CN105255942B - 一种利用基因工程培育高异黄酮抗草甘膦大豆的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种利用基因工程培育高异黄酮抗草甘膦大豆的方法，包括以下步骤：步骤一、克隆TpIFS基因片段；步骤二、克隆EPSPS基因片段；步骤三、共转化TpIFS基因片段和EPSPS基因片段到大豆中，得到高异黄酮抗草甘膦大豆；该TpIFS基因片段是异黄酮合成酶基因片段，来自红三叶；该EPSPS基因片段是5‑烯醇丙酮酰莽草酸‑3‑磷酸合成酶基因片段。在非转化对照大豆中异黄酮含量为5.1mg/g干重时，本发明得到的基因工程大豆植株中成熟籽粒异黄酮含量最高14.18mg/g干重，其含量是非转化对照大豆含量的2.78倍。本发明的方法对于提高大豆异黄酮含量具有重要意义。

Description

一种利用基因工程培育高异黄酮抗草甘膦大豆的方法

技术领域

本发明涉及利用基因工程培养植物领域，具体是一种利用基因工程培育高异黄酮抗草甘膦大豆的方法。

背景技术

大豆(Glycine max)属于豆科、蝶形花亚科、大豆属的二倍体(2n＝40)植物，在世界各国广泛种植，是世界上重要的粮食作物和经济作物，也是食用油和植物蛋白的主要来源。异黄酮作为豆科植物，特别是大豆中重要的黄酮类化合物，在植物生长调节，植物与微生物互相识别等方面起着重要的作用。有研究表明，大豆异黄酮是大豆组织对疫霉根腐病菌(Phytophthora megasperma f.sp.glycinea)侵染的反应物质。同时，异黄酮在大豆与根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)互作的过程中起着一种信号分子的作用。

近年来由于发现异黄酮在人体保健与疾病治疗等方面有直接而有效的作用，受到普遍重视。大量研究表明，异黄酮具有抗氧化活性、抗溶血活性和抗真菌活性，能有效地预防和抑制白血病、骨质疏松、癌症等多种疾病的发生。许多流行病学和免疫学实验研究报告表明，大豆异黄酮可以有效地抑制乳腺癌、前列腺癌、白血病、结肠癌、肺癌、肝癌、胃癌等多种癌症的发生。大豆异黄酮可以促进骨质形成，保护骨质不丢失，有效防治骨质疏松症。此外，由于异黄酮和动物雌激素17β-雌二醇的结构相似，是一类植物雌激素。因此，大豆异黄酮还具有弱的雌激素活性，可改善妇女更年期症状。大豆异黄酮还具有一定的抗酸化能力，能增强心肌收缩力，增加冠状动脉血流量。

在高等植物中，异黄酮是通过苯基丙酸类(Phenylpropanoid)代谢途径合成的。异黄酮的12种成分中，大豆甙原(Daidzein，7,4’-二羟基异黄酮)、染料木素(Genistein，5,7,4’-三羟基异黄酮)、黄豆素(Glycitein)是苯基丙酸类代谢途径的主要分支产物，并且以葡糖甙-和丙二酰-葡糖甙的形式贮存在液泡中。苯基丙酸类途径中形成大豆甙原(Daidzein)的分支在大多数植物中都比较普遍，形成黄豆素(Glycitein)的途径目前研究还不是很清楚[42]。染料木素的合成与黄酮和花青素的合成有共同的前体柚皮素(Naringenin，4,5,7-三羟黄烷酮)。在苯基丙酸类(Phenylpropanoid)途径中，柚皮素(Naringenin，4,5,7-三羟黄烷酮)所涉及的代谢途径中形成三羟基异黄酮(Genistein)的异黄酮合成酶(Isoflavonesynthase，IFS)是异黄酮合成的关键限速酶基因。

红三叶(Trifolium pratense)是豆科三叶草属多年生草本植物。富含异黄酮，其中异黄酮含量为4μg/mg～6μg/mg，是大豆中异黄酮含量的1.25～6倍，红三叶中的IFS基因与大豆的IFS基因具有77％的同源性，其功能相似，但与大豆IFS相比具有更高的活性。

杂草控制是农业生产中关键的措施。草甘膦是一种有机磷除草剂，具有高效、低毒、杀草谱广及低残留等特点，是农业上应用最为广泛的一种除草剂。植物体中有3种芳香族必需氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)，它们的生物合成途径中有一个关键性酶——5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(5-enolpyryvyl shikimic acid-3-phosphatechorismate synthase,EPSPS)。草甘膦能够与EPSPS蛋白结合位点结合，从而竞争性抑制该酶的活性，阻断植物莽草酸途径，导致苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸等芳香族必需氨基酸的生物合成受阻，从而使莽草酸过度积累而影响植物正常生长，最终导致死亡。草甘膦属于非选择性、灭生性除草剂，只能用于播种前杂草控制。从抗高浓度草甘膦的微生物中分离获得的草甘膦不敏感EPSPS蛋白编码基因，能够有效的提高转基因植株对于草甘膦的抗性，从而扩大草甘膦的使用范围，降低杂草控制成本。

发明内容

针对现有生产中对异黄酮含量的需求及大豆生产中杂草控制成本的考虑，本发明所要解决的技术问题是在大豆基因组中导入能提高异黄酮合成及增加草甘膦抗性的基因，获得转基因青蒿新品系，以提高其异黄酮合成能力及草甘膦抗性，使这种转基因大豆品系成为大规模种植的大豆品种。

为了提高大豆中异黄酮含量以及降低杂草控制成本，本发明提供一种利用基因工程培育高异黄酮抗草甘膦大豆的方法，包括以下步骤：

步骤一、克隆TpIFS基因片段；

步骤二、克隆EPSPS基因片段；

步骤三、共转化TpIFS基因片段和EPSPS基因片段到大豆中，得到高异黄酮抗草甘膦大豆；

TpIFS基因片段是异黄酮合成酶基因片段，EPSPS基因片段是5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶基因片段。步骤一和步骤二是分别进行的，不存在先后顺序。

进一步地，TpIFS基因片段来自红三叶(Trifolium pratense)。

进一步地，TpIFS基因片段的序列是SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

进一步地，步骤一中TpIFS基因片段的获得是：以红三叶的基因组为模板，以SEQID No.2和SEQ ID No.3为引物进行PCR扩增得到的；或者通过人工合成SEQ ID No.1序列得到的。其中，PCR扩增的条件是98℃10s，55℃5s，72℃10s，共进行25-35个循环。

进一步地，EPSPS基因片段的序列是SEQ ID No.4。

进一步地，步骤二中EPSPS基因片段的获得是：以pSOY19的基因组为模板，以SEQID No.5和SEQ ID No.6为引物进行PCR扩增得到的；或者通过人工合成SEQ ID No.4序列得到的。其中，PCR扩增的条件是98℃10s，55℃5s，72℃10s，共进行25-35个循环。

进一步地，步骤三中采用冷激的方法将同时包含TpIFS基因片段和EPSPS基因片段的重组质粒导入根癌农杆菌，然后采用农杆菌介导法将根癌农杆菌导入大豆，得到高异黄酮抗草甘膦大豆。

进一步地，步骤一具体为：PCR扩增、回收得到TpIFS基因片段，将TpIFS基因片段与pMD18-T载体连接，将连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，酶切及PCR鉴定后将阳性克隆测序，确定得到包含TpIFS基因片段的重组子pTpIFS；

步骤二具体为：PCR扩增、回收得到EPSPS基因片段，将EPSPS基因片段与pMD18-T载体连接，将连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，酶切及PCR鉴定后将阳性克隆测序，确定得到包含EPSPS基因片段的重组子pEPSPS；

步骤三具体为：利用步骤一中的重组子pTpIFS和步骤二中的重组子pEPSPS构建重组质粒pCAMBIA-TpIFS-EPSPS，并利用重组质粒pCAMBIA-TpIFS-EPSPS将其含有的TpIFS基因片段和EPSPS基因片段共转化到大豆中，得到高异黄酮抗草甘膦大豆。

进一步地，还包括以下步骤：

步骤四、通过PCR扩增TpIFS基因片段和EPSPS基因片段后的电泳条带对步骤三中得到的高异黄酮抗草甘膦大豆中的进行鉴定，确保TpIFS基因片段和EPSPS基因片段已转入；

步骤五、通过HPLC检测步骤三中得到的高异黄酮抗草甘膦大豆的异黄酮水平。

异黄酮合成酶(Isoflavone synthase，IFS)是大豆植株合成异黄酮的关键酶，增强IFS的活性可以提高植株异黄酮的含量。5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(5-enolpyryvyl shikimic acid-3-phosphate chorismate synthase,EPSPS)是苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸等植物芳香族必需氨基酸的生物合成的关键酶，提高EPSPS的活性能够提高植株对于草甘膦的抗性。本发明将关键酶基因IFS及EPSPS基因共转化大豆，提高大豆异黄酮含量的同时增强对于草甘膦的抗性，获得高异黄酮含量并抗除草剂的基因工程青蒿品种，为培育高异黄酮含量的除草剂抗性大豆提供一种新的方法。

本发明可以对所述的F1代植株进行人工筛选，以获得稳定表达TpIFS基因和EPSPS基因的高异黄酮含量且抗草甘膦的大豆植株。在大豆基因组中导入TpIFS和EPSPS基因，使大豆合成异黄酮过程中产生调控性，且能够合成5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶，调控大豆在草甘膦存在条件下能够继续正常生长，具有比原先更高效地合成异黄酮及在草甘膦存在情况下继续合成苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸等植物芳香族必需氨基酸的特性，并能够获得高异黄酮含量且抗草甘膦的大豆。

通过对大豆基因组进行的上述改造，可大幅度提高大豆中异黄酮的含量，提高其作为营养保健食品的作用，并且使转基因大豆具有对草甘膦的抗性，降低其在种植过程中的成本。

本发明用于作为TPIFS基因和EPSPS基因的受体亲本异黄酮含量较高。在大豆中导入TpIFS基因可以提高大豆中异黄酮的含量，普通植株异黄酮含量为5.1mg/g干重，本发明得到的转基因大豆植株中成熟籽粒中异黄酮含量最高为14.18mg/g干重，其含量为非转化对照大豆含量的2.78倍。在大豆中导入EPSPS基因可以提高大豆对草甘膦的抗性，普通植株在10mg/g浓度草甘膦喷施下死亡率为100％，本发明得到的转基因大豆植株在10mg/g浓度草甘膦喷施下死亡率为0％。本发明获得的稳定大豆植株可以广泛种植，提高大豆品质节约大豆种植成本。

附图说明

图1是pCAMBIA-TpIFS-EPSPS载体构建示意图。

图2是候选转基因植株的PCR特异性扩增结果示意图。

图3是阳性转基因植株与对照植株成熟籽粒异黄酮含量的数据统计图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的描述。

材料：采用高异黄酮含量的大都栽培品种中黄68。

菌株和质粒：E.coli DH5α，pMD18-T载体，质粒载体pRI201-AN，质粒载体pCAMBIA3300，根癌农杆菌LBA4404。

酶和化学试剂：Taq酶，T₄-DNA连接酶，限制性内切酶XhoI，HindIII及BamHI，PCRMarker购自Takara公司，植物DNA提取试剂盒，植物RNA提取试剂盒，琼脂糖回收试剂盒及质粒提取试剂盒购自天根生物技术公司，PCR引物由生工生物技术公司合成。

分子生物学技术：除另有说明，所有分子生物学技术均按分子克隆实验指南(第二版)(J.莎姆布鲁克著，黄培堂译，科学出版社)中提供的方法进行。

步骤与结果：

DNA的提取：大豆DNA利用植物DNA提取试剂盒从上部幼嫩叶片中提取，红三叶DNA利用植物DNA提取试剂盒从上部幼嫩叶片中提取。提取步骤严格按照植物DNA提取试剂盒说明书进行。

下列实施例中未做特别说明的均按照常规实验条件进行，如按照分子克隆实验指南(第二版)(J.莎姆布鲁克著，黄培堂译，科学出版社)中提供的方法进行。

材料：植物材料：采用大豆异黄酮含量相对高的大豆品种中黄68及红三叶(Trifolium pratense)。

实验步骤；

1.TpIFS基因片段的克隆，该TpIFS基因片段的DNA序列为SEQ ID No.1。以红三叶为模板。

包括两端引物，引物设计为：

扩增用引物的上游引物SEQ ID No.2

5’-CGCCATATGATGTTGTTAGAAATTGCAG-3’(加NdeI接头)

扩增用引物的上游引物SEQ ID No.3

5’-CGCGTCGAC TTAAGAGGAAAGGAGTTTAG-3’(加SalI接头)

PCR反应总体系：总体积50μl，PrimeSTAR Max Premix(2×)25μl，上下游引物各0.2μM，模版DNA200ng，用去离子水(ddH₂O)补足体积至50μl。用引物(SEQ ID No.2和SEQ IDNo.3)进行PCR扩增，扩增条件：98℃10s，55℃5s，72℃10s，共进行30个循环。

用引物(SEQ ID No.2和SEQ ID No.3)扩增到了约1600bp的DNA片段，与预期DNA扩增片段长度相符，经1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，PCR回收产物与pMD18-T载体连接，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，随机挑取阳性克隆，利用质粒提取试剂盒提取质粒DNA，提取过程严格按照质粒提取试剂盒说明书进行。然后将酶切及PCR鉴定后的阳性克隆测序。比对挑选序列一致的重组子pTpIFS作进一步工作之用。

2.EPSPS基因片段的克隆，该EPSPS基因片段的DNA序列为SEQ ID No.4。以pSOY19为模板。pSOY19是以pCAMBIA为骨架，包含EPSPS基因片段的一种载体，其来源可见文献《以草甘膦为筛选标记的大豆转基因体系的建立及抗除草剂转基因大豆的培育》(陆玲鸿、宋张悦等，2014年，中国科学：生命科学，第44卷，第4期：406-415.)和《以草甘膦为筛选剂的大豆转基因研究》(宋张悦，2013年硕士毕业论文)。

包括两对引物，引物设计为：

扩增用引物的上游引物SEQ ID No.5

5’-TCGACTCGAGGCTCCTATAGGCGGTAGCCT-3’(加xhoI接头)

扩增用引物的上游引物SEQ ID No.6

5’-TCGACTCGAGGAGAAGGGATCCGACGCTCT-3’(加xhoI接头)

PCR反应总体系：总体积50μl，PrimeSTAR Max Premix(2×)25μl，上下游引物各0.2μM，模版DNA200ng，用去离子水(ddH₂O)补足体积至50μl。用引物(SEQ ID No.5和SEQ IDNo.6)进行PCR扩增，扩增条件：98℃10s，55℃5s，72℃10s，共进行30个循环。

用引物(SEQ ID No.5和SEQ ID No.6)扩增到了约1300bp的DNA片段，与预期DNA扩增片段长度相符，经1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，PCR回收产物与pMD18-T载体连接，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，随机挑取阳性克隆，利用质粒提取试剂盒提取质粒DNA，提取过程严格按照质粒提取试剂盒说明书进行。然后将酶切及PCR鉴定后的阳性克隆测序。比对挑选序列一致的重组子pEPSPS作进一步工作之用。

3.重组质粒pCAMBIA-EPSPS的构建

用限制性内切酶XhoI对载体pCAMBIA3300进行单酶切，切除草铵膦抗性基因phosphinothricin，回收约7800bp的大片段pCAMBIA3300。用限制性内切酶XhoI对含有EPSPS的重组子进行单酶切，回收约1300bp的片段，并将此片段用T₄连接酶连接至经过相同酶切的质粒载体pCAMBIA3300上。将重组质粒转化E.coli DH5α感受态细胞，提取质粒，对重组质粒进行酶切鉴定，并将经过酶切鉴定的重组质粒进行测序，确定插入EPSPS片段方向。将经过测序鉴定且EPSPS片段正向插入的重组质粒命名为pCAMBIA-EPSPS。

4.重组质粒pCAMBIA-TpIFS-EPSPS的构建

将重组质粒pTpIFS用限制性内切酶NdeI和SalI进行双酶切，回收约1600bp的小片段，将此片段用T4连接酶连接到相同酶切的质粒载体pRI201上，重组质粒具有基因片段TpIFS，该片段位于CaMC 35S启动子下游，对重组质粒进行酶切鉴定，将经过鉴定的重组质粒命名为pRI201-TpIFS。

将重组质粒pRI201-TpIFS用限制性内切酶HindIII和BamHI进行双酶切，回收约5200bp的片段，将此片段用T₄连接酶连接到相同酶切的质粒载体pCAMBIA-EPSPS上，重组质粒具有基因片段TpIFS，该片段位于CaMC 35S启动子下游，对重组质粒进行酶切鉴定，将经过鉴定的重组质粒命名为pCAMBIA-TpIFS-EPSPS。其各部分的结构见图1。

5.利用重组质粒pCAMBIA-TpIFS-EPSPS将其含有的TpIFS和EPSPS基因导入大豆基因组。步骤如下：

①将上述制备的pCAMBIA-TpIFS-EPSPS质粒采取冷激的方法转化根癌农杆菌LBA4404：每100μl菌液中加入5μl已纯化的组质粒pCAMBIA-TpIFS-EPSPS，混匀后于冰上放置30min；将混有质粒的菌液放入液氮中2-5min后，迅速投入37℃水浴中融化5min；向其中加入800μl不含抗生素的YEB液体培养基，并于28℃条件下180r/min震荡培养3-5h，使菌体复苏；离心浓缩菌液后，取100μl均匀涂布于含有链霉素50mg/l及卡那霉素25mg/L的YEB平板上。28℃倒置培养2-3d后，挑取其中的阳性克隆用于大豆外植体的侵染。

②大豆外植体的转化及再生：将消毒大豆种子接种在添加BA 0.4mg L-1的MSB5培养基中培养5～7d后，用无菌刀片切除部分下胚轴，留3～5mm，去除1/3的子叶，在两片子叶之间纵切，去除上胚轴，得到两个外植体。将外植体转到添加BA 1.0mg L^-1和IBA 0.2mg L^-1的MSB5培养基中诱导出芽，每隔14d更换新的相同培养基至丛生芽出现后转入不添加激素的MSB5芽伸长培养基中，每隔14d转入新的芽伸长培养基中，至芽伸长到3cm左右，转入添加IBA 0.5mg L^-1的MSB5生根培养基中培养至生出2～3条根，将瓶盖打开炼苗2d，小心用镊子取出小苗，温水洗净根部残留琼脂，然后栽于盛有灭菌的土:蛭石:沙子(1:1:1)均匀混合的塑料盆中，保持一定湿度，此时要适当降低培养温度，三周后移栽到温室中。

6.转基因大豆的鉴定

采取PCR方法测定外源基因在转化再生植株中的存在。TpIFS及EPSPS转基因大豆的PCR扩增：利用引物(SEQ ID No.2和SEQ ID No.3)对TpIFS基因进行扩增，利用引物(SEQID No.5和SEQ ID No.6)对EPSPS基因进行扩增。

提取再生大豆DNA为模版，PCR扩增，转基因大豆扩增出与pCAMBIA-TpIFS-EPSPS重组质粒PCR扩增片段相同的条带，而非转基因大豆对照没有扩增出相应条带。电泳结果见图2，图中M标示DL2000Marker，P：重组质粒，-：仅转化空载体植株，+：三泳道为3株不同阳性对照植株，即转化TpIFS及EPSPS基因的阳性植株，TpIFS为TpIFS扩增结果，EPSPS为EPSPS转化结果。TpIFS及EPSPS鉴定引物分别为SEQ ID No.2，SEQ ID No.3和SEQ ID No.5，SEQ IDNo.6。

7.转基因大豆成熟籽粒异黄酮含量的测定：取阳性转化株成熟籽粒作为实验组，取未转化中黄68成熟籽粒作为对照组，加入液氮研磨粉碎，准确称取后加入2mL的eppendorf管中，按4mL/g的比例加入80％的甲醇水溶液，过夜。超声波仪(100W)处理1h，12000r/m离心5min，取上清液，用0.45μm的滤膜进行过滤，准备高效液相色谱分析。结果见图3，图中，Vector表示对照；TpIFS+EPSPS表示候选转基因植株，其后的数字表示不同的候选转基因植株编号。

高效液相色谱仪为Agilent 1100(美国Agilent Int.)，色谱柱为Venusil MP-C18(2.1×150mm，5um；Agela Technologies Inc.)。标样为黄豆甙元(Daidzein)、黄豆苷(Glycitin)、染料木苷(Genistin)、大豆苷(Daidzin)、染料木素(Genistein)。HPCL条件为流动相：甲醇(A)，淋洗：pH＝3超纯水(B)。检验波长：254nm，柱温：25℃，流速：1mL/min，进样量：5μL。线性梯度洗脱程序：0-30min，A％15-86/B％85-14；30-40min，A％86-100/B％14-0；40-50min，A％100/B％0；50-53min，A％100-0/B％0-100；53-55min，A％0/B％100；55-56min，A％0-15/B％100-85；56-60min A％15/B％85。

8.对比实验的结果

在大豆中导入TpIFS基因可以提高大豆中异黄酮的含量，普通植株中黄68的异黄酮含量为5.1mg/g干重，本发明得到的转基因大豆植株中成熟籽粒中异黄酮含量最高为14.18mg/g干重，其含量为非转化对照大豆含量的2.78倍。

在大豆中导入EPSPS基因可以提高大豆对草甘膦的抗性，普通植株中黄68在10mg/g浓度草甘膦喷施下死亡率为100％，本发明得到的转基因大豆植株在10mg/g浓度草甘膦喷施下死亡率为0％。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (7)

1.一种利用基因工程培育高异黄酮抗草甘膦大豆的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、克隆TpIFS基因片段；

步骤二、克隆EPSPS基因片段；

步骤三、共转化TpIFS基因片段和EPSPS基因片段到大豆中，得到高异黄酮抗草甘膦大豆；

其中，所述TpIFS基因片段是异黄酮合成酶基因片段，所述TpIFS基因片段来自红三叶(Trifolium pratense)，所述EPSPS基因片段是5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶基因片段；

所述步骤一具体为：PCR扩增、回收得到所述TpIFS基因片段，将所述TpIFS基因片段与pMD18-T载体连接，将连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，酶切及PCR鉴定后将阳性克隆测序，确定得到包含TpIFS基因片段的重组子pTpIFS；

所述步骤二具体为：PCR扩增、回收得到所述EPSPS基因片段，将所述EPSPS基因片段与pMD18-T载体连接，将连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，酶切及PCR鉴定后将阳性克隆测序，确定得到包含EPSPS基因片段的重组子pEPSPS；

所述步骤三具体为：利用所述步骤一中的重组子pTpIFS和所述步骤二中的重组子pEPSPS构建重组质粒pCAMBIA-TpIFS-EPSPS，并利用所述重组质粒pCAMBIA-TpIFS-EPSPS将其含有的TpIFS基因片段和EPSPS基因片段共转化到大豆中，得到所述高异黄酮抗草甘膦大豆；

所述步骤三中采用冷激的方法将同时包含TpIFS基因片段和EPSPS基因片段的重组质粒导入根癌农杆菌，然后采用农杆菌介导法将所述根癌农杆菌导入大豆，得到所述高异黄酮抗草甘膦大豆。

2.如权利要求1所述的利用基因工程培育高异黄酮抗草甘膦大豆的方法，其特征在于，所述TpIFS基因片段的序列是SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

3.如权利要求1所述的利用基因工程培育高异黄酮抗草甘膦大豆的方法，其特征在于，所述步骤一中TpIFS基因片段的获得是：以红三叶的基因序列为模板，以SEQ ID No.2和SEQID No.3为引物进行PCR扩增得到的；或者通过人工合成SEQ ID No.1序列得到的。

4.如权利要求3所述的利用基因工程培育高异黄酮抗草甘膦大豆的方法，其特征在于，所述PCR扩增的条件是98℃10s，55℃5s，72℃10s，共进行25-35个循环。

5.如权利要求1所述的利用基因工程培育高异黄酮抗草甘膦大豆的方法，其特征在于，所述EPSPS基因片段的序列是SEQ ID No.4。

6.如权利要求1所述的利用基因工程培育高异黄酮抗草甘膦大豆的方法，其特征在于，所述步骤二中EPSPS基因片段的获得是：以pSOY19的基因序列为模板，以SEQ ID No.5和SEQID No.6为引物进行PCR扩增得到的；或者通过人工合成SEQ ID No.4序列得到的。

7.如权利要求1所述的利用基因工程培育高异黄酮抗草甘膦大豆的方法，其特征在于，还包括以下步骤：

步骤四、通过PCR扩增TpIFS基因片段和EPSPS基因片段后的电泳条带对所述步骤三中得到的高异黄酮抗草甘膦大豆中的进行鉴定，确保TpIFS基因片段和EPSPS基因片段已转入；

步骤五、通过HPLC检测所述步骤三中得到的高异黄酮抗草甘膦大豆的异黄酮水平。