近似することが判明した。したがって、配列番号１と６０％以上の同一性を有し、かつ配列番号６、配列番号７、配列番号８に示すアミノ酸配列の少なくとも１の配列を有するタンパク質は、マンノースにエリスルトールをβグリコシド結合させて１－Ｏ－β－ＭＥを生合成できる可能性が極めて高い。本発明で使用するマンノース転移酵素遺伝子は、配列番号１と同一のアミノ酸配列をコードする遺伝子であってもよく、マンノースにエリスルトールをβグリコシド結合させて１－Ｏ－β－ＭＥを生合成できることを条件に、配列番号１と６０％以上の同一性を有するもの、より好ましくは配列番号６、配列番号７および／または配列番号８のアミノ酸配列を含むものをコードする遺伝子を広く使用することができる。なお、配列番号６、配列番号７、配列番号８のアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が付加され、または欠失したものであっても、マンノースにエリスルトールをβグリコシド結合させて１－Ｏ－β－ＭＥを生合成できるものであれば、当該アミノ酸配列をコードする遺伝子は、本発明のマンノース転移酵素遺伝子に含まれるものとする。一実施形態において、４－Ｏ－β－ＭＥの合成を触媒する酵素は、配列番号１のアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有し、配列番号１の第１番目～第２７０番目、第３０１番目～３６８番目、および第３９９番目～第５６８番目において、少なくとも１つもアミノ酸残基が置換、欠失、不可、及び／又は削除されていることが好ましい。このような変異が導入されるアミノ酸残基の数は、特に制限されないが、例えば、５０個以下、４０個以下、３０個以下、２０個以下、１０個以下、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下、又は１個に設定することができる。
　一実施形態において、上記アミノ酸残基の変異は、アミノ酸残基の置換であることが好ましい。アミノ酸残基の置換の種類は、特に制限されないが、酵素活性に顕著な影響を与えないという観点から保存的アミノ酸置換が好ましい。「保存的アミノ酸置換」とは、あるアミノ酸残基を、同様の性質の側鎖を有するアミノ酸残基に置換することをいう。アミノ酸残基はその側鎖によって塩基性側鎖（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）のように、いくつかのファミリーに分類されている。保存的アミノ酸置換は好ましくは、同一のファミリー内のアミノ酸残基間の置換である。
　配列番号６、配列番号７、配列番号８が挿入される位置は、配列番号１に示すアミノ酸配列のこれら配列に該当する位置の近傍であることが好ましい。例えば、配列番号６に関して説明すれば、配列番号１と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列は、Ｎ末端から第２６８～２７０のアミノ酸配列にＥＮＨ配列を含む点で共通する。したがって、本発明では、ＥＮＨ配列に次いで配列番号６のアミノ酸配列が含まれるものを好適に使用することができる。同様に、配列番号１と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列は、Ｎ末端から第３５０～３６０番にいずれもＫＬＮ配列を含む点で共通する。この配列を目安に、前記ＫＥＮ配列の後に配列番号７のアミノ酸を含むものを好適に使用することができる。同様に、配列番号１と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列は、Ｎ末端から第５４０～５６０番にＡＡＡ配列を含む点で共通する。この配列を目安に、前記ＡＡＡ配列の後に配列番号８のアミノ酸配列を有するものを使用する。なお、配列番号６、配列番号７、配列番号８のアミノ酸配列は、前記した特有の配列の直後に存在するものであってもよく、ＥＮＨ配列と配列番号６、ＫＬＮ配列と配列番号７、ＡＡＡ配列と配列番号８との間に、７～２０個のアミノ酸を更に含むものであってもよい。具体的には、前記したウスティラゴ・ホルデイのＵＨＯＲ　０４８７６タンパク質のアミノ酸配列のＮ末端から第２７１～３０５番目のアミノ酸配列が配列番号６で置換され、同第３７３～３０８番目のアミノ酸配列が配列番号７で置換され、同第５６８番目以降のアミノ酸配列が配列番号８で置換されたものなどを例示することができる。
　なお、通常の遺伝子組換え技術を用いて、アミノ酸やＤＮＡの付加、欠失、挿入、置換等によって、本発明のマンノース転移酵素遺伝子の機能を保持した誘導体を得ることは当業者にとって容易である。ゆえにそのような常套手段で得られる１－Ｏ－β－ＭＥを生合成しうるマンノース転移酵素遺伝子も本発明の範囲に含まれるものとする。
　（３）タンパク質およびＤＮＡ
　本発明のタンパク質は、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。前記したように、配列番号１で表されるアミノ酸配列は、シュードザイマ・ツクバエンシスに由来する、マンノースとエリスリトールとから１－Ｏ－β－ＭＥを生合成するマンノース転移酵素のアミノ酸配列である。本発明のタンパク質は、マンノースとエリスリトールとから１－Ｏ－β－ＭＥを生合成するマンノース転移反応を触媒することができ、マンノース転移酵素として使用することができる。ただし、マンノース転移活性に限定されず他の触媒活性を有する場合も含む。なお、本発明のタンパク質は、配列番号１と９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有するタンパク質であってもよい。
　一実施形態において、本発明のＤＮＡは、配列番号２で表される塩基配列を有することが好ましい。配列番号２で表される塩基酸配列は、マンノースとエリスリトールとから１－Ｏ－β－ＭＥを生合成するマンノース転移酵素をコードするＤＮＡである。したがって、本発明のＤＮＡは、マンノースとエリスリトールとから１－Ｏ－β－ＭＥを生合成する上記マンノース転移酵素の遺伝子と同様に使用することができる。なお、本発明のＤＮＡが有する塩基配列は、上述する１－Ｏ－β－ＭＥを生合成するマンノース転移酵素をコードする限り任意であり、例えば、配列番号２と６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有するＤＮＡであってもよい。一実施形態において、１－Ｏ－β－ＭＥを生合成するマンノース転移酵素をコードするDNAは、配列番号２の塩基配列とは異なる塩基配列を有することが好ましい。
　塩基配列の相同性は、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができ、例えば、FASTA、BLAST、PSI-BLAST、SSEARCH等のソフトウェアを用いて計算される。具体的には、BLAST検索の初期条件で求めることができる。初期条件とは例えば次の通りである。即ち、Advanced BLAST 2.1において、プログラムにblastnを用い、各種パラメータはデフォルト値に設定して検索を行うことにより、ヌクレオチド配列の相同性の値（%）を算出することができる。
　（４）マンノース転移酵素遺伝子の調製方法
　配列番号１に示すアミノ酸配列は、シュードザイマ・ツクバエンシスのマンノース転移酵素のアミノ酸配列である。このアミノ酸配列をコードする遺伝子は、例えば、シュードザイマ・ツクバエンシスの全ゲノム配列情報を取得し、全遺伝子領域を推定し、４－Ｏ－β－ＭＥを生合成するマンノース転移酵素をコードするＤＮＡと同一性を比較し、同一性の高い遺伝子を選択することで調製することができる。また、シュードザイマ・ツクバエンシスを培養する際に、脂肪酸を含む培地で培養して１－Ｏ－β－ＭＥＬ生産に関与する遺伝子群を発現させ、発現量の多いｍＲＮＡなどを選択し、４－Ｏ－β－ＭＥを合成するマンノース転移酵素の遺伝子ゲノム情報を参照して、配列同一性の高い遺伝子を選択してもよい。このような遺伝子を構成するＤＮＡは、配列番号１をコードするＤＮＡ配列に基づいて化学合成したものであってもよい。マンノース転移酵素をコードするＤＮＡは、ここに開示される配列情報を基に、化学的DNA合成法、標準的な遺伝子工学的手法、分子生物学的手法、又は生化学的手法などを用いることによって容易に調製することができる
　また、前記したウスティラゴ・ホルデイのＵＨＯＲ　０４８７６タンパク質のアミノ酸配列のＮ末端から第２７１～３０５番目のアミノ酸配列が配列番号６で置換され、同第３７３～３０８番目のアミノ酸配列が配列番号７で置換され、同第５６８番目以降のアミノ酸配列が配列番号８で置換されたアミノ酸配列をコードする遺伝子であってもよい。このような遺伝子は、ウスティラゴ・ホルデイから全ゲノム配列情報を得て、ＵＨＯＲ　０４８７６タンパク質をコードするＤＮＡを選択し、配列番号６、配列番号７、配列番号８に相当するＤＮＡで適宜置換して調製することができる。
　選択した遺伝子が、マンノース転移酵素をコードするものであるかは、この遺伝子を、後記するマンノース転移酵素活性を欠失したＭＥＬ非生産株に導入し、ＭＥＬ生産条件で培養し、ＭＥＬを生産するかで評価し、更に得られたＭＥＬの構造を解析し、１－Ｏ－β－ＭＥＬを検出することで確認することができる。
　（５）組換えベクターおよびその調製方法
　本発明では、マンノース転移酵素遺伝子を適当な発現ベクターに導入して組換えベクターとして使用することができる。このような組換えベクターは、発現ベクターのプロモーターの下流に前記マンノース転移酵素遺伝子を挿入して調製することができ、従来公知の遺伝子工学に基づいて構築することができる。なお、使用する発現ベクターとしては、プラスミド、コスミドあるいはウイルス由来のもの等を使用することができる。例えば、シュードザイマ属の４－Ｏ－β－ＭＥＬ生産菌を使用して形質転換する場合には、使用する発現ベクターとして、ｐＵＸＶ１　ＡＴＣＣ　７７４６３、ｐＵＸＶ２　ＡＴＣＣ　７７４６４、ｐＵＸＶ５　ＡＴＣＣ　７７４６８、ｐＵＸＶ６　ＡＴＣＣ　７７４６９、ｐＵＸＶ７　ＡＴＣＣ　７７４７０、ｐＵＸＶ８　ＡＴＣＣ　７７４７１、ｐＵＸＶ３　ＡＴＣＣ　７７４６５、ｐＵ２Ｘ１　ＡＴＣＣ　７７４６６、ｐＵ２Ｘ２　ＡＴＣＣ　７７４６７等を例示することができる。
　なお、上記は本発明の組換えベクターの一例に過ぎず、当業者が当該技術分野の常套手段に従って、種々の１－Ｏ－β－ＭＥＬを生合成するための組換えベクターを構築することができる。発現ベクターに導入するマンノース転移酵素遺伝子以外は、プロモーター、その他の条件は、既知のものから適宜選択することができる。
　（６）形質転換体の調製方法
　本発明では、４－Ｏ－β－ＭＥＬ非生産菌に、前記組換えベクターを導入して形質転換体を製造することができる。なお、本発明において「４－Ｏ－β－ＭＥＬ非生産菌」とは、本来４－Ｏ－β－ＭＥＬを生合成できる菌（以下、４－Ｏ－β－ＭＥＬ生産菌とも称する。）であるが、マンノースとエリスルトールとを結合して４－Ｏ－β－ＭＥを生合成するマンノース転移酵素活性が失活された菌を意味する。４－Ｏ－β－ＭＥＬ生産菌としては、ＭＥＬ－Ａ、ＭＥＬ－Ｂ、ＭＥＬ－Ｃ、ＭＥＬ－Ｄのいずれの４－Ｏ－β－ＭＥＬを生産するものであってもよい。更に、「菌」の名称に限定されず、４－Ｏ－β－ＭＥＬ生産能を有することを条件に、酵母、カビ等の真核微生物、さらには他の高等生物の細胞でもよい。このような高等生物の細胞としては、動物細胞や培養植物細胞が例示される。４－Ｏ－β－ＭＥＬ生産菌の好ましい例として、サッカロマイセス属の菌株（例えば、サッカロマイセス・セレビシエ）やシュードザイマ属の菌株（例えば、シュードザイマ・アンタークティカ）を例示することができる。一実施形態において、１－Ｏ－β－ＭＥの合成を触媒するマンノース転移酵素をコードするDNAを有する宿主細胞は、４－Ｏ－β－ＭＥＬ非生産菌に限定されず、目的に応じて任意に選択できる。
　本発明で使用する４－Ｏ－β－ＭＥＬ非生産菌は、４－Ｏ－β－ＭＥＬ生産菌のマンノース転移酵素が失活され、４－Ｏ－β－ＭＥを生合成する従前の培養条件では４－Ｏ－β－ＭＥＬを生合成することができない。ただし、マンノースとエリスリトールとを結合するマンノース転移酵素が失活するのみであるから、例えばＭＥを含む培地で培養した場合に４－Ｏ－β－ＭＥＬを生合成するものであってもよい。本発明で使用する４－Ｏ－β－ＭＥＬ非生産菌は、４－Ｏ－β－ＭＥＬ生産菌のマンノース転移酵素を失活して調製することができ、このような方法は公知である。例えば特許文献３記載の方法で調製することができる。
　なお、微生物が生合成するＭＥＬは、ＭＥＬ－Ａ、ＭＥＬ－Ｂ、ＭＥＬ－Ｃ、ＭＥＬ－Ｄの他に、ＭＥＬに導入される脂肪酸残基数が１～３個の範囲のものが存在する。培養条件によって同じ微生物が異なるＭＥＬを生合成することもできる。従来知られているＭＥＬの種類と生産菌との関係の一部を表１に示す。なお、図７に示すように、マンノースにはＯＲ１、ＯＲ２、ＯＲ３およびＯＲ４が存在するが、脂肪酸残基数が１本鎖のＭＥＬは、Ｒ１～Ｒ４のいずれか１カ所が脂肪酸残基で他の３カ所がアセチル基のタイプと、Ｒ１～Ｒ４のいずれか１カ所が脂肪酸残基でアセチル基が存在せず他の３カ所が水素原子のタイプの２種類しか知られていない。現在知られている構造に基づいて表１を作成した。本発明では、４－Ｏ－β－ＭＥＬ生産菌として表１に示す微生物を好適に使用することができる。ただし、本発明で使用できる４－Ｏ－β－ＭＥＬ生産菌は、下記に限定されるものではない。例えば、脂肪酸残基数が１本鎖のＭＥＬであって、Ｒ１～Ｒ４のいずれか２カ所がアセチル基で他の１カ所が水素原子のＭＥＬや、Ｒ１～Ｒ４のいずれか２カ所が水素原子で他の１カ所がアセチル基のＭＥＬを生産する微生物が知られた場合に、このような微生物を使用することもできる。
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　本発明では、前記した組換えベクターを用いて４－Ｏ－β－ＭＥＬ非生産菌を形質転換し、形質転換体を得ることができる。４－Ｏ－β－ＭＥＬ非生産菌に前記組換えベクターを導入して形質転換する方法や形質転換体の選別方法は、従来公知の方法を用いて行うことができる。たとえば、エレクトロポレーション法で簡便に形質転換することができ、ハイグロマイシンＢなどを使用して形質転換体を選別することができる。
　得られた形質転換体は、エリスリトールの立体構造を認識してマンノースにエリスリトールを結合して１－Ｏ－β－ＭＥを製造する以外は、形質転換前の４－Ｏ－β－ＭＥＬ生産菌の特性を維持している。例えば、４－Ｏ－β－ＭＥＬ生産菌が４－Ｏ－β－ＭＥＬ－Ａ生産菌である場合、形質転換体は１－Ｏ－β－ＭＥＬ－Ａを生産することができる。また、脂肪酸残基数が１の４－Ｏ－β－ＭＥＬを生合成する場合は、脂肪酸残基数が１の１－Ｏ－β－ＭＥＬを生合成することができる。したがって、形質転換体によって生産させる１－Ｏ－β－ＭＥＬの構造を基準に、対応する４－Ｏ－β－ＭＥＬ生産菌を選択することができる。例えば、脂肪酸残基数が１の１－Ｏ－β－ＭＥＬ－Ｃを製造する場合は、脂肪酸残基数が１の４－Ｏ－β－ＭＥＬ－Ｃを生産するシュードザイマ・アンタークティカを用いて４－Ｏ－β－ＭＥＬ非生産菌を調製し、これを形質転換すればよい。
　（７）１－Ｏ－β－ＭＥＬの製造方法
　本発明の形質転換体は、１－Ｏ－β－ＭＥＬを生合成できるように改変されたものである。この形質転換体を培養し、形質転換体を含む培養物から１－Ｏ－β－ＭＥＬを採取する。培養条件は、４－Ｏ－β－ＭＥＬ生産菌の培養条件を好適に使用することができる。４－Ｏ－β－ＭＥＬ生産菌がシュードザイマ属の場合には、一般には、ｐＨ５～８、好ましくはｐＨ６、温度２０～３５℃、好ましくは２２～２８℃で３～７日間培養すればよい。１－Ｏ－β－ＭＥＬは、定法にしたがって培養液中から回収することができる。
　ＭＥＬは、アセチル基の結合位置や含まれる脂肪酸残基数、エリスリトールの立体構造等が相違すると、界面活性効果やベシクル形成能、水和性などが相違する。本発明によれば、４－Ｏ－β－ＭＥＬ生合菌の培養条件と同じ培養条件で形質転換体を培養することで、４－Ｏ－β－ＭＥＬ生合菌の特性を維持して１－Ｏ－β－ＭＥＬを製造することができる。形質転換体から生合成される産物の推定が容易であり、かつ従前の培養条件で効率的にＭＥＬを生合成することができる。
　（８）１－Ｏ－β－ＭＥＬの用途
　１－Ｏ－β－ＭＥＬは、親水性の糖骨格と、親油性の脂肪酸残基を有し、脂肪酸残基数によって１－Ｏ－β－ＭＥＬの親水性が異なる。したがって、生産された種々の１－Ｏ－β－ＭＥＬは、その特性に応じて、界面活性剤、医薬品、化粧品、食品などに使用することができる。
　以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。
　（実施例１）
　（１）ＭＥＬ生産菌の培養
　保存培地（麦芽エキス３ｇ／Ｌ、酵母エキス３ｇ／Ｌ、ペプトン５ｇ／Ｌグルコース１０ｇ／Ｌ、寒天３０ｇ／Ｌ）に保存したシュードザイマ・ツクバエンシス株を、グルコース２０ｇ／Ｌ、酵母エキス１ｇ／Ｌ、硝酸ナトリウムム３ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム０．３ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．３ｇ／Ｌを含む液体培地（ａ）４ｍＬが入った試験管に１白金耳接種し、２５℃で振とう培養し、菌体培養液（ａ）を得た。
　この菌体培養液（ａ）を、オリーブ油４０ｇ／Ｌ、酵母エキス１ｇ／Ｌ、硝酸ナトリウム３ｇ／Ｌ、リン酸２水素カリウム０．３ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．３ｇ／Ｌを含む液体培地（ｂ）２０ｍＬの入った坂口フラスコに接種し、２５℃で振とう培養を行い、菌体培養液（ｂ）を得た。
　（２）マンノース転移酵素の抽出と遺伝子配列の特定
　上記菌体培養液（ｂ）に含まれる菌体を液体窒素で凍結し、フェノールおよびクロロホルムで処理しゲノムＤＮＡを抽出した。得られたゲノムＤＮＡの純度と量を分光光度計で確認した後、ゲノムシーケンス用のＤＮＡライブラリー調製キットを用いて、ＤＮＡライブラリーを調製した。調製したＤＮＡライブラリーに挿入された遺伝子サイズの分布をバイオアナライザーにて確認した。なお、ＤＮＡライブラリーの量は微量ＤＮＡ定量キットを用いて測定した。所定量のＤＮＡライブラリーを用いて、ゲノム配列を次世代シーケンサーで解読した。得られた配列情報は、解析ソフトにてアッセンブルを行い、断片化したゲノム情報を得た。このゲノム情報から遺伝子領域を推定した。次いで、４－Ｏ－β－ＭＥを生合成する既知のマンノース転移酵素のアミノ酸配列と、前記推定遺伝子領域とを対比し、配列同一性の高い遺伝子を選択した。この配列を配列番号３に示す。
　（３）４－Ｏ－β－ＭＥＬ非生産菌の調製
　特許文献３に従い、４－Ｏ－β－ＭＥＬ生産菌であるシュードザイマ・アンタークティカＴ－３４の４－Ｏ－β－ＭＥを生合成するためのマンノース転移酵素を欠損させて、４－Ｏ－β－ＭＥＬ非生産株を調製した。
　（４）４－Ｏ－β－ＭＥＬ非生産菌のＭＥＬ生合成能の評価
４－Ｏ－β－ＭＥＬ生産菌と４－Ｏ－β－ＭＥＬ非生産株とを上記（１）の菌体培養液（ｂ）を得る条件で７日間培養し、培養物をＴＬＣにて評価した。結果を図１に示す。Ｍはマーカーであり、図８（ｄ）に示す４－Ｏ－β－ＭＥＬの標品である。また、１は４－Ｏ－β－ＭＥＬ生産菌の培養物を示し、２は、４－Ｏ－β－ＭＥＬ非生産株の培養物を示す。１で示される４－Ｏ－β－ＭＥＬ生産菌であるシュードザイマ・アンタークティカＴ－３４は、ＭＥＬ－Ａを生産するが、２で示される４－Ｏ－β－ＭＥＬ非生産株は、上記培養条件ではいずれのＭＥＬも生産することができなかった。
　（５）組換えベクター構築
　配列番号３に示す遺伝子を発現する組換えベクターを以下の方法で構築した。
　まず、配列番号３を参照して、配列番号４に示す開始コドンの上流にBamHIサイト（ggatcc）を導入したプライマーと、配列番号５に示す終始コドンの下流でBamHIサイトを導入するように設計したプライマーとの一対のプライマーを用いてＰＣＲを行い、前記した選択遺伝子を増幅した。増幅した遺伝子を、糸状菌(Ustilago maydis)用の発現ベクターのｐＵＸＶ１のクローニングサイトに連結し、ｇａｐプロモーターの制御下でこの遺伝子が発現される遺伝子組換えベクターｐＵＸＶ１－ＰｔＥＭＴ１を構築した。組換えベクターの構造を図２に示す。
Fwd:gtttggatccatgaaagtggcactgctttc（配列番号４）
Rvs:cgggatcccatgagggaactgatgtgcg（配列番号５）
（６）形質転換体の調製
　得られた組換えベクターを用いて４－Ｏ－β－ＭＥＬ非生産株を形質転換した。形質転換の方法は以下に従った。
　エレクトロポレーション法にて、前記遺伝子組換えベクターｐＵＸＶ１－ＰｔＥＭＴ１を、前記シュードザイマ・アンタークティカＴ－３４由来の４－Ｏ－β－ＭＥＬ非生産株に導入した。一方、コントロールとしてインサートを含まないベクターｐＵＸＶ１を用い、同様に操作した。次いで、Ｇ４１８を使用して形質転換体を選別した。
　（７）形質転換体のＭＥＬ生産能の評価
　形質転換体を上記（１）の菌体培養液（ａ）を得る条件で１日間培養し、ついで菌体培養液（ｂ）を得る条件で７日間培養し、得られた菌体培養液からＭＥＬを抽出した。菌体培養液に等量の酢酸エチルを添加し、十分攪拌した後、酢酸エチル層を分取した。酢酸エチル層に含まれるＭＥＬの確認は薄層クロマトグラフィーにて行った。結果を図３に示す。図中、Ｍはマーカーであり、符号１、２、３は酢酸エチル層を示す。ＴＬＣで検出したスポットは、既知のＭＥＬのスポットと一致した。図３に示すように、遺伝子発現ベクターｐＵＸＶ１－ＰｔＥＭＴ１で形質転換されたシュードザイマ・アンタークティカ由来のＭＥＬ非生産株は、ＭＥＬを生産することができた。
　（８）ＭＥＬの同定
　形質転換体から生産されたＭＥＬを、シリカカラムクロマトグラフィーで精製した。次いで、精製品の化学構造を、１Ｈ－ＮＭＲと１３Ｃ－ＮＭＲとにより解析した。精製後のＭＥＬのＴＬＣを図４に示す。図４においてＭはマーカーであり、１は精製品である。図４の結果から、ＭＥＬ非生産株が生産したＭＥＬは、ＭＥＬ－Ａと推定された。
　この精製品の１Ｈ－ＮＭＲの分析結果を図５に、１３Ｃ－ＮＭＲの分析結果を図６に示す。図５（Ａ）、は、ＭＥＬ非生産菌を調製する際に使用したシュードザイマ・アンタークティカが生産したＭＥＬ－Ａの１Ｈ－ＮＭＲの分析結果であり、図５（Ｂ）は形質転換体が生産したＭＥＬ－Ａの１Ｈ－ＮＭＲの分析結果である。図５（Ｂ）の１Ｈ－ＮＭＲの結果に示すように、シュードザイマ・ツクバエンシス由来のマンノース転移酵素を発現している形質転換体は、１－Ｏ－β－ＭＥＬに特徴的なＨ－４ａとＨ－４ｂのピークシフトを示し、１－Ｏ－β－ＭＥＬであることが確認された。同様に、図６（Ａ）はＭＥＬ非生産菌を調製する際に使用したシュードザイマ・アンタークティカが生産したＭＥＬ－Ａの１３Ｃ－ＮＭＲの分析結果であり、図６（Ｂ）は形質転換体が生産したＭＥＬ－Ａの１３Ｃ－ＮＭＲの分析結果である。図６（Ａ）、（Ｂ）を比較して明らかなように、エリスリトールの３位の炭素のピーク位置が大きく異なり、１－Ｏ－β－ＭＥＬであることが確認された。
　上記したように、４－Ｏ－β－ＭＥＬ生産菌を使用して、１－Ｏ－β－ＭＥＬを製造することができた。しかも、使用した４－Ｏ－β－ＭＥＬ生産菌は、主として４－Ｏ－β－ＭＥＬ－Ａを生産するシュードザイマ・アンタークティカである。ＭＥＬ－Ｂを生合成するシュードザイマ・ツクバエンシス由来のマンノース転移酵素を使用して、形質転換体から１－Ｏ－β－ＭＥＬ－Ａを生産させることができた。これは、ＭＥＬ－Ｂを生合成するシュードザイマ・ツクバエンシス由来のマンノース転移酵素の遺伝子を使用し、従来の４－Ｏ－β－ＭＥＬ生産菌の生合成特性をそのまま利用し、マンノースに結合するエリスリトールの立体構造のみが異なる１－Ｏ－β－ＭＥＬを生産させうることを示すものである。
　１－Ｏ－β－ＭＥを生合成するためのマンノース転移酵素の遺伝子は、微生物が生合成するＭＥＬの糖構造を制御するためのターゲット遺伝子の一つとなり、該遺伝子を用いた組み換えベクターで形質転換することで、従来の微生物に１－Ｏ－β－ＭＥＬの生合成能力を付与できることが示された。この技術によって、より水になじみやすく実用性に優れた１－Ｏ－β－ＭＥＬの生産技術の向上や、遺伝子組換え技術を駆使した微生物プロセスによる新たなバイオ素材の開発への応用も期待できる。
　本発明のマンノース転移酵素遺伝子を用いると、種々の１－Ｏ－β－ＭＥＬを生産することができ、医薬、環境その他の産業に使用でき有用である。

Claims (10)

  1. 　マンノースとエリスリトールとから、下記式に示す１－Ｏ－β－Ｄ－マンノピラノシルエリスリトールを生合成するマンノース転移酵素をコードする遺伝子であって、配列番号１と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子を含むことを特徴とする、マンノース転移酵素遺伝子。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
  2. 　前記マンノース転移酵素は、配列番号６、配列番号７および／または配列番号８に示すアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１記載のマンノース転移酵素遺伝子。
  3. 　請求項１または請求項２に記載されるマンノース転移酵素遺伝子が導入された、組換えベクター。
  4. 　下記式で示される４－Ｏ－β－Ｄ－マンノピラノシルエリスリトールを生合成する菌のマンノース転移酵素活性を失活させた４－Ｏ－β－Ｄ－マンノピラノシルエリスリトールリピッド非生産菌を、請求項３に記載の組換えベクターを用いて形質転換したことを特徴とする形質転換体。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
  5. 　前記４－Ｏ－β－Ｄ－マンノピラノシルエリスリトールを生合成する菌が、下記式で示す４－Ｏ－β－マンノシルエリスリトールリピッドを生産する菌であることを特徴とする、請求項４に記載の形質転換体。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     （式中、Ｒ１～Ｒ４は、互いに同一であっても異なっていてもよい、水素原子、アセチル基、又は炭素原子数３～１８の飽和若しくは不飽和の脂肪酸残基を示し、Ｒ５は、水素原子または炭素原子数３～１８の飽和若しくは不飽和の脂肪酸残基を示す。）
  6. 　請求項４または５記載の形質転換体を培養することを特徴とする、下記式で示す１－Ｏ－β－マンノシルエリスリトールリピッドの製造方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     （式中、Ｒ１～Ｒ４は、互いに同一であっても異なっていてもよい、水素原子、アセチル基、又は炭素原子数３～１８の飽和若しくは不飽和の脂肪酸残基を示し、Ｒ５は、水素原子または炭素原子数３～１８の飽和若しくは不飽和の脂肪酸残基を示す。）
  7. 　配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
  8. 　配列番号１と９０％以上の同一性を有することを特徴とする、請求項７記載のタンパク質。
  9. 　配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
  10. 　配列番号２と９０％以上の同一性を有することを特徴とする、請求項９記載のＤＮＡ。
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