JP6675759B2 - マンノース転移酵素遺伝子、組換えベクター、形質転換体、1−O−β−マンノシルエリスリトールリピッドの製造方法 - Google Patents
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Description
更に本発明は、前記形質転換体を培養することを特徴とする、下記式で示す1−O−β−MELの製造方法を提供するものである。
加えて本発明は、配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、および前記配列番号1と90%以上の同一性を有することを特徴とするタンパク質を提供するものである。
本発明で製造される1−O−β−MELは、下記式で示される。エリスルトールがマンノースにβグリコシド結合した1−O−β−MEに、1〜4個の脂肪酸がエステル結合してなる化合物である。式中、R1〜R4は、互いに同一であっても異なっていてもよい、水素原子、アセチル基、又は炭素原子数3〜18の飽和若しくは不飽和の脂肪酸残基を示し、R5は、水素原子または炭素原子数3〜18の飽和若しくは不飽和の脂肪酸残基を示す。なお、本願明細書において、R3およびR4がアセチル基である構造物をMEL−A、R3が水素原子でありR4がアセチル基である構造物をMEL−B、R3がアセチル基でありR4が水素原子である構造物をMEL−C、R3およびR4が水素である構造物をMEL−Dと称する。1−O−β−MELは、主としてシュードザイマ・ツクバエンシスによって製造されてきたが、シュードザイマ・ツクバエンシスが生産する1−O−β−MELはMEL−Bに限定されていた。また、シュードザイマ・ツクバエンシスが生産する1−O−β−MELに含まれる脂肪酸残基は2または3に限定され、脂肪酸残基が1のものは存在しなかった。しかしながら、本発明で製造される1−O−β−MELは、脂肪酸残基数が2または3に限定されず、かつアセチル基の配置もMEL−Bに限定されない。したがって、従来存在しない脂肪酸残基が3本鎖の1−O−β−MEL−Aや1−O−β−MEL−C、脂肪酸残基が1本鎖の1−O−β−MELなどの新規化合物も含まれる。
(2)マンノース転移酵素遺伝子
エリスリトールは炭素鎖の両端にCH2OH基を有するため、何れのCH2OH基とマンノシル基とがβ結合するかによって生産されるMELの立体構造が相違する。シュードザイマ・ヒュベイエンシスKM−59株が生成するMELは、図8(b)に示される4−O−β−MEを糖骨格とし、シュードザイマ・ツクバエンシスが生成するMELは、図8(c)1−O−β−MEを糖骨格とする。これらMEL生産菌は、マンノースにエリスルトールをβグリコシド結合する際に、エリスリトールの立体構造を認識して、1−O−β−MEまたは4−O−β−MEを生産すると推定される。一実施形態において、本発明では、MEL生合成遺伝子クラスターを構成する遺伝子の中から、マンノースとエリスリトールとを結合してMEを生合成するマンノース転移酵素を選択し、1−O−β−MELを製造するための遺伝子として使用する。
本発明のタンパク質は、配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。前記したように、配列番号1で表されるアミノ酸配列は、シュードザイマ・ツクバエンシスに由来する、マンノースとエリスリトールとから1−O−β−MEを生合成するマンノース転移酵素のアミノ酸配列である。本発明のタンパク質は、マンノースとエリスリトールとから1−O−β−MEを生合成するマンノース転移反応を触媒することができ、マンノース転移酵素として使用することができる。ただし、マンノース転移活性に限定されず他の触媒活性を有する場合も含む。なお、本発明のタンパク質は、配列番号1と90%以上、より好ましくは95%以上の同一性を有するタンパク質であってもよい。
配列番号1に示すアミノ酸配列は、シュードザイマ・ツクバエンシスのマンノース転移酵素のアミノ酸配列である。このアミノ酸配列をコードする遺伝子は、例えば、シュードザイマ・ツクバエンシスの全ゲノム配列情報を取得し、全遺伝子領域を推定し、4−O−β−MEを生合成するマンノース転移酵素をコードするDNAと同一性を比較し、同一性の高い遺伝子を選択することで調製することができる。また、シュードザイマ・ツクバエンシスを培養する際に、脂肪酸を含む培地で培養して1−O−β−MEL生産に関与する遺伝子群を発現させ、発現量の多いmRNAなどを選択し、4−O−β−MEを合成するマンノース転移酵素の遺伝子ゲノム情報を参照して、配列同一性の高い遺伝子を選択してもよい。このような遺伝子を構成するDNAは、配列番号1をコードするDNA配列に基づいて化学合成したものであってもよい。マンノース転移酵素をコードするDNAは、ここに開示される配列情報を基に、化学的DNA合成法、標準的な遺伝子工学的手法、分子生物学的手法、又は生化学的手法などを用いることによって容易に調製することができる
また、前記したウスティラゴ・ホルデイのUHOR 04876タンパク質のアミノ酸配列のN末端から第271〜305番目のアミノ酸配列が配列番号6で置換され、同第373〜308番目のアミノ酸配列が配列番号7で置換され、同第568番目以降のアミノ酸配列が配列番号8で置換されたアミノ酸配列をコードする遺伝子であってもよい。このような遺伝子は、ウスティラゴ・ホルデイから全ゲノム配列情報を得て、UHOR 04876タンパク質をコードするDNAを選択し、配列番号6、配列番号7、配列番号8に相当するDNAで適宜置換して調製することができる。
本発明では、マンノース転移酵素遺伝子を適当な発現ベクターに導入して組換えベクターとして使用することができる。このような組換えベクターは、発現ベクターのプロモーターの下流に前記マンノース転移酵素遺伝子を挿入して調製することができ、従来公知の遺伝子工学に基づいて構築することができる。なお、使用する発現ベクターとしては、プラスミド、コスミドあるいはウイルス由来のもの等を使用することができる。例えば、シュードザイマ属の4−O−β−MEL生産菌を使用して形質転換する場合には、使用する発現ベクターとして、pUXV1 ATCC 77463、pUXV2 ATCC 77464、pUXV5 ATCC 77468、pUXV6 ATCC 77469、pUXV7 ATCC 77470、pUXV8 ATCC 77471、pUXV3 ATCC 77465、pU2X1 ATCC 77466、pU2X2 ATCC 77467等を例示することができる。
本発明では、4−O−β−MEL非生産菌に、前記組換えベクターを導入して形質転換体を製造することができる。なお、本発明において「4−O−β−MEL非生産菌」とは、本来4−O−β−MELを生合成できる菌(以下、4−O−β−MEL生産菌とも称する。)であるが、マンノースとエリスルトールとを結合して4−O−β−MEを生合成するマンノース転移酵素活性が失活された菌を意味する。4−O−β−MEL生産菌としては、MEL−A、MEL−B、MEL−C、MEL−Dのいずれの4−O−β−MELを生産するものであってもよい。更に、「菌」の名称に限定されず、4−O−β−MEL生産能を有することを条件に、酵母、カビ等の真核微生物、さらには他の高等生物の細胞でもよい。このような高等生物の細胞としては、動物細胞や培養植物細胞が例示される。4−O−β−MEL生産菌の好ましい例として、サッカロマイセス属の菌株(例えば、サッカロマイセス・セレビシエ)やシュードザイマ属の菌株(例えば、シュードザイマ・アンタークティカ)を例示することができる。一実施形態において、1−O−β−MEの合成を触媒するマンノース転移酵素をコードするDNAを有する宿主細胞は、4−O−β−MEL非生産菌に限定されず、目的に応じて任意に選択できる。
本発明の形質転換体は、1−O−β−MELを生合成できるように改変されたものである。この形質転換体を培養し、形質転換体を含む培養物から1−O−β−MELを採取する。培養条件は、4−O−β−MEL生産菌の培養条件を好適に使用することができる。4−O−β−MEL生産菌がシュードザイマ属の場合には、一般には、pH5〜8、好ましくはpH6、温度20〜35℃、好ましくは22〜28℃で3〜7日間培養すればよい。1−O−β−MELは、定法にしたがって培養液中から回収することができる。
1−O−β−MELは、親水性の糖骨格と、親油性の脂肪酸残基を有し、脂肪酸残基数によって1−O−β−MELの親水性が異なる。したがって、生産された種々の1−O−β−MELは、その特性に応じて、界面活性剤、医薬品、化粧品、食品などに使用することができる。
(1)MEL生産菌の培養
保存培地(麦芽エキス3g/L、酵母エキス3g/L、ペプトン5g/Lグルコース10g/L、寒天30g/L)に保存したシュードザイマ・ツクバエンシス株を、グルコース20g/L、酵母エキス1g/L、硝酸ナトリウムム3g/L、リン酸2水素カリウム0.3g/L、及び硫酸マグネシウム0.3g/Lを含む液体培地(a)4mLが入った試験管に1白金耳接種し、25℃で振とう培養し、菌体培養液(a)を得た。
上記菌体培養液(b)に含まれる菌体を液体窒素で凍結し、フェノールおよびクロロホルムで処理しゲノムDNAを抽出した。得られたゲノムDNAの純度と量を分光光度計で確認した後、ゲノムシーケンス用のDNAライブラリー調製キットを用いて、DNAライブラリーを調製した。調製したDNAライブラリーに挿入された遺伝子サイズの分布をバイオアナライザーにて確認した。なお、DNAライブラリーの量は微量DNA定量キットを用いて測定した。所定量のDNAライブラリーを用いて、ゲノム配列を次世代シーケンサーで解読した。得られた配列情報は、解析ソフトにてアッセンブルを行い、断片化したゲノム情報を得た。このゲノム情報から遺伝子領域を推定した。次いで、4−O−β−MEを生合成する既知のマンノース転移酵素のアミノ酸配列と、前記推定遺伝子領域とを対比し、配列同一性の高い遺伝子を選択した。この配列を配列番号3に示す。
特許文献3に従い、4−O−β−MEL生産菌であるシュードザイマ・アンタークティカT−34の4−O−β−MEを生合成するためのマンノース転移酵素を欠損させて、4−O−β−MEL非生産株を調製した。
4−O−β−MEL生産菌と4−O−β−MEL非生産株とを上記(1)の菌体培養液(b)を得る条件で7日間培養し、培養物をTLCにて評価した。結果を図1に示す。Mはマーカーであり、図8(d)に示す4−O−β−MELの標品である。また、1は4−O−β−MEL生産菌の培養物を示し、2は、4−O−β−MEL非生産株の培養物を示す。1で示される4−O−β−MEL生産菌であるシュードザイマ・アンタークティカT−34は、MEL−Aを生産するが、2で示される4−O−β−MEL非生産株は、上記培養条件ではいずれのMELも生産することができなかった。
配列番号3に示す遺伝子を発現する組換えベクターを以下の方法で構築した。
Fwd:gtttggatccatgaaagtggcactgctttc(配列番号4)
Rvs:cgggatcccatgagggaactgatgtgcg(配列番号5)
得られた組換えベクターを用いて4−O−β−MEL非生産株を形質転換した。形質転換の方法は以下に従った。
形質転換体を上記(1)の菌体培養液(a)を得る条件で1日間培養し、ついで菌体培養液(b)を得る条件で7日間培養し、得られた菌体培養液からMELを抽出した。菌体培養液に等量の酢酸エチルを添加し、十分攪拌した後、酢酸エチル層を分取した。酢酸エチル層に含まれるMELの確認は薄層クロマトグラフィーにて行った。結果を図3に示す。図中、Mはマーカーであり、符号1、2、3は酢酸エチル層を示す。TLCで検出したスポットは、既知のMELのスポットと一致した。図3に示すように、遺伝子発現ベクターpUXV1−PtEMT1で形質転換されたシュードザイマ・アンタークティカ由来のMEL非生産株は、MELを生産することができた。
形質転換体から生産されたMELを、シリカカラムクロマトグラフィーで精製した。次いで、精製品の化学構造を、1H−NMRと13C−NMRとにより解析した。精製後のMELのTLCを図4に示す。図4においてMはマーカーであり、1は精製品である。図4の結果から、MEL非生産株が生産したMELは、MEL−Aと推定された。
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- 請求項1に記載されるマンノース転移酵素遺伝子が導入された、組換えベクター。
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