CN110616204A - 黄酮合酶及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种黄酮合酶及其应用。所述黄酮合酶选自：(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的多肽；或(b)将SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有黄酮合酶活性的由(a)衍生的多肽；或(c)与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2氨基酸序列有至少85％序列相同性，且具有黄酮合酶活性的由(a)衍生的多肽。该黄酮合酶可实现包括芹菜素在内的多种黄酮化合物的转化和制备，且具有更优的催化效率，具有优于现有种类的FNS I的转化效率，能够用于黄酮化合物细胞工厂的构建与优化。
Description
技术领域
本发明涉及生物酶技术领域，特别涉及一种黄酮合酶，以及该黄酮合酶的应用。
背景技术
黄酮类化合物是结构多样性高的重要植物天然化合物，目前已经分离到了9000多种不同结构的黄酮类化合物，按结构可以分为黄酮(flavones)、黄烷酮(flavanones)、异黄酮(isoflavone)、黄烷醇(flavanols)、黄酮醇(flavonols)和花青素(anthocyanidines)等不同类型。其中，黄酮是黄酮类化合物中最大的类型。黄酮不但对于植物的生理、生态和农业有广泛的用途，而且在癌症和心血管等疾病防治方面也显著的疗。例如，芹菜素(apigenin)是一种黄酮类化合物，分布于一些温热带的蔬菜和水果中，尤以芹菜中含量为高。芹菜素具有抗肿瘤、抗炎和抗氧化等多种生物学活性，它的抗肿瘤活性非常优异，不但可抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤侵袭和转移而且可以提高化疗药物敏感性和抗氧化作用等(陈亭亭等，中国现代应用药学，2019年)。木犀草素(luteolin)也是一种存在于多种蔬菜和药用植物中的黄酮类化合物，具有包括抗肿瘤、抗氧化、抗炎、保护神经系统等在内的多种药物活性(王继双等，生命科学，2013)。白杨素(chrysin)又是一种具有广泛药理活性的黄酮类化合物，它即可从紫葳科植物木蝴蝶中提取，同时也是蜂胶的主要有效成分之一，具有抗肿瘤和防治心脑血管疾病等多种药理作用(姜金生等，中草药，2011年)。由于具有良好的药理活性使得黄酮在药物开发与设计方面也越来越受到重视(Stefan Martens等，Molecules of Interest，2005年)。因此，如何大量制备这些黄酮化合物也受到了越来越多的关注。
黄酮的生物合成包括以下几个步骤，首先三个分子丙二酰辅酶A与一个分子对香豆酰基辅酶A或者一份子肉桂酰辅酶A或者一分子咖啡酰辅酶A等合成查尔酮衍生物，接着查尔酮衍生物转化为黄烷酮，最后黄烷酮在黄酮合酶(FNS)的催化下生成黄酮。在黄酮的生物合成途径中，黄酮合酶是其中的限速酶。目前已经发现植物中存在两种完全不同的FNS，其中一种是FNS I，它是一种可溶性双加氧酶，另外一种是FNS II，它是一种膜结合细胞色素P450酶。通过FNS的催化作用可以将很多低成本的黄烷酮化合物转化为药用价值更高的黄酮化合物，例如将柚皮素转化为芹菜素，圣草素(eriodictyol)转化为木犀草素和松果间素(pinocembrin)转化为木犀草素。经过文献比较分析，大部分FNS I的催化效率要高于FNSII(Effendi Leonard，APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY，2005)，但是现有种类的FNS I转化效率仍不能满足要求生产、科研需求。
发明内容
本技术公开的FNS I可实现包括芹菜素在内的多种黄酮化合物的转化和制备，且具有更优的催化效率。
本发明公开的黄酮合酶选自：
(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的多肽；或
(b)将SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个，较佳地1-10个，更佳地1-5个，最佳地1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有黄酮合酶活性的由(a)衍生的多肽；或
(c)与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2氨基酸序列有至少85％(较佳地至少90％；更佳地至少95％)序列相同性，且具有黄酮合酶活性的由(a)衍生的多肽。
优选地，所述(c)还包括：由(a)或(b)添加了标签序列、信号序列或分泌信号序列后所形成的融合蛋白。
本发明同时还公开了编码上述黄酮合酶的多核苷酸。优选地，该多核苷酸的序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示。
在本发明的另一方面，提供一种载体，含有前述的多核苷酸。
在本发明的另一方面，提供一种宿主细胞，含有所述的载体或基因组中整合有所述的多核苷酸。所述的宿主细胞是原核细胞或真核细胞，常用的原核宿主细胞包括大肠杆菌、枯草杆菌等；常用的真核宿主细胞包括真菌细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞等；所述的真菌细胞包括酵母细胞。
在本发明的另一方面，提供上述黄酮合酶的制备方法，其包括步骤：
1)在适合表达的条件下，培养所述宿主细胞；
2)从培养物中分离出黄酮合酶。
制得的黄酮合酶可应用于将黄烷酮化合物转化为黄酮化合物。具体是以α酮戊二酸为辅因子将黄烷酮化合物合成黄酮类植物的小分子代谢产物；例如，将柚皮素转化为芹菜素。
本发明公开的黄酮合酶具有优于现有种类的FNS I的转化效率，能够用于黄酮化合物细胞工厂的构建与优化。
附图说明
图1为黄酮合酶DcFNS和AgFNS琼脂糖凝胶电泳图；
图2为黄酮合酶DcFNS和AgFNS的western blot图；
图3为黄酮合酶DcFNS、AgFNS和PcFNS催化柚皮素反应产物的HPLC检测图；
图4为黄酮合酶DcFNS、AgFNS和PcFNS催化柚皮素效率比较图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
通过对多种植物的基因组和转录组数据进行数据挖掘分析，从中分别获得黄酮合酶的核苷酸候选序列DcFNS(SEQ ID NO:3)和AgFNS(SEQ ID NO:4)。通过在大肠杆菌中表达该序列，制备含有该序列表达产物的粗酶液，以α酮戊二酸为辅因子，通过体外催化检测其对柚皮素的催化活性。本发明发现DcFNS和AgFNS表达产物能够高效催化柚皮素合成具有高附加值和多种重要生理活性的芹菜素。
实施例1.黄酮合酶DcFNS的克隆及其在大肠杆菌中表达
合成如序列表中SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的两条引物，以从植物提取的RNA反转录获得的cDNA为模板，利用如上引物进行PCR。DNA聚合酶选用宝生物工程有限公司的高保真的KOD DNA聚合酶。PCR扩增程序为：94℃2min；94℃15s，58℃30s，68℃2min，共35个循环；68℃10min降至10℃。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，结果如附图1。
在紫外下照射，切下目标DNA条带。然后采用Axygen Gel Extraction Kit(AEYGEN公司)从琼脂糖凝胶中回收DNA即为扩增出的黄酮合酶基因的DNA片段。利用宝生物工程(大连)有限公司(Takara)的PMD18-T克隆试剂盒，将回收的PCR产物克隆到PMDT载体，所构建的载体命名为PMDT-DcFNS。经测序获得DcFNS的基因序列。
DcFNS基因具有SEQ ID NO:3的核苷酸序列。自SEQ ID NO:3的5’端第1-1074位核苷酸为DcFNS的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)，自SEQ ID NO:3的5’端的第1-3位核苷酸为DcFNS基因的起始密码子ATG，自SEQ ID NO:3的5’端的第1072-1074位核苷酸为DcFNS基因的终止密码子TAG。黄酮合酶DcFNS编码一个含有357个氨基酸的蛋白质DcFNS，具有SEQ ID NO:1的氨基酸残基序列，用软件预测到该蛋白质的理论分子量大小为40.3kDa，等电点pI为5.73。
合成如序列表中SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的两条引物，在合成的引物，两端分别加BamH I和Xho I两个酶切位点，以质粒PMDT-DcFNS为模板进行PCR。PCR扩增程序同上。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离，回收后的PCR产物利用Vazyme公司的One-step mutisclone kit连入经BamH I和Xho I双酶切的pET28a载体(Invitrogen公司)中。所获得的重组质粒命名为pET28a-DcFNS。
将重组质粒pET28a-DcFNS及空载体pET28a转化大肠杆菌BL21(DE3)中构建重组大肠杆菌BL21-pET28a-DcFNS和BL21-pET28a。
分别接种BL21-pET28a-DcFNS和BL21-pET28a到LB培养基中，37℃200rpm培养至OD600约0.6-0.8，使菌液降温至4℃，加入终浓度为50μM的IPTG，18℃，200rpm诱导表达15h。4℃离心收集菌体，加入裂解buffer(50mM磷酸盐缓冲液、1mM EDTA、1mM DTT，pH 7.4)重悬菌体，超声破碎细胞，4℃12000g离心收集细胞裂解液上清，取样品进行SDS-PAGE电泳和Western blot分析，结果如附图2。
实施例2.黄酮合酶DcFNS催化柚皮素反应
以实施例1获得的BL21-pET28a-DcFNS和BL21-pET28a裂解液上清为粗酶液，配置如下反应体系(100μL)：
在30℃水浴下反应2h。反应结束后加入等体积的乙酸乙酯抽提，取上层乙酸乙酯相，经真空浓缩后，反应产物溶解于100μL甲醇中，结果用HPLC检测，结果如附图3。
从图3中结果可以看出含有黄酮合酶DcFNS的大肠杆菌粗酶液BL21-pET28a-DcFNS可以催化柚皮素形成一种新的产物其在HPLC的保留时间与芹菜素标准品一致，而对照组含有空载体pET28a的大肠杆菌粗酶液BL21-pET28a催化柚皮素则没有该产物生成。结果表明，本发明中发现的黄酮合酶DcFNS能催化黄烷酮类化合物柚皮素的C3位脱氢反应合成芹菜素。
实施例3.黄酮合酶AgFNS的克隆及其在大肠杆菌中表达
合成如序列表中SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10的两条引物，以从植物提取的RNA反转录获得的cDNA为模板，利用如上引物进行PCR。DNA聚合酶选用宝生物工程有限公司的高保真的KOD DNA聚合酶。PCR扩增程序为：94℃2min；94℃15s，58℃30s，68℃2min，共35个循环；68℃10min降至10℃。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，结果如附图1。
在紫外下照射，切下目标DNA条带。然后采用Axygen Gel Extraction Kit(AEYGEN公司)从琼脂糖凝胶中回收DNA即为扩增出的黄酮合酶基因的DNA片段。利用宝生物工程(大连)有限公司(Takara)的PMD18-T克隆试剂盒，将回收的PCR产物克隆到PMDT载体，所构建的载体命名为PMDT-AgFNS。经测序获得AgFNS的基因序列。
AgFNS基因具有SEQ ID NO:4的核苷酸序列。自SEQ ID NO:4的5’端第1-1068位核苷酸为AgFNS的开放阅读框，自SEQ ID NO:4的5’端的第1-3位核苷酸为AgFNS基因的起始密码子ATG，自SEQ ID NO:4的5’端的第1066-1068位核苷酸为AgFNS基因的终止密码子TGA。黄酮合酶AgFNS编码一个含有355个氨基酸的蛋白质AgFNS，具有SEQ ID NO:1的氨基酸残基序列，用软件预测到该蛋白质的理论分子量大小为40.0kDa，等电点pI为6.2。
合成如序列表中SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的两条引物，在合成的引物，两端分别加BamH I和Xho I两个酶切位点，以质粒PMDT-AgFNS为模板进行PCR。PCR扩增程序同上。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离，回收后的PCR产物利用Vazyme公司的One-step mutisclone kit连入经BamH I和Xho I双酶切的pET28a载体中。所获得的重组质粒命名为pET28a-AgFNS。
将重组质粒pET28a-AgFNS转化大肠杆菌BL21(DE3)中构建重组大肠杆菌BL21-pET28a-AgFNS。
分别接种BL21-pET28a-AgFNS和BL21-pET28a(实施例1)到LB培养基中，37℃200rpm培养至OD600约0.6-0.8，使菌液降温至4℃，加入终浓度为50μM的IPTG，18℃，200rpm诱导表达15h。4℃离心收集菌体，加入裂解buffer(50mM磷酸盐缓冲液、1mM EDTA、1mM DTT，pH 7.4)重悬菌体，超声破碎细胞，4℃12000g离心收集细胞裂解液上清，取样品进行SDS-PAGE电泳和Western blot分析，结果如附图2。
实施例4.黄酮合酶AgFNS催化柚皮素反应
以实施例1获得BL21-pET28a-AgFNS和BL21-pET28a裂解液上清为粗酶液，配置如下反应体系(100μL)：
在30℃水浴下反应2h。反应结束后加入等体积的乙酸乙酯抽提，取上层乙酸乙酯相，经真空浓缩后，反应产物溶解于100μL甲醇中，结果用HPLC检测，结果如附图3。
从图3中结果可以看出含有黄酮合酶AgFNS的大肠杆菌粗酶液BL21-pET28a-AgFNS可以催化柚皮素形成一种新的产物其在HPLC的保留时间与芹菜素标准品一致，而对照组含有空载体pET28a的大肠杆菌粗酶液BL21-pET28a催化柚皮素则没有该产物生成。结果表明，本发明中发现的黄酮合酶AgFNS能催化黄烷酮类化合物柚皮素的C3位脱氢反应合成芹菜素。
实施例5.黄酮合酶DcFNS、AgFNS与PcFNS催化柚皮素反应活性比较
PcFNS是从植物欧兰芹(Petroselinum crispum)中克隆的一种黄酮合酶(参考文献Martens S,Forkmann G,Matern U,et al.Cloning of parsley flavone synthase I[J].Phytochemistry,2001,58(1):43-46.)，根据许多文献报道黄酮合酶PcFNS催化活性不仅强于已报道的II型黄酮合酶，也优于众多其他I型黄酮合酶，是目前芹菜素等化合物细胞工厂研究中使用最为普遍的黄酮合酶。为将本发明获得的两个黄酮合酶AgFNS和DcFNS与PcFNS比较，通过基因合成获得了文献报道的PcFNS核苷酸序列(NCBI accession No.：AY230247)，并按照实施例1、2策略通过大肠杆菌表达和体外催化比较了AgFNS和DcFNS与PcFNS催化柚皮素的效率。结果如图4所示，AgFNS和DcFNS与PcFNS催化柚皮素合成芹菜素的转化率分别为21.89％、30.6％和18.46％。结果表明AgFNS和DcFNS催化效率显著高于PcFNS，分别提高了18.6％和65.8％。
SEQUENCE LISTING
<110> 佛山市汇腾生物技术有限公司；中国科学院上海生命科学研究院
<120> 黄酮合酶及其应用
<130> 2019
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 357
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Ala Pro Thr Thr Ile Thr Ala Leu Ala Lys Glu Lys Thr Leu Asn
1 5 10 15
Ser Asp Phe Val Arg Asp Glu Asp Glu Arg Pro Lys Val Ala Tyr Asn
20 25 30
Gln Phe Ser Thr Glu Ile Pro Ile Ile Ser Leu Ala Gly Ile Asp Asp
35 40 45
Asp Ser Asn Gly Arg Arg Pro Glu Val Cys Arg Lys Ile Val Glu Ala
50 55 60
Phe Glu Asp Trp Gly Ile Phe Gln Val Val Asp His Gly Ile Asp Ser
65 70 75 80
Gly Leu Ile Ala Glu Met Ser Arg Leu Ser Arg Glu Phe Phe Ala Leu
85 90 95
Pro Ala Glu Glu Lys Leu Arg Tyr Asp Thr Thr Gly Gly Lys Arg Gly
100 105 110
Gly Phe Thr Ile Ser Thr His Leu Gln Gly Asp Asp Val Lys Asp Trp
115 120 125
Arg Glu Phe Val Val Tyr Phe Ser Tyr Pro Val Asp Ala Arg Asp Tyr
130 135 140
Ser Arg Trp Pro Asp Lys Pro Glu Gly Trp Arg Ser Val Thr Glu Val
145 150 155 160
Tyr Ser Glu Lys Leu Met Ala Leu Gly Ala Lys Leu Leu Glu Val Leu
165 170 175
Ser Glu Ala Met Gly Leu Glu Lys Glu Ala Leu Thr Glu Ala Cys Val
180 185 190
Asn Met Glu Gln Lys Val Leu Ile Asn Tyr Tyr Pro Thr Cys Pro Gln
195 200 205
Pro Asp Leu Thr Leu Gly Val Arg Arg His Thr Asp Pro Gly Thr Ile
210 215 220
Thr Ile Leu Leu Gln Asp Met Val Gly Gly Leu Gln Ala Thr Arg Asp
225 230 235 240
Gly Gly Lys Thr Trp Ile Thr Val Gln Pro Val Glu Gly Ala Phe Val
245 250 255
Val Asn Leu Gly Asp His Gly His Tyr Leu Ser Asn Gly Arg Phe Lys
260 265 270
Asn Ala Asp His Gln Ala Val Val Asn Ser Thr Ser Ser Arg Leu Ser
275 280 285
Ile Ala Thr Phe Gln Asn Pro Ala Gln Asn Ala Ile Val Tyr Pro Leu
290 295 300
Lys Ile Arg Glu Gly Glu Lys Pro Ile Leu Glu Glu Ala Met Thr Tyr
305 310 315 320
Ala Glu Met Tyr Lys Lys Asn Met Thr Lys His Ile Glu Val Ala Thr
325 330 335
Gln Lys Lys Leu Ala Lys Glu Lys Arg Leu Gln Asn Glu Lys Ala Lys
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260 265 270
Asn Ala Asp His Gln Ala Val Val Asn Ser Thr Ser Thr Arg Leu Ser
275 280 285
Ile Ala Thr Phe Gln Asn Pro Ala Gln Asn Ala Ile Val Tyr Pro Leu
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atttctttag ctggtatcga tgatgattcc aatggcagga gacctgaggt gtgtcgtaaa 180
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ggtttgatcg cggaaatgtc tcgtctgtct cgtgaattct ttgctttgcc tgccgaggag 300
aaacttcggt atgatactac tggtggaaag agaggcggct tcactatctc cactcatctt 360
cagggtgacg atgtgaagga ttggcgtgag tttgttgttt atttttcgta cccagtcgat 420
gctcgggact actcgagatg gcctgataag ccagagggat ggaggtctgt tacggaggtt 480
tatagtgaga agttgatggc gctaggtgcc aagttactgg aagtgctatc agaggccatg 540
gggcttgaaa aagaggctct tacagaggct tgtgtgaaca tggaacagaa agtgttgatt 600
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gatcatggtc attatttgag caatggaagg ttcaagaatg ccgatcacca agcagtagtg 840
aattcaactt ctagcagatt gtctatcgca actttccaga acccggctca gaatgctata 900
gtgtatccat taaagatcag ggagggcgag aagccaattc ttgaggaggc catgacatac 960
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aaacttgtgt atgataccac tggtggaaag aaaggcggct ttactatctc cactcatctt 360
cagggagatg atgttcggga ttggcgtgag tttgttactt acttttcgta tccaatcagt 420
gctcgggact actcaagatg gcctaaaaag cccgaggggt ggagatcaac cacggaggtt 480
tatagtgaga agttaatggt gctaggtgcc aagttactgg aggtgttatc cgaggcaatg 540
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aattcaactt ccaccagatt gtcaattgca actttccaga acccggctca gaatgcgata 900
gtatatccgt taaagatcag ggagggagag aaggcaattc tggatgaggc catcacctac 960
gctgaaatgt ataagaaaaa catgactaaa catattgcgg tggctaccca gaagaaattg 1020
gccaaggaga aaaggttgca agatgagaag gccaagatga agatatga 1068
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
atggctccaa caactattac tgc 23
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ctaaaatttc gtctccagct tggc 24
<210> 7
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
agcaaatggg tcgcggatcc atggctccaa caactattac t 41
<210> 8
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tggtggtggt ggtgctcgag aaatttcgtc tccagcttgg c 41
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
atggctccat caactataac tgc 23
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
tcatatcttc atcttggcct tctc 24
<210> 11
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
agcaaatggg tcgcggatcc atggctccat caactataac t 41
<210> 12
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
tggtggtggt ggtgctcgag tatcttcatc ttggccttct c 41
Claims (9)
1.黄酮合酶，其特征在于，选自：
(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的多肽；或
(b)将SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有黄酮合酶活性的由(a)衍生的多肽；或
(c)与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2氨基酸序列有至少85％序列相同性，且具有黄酮合酶活性的由(a)衍生的多肽。
2.根据权利要求1所述的黄酮合酶，其特征在于，所述(c)还包括：由(a)或(b)添加了标签序列、信号序列或分泌信号序列后所形成的融合蛋白。
3.多核苷酸，其特征在于，选自：
(α)如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的多核苷酸；或
(β)编码如权利要求1或2所述黄酮合酶的多核苷酸。
4.一种载体，其特征在于，含有如权利要求3所述的多核苷酸。
5.一种宿主细胞，其特征在于，含有如权利要求4所述的载体或基因组中含有如权利要求3所述的多核苷酸。
6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是原核细胞、真核细胞或真菌细胞。
7.一种黄酮合酶的制备方法，其特征在于，包括步骤：
1)在适合表达的条件下，培养如权利要求5或6所述的宿主细胞；
2)从培养物中分离出黄酮合酶。
8.权利要求1或2所述黄酮合酶在黄烷酮化合物转化为黄酮化合物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述转化过程以是α酮戊二酸为辅因子。
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