CN101514344A - 黄酮合成酶基因及其编码的多肽 - Google Patents

Abstract

本发明涉及的是生物技术领域的黄酮合成酶基因及其编码的多肽。其中：①一种黄酮合成酶基因具有SEQ ID NO.1中从核苷酸第1－1584位所示的核苷酸序列，该黄酮合成酶基因编码的多肽具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；②另一种一种黄酮合成酶基因具有SEQ ID NO.3中从核苷酸第1－1584位所示的核苷酸序列，该黄酮合成酶基因编码的多肽具有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。本发明可获得在高异黄酮、抗WGE、抗铝毒害、抗UV－B等方面具有重要特性的大豆品种；利用本发明的大豆黄酮合成酶，通过各种常规筛选方法，可筛选出与大豆黄酮合成酶相关发生相互作用的物质、受体、抑制剂或拮抗剂等。

Description

黄酮合成酶基因及其编码的多肽

技术领域

本发明涉及的是生物技术领域的基因及其编码的多肽，具体地说是黄酮合成酶基因及其编码的多肽。

背景技术

黄酮是植物生长过程中形成的一种次生代谢产物，黄酮与异黄酮、查耳酮、花青素等都是具有生物活性的类黄酮物质。在植物的组织器官中，类黄酮化合物的积累是植物胁迫的重要特征，不同生物体在受到逆境胁迫条件下耐性有很大的差异，这与植物体内的类黄酮化合物类型、含量、结构等有密切的关系。大量研究表明，豆科植物，尤其是大豆独有的黄酮和异黄酮，含量一般仅为0.1％-0.5％，具有弱雌激素活性、抗氧化活性、抗溶血活性和抗真菌活性，能有效地预防和抑制白血病、骨质疏松、癌症等多种疾病的发生。

0liver等在《Phytochemistry》(植物化学)2003年63卷第753-763页发表了《Metabolic engineering to increase isoflavone biosynthesis in soybeanseed》(用代谢工程的方法增加大豆种子中异黄酮含量)一文，文中评述，在大豆黄酮类主要物质黄豆甙原、黄豆素、三羟基异黄酮是通过苯基丙酸类途径合成的。在苯基丙酸类途径中，中间产物4，5，7-三羟黄烷酮(Naringenin)代谢涉及三个关键酶：形成黄酮(Flavone)的黄酮合成酶(Flavone synthase，FNS)，形成黄烷酮醇(Dihydroflavonol)的黄烷酮3-羟化酶(Flavanone 3-hydroxylase，F3H)和形成三羟基异黄酮(genistein)的异黄酮合成酶(Isoflavone synthase，IFS)，黄烷酮3-羟化酶和异黄酮合成酶的基因序列已经克隆，但关键的黄酮合成酶基因序列目前仍然未克隆出来。

经对现有技术的文献检索发现，《Phytochemistry》(植物化学)在2005年66卷20期第2399-2407页刊登了文章“Flavones and flavone synthases“(黄酮与黄酮合成酶)，文中评述，黄酮在植物的药理学及抗逆性方面有重要作用，推断控制黄酮形成的黄酮合成酶有两种类型，大豆中黄酮合成酶可能为黄酮合成酶II型。但至今尚未发现与黄酮合成酶基因及其编码的多肽密切相关的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供黄酮合成酶基因及其编码的多肽。利用本发明的大豆黄酮合成酶，可筛选出与大豆黄酮合成酶相关发生相互作用的物质、受体、抑制剂或拮抗剂等，利用本发明可获得在高异黄酮、抗WGE、抗铝毒害、抗UV-B等方面具有重要特性的大豆品种。

本发明是通过以下技术方案实现的，

本发明涉及一种基因序列，该序列具有SEQ ID NO.1中从核苷酸第1-1584位所示的核苷酸序列。

根据所述基因序列编码的多肽具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

本发明还涉及一种基因序列，该序列具有SEQ ID NO.3中从核苷酸第1-1584位所示的核苷酸序列。

根据所述基因序列编码的多肽具有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。

本发明根据大豆基因序列数据库，运用生物信息学手段，通过序列比较和电子克隆拼接，设计出合适的引物，用分子克隆的方法，克隆出大豆黄酮合成酶GfnsII-1基因以及大豆黄酮合成酶Gfns II-2基因；经过功能鉴定，确定分离出的是大豆中编码黄酮合成酶的基因。

本发明具有如下的有益效果：利用本发明的大豆黄酮合成酶，可筛选出与大豆黄酮合成酶相关发生相互作用的物质、受体、抑制剂或拮抗剂等，利用本发明可获得在高异黄酮、抗WGE、抗铝毒害、抗UV-B等方面具有重要特性的大豆品种。

本发明涉及的大肠杆菌DH5α已在《萨姆布鲁克J，拉塞尔D W.分子克隆实验指南[M].黄培堂，王嘉玺，朱厚础，等译.第3版.北京：科学出版社，2002》中公开；大肠杆菌DH5α可通过公开市售的商业渠道取得，如上海天根生物公司，公司地址：上海市漕溪路258弄27号航星商务楼1号楼606室。

本发明涉及的农杆菌LBA4404已在《刘志学，张旭，徐亚南，何艺园，马向前，沈大棱，唐克轩.用LBA4404/pCAMBIA系列转化水稻的最佳条件菌株.复旦学报(自然科学版)，1999，38(4)：439-443》中公开；农杆菌LBA4404可以向LifeTechnologies公司购买，Life Technologies公司中国上海代理上海英骏生物技术有限公司地址：上海市的银都路218号。

具体实施方式

下面结合具体的实施例子，进一步阐述本发明的具体实施方式。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等(1989)编著的分子克隆实验手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实验所用的PrimeScript^TM 1st StrandcDNA Synthesis Kit、高保真的Taq酶、pMD18-T载体是大连TaKaRa公司产品。

实施例1

Gfns II-1大豆黄酮合成酶基因的克隆、表达和鉴定

步骤一、Gfns II-1大豆黄酮合成酶基因的克隆

1、大豆组织的处理

使用大豆品种合丰47，该品种来源于黑龙江省农业科学院合江农科所，审定编号：黑审豆2004003。种子经过消毒，接种于MSB5固体培养基上萌发5天，其中MSB5培养基具体为：MS培养基的无机成分(Murashige and Skoog，1962)+B5培养基有机成分(Gamborg et al，1968)；将植株放入加有0.4M葡萄糖的MSB5液体培养基中处理24小时，取根作为提取DNA或RNA的材料。

2、TRIzol法提取根中的总RNA

(1)称取0.5g大豆处理根，用液氮速冻后，迅速研磨成细粉，分装于1.5ml的eppendorf离心管中；

(2)加入1ml TRIzol，用力摇动使混合均匀，25℃，放置5min；

(3)每管加0.2ml氯仿，用力振荡15sec，室温放置2min-3min，4℃，12,000g，离心15min；

(4)将上清液600ul吸入1.5ml的新eppendorf离心管中，加与上清等体积异丙醇，颠倒混匀，-20℃冰箱中放置30min；

(5)4℃，12,000g，离心15min，弃上清，收集RNA沉淀，加1ml 75％(V/V)乙醇洗涤沉淀1-2次，洗涤具体为：加1ml 75％(V/V)乙醇，4℃离心，12000g，10min-15min，弃上清，收集RNA沉淀；

(6)沉淀25℃下干燥15min-20min，溶于30μl-50μl的RNase-free water中；

(7)用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。

3、Gfns II-1大豆黄酮合成酶基因cDNA的克隆

以根中总RNA为模板，用PrimeScript^TM 1st Strand cDNA Synthesis Kit反转录为cDNA，

用上游引物5’-ATGATTTCTGAGTCCCTCTTGTTAG-3’

和下游引物5’-CTACATTTGACGAAAAGGAGTGGG-3’

与高保真的Taq酶PCR得到1600bp左右的片断，连入pMD18-T载体，导入大肠杆菌DH5α，测序验证得到SEQ ID.NO.1，测序结果用GCG软件包(Wisconsingroup，USA)中的BLAST和FASTA软件搜索已有的数据库(Genebank+EMBL)，与已知豆科科植物苜蓿(Medicago truncatula)中FNS II基因同源性很高，具体见表1。酵母表达证实SEQ ID NO.1是大豆黄酮合成酶基因，与已报导的苜蓿(Medicagotruncatula，DQ354373)中FNS II同源度为64％、欧亚甘草(Glycyrrhiza echinata，AB001380)为62％、非洲菊(Gerbera hybrida，AF156976)为65％，金鱼草(Antirrhinum majus，AB028151)为66％，三色堇(Torenia hybrida，AB028152)为65％，翠菊(Callistephus chinensis，AF188612)为66％，紫苏(Perillafrutescens，AB045592)为66％，三花龙胆(Gentiana triflora，AB193314)为65％。

表1 Gfns II-1大豆黄酮合成酶蛋白与苜蓿MtFNS II的核苷酸序列的同源比较表

MtFNS    ------ATGGAACCTCTACTATTGGCCTTCACATTATTTCTTTCATCACTCATTTGCTAC 54

GFNS-1   ATGATTTCTGAGTCCCTCTTGTTAGTATTCC--TCATTGTCTTCATTTCTGCTTCCCTTC 58

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MtFNS    ATAATTTTCCAGCCA-ATTTTAAACCGTCACAAAAACCTCCCT-------CCATCGCCTC 106

GFNS-1   TCAAACTCTTGTTTGTGAGAGAAAACAAACCAAAGGCCCACTTGAAGAACCCACCAAGCC 118

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MtFNS    TATTCAAACTTCCGATCATTGGCCACATGCACATGTTAGGTCCCCTTCTCCACCACTCCT 166

GFNS-1   CACCTGCAATACCCATAATAGGTCATCTCCACCTCCTTAAACCCCTCATCCATCACTCAT 178

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MtFNS    TCGACCGCCTCTCCCAAAAATACGGACCAATATTTTCACTTAACTTTGGTTCCGTCCTCT 226

GFNS-1   TCCGAGACCTCTCTCTCCGATATGGGCCCCTCCTAAGCCTTCGAATTGGTTCCGTTAAGT 238

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MtFNS    GCGTTGTTGCATCCACTCC-TCACTACGCAAAACAAATCCTTCAAATCAACGAACACGCC 285

GFNS-1   TCATAGTTGCAAGCACCCCATCACT-CGCCCAAGAGTTTCTCAAGACCAACGAGCTCACA 297

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MtFNS    TTTAATTGTCGTAATGAATCAACTGCAATTAAACGCCTCACCTAT---GAAGCATCTCTA 342

GFNS-1   TACTCTTCCCGCAAAATGAACATGGCCATCAACATGGTCACTTACCACAACGCCACGTTT 357

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MtFNS    GCTTTTGCACCCTATGGCGAATATTGGAGATTTATTAAAAAACTTAGTATGAATGAGCTT 402

GFNS-1   GCGTTTGCACCTTACGACACTTACTGGAAGTTCATGAAAAAACTAAGCACCACTGAGCTC 417

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MtFNS    TTGGGCTCTCGTAGCATTAGTAGCTTCCAACACTTGCGTTTACAAGAGACTCACAACCTC 462

GFNS-1   TTGGGAAACAAAACCCTCGGACACTTCCTACCTATTCGGACGAGGGAAGTTCATGACATC 477

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MtFNS    CTTAAGCTTTTCGCTGATAAAGCGAAAAACTACGAGGCTGTGAATGTGACACAAGAGTTG 522

GFNS-1   ATTCAATTTTTGTTCCATAAATCAAAGGCCCAAGAGAGCGTGAACCTCACCGAAGCGCTT 537

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MtFNS    CTAAAGTTGTCAAACAACGTCATTTCTAAAATGATGTTGGGGG------------------565

GFNS-1   TTGAGTCTTTCCAACAACGTAATATCGCAGATGATGTTGAGCATTAAGAGCTCCGGTACA 597

          * *   * ** ******** ** **  * ********* *

MtFNS    -------AAGCTGAGGAGGCTAGGGATGTTGTGCGAGATGTGACCGAGATTTTTGGAGAG 618

GFNS-1   GACAGCCAGGCAGAGCAGGCACGGACTTTGGTTCGTGAAGTGACGCAGATTTTCGGGGAG 657

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MtFNS    TTTAATGTATCGGATTTTATTTGGTTGTTTAAGAAACTTGATTTGCAAGGGTTTGGGAAG 678

GFNS-1   TTTAACGTGTCGGATTTCTTAGGTTTCTGCAAAAACTTGGACTTGCAAGGTTTCAGGAAG 717

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MtFNS    AGGATAGAGGATTTGTTTATGAGGTTTGATACATTGGTGGAAAGGATTATTAGTAAAAGA 738

GFNS-1   AGGGCATTGGACATACATAAGAGGTACGATGCTCTGCTAGAGAAGATCATCTCTGATCGT 777

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MtFNS    GAAGAGTTGAGGAAGAACAAAGGAAGGAAAGAAAATAAGGGTGAGCAAGGTGCTGAATTC 798

GFNS-1   GAGGAGTTGAGAAGGAAATCAAAGGTAGATGGCTGTGAAGATGGAGATGATGAGAAAGTG 837

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MtFNS    AGAGACTTTCTTGATATATTGCTTGATTGTGCCGAGGATCAAAATTCAGAAATAAAAGTT 858

GFNS-1   AAGGATTTTCTTGACATTTTGTTGGATGTTGCTGAGCAGAAAGAATGCGAGGTCCAGTTA 897

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MtFNS    CAAAGGGTTCACATCAAGGCCTTGATTATGGATTTCTTTACAGCAGGAACAGACACAACA 918

GFNS-1   ACTCGGAACCATGTCAAATCATTGATCTTGGATTATTTTACGGCAGCTACTGACACAACT 957

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MtFNS    TCAATTTCAACAGAATGGGCATTAGTTGAGCTAATGAACAACCCTTCATTGTTACAAAAA 978

GFNS-1   GCCATATCAGTGGAATGGACAATAGCAGAACTATTTAACAATCCAAAGGTGTTAAAGAAA 1017

          * ** ***   ****** ** ***  ** *** * ***** **     ***** * ***

MtFNS    GCTCGTGAAGAAATAGACAATGTAGTAGGGAAAAACAGACTAGTAGATGAATCTGACGGA 1038

GFNS-1   GCGCAAGAGGAAGTTGATAGAGTCACCGGAAACACGCAATTAGTGTGTGAAGCAGACATT 1077

         ** *  ** *** * ** *  **    ** ** *    * ****   **** * ***

MtFNS    CCAAATCTTCCTTATATTCAAGCCATAATAAAAGAAACATTTCGTCTACACCCACCGGTT 1098

GFNS-1   CCAAACCTTCCTTATATTCATGCCATCATAAAAGAAACAATGAGACTTCACCCGCCAATA 1137

         ***** ************** ***** ************ *  * ** ***** **  *

MtFNS    CCTATGGTCACTAGAAGATGTGTCACGCAATGCAAAATTGAAAATTATGTGATCCCAGAA 1158

GFNS-1   CCAATGATTATGAGGAAAGGAATCGAAGACTGCGTGGTTAATGGAAACATGATTCCAAAA 1197

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MtFNS    AATAGTTTAATCTTTGTGAATAATTGGGCTATGGGAAGAAACTCAGCTTATTGGGACAAA 1218

GFNS-1   GGTTCAATAGTTTGTGTAAACATTTGGGCTATGGGAAGGGACCCAAATATCTGGAAGAAC 1257

           *    ** * * *** ** * ***************  ** **  *   *** * **

MtFNS    CCATTGGAATTTAATCCAGAAAGATTTCTAAAAAATTCAACAAATTCCAATGGGGTTATT 1278

GFNS-1   CCTTTAGAATTCAAGCCAGAGAGGTTTCTAGAAGGTGAAGGAAGT---------GCTATA 1308

         ** ** ***** ** ***** ** ****** **  *  *  ** *         * ***

MtFNS    GATGTGAGGGGGCAAAATTTTCAGATTTTGCCATTTGGGTCAGGAAGAAGGATGTGTCCT 1338

GFNS-1   GATACCAAAGGGCATCATTTTGAGTTGTTGCCATTTGGCAGTGGAAGGAGAGGGTGTCCT 1368

         ***   *  *****  ***** ** ************     ***** **   *******

MtFNS    GGGGTTACTTTAGCAATGCAAGAAGTTCCAGCTTTGCTTGGTGCCATAATTCAATGCTTT 1398

GFNS-1   GGAATGCCTTTGGCCATGCGTGAATTGCCCACCATCATTGGAGCACTCATACAATGCTTT 1428

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MtFNS    GATTTTAATTTTGTGGGTCCTAAGGGTGAGATTTTGAAGGGTGGTGATATTGTTATTGAT 1458

GFNS-1   GAGTGGAAGATGTTAGGTTCACAAGGTGAAATCTTAGATCATGGAAGAAGCTTAATCAGT 1488

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MtFNS    GTGAATGAAAGGCCAGGATTGACTGCTCCTAGGGTGCATGATTTGGTTTGTGTTCCTGTT 1518

GFNS-1   ATGGATGAACGGCCAGGATTGACTGCCCCAAGGGCCAATGATCTTATTGGCATTCCTGTT 1548

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MtFNS    GAAAGGTTTGCTTGTGGTGGACCTCTTCAAAGCCTTGGATGTTGA 1563

GFNS-1   GCACGATTGAATCCCACTCCTTTTCGTCAAA--TGTAG-------1584

         * * * **    *     *     ** *****    * *

GFNS-1： Gfns II-1大豆黄酮合成酶核苷酸序列；

MtFNS：苜蓿FNs II的核苷酸序列(DQ354373)；

“*”表示一致的序列。

步骤二、Gfns II-1大豆黄酮合成酶基因的表达和鉴定

1、GFNSII-1酵母表达载体的构建

用Not I和SnaB I分别酶切GFNS II-1和pPIC9K(购自invitrogen公司)酵母表达载体，按照pPIC9K：GFNSII-1摩尔浓度比为1∶3的比例，用T4连接酶16℃连接过夜，将连接产物导入大肠杆菌DH5α。挑选阳性克隆，提取质粒，用BglII酶切成线性质粒。

2、转化酵母

(1)挑取酵母GS115(购自invitrogen公司)单菌落，接种至含有5ml YPD培养基的50ml三角瓶中，30℃，250r/min-300r/min培养过夜；YPD培养基购自上海生物工程有限公司，内含1％酵母抽提物，2％胰蛋白胨，2％右旋葡萄糖，各百分数均为质量百分比；

(2)取100μl的培养物接种至含有500ml新鲜培养基的2L三角摇瓶中，28℃～30℃，250r/min～300r/min培养过夜，至OD₆₀₀达到1.3～1.5；

(3)将细胞培养物于4℃，1500g离心5min，用500ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；

(4)4℃，1500g离心5min，用250ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；

(5)4℃，1500g离心5min，用20ml的冰预冷的1M的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬；

(6)4℃，1500g离心5min，用1ml的冰预冷的1M的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为1.5ml；

(7)将5μg～20μg的用Bgl II酶切成线性质粒的溶解在5μl～10μl TE溶液中，与80μl感受态的酵母混匀，转至0.2cm冰预冷的电转化杯中；

(8)将电转化杯冰浴5min；

(9)电击完毕后，加入1ml冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀，转至1.5ml的灭菌管中；

(10)将菌体悬液涂布于MD平板上，该MD平板具体为：0.34％酵母基础氮源培养基，1％的硫酸铵，0.00004％生物素，2％葡萄糖，2％琼脂，各百分数均为质量百分比；每200μl～600μl涂布一块平板；

(11)将平板置于30℃培养，直至单个菌落出现。

3、GFNS II-1在酵母中表达

(1)挑选阳性菌落，置于装有25ml MGY培养基的250ml摇瓶中，于28℃-30℃，250rpm-300rpm培养至OD600为2-6；其中MGY培养基为：0.34％酵母基础氮源培养基，1％的硫酸铵，1％甘油，0.00004％生物素，各百分数均为质量百分比；

(2)室温下，1500g～3000g离心5min，收集菌体，用MM溶液重悬菌体，加入100ml～200mlMM溶液，其中MM溶液中含质量分数为0.34％酵母基础氮源培养基，质量分数为1％的硫酸铵，质量分数为0.00004％的生物素，体积分数为0.5％的甲醇，使菌体OD₆₀₀＝1.0；

(3)将重悬菌体置于1L的摇瓶中，用双层纱布或粗棉布封口，放置于28℃-30℃，250rpm～300rpm的摇床上继续生长；

(4)每24h向培养基中添加纯甲醇至甲醇终体积分数为0.5％～1.0％；

(5)按0、6、12、24、36、48、60、72、84和96h时间点分别取菌液样品，取样量为1ml，置于1.5mlEP管中，16,000g离心2min～3min，分别收集上清和菌体，分析GFNSII-1的表达量；

(6)测定GFNS II-1的酶活性(Martens S.and Forkmann G.Genetic controlof flavone synthase II activity in flowers of Gerbera hybrids.Phytochemistry，1998，49(7)：1953-1958.非洲菊中控制黄酮合成酶II的基因.植物化学，1998年，49卷第七期，1953-1958页)，表明GFNS II-1具有完全黄酮合成酶活性。

实施例2

Gfns II-2大豆黄酮合成酶基因的克隆、表达和鉴定

大豆组织的处理、TRIzol法提取根中的总RNA实施例1中相同。

步骤一，Gfns II-2基因cDNA的克隆

以根中总RNA为模板，用PrimeScript^TM 1st Strand cDNA Synthesis Kit反转录为cDNA。用正向引物5’-ATGATATCTGAGTCCCTCTTGTTAG-3’和反向引物5’-CTACACTTGAGGAAAAGAGGTGGG-3’所列的引物与高保真的Taq酶PCR得到1600bp左右的片断，连入pMD18-T载体，导入大肠杆菌DH5α。测序验证得到SEQ ID NO.2，测序结果用GCG软件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA软件搜索已有的数据库(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及编码蛋白与已知豆科科植物苜蓿(Medicago truncatula)中FNS II基因同源性很高，具体见表2。酵母表达证实SEQ ID NO.2是大豆黄酮合成酶基因，与已知的苜蓿(Medicagotruncatula，DQ354373)中FNS II同源度为63％、欧亚甘草(Glycyrrhiza echinata，AB001380)为59％、非洲菊(Gerbera hybrida，AF156976)为66％、金鱼草(Antirrhinum majus，AB028151)为65％，三色堇(Torenia hybrida，AB028152)为65％，翠菊(Callistephus chinensis，AF188612)为66％，紫苏(Perillafrutescens，AB045592)为67％，三花龙胆(Gentiana triflora，AB193314)为65％。

表2Gfns II-2大豆黄酮合成酶蛋白与苜蓿MtFNS II的核苷酸序列同源比较表

MtFNS    ------ATGGAACCTCTACTATTGGCCTTCA-CATTATTTCTTTCATCACTCATTTGCT- 52

GFNS-2   ATGATATCTGAGTCCCTCTTGTTAGTATTCCTCATTGTCTTCATTTCTGCTTCCCTTCTC 60

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MtFNS    --ACATAATTTTCCAGCCAATTTTAAACCG-----TCACAAAAACCTCCCTCCATCGCCT 105

GFNS-2   AAACTCTTGTTTGTGAGAAAAAACAAACCAAAGGCTCACTTGAAGTACCCTCCAAGCCCC 120

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MtFNS    CTATTCAAACTTCCGATCATTGGCCACATGCACATGTTAGGTCCCCTTCTCCACCACTCC 165

GFNS-2   CCAGCAATAC---CCATAATAGGTCATCTCCACCTCCTTAAACCACTCATCCATCACTCA 177

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MtFNS    TTCGACCGCCTCTCCCAAAAATACGGACCAATATTTTCACTTAACTTTGGTTCCGTCCTC 225

GFNS-2   TTCCGAGACCTTTCTCTCCGATATGGGCCCCTCCTAAGCCTTCGAATTGGTTCCGTTAAG 237

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MtFNS    TGCGTTGTTGCATCCACTCC-TCACTACGCAAAACAAATCCTTCAAATCAACGAACACGC 284

GFNS-2   TTCATAGTTGCAAGCACCCCATCACT-CGCCAAAGAGTTTCTCAAGACCAACGAGCTCAC 296

         * * * ******  *** ** ***** *** *** *  * **  * * ****** * * *

MtFNS    CTTTAATTGTCGTAATGAATCAACTGCAATTAAACGCCTCACCTAT---GAAGCATCTCT 341

GFNS-2   ATACTCTTCCCGCAAAATGAACATGGCCATCAACACGGTCACCTACCACAACGCCACTTT 356

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MtFNS    AGCTTTTGCACCCTATGGCGAATATTGGAGATTTATTAAAAAACTTAGTATGAATGAGCT 401

GFNS-2   CGCGTTTGCACCTTACGACACTTACTGGAAGTTCATGAAAAAACTAAGCACCACTGAGCT 416

          ** ******** ** * *   ** ****  ** ** ******** ** *  * ******

MtFNS    TTTGGGCTCTCGTAGCATTAGTAGCTTCCAACACTTGCGTTTACAAGAGACTCACAACCT 461

GFNS-2   CTTGGGAAACAAAACCCTCGGACACTTCCTACCTATTCGAACTCAGGAAGTTCATGACTT 476

          *****       * * *  *   ***** **   * **    ** **   ***  ** *

MtFNS    CCTTAAGCTTTTCGCTGATAAAGCGAAAAACTACGAGGCTGTGAATGTGACACAAGAGTT 521

GFNS-2   TATTCAAATTTTGTTCCATAAATCAAAGGCCCAAGAGAGCGTGAACCTCACCGAAGCGCT 536

           ** *  ****     ***** * **   * * ***   *****  *  ** *** * *

MtFNS    GCTAAAGTTGTCAAACAACGTCATTTCTAAAATGATGTTGGG-------------GGAA- 567

GFNS-2   TTTGAGGCTTTCCAACAACGTCATATCGCGGATGATGTTGAGCATTAAGAGCTCCGGAAC 596

           * * * * ** *********** **    ********* *             ****

MtFNS    ----------GCTGAGGAGGCTAGGGATGTTGTGCGAGATGTGACCGAGATTTTTGGAGA 617

GFNS-2   TGATAGTCAGGCAGAGCAGGCACGGGCTTTGGTTCGTGAAGTGACGCGGATTTTCGGGGA 656

                   ** *** ****  *** * * ** ** ** *****   ****** ** **

MtFNS    GTTTAATGTATCGGATTTTATTTGGTTGTTTAAGAAACTTGATTTGCAAGGGTTTGGGAA 677

GFNS-2   GTTTAACGTGTCGGATTTCTTAGGGTTTTGCAAAAACATGGACTTGCAAAGTTTCAGGAA 716

         ****** ** ********  *  **** *  ** **  * ** ****** * **  ****

MtFNS    GAGGATAGAGGATTTGTTTATGAGGTTTGATACATTGGTGGAAAGGATTATTAGTAAAAG 737

GFNS-2   GAGGGCATTGGACATACATAAGAGGTACGATGCTCTGCTAGAGAAGATCATCTCTGATCG 776

         ****  *  ***  *   ** *****  *** *  ** * ** * *** **   * *  *

MtFNS    AGAAGAGTTGAGGAAGAACAAAGGAAGGAAAGAAAATAAGGGTGAGCAAGGTGCTGAATT 797

GFNS-2   TGAGGAGTTGAGAAGGAAATCAAAGGAAGAGGGTTGTGAAGATGGAGGTGATGAGAAAGT 836

          ** ******** * ***   *       * *    * * * **     * **   ** *

MtFNS    CAGAGACTTTCTTGATATATTGCTTGATTGTGCCGAGGATCAAAATTCAGAAATAAAAGT 857

GFNS-2   TAAGGATTTTCTTGACATTTTGCTGGATGTTTCTGAGCAGAAAGAATGCGAGGTCCAGTT 896

          *  ** ******** ** ***** *** *  * *** *  ** * *  **  *  *  *

MtFNS    TCAAAGGGTTCACATCAAGGCCTTGATTATGGATTTCTTTACAGCAGGAACAGACACAAC 917

GFNS-2   AACTCGGAACCATGTCAAATCATTGATCTTGGATTATTTTACGGCAGCTACTGACACAAC 956

              **   **  ****  * *****  ******  ***** ****  ** ********

MtFNS    ATCAATTTCAACAGAATGGGCATTAGTTGAGCTAATGAACAACCCTTCATTGTTACAAAA 977

GFNS-2   TGCCATATCAGTGGAATGGACAATAGCAGAACTATTCAACAATCCAAAGGTGTTGAAGAA 1016

           * ** ***   ****** ** ***  ** *** * ***** **     **** *  **

MtFNS    AGCTCGTGAAGAAATAGACAATGTAGTAGGGAAAAACAGACTAGTAGATGAATCTGACGG 1037

GFNS-2   AGCTCAAGAGGAGGTAGAGAAAGTCACCGGAAACAAGCGATTAGTGTGTGAAGCAGACAT 1076

         *****  ** **  **** ** **    ** ** **  ** ****   **** * ***

MtFNS    ACCAAATCTTCCTTATATTCAAGCCATAATAAAAGAAACATTTCGTCTACACCCACCGGT 1097

GFNS-2   TTCAAACCTCCCTTATATTCATGCCATCATTAAAGAAACAATGAGACTTCACCCGCCAAT 1136

           **** ** *********** ***** ** ********* *  * ** ***** **  *

MtFNS    TCCTATGGTCACTAGAAGATGTGTCACGCAATGCAAAATTGAAAATTATGTGATCCCAGA 1157

GFNS-2   ACCAATGATTACGAGGAAAGGAATCGAAGACTGCGTGGTTAATGGAAACATGATTCCAAA 1196

          ** *** * ** ** * * *  **    * ***    ** *     *  **** *** *

MtFNS    AAATAGTTTAATCTTTGTGAATAATTGGGCTATGGGAAGAAACTCAGCTTATTGGGACAA 1217

GFNS-2   AGGTTCAATAGTTTGCGTAAACATTTGGGCTATGGGGAGGGACCCAAATATCTGGAAGAA 1256

         *  *    ** * *  ** ** * ************ **  ** **  *   *** * **

MtFNS    ACCATTGGAATTTAATCCAGAAAGATTTCTAAAAAATTCAACAAATTCCAATGGGGTTAT 1277

GFNS-2   CCCTTTAGAATTCATGCCAGAGAGGTTTCTAGAAGGTGAAGGAAGT---------GCTAT 1307

          ** ** ***** *  ***** ** ****** **  *  *  ** *         * ***

MtFNS    TGATGTGAGGGGGCAAAATTTTCAGATTTTGCCATTTGGGTCAGGAAGAAGGATGTGTCC 1337

GFNS-2   AGATACCAAAGGGCATCATTTTGAGTTGTTGCCATTTGGTAGTGGAAGGAGAGGGTGTCC 1367

          ***   *  *****  ***** ** * ***********    ***** **   ******

MtFNS    TGGGGTTACTTTAGCAATGCAAGAAGTTCCAGCTTTGCTTGGTGCCATAATTCAATGCTT 1397

GFNS-2   TGGAATGCCTTTGGCCATGCGTGAATTGCCCACTTTCATTGGAGCACTCATACTGTGTTT 1427

         ***  *  **** ** ****  *** * **  ****  **** **  * ** *  ** **

MtFNS    TGATTTTAATTTTGTGGGTCCTAAGGGTGAGATTTTGAAGGGTGGTGATATTGTTATTGA 1457

GFNS-2   TGAGTGGAAGATGTTTGGTTCACAAGGTGAAATCTTAGACCACGGAAAAAGTTTAATCAA 1487

         *** *  **  *  * *** *  * ***** ** **  *    **  * * * * **  *

MtFNS    TGTGAATGAAAGGCCAGGATTGACTGCTCCTAGGGTGCATGATTTGGTTTGTGTTCCTGT 1517

GFNS-2   CATGGATGAACGACCAGGATTGACTGCTCCAAGGGCCAATGATCTTATTGGCATTCCTGT 1547

           ** ***** * ***************** ****   ***** *  ** *  *******

MtFNS    TGAAAGGTTTGCTTGTGGTGGACCTCTTCAAAGCCTTGGATGTTGA 1563

GFNS-2   TGCACGATTGAATCCC-----ACCTCTTTT---CCTCAAGTGTAG-1584

         ** * * **   *        *******     ***    *** *

GFNS-2：Gfns II-2大豆黄酮合成酶核苷酸序列；

MtFNS：苜蓿fns II的核苷酸序列(DQ354373)；

“*”表示一致的序列

步骤二、GFNS II-2黄酮合成酶表达和鉴定

1、GFNSII-2酵母表达载体的构建

用Not I和SnaB I分别酶切GFNS II-2和pPIC9K(购自invitrogen公司)酵母表达载体，按照pPIC9K：GFNS II-1摩尔浓度比1∶3的比例，用T4连接酶16℃连接过夜，将连接产物导入大肠杆菌DH5α中。挑选阳性克隆，提取质粒，用BglII酶切成线性质粒。

2、转化酵母

转化方法与实施例1相同。

3、GFNS II-2在酵母中表达

(1)挑选阳性菌落，置于装有25ml MGY培养基的250ml摇瓶中，于28℃-30℃，250rpm-300rpm培养至OD₆₀₀为2-6；

(2)室温下1500g～3000g离心5min，收集菌体，用MM重悬菌体，加入100～200mlMM溶液，使OD₆₀₀＝1.0；

(3)将重悬菌体置于1L的摇瓶中，用双层纱布或粗棉布封口，放置于28℃-30℃，250rpm～300rpm的摇床上继续生长；

(4)每24h向培养基中添加纯甲醇至甲醇终体积分数为0.5％～1.0％；

(5)按0、6、12、24、36、48、60、72、84和96h时间点分别取菌液样品，取样量为1ml，置于1.5mlEP管中，16，000g离心2min～3min，分别收集上清和菌体，分析GFNS II-2的表达量；

(6)测定GFNS II-2的酶活性(Martens S.and Forkmann G.Genetic controlof flavone synthase II activity in flowers of Gerbera hybrids.Phytochemistry，1998，49(7)：1953-1958.非洲菊中控制黄酮合成酶II的基因.植物化学，1998年，49卷第七期，1953-1958页)，表明GFNS II-2具有完全黄酮合成酶活性。

实施例3

Gfns II-1与Gfns II-2基因RNAi植物表达载体的构建与功能鉴定

步骤一，Gfns II-1与Gfns II-2基因RNAi植物表达载体的构建

鉴于Gfns II-1与Gfns II-2基因的高度同源性，取两基因序列近3’端完全相同的约300bp作为构建RNAi植物表达载体的目的片断。设计扩增出目的片断的引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点，具体视选用的载体而定，以便构建表达载体。以实施例1中获得的Gfns II-1为模板，构建RNAi载体只要其中一个基因为模板就可以。经PCR扩增及酶切后，以正反不同方向连接在含有CaMV35S启动子与nos终止子的pHannibal质粒上，中间以一段内含子片断隔开，此为RNAi表达载体。为了使载体能够在植物中转化表达，再将构建好的RNAi载体上的CaMV35S启动子、正义片断、内含子、反义片断、终止子一起切下，连接到经pCAMBIA1304+pBI121质粒上。得到的最终产物经过序列分析及酶切验证即为所需的RNAi植物表达载体，导入到农杆菌LBA4404，可用于植物转化分析。

步骤二，转化大豆品种合丰47

(1)大豆种子经过消毒，放在MSB5培养基上萌发5天，MSB5培养基具体为：MS大量成分(Murashige and Skoog，1962)+B5微量成分(Gamborg et al，1968)，含0.4mg/L 6-BA(6-苄氨基嘌呤)，pH值为5.8；去顶芽并制造伤口，得到外植体，放在含有10mg/L的6-BA和0.2mg/L的IBA，PH为5.8的MSB5培养基预培养一天；

(2)无菌条件下，用含有构建的Gfns II基因RNAi植物表达载体的农杆菌LBA4404感染大豆品种合丰47，时间为10分钟～20分钟，感染时菌浓度为OD₆₀₀≈0.5，放在MSB5+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.2mg/L培养基上共培养3天，该培养基的pH为5.8；取出放在MSB5+6-BA 0.5mg/L+IBA 0.1mg/L+头孢霉素300mg/L+羧苄青霉素300mg/L培养基上除菌2周，该培养基的pH为5.8；

(3)除菌后的外植体放在MSB5+卡那霉素80mg/L培养基上，该培养基的pH为5.8；每2周转接一次，进行筛选至出现不定芽。伸长到1cm～2cm时切除子叶，至伸长到3～4cm；

(4)切下外植体上的不定芽并放在1/2MSB5+卡那霉素50mg/L培养基上，该培养基的pH为5.8；进行转化芽诱导生根15～20天，移栽到大盆直至获得转化植株产生的种子；

(5)收获T2代种子，进行分析

步骤三，Gfns II基因RNAi植物表达载体的功能鉴定

根据Northern blot和RealTime PCR分析结果证明，转基因植株Gfns II基因转录水平表达量显著减弱，干扰效率对照非转基因植株平均达到95％以上。在HPLC分析中，转基因植株在三羟基异黄酮与总黄酮(黄豆甙原+豆素+羟基异黄酮)含量上高于对照非转基因植株15％-25％。

豆科植物中已发现的植保素到目前为止有102种，主要是类异黄酮的衍生物，用低浓度的异黄酮类植保素-大豆素处理大豆疫霉根腐病菌的菌丝，发现它可以抑制固体培养基中的菌丝的辐射生长；鉴于植物最主要的一种方式是依赖于植物叶片中广泛存在的类黄酮化合物，可以吸收280nm-315nm波长的辐射，起着“UV过滤器”的作用，可以保护植物体器官，尤其是光合作用组织免受或少受辐射伤害。鉴于类黄酮在玉米抗铝中毒中有特定的作用，耐铝毒害玉米品种在铝诱导条件下，可在10mm根尖处分泌类黄酮化合物儿茶精与槲皮素；铝敏感品种的根大量分泌五羟基黄酮与儿茶素等类黄酮化合物，并以固定比例与铝结合。

通过Gfns II-1与Gfns II-2基因RNAi，可进一步对转基因植株Gfns II基因进行抗大豆疫霉根腐病、抗铝毒害、抗UV-B等方面的鉴定。在接种大豆疫霉根腐病黑龙江省流行的15号优势生理小种条件下，转基因植株根系正常，非转基因植株根腐病严重，植株生长缓慢，最后枯萎而死；在铝毒害50μmol/L Al³⁺胁迫24h条件下，耐铝毒害转基因品种在铝诱导条件下，可在10mm根尖处分泌类黄酮化合物儿茶精与槲皮素，非转基因植株生长缓慢，最后枯萎而死，转基因植物依然能正常生长；在紫外线辐射UV-B(280nm-315nm)条件下，突变体光合作用效率明显下降，而野生型则保持正常。转基因植株接种大豆疫霉根腐病；铝毒害和紫外线辐射的逆境条件下明显表现出比对照未转基因植株生长正常。这都证明Gfns II基因具有有效的和广泛的抗逆境的功能，将可用于利用转基因技术改良大豆疫霉根腐病、抗铝毒害、抗UV-B的研究和产业化生产中。

序列表

<110>上海交通大学

<120>黄酮合成酶基因及其编码的多肽

<160>4

<170>PatentIn version 2.1

<210>1

<211>1584

<212>DNA

<213>大豆(Glycine max(L.)Merr.)

<220>

<221>CDS

<222>(1)…(1584)

<400>1

atgatttctg agtccctctt gttagtattc ctcattgtct tcatttctgc ttcccttctc  60

aaactcttgt ttgtgagaga aaacaaacca aaggcccact tgaagaaccc accaagccca  120

cctgcaatac ccataatagg tcatctccac ctccttaaac ccctcatcca tcactcattc  180

cgagacctct ctctccgata tgggcccctc ctaagccttc gaattggttc cgttaagttc  240

atagttgcaa gcaccccatc actcgcccaa gagtttctca agaccaacga gctcacatac  300

tcttcccgca aaatgaacat ggccatcaac atggtcactt accacaacgc cacgtttgcg  360

tttgcacctt acgacactta ctggaagttc atgaaaaaac taagcaccac tgagctcttg  420

ggaaacaaaa ccctcggaca cttcctacct attcggacga gggaagttca tgacatcatt  480

caatttttgt tccataaatc aaaggcccaa gagagcgtga acctcaccga agcgcttttg  540

agtctttcca acaacgtaat atcgcagatg atgttgagca ttaagagctc cggtacagac  600

agccaggcag agcaggcacg gactttggtt cgtgaagtga cgcagatttt cggggagttt  660

aacgtgtcgg atttcttagg tttctgcaaa aacttggact tgcaaggttt caggaagagg  720

gcattggaca tacataagag gtacgatgct ctgctagaga agatcatctc tgatcgtgag  780

gagttgagaa ggaaatcaaa ggtagatggc tgtgaagatg gagatgatga gaaagtgaag  840

gattttcttg acattttgtt ggatgttgct gagcagaaag aatgcgaggt ccagttaact  900

cggaaccatg tcaaatcatt gatcttggat tattttacgg cagctactga cacaactgcc  960

atatcagtgg aatggacaat agcagaacta tttaacaatc caaaggtgtt aaagaaagcg  1020

caagaggaag ttgatagagt caccggaaac acgcaattag tgtgtgaagc agacattcca  1080

aaccttcctt atattcatgc catcataaaa gaaacaatga gacttcaccc gccaatacca  1140

atgattatga ggaaaggaat cgaagactgc gtggttaatg gaaacatgat tccaaaaggt  1200

tcaatagttt gtgtaaacat ttgggctatg ggaagggacc caaatatctg gaagaaccct  1260

ttagaattca agccagagag gtttctagaa ggtgaaggaa gtgctataga taccaaaggg  1320

catcattttg agttgttgcc atttggcagt ggaaggagag ggtgtcctgg aatgcctttg  1380

gccatgcgtg aattgcccac catcattgga gcactcatac aatgctttga gtggaagatg  1440

ttaggttcac aaggtgaaat cttagatcat ggaagaagct taatcagtat ggatgaacgg  1500

ccaggattga ctgccccaag ggccaatgat cttattggca ttcctgttgc acgattgaat  1560

cccactcctt ttcgtcaaat gtag                                         1584

<210>2

<211>527

<212>PRT

<213>大豆(Glycine max(L.)Merr.)

<400>2

Met Ile Ser Glu Ser Leu Leu Leu Val Phe Leu Ile Val Phe Ile

1 5 10 15

Ser Ala Ser Leu LeuL ys Leu Leu Phe Val Arg Glu Asn Lys Pro

20 25 30

Lys Ala His Leu Lys Asn Pro Pro Ser Pro Pro Ala Ile Pro Ile

35 40 45

Ile Gly His Leu His Leu Leu Lys Pro Leu Ile His His Ser Phe

50 55 60

Arg Asp Leu Ser Leu Arg Tyr Gly Pro Leu Leu Ser Leu Arg Ile

65 70 75

Gly Ser Val Lys Phe Ile Val Ala Ser Thr Pro Ser Leu Ala Gln

80 85 90

Glu Phe Leu Lys Thr Asn Glu Leu Thr Tyr Ser Ser Arg Lys Met

95 100 105

Asn Met Ala Ile Asn Met Val Thr Tyr His Asn Ala Thr Phe Ala

110 115 120

Phe Ala Pro Tyr Asp Thr Tyr Trp Lys Phe Met Lys Lys Leu Ser

125 130 135

Thr Thr Glu Leu Leu Gly Asn Lys Thr Leu Gly His Phe Leu Pro

140 145 150

Ile Arg Thr Arg Glu Val His Asp Ile Ile Gln Phe Leu Phe His

155 160 165

Lys Ser Lys Ala Gln Glu Ser Val Asn Leu Thr Glu Ala Leu Leu

170 175 180

Ser Leu Ser Asn Asn Val Ile Ser Gln Met Met Leu SerIle Lys

185 190 195

Ser Ser Gly Thr Asp Ser Gln Ala Glu Gln Ala Arg Thr Leu Val

200 205 210

Arg Glu Val Thr Gln Ile Phe Gly Glu Phe Asn Val Ser Asp Phe

215 220 225

Leu Gly Phe  Cys Lys Asn Leu Asp Leu Gln Gly Phe Arg Lys Arg

230 235 240

Ala Leu Asp Ile His Lys Arg Tyr Asp Ala Leu Leu Glu Lys Ile

245 250 255

Ile Ser Asp Arg Glu Glu Leu Arg Arg Lys Ser Lys Val Asp Gly

260 265 270

Cys Glu Asp Gly Asp Asp Glu Lys Val Lys Asp Phe Leu Asp Ile

275 280 285

Leu Leu Asp Val Ala Glu Gln Lys Glu Cys Glu Val Gln Leu Thr

290 295 300

Arg Asn His Val Lys Ser Leu Ile Leu Asp Tyr Phe Thr Ala Ala

305 310 315

Thr Asp Thr Thr Ala Ile Ser Val Glu Trp Thr Ile Ala Glu Leu

320 325 330

Phe Asn Asn Pro Lys Val Leu Lys Lys Ala Gln Glu Glu Val Asp

335 340 345

Arg Val Thr Gly Asn Thr Gln Leu Val Cys Glu Ala Asp Ile Pro

350 355 360

Asn Leu Pro Tyr Ile His Ala Ile Ile Lys Glu Thr Met Arg Leu

365 370 375

His Pro Pro Ile Pro Met Ile Met Arg Lys Gly Ile Glu Asp Cys

380 385 390

Val Val Asn Gly Asn Met Ile Pro Lys Gly Ser Ile Val Cys Val

395 400 405

Asn Ile Trp Ala Met Gly Arg Asp Pro Asn Ile Trp Lys Asn Pro

410 415 420

Leu Glu Phe Lys Pro Glu Arg Phe Leu Glu Gly Glu Gly Ser Ala

425 430 435

Ile Asp Thr Lys Gly His His Phe Glu Leu Leu Pro Phe Gly Ser

440 445 450

Gly Arg Arg Gly Cys Pro Gly Met Pro Leu Ala Met Arg Glu Leu

455 460 465

Pro Thr Ile Ile Gly Ala Leu Ile Gln Cys Phe Glu Trp Lys Met

470 475 480

Leu Gly Ser Gln Gly Glu Ile Leu Asp His Gly Arg Ser Leu Ile

485 490 495

Ser Met Asp Glu Arg Pro Gly Leu Thr Ala Pro Arg Ala Asn Asp

500 505 510

Leu Ile Gly Ile Pro Val Ala Arg Leu Asn Pro Thr Pro Phe Arg

515 520 525

Gln Met

527

<110>上海交通大学

<120>黄酮合成酶基因及其编码的多肽

<160>4

<170>PatentIn version 3.1

<210>3

<211>1584

<212>DNA

<213>大(Glycine max(L.)Merr.)

<220>

<221>CDS

<222>(1)…(1584)

<400>3

atgatatctg agtccctctt gttagtattc ctcattgtct tcatttctgc ttcccttctc  60

aaactcttgt ttgtgagaaa aaacaaacca aaggctcact tgaagtaccc tccaagcccc  120

ccagcaatac ccataatagg tcatctccac ctccttaaac cactcatcca tcactcattc  180

cgagaccttt ctctccgata tgggcccctc ctaagccttc gaattggttc cgttaagttc  240

atagttgcaa gcaccccatc actcgccaaa gagtttctca agaccaacga gctcacatac  300

tcttcccgca aaatgaacat ggccatcaac acggtcacct accacaacgc cactttcgcg  360

tttgcacctt acgacactta ctggaagttc atgaaaaaac taagcaccac tgagctcttg  420

ggaaacaaaa ccctcggaca cttcctacct attcgaactc aggaagttca tgactttatt  480

caaattttgt tccataaatc aaaggcccaa gagagcgtga acctcaccga agcgcttttg  540

aggctttcca acaacgtcat atcgcggatg atgttgagca ttaagagctc cggaactgat  600

agtcaggcag agcaggcacg ggctttggtt cgtgaagtga cgcggatttt cggggagttt  660

aacgtgtcgg atttcttagg gttttgcaaa aacatggact tgcaaagttt caggaagagg  720

gcattggaca tacataagag gtacgatgct ctgctagaga agatcatctc tgatcgtgag  780

gagttgagaa ggaaatcaaa ggaagagggt tgtgaagatg gaggtgatga gaaagttaag  840

gattttcttg acattttgct ggatgtttct gagcagaaag aatgcgaggt ccagttaact  900

cggaaccatg tcaaatcatt gatcttggat tattttacgg cagctactga cacaactgcc  960

atatcagtgg aatggacaat agcagaacta ttcaacaatc caaaggtgtt gaagaaagct  1020

caagaggagg tagagaaagt caccggaaac aagcgattag tgtgtgaagc agacatttca  1080

aacctccctt atattcatgc catcattaaa gaaacaatga gacttcaccc gccaatacca  1140

atgattacga ggaaaggaat cgaagactgc gtggttaatg gaaacatgat tccaaaaggt  1200

tcaatagttt gcgtaaacat ttgggctatg gggagggacc caaatatctg gaagaaccct  1260

ttagaattca tgccagagag gtttctagaa ggtgaaggaa gtgctataga taccaaaggg  1320

catcattttg agttgttgcc atttggtagt ggaaggagag ggtgtcctgg aatgcctttg  1380

gccatgcgtg aattgcccac tttcattgga gcactcatac tgtgttttga gtggaagatg  1440

tttggttcac aaggtgaaat cttagaccac ggaaaaagtt taatcaacat ggatgaacga  1500

ccaggattga ctgctccaag ggccaatgat cttattggca ttcctgttgc acgattgaat  1560

cccacctctt ttcctcaagt gtag                                         1584

<210>4

<211>527

<212>PRT

<213>大豆(Glycine max(L.)Merr.)

<400>4

Met Ile Ser Glu Ser Leu Leu Leu Val Phe Leu Ile Val Phe Ile

1 5 10 15

Ser Ala Ser Leu Leu Lys Leu Leu Phe Val Arg Lys Asn Lys Pro

15 20 30

Lys Ala His Leu Lys Tyr Pro Pro Ser Pro Pro Ala Ile Pro Ile

35 40 45

Ile Gly His Leu His Leu Leu Lys Pro Leu Ile His His Ser Phe

50 55 60

Arg Asp Leu Ser Leu Arg Tyr Gly Pro Leu Leu Ser Leu Arg Ile

65 70 75

Gly Ser Val Lys PheIle Val Ala Ser Thr Pro Ser Leu Ala Lys

80 85 90

Glu Phe Leu Lys Thr Asn Glu Leu Thr Tyr Ser Ser Arg Lys Met

95 100 105

Asn Met Ala Ile Asn Thr Val Thr Tyr His Asn Ala Thr Phe Ala

110 115 120

Phe Ala Pro Tyr Asp Thr Tyr Trp Lys Phe Met Lys Lys Leu Ser

125 130 135

Thr Thr Glu Leu Leu Gly Asn Lys Thr Leu Gly His Phe Leu Pro

140 145 150

Ile Arg Thr Gln Glu Val His Asp Phe Ile GlnIle Leu Phe His

155 160 165

Lys Ser Lys Ala Gln Glu Ser Val Asn Leu Thr Glu A1a Leu Leu

170 175 180

Arg Leu Ser Asn Asn Val Ile Ser Arg Met Met Leu SerIle Lys

185 190 195

Ser Ser Gly Thr Asp Ser Gln Ala Glu Gln Ala Arg Ala Leu Val

200 205 210

Arg Glu Val Thr Arg Ile Phe Gly Glu Phe Asn Val Ser Asp Phe

215 220 225

Leu Gly Phe Cys Lys Asn Met Asp Leu Gln Ser Phe Arg Lys Arg

230 235 240

Ala Leu Asp Ile His Lys Arg Tyr Asp Ala Leu Leu Glu Lys Ile

245 250 255

Ile Ser Asp Arg Glu Glu Leu Arg Arg Lys Ser Lys Glu Glu Gly

260 265 270

Cys Glu Asp Gly Gly Asp Glu Lys Val Lys Asp Phe Leu Asp Ile

275 280 285

Leu Leu Asp Val Ser Glu Gln Lys Glu Cys Glu Val Gln Leu Thr

209 295 300

Arg Asn His Val Lys Ser Leu Ile Leu Asp Tyr Phe Thr Ala Ala

305 310 315

Thr Asp Thr Thr Ala Ile Ser Val Glu Trp Thr Ile Ala Glu Leu

320 325 330

Phe Asn Asn Pro Lys Val Leu Lys Lys Ala Gln Glu Glu Val Glu

335 340 345

Lys Val Thr Gly Asn Lys Arg Leu Val Cys Glu Ala Asp Ile Ser

350 355 360

Asn Leu Pro Tyr Ile His Ala Ile Ile Lys Glu Thr Met Arg Leu

365 370 375

His Pro Pro Ile Pro Met Ile Thr Arg Lys Gly Ile Glu Asp Cys

380 385 390

Val Val Asn Gly Asn Met Ile Pro Lys Gly Ser Ile Val Cys Val

395 400 405

Asn Ile Trp Ala Met Gly Arg Asp Pro Asn Ile Trp Lys Asn Pro

410 415 420

Leu Glu Phe Met Pro Glu Arg Phe Leu Glu Gly Glu Gly Ser Ala

425 430 435

Ile Asp Thr Lys Gly His His Phe Glu Leu Leu Pro Phe Gly Ser

440 445 450

Gly Arg Arg Gly Cys Pro Gly Met Pro Leu Ala Met Arg Glu Leu

455 460 465

Pro Thr Phe Ile Gly Ala Leu Ile Leu Cys Phe Glu Trp Lys Met

470 475 480

Phe Gly Ser Gln Gly Glu Ile Leu Asp His Gly Lys Ser Leu Ile

485 490 495

Asn Met Asp Glu Arg Pro Gly Leu Thr Ala Pro Arg Ala Asn Asp

500 505 510

Leu Ile Gly Ile Pro Val Ala Arg Leu Asn Pro Thr Ser Phe Pro

515 520 525

Gln Val

527

Claims (4)

1、一种黄酮合成酶基因，其特征在于，该序列具有SEQ ID NO.1中从核苷酸第1-1584位所示的核苷酸序列。

2、一种根据权利要求1所述的黄酮合成酶基因编码的多肽，其特征是，具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

3、一种黄酮合成酶基因，其特征在于，该序列具有SEQ ID NO.3中从核苷酸第1-1584位所示的核苷酸序列。

4、一种根据权利要求3所述的黄酮合成酶基因编码的多肽，其特征是，所述基因序列编码具有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。