CN108699559A - 包括CYP76AD1-β进化枝多肽的组合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了包括编码CYP76AD6或相关基因的核酸的重组多核苷酸，及它们用于由酪氨酸产生L‑DOPA以及治疗多巴胺反应性病症如帕金森病的用途。本发明还提供了重组多核苷酸，其包括编码CYP76AD1和/或CYP76AD6的核酸、编码DOPA 4，5‑双加氧酶(DOD)的核酸如甜菜DODA1、以及在一些情况下编码甜菜色素相关的葡糖基转移酶的核酸如紫茉莉基因环‑DOPA 5‑O‑葡糖基转移酶(cDOPA5GT)，以及它们用于产生甜菜色素的用途。最后，本发明提供了嵌合多肽、表达载体、细胞、组合物和生物体(包括植物)，以及它们在本发明的各种方法中的用途。

Description

包括CYP76AD1-β进化枝多肽的组合物及其用途
技术领域
本发明提供了包括编码CYP76AD6或相关基因的核酸的重组多核苷酸，及它们用于由 酪氨酸产生L-DOPA和治疗多巴胺反应性疾病如帕金森病的用途。本发明还提供了重组多核苷酸，其包括编码CYP76AD1和/或CYP76AD6的核酸、编码DOPA 4，5-双加氧酶 (DOD)的核酸如甜菜DODA1、以及在一些情况下编码甜菜色素相关的葡糖基转移酶的 核酸如紫茉莉基因环-DOPA 5-O-葡糖基转移酶(cDOPA5GT)，以及它们用于产生甜菜色素 的用途。最后，本发明提供了嵌合多肽、表达载体、细胞、组合物和生物体(包括植物)， 以及它们在本发明的各种方法中的用途。
背景技术
甜菜色素是仅在一组被子植物(石竹目)中发现的酪氨酸衍生的、红紫色和黄色的植 物色素，其中它们以与化学上不同且广泛存在的花青素色素相互排斥的方式出现。甜菜色 素类含有大量的化合物，这些化合物通常分为两组；红紫色的甜菜红素和黄色的甜菜黄素。
甜菜素生物合成中的关键酶DOPA 4，5-双加氧酶(DOD)将L-DOPA转化为构成所有甜菜色素的基本骨架的甜菜醛氨酸(图1)。甜菜醛氨酸与胺或与L-DOPA衍生物的自发结 合导致分别形成黄色甜菜黄素或红紫色甜菜红素。甜菜色素相关的葡糖基转移酶也已在几种石竹目植物物种中表征，催化环-DOPA的5-O葡糖基化或可替代地催化甜菜素的5-O或 6-O葡糖基化。催化由酪氨酸形成L-DOPA的酶是未知的。
由于它们的高稳定性、pH独立性和抗氧化性质，甜菜色素可以用作天然食品着色剂和 膳食补充剂。
虽然花青素的潜在可食用植物源很多，但很少在可食用植物中发现甜菜色素，红甜菜 是当今商业用途中甜菜色素提取物的唯一主要来源。尽管甜菜色素含量高，但红甜菜提取 物作为食品着色剂的来源有几个缺点；它主要产生甜菜苷，因此颜色可变性有限；由于土 臭素和各种吡嗪类的存在而带有不利的泥土味；并且存在土壤携带微生物遗留的风险。目 前还没有大规模使用天然来源的甜菜黄素作为食品染料。例如，黄色甜菜由于同时存在易 被氧化且掩盖甜菜黄素的黄色调的酚类化合物，因此不太可能使用。显然，开发甜菜色素 特别是甜菜黄素的替代来源是有利益的，因为目前在食品工业中没有可用于商业用途的天 然黄色水溶性色素。异源产生甜菜色素可为这些色素提供许多新型可行来源，如植物、植 物细胞培养物、藻类和酵母。
甜菜色素途径中间体L-3，4-二羟基苯丙氨酸(L-DOPA)也是广泛用于治疗帕金森病的 商业上有价值的代谢物。
帕金森病是主要影响身体运动系统的神经系统的进行性疾病。它是第二常见的神经退 行性疾病和最常见的运动疾病，影响估计全球500万人。帕金森病的一个主要特征是多巴 胺水平降低，多巴胺是神经系统中一种重要的信号分子。对帕金森病最有效的治疗方法是 施用L-DOPA(3，4-二羟基苯丙氨酸)，其在脑中转化为多巴胺。由于多巴胺不能通过血脑 屏障，L-DOPA是治疗帕金森病最有效的药物。
L-DOPA还作为膳食补充剂广泛销售并且是其它高价值代谢物的前体，其包括例如儿 茶酚胺(例如多巴胺、肾上腺素)、苄基异喹啉生物碱(例如吗啡和其它阿片剂)、甜菜色素和黑色素。
虽然L-DOPA在许多植物和动物物种中产生，但其很少大量累积。这部分归因于 L-DOPA普遍由酪氨酸酶形成，酪氨酸酶催化酪氨酸被羟化为L-DOPA，但也立即将L-DOPA转化为其氧化形式，即多巴醌。
用于制药工业的L-DOPA目前使用几种方法之一来制备，所有这些方法都具有严重的 限制，因为化学合成只能在昂贵的工艺中实现，该工艺涉及许多化学反应并需要使用昂贵 的底物和苛刻的生产条件。也已经探索通过使用酪氨酸酶(也称为多酚氧化酶-PPO)生物 技术产生L-DOPA。上述酪氨酸酶的双重反应对于商业化产生L-DOPA是很成问题的，因为感兴趣的产物被直接代谢为商业上无用的多巴醌，因此是其用于酶促生物合成以由酪氨酸大规模产生L-DOPA的主要瓶颈。因此，需要制备L-DOPA的更高效且更便宜的方法， 该需要未得以满足。
与其它主要类别的植物色素(即花青素和类胡萝卜素)相比，甜菜色素生物合成仍未 被很好理解，特别是关于催化石竹目中甜菜色素合成途径中使酪氨酸转化为L-DOPA的酶。
发明内容
在一个实施方式中，本发明提供了一种重组多核苷酸，其包括在启动子的控制下编码 CYP76AD6基因的核酸、编码CYP76AD15基因的核酸、或编码其组合的核酸。在一个实施方式中，多核苷酸还包括编码DOPA 4，5-双加氧酶(DOD)的核酸。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种重组多核苷酸，其包括编码CYP76AD1的核 酸、编码DOPA 4，5-双加氧酶(DOD)的核酸、和编码甜菜色素相关的葡糖基转移酶的核酸，其中，所述核酸被框内插入多核苷酸中。在一个实施方式中，多核苷酸还包括编码CYP76AD6的核酸。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种组合物，其包括如上所述的重组多核苷酸。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种表达载体，其包括如上所述的重组多核苷酸。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种细胞，其包括如上所述的表达载体。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种嵌合多肽，其由如上所述的重组多核苷酸编 码。
在另一个实施方式中，本发明提供了在细胞中产生L-DOPA的方法，其包括以下步骤： 在足以产生L-DOPA的条件下，使所述细胞与包括在启动子的控制下编码CYP76AD6基因的核酸、编码CYP76AD15基因的核酸、或编码其组合的核酸的重组多核苷酸接触，从而 产生L-DOPA。
在另一个实施方式中，本发明提供了由酪氨酸产生L-DOPA的方法，其包括以下步骤： 在足以产生L-DOPA的条件下使CYP76AD6、CYP76AD15或其组合与酪氨酸组合，从而 产生L-DOPA。
在另一个实施方式中，本发明提供了CYP76AD1-β进化枝基因或来自包括高水平的所 述CYP76AD1-β进化枝基因的生物体的一个或多个细胞在制备用于治疗或抑制患者的多巴胺反应性疾病的组合物中的用途。
在另一个实施方式中，本发明提供了产生甜菜色素的方法，所述方法包括以下步骤： 在足以产生甜菜色素的条件下，使包括在启动子的控制下编码CYP76AD6基因的核酸、编 码CYP76AD15基因的核酸或编码其组合的核酸，编码DOPA 4，5-双加氧酶(DOD)的核 酸，以及编码CYP76AD1的核酸的重组多核苷酸与一个或多个细胞接触，其中，所述核酸 被框内插入多核苷酸中，从而产生甜菜色素。
在另一个实施方式中，本发明提供了产生甜菜黄素的方法，所述方法包括以下步骤： 在足以产生甜菜黄素的条件下，使包括在启动子的控制下编码CYP76AD6基因的核酸、编 码CYP76AD15基因的核酸或编码其组合的核酸，以及编码DOPA 4，5-双加氧酶(DOD) 的核酸的重组多核苷酸与一个或多个细胞接触，其中，所述核酸被框内插入多核苷酸中， 从而产生甜菜黄素。
在另一个实施方式中，本发明提供了增加植物或植物部分对一种或多种生物或非生物 胁迫因子的抗性的方法，其包括以下步骤：在足以产生甜菜色素的条件下，使所述植物或 植物部分的一个或多个细胞与核酸编码CYP76AD6的酸、编码CYP76AD15的核酸、编码CYP76AD1的核酸或其组合，编码DOPA 4，5-双加氧酶(DOD)的核酸，以及可选的编码 甜菜色素相关的葡糖基转移酶的核酸接触，从而产生甜菜色素并增加所述植物或植物部分 对所述一种或多种胁迫因子的抗性。
在另一个实施方式中，本发明提供了增加植物或植物部分对一种或多种真菌疾病的抗 性的方法，其包括以下步骤：在足以产生甜菜色素的条件下，使植物或植物部分的一个或 多个细胞与编码CYP76AD6的核酸、编码CYP76AD15的核酸、编码CYP76AD1的核酸 或其组合，编码DOPA 4，5-双加氧酶(DOD)的核酸，以及可选的编码甜菜色素相关的葡 糖基转移酶的核酸接触，从而产生甜菜碱并增加所述植物或植物部分对所述一种或多种真 菌疾病的抗性。
在另一个实施方式中，本发明提供了增加生物体或生物体的部分中的一种或多种甜菜 色素水平的方法，其包括在生物体的至少一部分内引起或允许表达DOPA 4，5-双加氧酶 (DOD)和CYP76AD6、CYP76AD1或其组合，其中，如果所述生物体表达CYP76AD1 和DOD而不是CYP76AD6或CYP76AD15，则所述生物体还表达甜菜色素相关的葡糖基 转移酶，从而增加在所述生物体或生物体的所述部分中一种或多种甜菜色素的水平。
在另一个实施方式中，本发明提供了生物体或其部分，其包括编码CYP76AD1-α进化 枝基因、编码CYP76AD1-β进化枝基因的核酸序列、或编码其组合的核酸序列、以及编码DOPA 4，5-双加氧酶(DOD)的核酸序列的重组核酸序列。
在另一个实施方式中，本发明提供了由酪氨酸产生甜菜色素的方法，其包括以下步骤： 在足以产生甜菜色素的条件下，使包括CYP76AD1、DOPA 4，5-双加氧酶(DOD)以及CYP76AD6、CYP76AD15或其组合的组合物与酪氨酸接触，从而产生甜菜色素。
在另一个实施方式中，本发明提供了由酪氨酸产生甜菜黄素的方法，其包括以下步骤： 在足以产生甜菜黄素的条件下，使包括CYP76AD6、CYP76AD15或其组合、以及DOPA 4，5- 双加氧酶(DOD)的组合物与酪氨酸接触，从而产生甜菜黄素。
附图说明
在说明书的结论部分中特别指出并清楚地要求了被视为本发明的主题。然而，关于组 织和操作方法以及其目的、特征和优点，本发明可以通过参考以下详细描述并与附图一起 阅读来最好地理解，在附图中：
图1.甜菜色素生物合成途径。参与途径的基因以洋红色显示。酶促反应：EI，酪氨酸 的羟化；EII，DOPA-4，5双加氧酶；EIII，DOPA的氧化；EIV，环-DOPA的葡糖基化；EV， 甜菜素的葡糖基化；EVI，甜菜红素的额外葡糖基化；EVII，甜菜红素的酰化。预测的自 发反应：SI，缩合(醛亚胺形成)。酶促反应EII和EIII之后是自发环化反应，因此标有星 号。EV可以替代地由甜菜素-6-O-葡糖基转移酶催化，导致千日红素而不是甜菜苷的形成。 虚线表示替代途径的反应，其显示出现在紫茉莉中，其中环-DOPA首先被糖基化，然后与 甜菜醛氨酸缩合以形成甜菜苷。
图2A-2G.识别MjCYP76(SEQ ID NO：1)作为甜菜色素相关的候选基因。在来源于24种组织的转录组数据集中分析了紫茉莉中的基因表达，其中包括五个发育阶段中的四种花器官类型，红色或绿色茎表皮，以及红色或绿色叶。图2A：花瓣。图2B：雄蕊花丝。 图2C：来自节点或节间的茎表皮。图2D：柱头。图2E：花药。图2F：红色幼嫩或成熟 绿色叶。图2G：甜菜色素相关的基因环-多巴-5-O-葡糖基转移酶(cDOPA5GT；SEQ ID NO： 2)，DOPA 4，5-双加氧酶(MjDOD；SEQ ID NO：3)和细胞色素P450 CYP76AD3(基因 库登录号HQ656026.1；SEQ IDNO：4)表现出平行色素积累的表达模式。细胞色素P450 基因MjCYP76(SEQ ID NO：1)与cDOPA5GT(Pearson相关性r值＝0.90)高度共表达， 并与MjDOD(r值＝0.67)的共表达程度较低。
图3.在紫茉莉RNA序列数据集中推定的多酚氧化酶编码基因MjPPO1(SEQ ID NO：5)；MjPPO2(SEQ ID NO：6)；MjPPO3(SEQ ID NO：7)；和MjPPO4(SEQ ID NO：8) 的基因表达模式。
图4A.在感染pTRV2：CYP76AD1或pTRV2：CYP76AD1-CYP76AD6载体后，四种 CYP76AD旁系同源物的qRT-PCR分析显示部分下调，表明脱靶沉默。在感染pTRV2： CYP76AD1-CYP76AD6的组织中观察到Bv20048的上调。相对定量(RQ)值表示三次生 物学重复的平均值±SE。星号表示与未沉默的组织相比差异表达的统计学显著性。*， P＜0.05；**，P＜0.01。
图4B.CYP76AD旁系同源物在甜菜中的最大可能性系统发生树。CYP76AD6(基因 库登录号KT962274；SEQ ID NO：30)；CYP76AD1(登录号AET43289.1；SEQ ID NO： 14)；BvCYP76new(登录号KU041699；SEQ ID NO：9)；Bv20048(登录号KU041700)； Bv10427(登录号KU041701)；Bv31911(登录号KU041702)；Bv15899(登录号KU041703)； Bv15885(登录号KU041704)。
图5A-5C.CYP76AD1和CYP76AD6的共沉默抑制了甜菜色素的产生。红甜菜中的病毒诱导基因沉默(VIGS)测定用于沉默BvDODA1或CYP76AD1。CYP76AD1另外与两 个新候选者BvCYP76new(SEQ ID NO：9)和CYP76AD6中的每一个共沉默。虽然单独 沉默CYP76AD1或与BvCYP76new共沉默阻止甜菜红素而不是甜菜黄素的形成，但是 CYP76AD1和CYP76AD6的共沉默阻止两种类型的色素产生，得到与通过沉默BvDODA1 获得的表型类似的表型。通过黄色的可见减少和在蓝光下缺乏荧光(甜菜黄素的典型表现) 观察到甜菜黄素水平的降低。在图5A中，呈现渗入后3.5周的全植物图像；在图5B中， 显示了单叶图像，明场，以及图5C中，显示了单叶图像，蓝光。
图6A.VIGS沉默的甜菜叶中甜菜黄素的相对定量。通过在475nm和600nm处的光吸收测量以分光光度评估相对的甜菜黄素含量。值表示四次生物学重复的平均值±SEM，每次重复由两到三个植物的基因沉默组织组成。星号表示与pTRV2：CYP76AD1有统计学显 著差异。**，P值＜0.01。RQ，相对定量。
图6B.CYP76AD1和CYP76AD6的定量实时PCR(qRT-PCR)分析。CYP76AD1在 感染pTRV2：CYP76AD1或pTRV2：CYP76AD1-CYP76AD6的组织中下调。CYP76AD6 在感染pTRV2：CYP76AD1-CYP76AD6后显著下调。相对定量(RQ)值表示三次生物学 重复的平均值±SE。星号表示与未感染植物相比差异表达的统计学显著性。**，P值＜0.01。
图7A-7F.本氏烟草叶中CYP76AD1或CYP76AD6的重组表达使得能够产生L-DOPA 和甜菜色素。图7A：包含用于在本氏烟草叶中用cDOPA5GT(pAD1-GT)和BvDODA1 (pDODA)表达CYP76AD1的质粒的农杆菌的共渗入导致红色素沉着。图7B：红色素组 织的LC-MS分析显示了甜菜苷和异甜菜苷的出现。图7C：本氏烟草叶中CYP76AD6表达 载体(pAD6)和pDODA的共渗入导致黄色素沉着。图7D：本氏烟草叶中pAD1-GT的渗 入使得能够产生L-DOPA。在表达YFP(pYFP)的对照实验中没有检测到L-DOPA。图7E： 黄色素沉积的组织的分析允许识别几种甜菜黄素化合物，包括梨果仙人掌黄素。图7F：本 氏烟草叶中pAD6的渗入使得能够产生L-DOPA。在对照实验中没有检测到L-DOPA (pDODA+pYFP)。XIC，提取离子色谱图。
图8A-8C.细胞色素P450 CYP76AD1和CYP76AD6在活性和系统发生上不同。
图8A：酵母细胞中CYP76AD1、CYP76AD6和BvDODA1的重组表达。呈现的图像 是在过夜半乳糖诱导后酵母生长的培养基。用三种载体转化每种酵母克隆，用于以不同组 合表达CYP76AD1、CYP76AD6、BvDODA1和β-葡糖醛酸酶(GUS)，并在不补充L-DOPA 的标准SD培养基中生长。BvDODA1和CYP76AD1的组合表达导致培养基的红紫色素沉 着，而BvDODA1与CYP76AD6一起的表达导致形成黄色素沉着，这表明CYP76AD1和 CYP76AD6之间的催化活性的区别。BvDODA1与两种细胞色素P450的表达均导致培养 基的橙红色素沉着。当单独表达每种细胞色素P450或BvDODA1时，未观察到色素沉着。
图8B：来自产生甜菜色素的石竹目植物的CYP76AD1样蛋白质序列的多重序列比对被处理成最大可能性系统发生树，导致形成两个单独的进化枝，已命名为α和β进化枝(Brockington等，2015)。CYP76AD6属于β进化枝，而CYP76AD1属于α进化枝。在 CYP76AD1-β进化枝中：B.vulgaris，甜菜(Beta vulgaris)(CYP76AD6；基因库登录号 KT962274；SEQ IDNO：30)；Bv.maritima，甜菜亚种maritima(登录号AKI33834.1；SEQ ID NO：10)；F.latifolia，Froelichia latifolia(登录号AKI33838.1；SEQ ID NO：11)；A.caracasana，刺花莲子草(Alternanthera caracasana)(登录号AKI33835.1；SEQ ID NO：12)； A.ficoidea，五色苋(Alternanthera ficoidea)(登录号AKI33831.1；SEQ ID NO：13)。在 CYP76AD1-α进化枝中：B.vulgaris，甜菜(CYP76AD1；登录号AET43289.1；SEQ IDNO： 14)；A.cruentus，籽粒苋(Amaranthus cruentus)(CYP76AD2；登录号AET43291.1；SEQID NO：15)；M.jalapa，紫茉莉(Mirabilis jalapa)(CYP76AD3；登录号AET43292.1；SEQ IDNO：16)；C.cristata，鸡冠花(Celosia cristata)(CYP76AD4；登录号AGI78466.1；SEQ IDNO：17)。
图8C：色素酵母培养基的液相色谱-质谱(LC-MS)分析显示，当CYP76AD1、CYP76AD6或两者均与BvDODA1一起表达时，除了几种甜菜黄素(包括谷氨酰胺-甜菜黄素和缬氨酸 甜菜黄素(表2；色谱图中未显示))，还出现甜菜醛氨酸发色团。仅在表达CYP76AD1时 观察到甜菜红素甜菜素和异甜菜素的出现。在没有表达BvDODA1时没有发现对应于甜菜 色素化合物的峰。所有六个色谱图的y轴(峰值强度)都相关联。XIC，对应于甜菜醛氨 酸[M+H＝212.05]和甜菜素异构体[M+H＝389.10]的质量的提取离子色谱图。时间，保留 时间(分钟)。
图9.CYP76AD1(SEQ ID NO：14)和CYP76AD6(SEQ ID NO：18)蛋白质序列的 比对显示它们之间72％的同一性。
图10.pX11过表达载体(SEQ ID NO：19)的示意图。KanR，赋予卡那霉素抗性的基因nptII；DODA1，甜菜DOPA 4，5-双加氧酶；CYP76AD1，甜菜细胞色素P450；cDOPA5GT， 紫茉莉环-DOPA-5-O-葡糖基转移酶；nos，胭脂碱合成酶启动子/终止子；35S，CaMV 35S 启动子/终止子；Act2，拟南芥肌动蛋白2终止子；Ub10，拟南芥泛素10启动子；
图11A-11B.在多种天然非生产植物物种中产生甜菜碱。
图11A：过表达细胞色素P450 CYP76AD1、DOPA 4，5-双加氧酶(BvDODA1)和环-DOPA5-O-葡糖基转移酶(cDOPA5GT)的pX11载体的农杆菌介导的转化引起红紫色愈伤组织 的发育或在各种茄科植物物种中的发芽，通常在以下组织培养物的1-2周内观察到： Solanumlycopersicum(番茄)、Solanum tuberosum(马铃薯)、Solanum melongena(茄子)、Nicotiana tabacum(烟草)、Nicotiana glauca(树烟草)、Solanum nigrum(欧洲龙葵)、Petunia x hybrida(矮牵牛)、本氏烟草。
图11B1-11B2：采用液体色谱-质谱(LC-MS)对树烟草(图11B1)和本氏烟草(图11B2)愈伤组织进行采样和分析，以允许除了识别仅在树烟草组织中发现的新型未识别的甜菜红素化合物外(甜菜红素III；表2)，还识别两种物种中的甜菜红素甜菜苷和异甜菜苷。XIC，对应于新型甜菜红素[M+H＝593.10]和甜菜苷异构体[M+H＝551.10]的质量的 提取离子色谱图。时间，保留时间(分钟)。
图12A-12C.甜菜红素在工程制造的和天然生产的物种中的识别和定量。
图12A：用pX11载体农杆菌渗入的本氏烟草叶的LC-MS分析能够识别甜菜苷，其表现出与来自红甜菜(甜菜)叶子提取物的甜菜苷相同的精确质量、保留时间、片段化模式 和UV-VIS吸收光谱。
图12B：将包含pX11载体的农杆菌渗入本氏烟草叶中导致渗入区中的强烈红色素沉 着，通常在2-3天内观察到。
图12C：与几种产生甜菜色素的物种相比较，评估了pX11-农杆菌渗入的本氏烟草和pX11转化的烟草的甜菜红素含量。通过在535nm和600nm处测量光吸收以分光光度评估甜菜红素含量。值表示四次生物学重复的平均值±SE，每次重复含有100mg组织(鲜重)。
图13A-13E.在为产生甜菜色素而工程化的转基因烟草植物中观察到的色素沉着表型。 三种甜菜途径基因，即CYP76AD1、BvDODA1和cDOPA5GT(在pX11二元载体中)在 烟草中异源表达，导致不同植物器官(包括叶、茎、根和花)中的红色素沉着。图13A： 左，野生型烟草；右，pX11转化的烟草。图13B：顶排，野生型烟草花；底排，pX11花。 在pX11根(图13C)，茎表皮部分，放大20倍(图13D)，和叶腺毛，放大20倍(图13E) 中的色素积累也是明显的。
图14A-14B.在食品作物番茄、马铃薯和茄子中产生甜菜色素。
图14A：pX11载体的转化导致在马铃薯(Solanum tuberosumvar.Désirée-左上图)、茄 子(Solanum melongena line DR2-左下图)和番茄(Solanum lycopersicumvar.MicroTom- 右图)中形成红色素植物。
图14B：通过LC-MS分析，将马铃薯块茎、番茄果实和茄子果实中的甜菜苷和异甜菜苷识别为主要的甜菜红素。示出了所有三种组织的甜菜苷/异甜菜苷相应质量[M+H＝551.1]和甜菜苷峰的UV-VIS吸收的提取离子色谱图(XIC)。
图15：pX11(SEQ ID NO：19)、pX11(E8)(SEQ ID NO：20)、pX11(CHS)(SEQ ID NO：21)、pX12(SEQ ID NO：22)、和pX13(SEQ ID NO：23)过表达载体的示意图。 KanR，赋予卡那霉素抗性的基因nptII；DODA1，甜菜DOPA 4，5-双加氧酶； CYP76AD1/CYP76AD6，甜菜细胞色素P450；cDOPA5GT，紫茉莉环-DOPA-5-O-葡糖基转 移酶；nos，胭脂碱合成酶启动子/终止子；35S，CaMV 35S启动子/终止子；Act2，拟南芥 肌动蛋白2终止子；Ub10，拟南芥泛素10启动子；E8，番茄E8启动子；CHS，矮牵牛 查耳酮合成酶启动子。
图16A-16B.番茄中甜菜色素的果实特异性积累。
图16A：将pX11(E8)载体引入番茄(Solanum lycopersicum var.M-82)导致限于成熟中和成熟果实的甜菜红色素沉着。
图16B：野生型和pX11(E8)番茄果实的整个果实和横截面。
图17A-17B.通过改变甜菜红素/甜菜黄素比率来确定转基因产生甜菜色素的烟草的花 色变化。
图17A：将pX11、pX12或pX13载体引入烟草导致形成不同颜色的花。从顶部(顶行)观察或放大并在明场(中间行)或蓝光(底行)下观察，其中甜菜黄素通常是荧光的。
图17B：pX11、pX12和pX13烟草花瓣的LC-MS分析。质量[M+H＝309.1，331.1，340.1，551.1]的提取离子色谱图(XIC)分别对应于脯氨酸-甜菜黄素、酪胺-甜菜黄素、谷氨酰胺-甜菜黄素、和甜菜苷/异甜菜苷。垂直轴相关联。
图18A-18B.在烟草BY2细胞中产生甜菜色素。
图18A：将pX11或pX13引入烟草BY2系细胞中分别导致红紫或黄橙色素沉着。
图18B：pX11和pX13BY2细胞的LC-MS分析。质量[M+H＝283.1，340.1，551.1]的 提取离子色谱图(XIC)，分别对应于丙氨酸-甜菜黄素、谷氨酰胺-甜菜黄素、和甜菜苷/ 异甜菜苷。垂直轴相关联。
图19.pDOPA1-pDOPA4(SEQ ID NO：24-27)过表达载体的示意图。nptII，赋予卡那霉素抗性的基因新霉素磷酸转移酶II；CYP76AD6，甜菜细胞色素P450；AroG，大肠杆菌AroG175(DAHPS)突变体；AAH，小立碗藓芳香族氨基酸羟化酶；35S，CaMV 35S启 动子/终止子；Ub10，番茄泛素10启动子。
图20A-20C.在烟草植物和BY2细胞中产生L-DOPA。图20A：通过LC-MS分析识别 表达pDOPA1和pDOPA3的烟草植物的叶提取物中的L-DOPA。图20B：BY2细胞中的 pDOPA2和pDOPA4表达在培养数周后引起不同程度的愈伤组织的黑化。图20C：通过LC-MS分析，pDOPA2、pDOPA4和野生型BY2细胞中的L-DOPA相对定量。
图21A-21B.在渗透和盐度胁迫条件下产生甜菜色素的烟草的种子发芽测定。图21A： 在高盐度胁迫条件(150mM NaCl)和对照条件(MS)下生长的野生型和pX11烟草幼苗被拍照并记录种子发芽率。图21B：在渗透胁迫条件(400mM甘露醇)和对照条件(MS) 下生长的野生型和pX11烟草幼苗被拍照并记录种子发芽率。
图22A-22C.产生甜菜色素的烟草植物的灰霉菌抗性分析。图22A：野生型和pX11烟草植物的叶子用灰霉菌悬液的液滴感染，并在感染后5天拍照。图22B：对每个植物感染 总共大约500个灰霉菌的野生型和pX11植物记录病斑大小。显示每个基因型约30个植物 的平均病斑面积。图22C：与pX11植物的叶片相比，野生型烟草植物的感染叶显示出坏 死迹象增加。
图23A-23D.本氏烟草中CYP76AD15的重组表达使得能够产生甜菜黄素和L-DOPA。图23A：包含用于在本氏烟草叶中表达CYP76AD15和BvDODA1的质粒的农杆菌的共渗 入导致渗入区的黄色素沉着。图23B：黄色素组织的LC-MS分析显示几种甜菜黄素的出 现，包括多巴胺-甜菜黄素[M+H＝347.1]和缬氨酸-甜菜黄素[M+H＝311.1]。XIC，提取 离子色谱图。图23C：在分析的组织中代表多巴胺-甜菜黄素和缬氨酸-甜菜黄素的峰的 UV-VIS吸收。图23D：在表达CYP76AD15的本氏烟草的叶组织中识别的L-DOPA峰的 质谱显示典型的L-DOPA片段[M+H＝181.05，152.07]和分子离子[M+H＝198.07]。
具体实施方式
在下面的详细描述中，阐述了许多具体细节以便提供对本发明的透彻理解。然而，本 领域技术人员将会理解，可以在没有这些具体细节的情况下实践本发明。在其它情况下， 众所周知的方法、程序和组分未被详细描述以免混淆本发明。
在一个实施方式中，本发明提供了一种组合物，其包括催化石竹目中甜菜色素合成的 第一步的酶，以及该酶在植物基因工程中和用于由酪氨酸产生L-DOPA的用途。通常，酪 氨酸酶是底物混杂的加氧酶，其表现出不需要的儿茶酚氧化酶活性。先前的研究表明植物 细胞色素P450 CYP76AD1表现出这种特征混杂性，并且尽管筛选策略识别了增加酶底物特异性和活性的突变，但仍产生不期望的副产物(DeLoache等，2015；Nat Chem Biol.2015年7月；11(7)：465-71，其全部内容通过引用并入本文)。因此没有预料到不同的植物细 胞色素P450对酪氨酸是特异性的，并且仅催化对L-DOPA的反应，从而避免不期望的最 终产物的积累。
CYP76AD6
本发明提供了催化酪氨酸羟化作用以形成L-DOPA的新基因(属于细胞色素P450基因 家族)。与目前用于产生L-DOPA的酪氨酸酶相比，这种酶潜在地具有显著的优势；在酪氨酸酶催化由酪氨酸形成L-DOPA，并立即将其氧化成不可用的代谢产物多巴醌时，新型P450酶仅催化L-DOPA的形成而不氧化L-DOPA。因此，该P450酶可以用于比使用酪氨 酸酶更高效的L-DOPA产生方法。
因此，在一个实施方式中，本发明提供了一种可用于生物合成产生L-DOPA的新型酶、 用于治疗帕金森病的药物、以及经济上重要的药物苄基异喹啉生物碱(例如吗啡)的前体。 该酶可以以几种方式潜在地用于商业产生L-DOPA；其编码基因可以在植物或微生物中表 达以诱导体内产生L-DOPA，或者替代地可以将其重组表达并用于体外酶促催化。
L-DOPA和甜菜色素产生方法
从蛋白质产生
在一个实施方式中，本发明的方法在体外进行，使得体外提供了产生L-DOPA或甜菜 色素所需的酪氨酸和酶。
在一个实施方式中，本发明提供了由酪氨酸产生L-DOPA的方法，其包括以下步骤：在足以产生L-DOPA的条件下，使CYP76AD1-β进化枝蛋白质和酪氨酸组合，从而产生 L-DOPA。
在一个实施方式中，本发明提供了由酪氨酸产生L-DOPA的方法，其包括以下步骤：在足以产生L-DOPA的条件下，使CYP76AD6、CYP76AD15或其组合和酪氨酸组合，从 而产生L-DOPA。
在另一个实施方式中，本发明提供了体外由酪氨酸产生L-DOPA的方法，其包括以下 步骤：在足以产生L-DOPA的条件下，使CYP76AD6、CYP76AD15或其组合和酪氨酸组 合，从而产生L-DOPA。
在另一个实施方式中，本发明提供了由酪氨酸产生甜菜色素的方法，其包括以下步骤： 在足以产生甜菜色素的条件下，使酪氨酸与CYP76AD6、CYP76AD1或其组合接触，从而产生甜菜色素。在一个实施方式中，方法还包括以下步骤：使酪氨酸和CYP76AD6、CYP76AD15或其组合，CYP76AD1或其组合与DOPA 4，5-双加氧酶(DOD)接触。
在另一个实施方式中，本发明提供了由酪氨酸产生甜菜色素的方法，其包括以下步骤： 在足以产生甜菜色素的条件下，使酪氨酸与CYP76AD1-β进化枝蛋白质和DOPA 4，5-双加 氧酶(DOD)以及可选的CYP76AD1接触，从而产生甜菜色素。
在另一个实施方式中，本发明提供了由酪氨酸产生甜菜色素的方法，其包括以下步骤： 在足以产生甜菜色素的条件下，使酪氨酸与CYP76AD6、CYP76AD15或其组合和DOPA4，5-双加氧酶(DOD)以及可选的CYP76AD1接触，从而产生甜菜色素。
在另一个实施方式中，本发明提供了产生甜菜色素混合物的方法，其包括以下步骤： 在足以产生甜菜红素和甜菜黄素的组合的条件下，使酪氨酸与CYP76AD6、CYP76AD15或其组合，CYP76AD1，DOPA 4，5-双加氧酶(DOD)和甜菜色素相关的葡糖基转移酶接触， 从而产生甜菜色素混合物。
在一个实施方式中，本发明中描述的产生甜菜色素在没有提供L-DOPA的情况下进行， 这是之前从未完成的。在一个实施方式中，甜菜色素包含甜菜红素和甜菜黄素。在一个实 施方式中，甜菜色素、甜菜红素和甜菜黄素可以用作食品着色剂或其它染料。
在一个实施方式中，甜菜红素产生红紫色。在一个实施方式中，甜菜黄素产生黄色。 在一个实施方式中，甜菜红素和甜菜黄素的组合产生橙色。在一个实施方式中，甜菜红素 和甜菜黄素的组合产生橙红色。
在另一个实施方式中，本发明提供了产生橙色染料的方法，其包括以下步骤：在足以 产生甜菜红素和甜菜黄素的组合的条件下，使酪氨酸与CYP76AD6、CYP76AD15或其组合，CYP76AD1，DOPA 4，5-双加氧酶(DOD)和甜菜色素相关的葡糖基转移酶接触，从而 产生橙色染料。
在另一个实施方式中，本发明提供了由酪氨酸产生甜菜黄素的方法，其包括以下步骤： 在足以产生甜菜黄素的条件下，使酪氨酸与CYP76AD6、CYP76AD15或其组合以及DOPA4，5-双加氧酶(DOD)接触，从而产生甜菜黄素。
在另一个实施方式中，本发明提供了产生黄色染料的方法，其包括以下步骤：在足以 产生甜菜黄素的条件下，使酪氨酸与CYP76AD6、CYP76AD15或其组合以及DOPA 4，5- 双加氧酶(DOD)接触，从而产生黄色染料。在一个实施方式中，所述黄色染料是食品着 色剂。
在一个实施方式中，本发明的方法产生一种或多种甜菜黄素。在一个实施方式中，甜 菜黄素包括仙人掌黄素I(谷氨酰胺-甜菜黄素)。在另一个实施方式中，甜菜黄素包括梨果 仙人掌黄素(脯氨酸-甜菜黄素)。在另一个实施方式中，甜菜黄素包括多巴黄素-己糖苷。 在另一个实施方式中，如在下文表2中所述，甜菜黄素包括甜菜黄素I(未知)。在另一个实施方式中，甜菜黄素包括组胺-甜菜黄素。在另一个实施方式中，甜菜黄素包括丙氨酸-甜菜黄素。在另一个实施方式中，甜菜黄素包括多巴胺-甜菜黄素。在另一个实施方式中，甜菜黄素包括缬氨酸-甜菜黄素。
在另一个实施方式中，本发明提供了由酪氨酸产生甜菜红素的方法，其包括以下步骤： 在足以产生甜菜红素的条件下，使酪氨酸与CYP76AD1、DOPA 4，5-双加氧酶(DOD)和甜菜色素相关的葡糖基转移酶接触，从而产生甜菜红素。
在另一个实施方式中，本发明提供了产生红紫色染料的方法，其包括以下步骤：在足 以产生甜菜红素的条件下，使酪氨酸与CYP76AD1、DOPA 4，5-双加氧酶(DOD)和甜菜 色素相关的葡糖基转移酶接触，从而产生红紫色染料。在一个实施方式中，所述红紫色染 料是食品着色剂。
在一个实施方式中，如本文所述的方法提供了糖基化甜菜色素(甜菜苷)而不是糖苷 配基(甜菜素)。在一个实施方式中，其中甜菜苷比甜菜素更稳定，因而存在显著的优点。甜菜素是高度不稳定的化合物，必须添加抗坏血酸以防止其降解。甜菜素更易被酶促和非酶促氧化降解。用于食物着色的甜菜色素提取物包含甜菜苷。由于不稳定性，甜菜素不适用于食品着色。
在另一个实施方式中，本发明的方法产生一种或多种甜菜红素。在一个实施方式中， 甜菜红素包括甜菜苷。在另一个实施方式中，甜菜红素包含异甜菜苷。在另一个实施方式 中，如下文表2中所述，甜菜红素包括甜菜红素I(未知)或甜菜红素II(未知)。在另一 个实施方式中，本发明的方法产生一种或多种甜菜红素片段，其中在一个实施方式中，甜 菜红素片段是甜菜素。
在另一个实施方式中，本发明提供了产生色素或染料的方法，其包括以下步骤：在足 以产生甜菜色素的条件下，使酪氨酸与CYP76AD6、CYP76AD15或其组合和DOPA 4，5- 双加氧酶(DOD)以及可选的CYP76AD1接触，从而产生甜菜色素，从而产生色素或染 料。
在另一个实施方式中，本发明提供了增加生物体、植物或植物部分中的一种或多种甜 菜色素水平的方法，其包括在所述生物体、植物或植物部分中引起或允许表达DOPA4，5- 双加氧酶(DOD)、甜菜色素相关的葡糖基转移酶，以及CYP76AD6、CYP76AD15或其组合、CYP76AD1或其组合，从而增加所述生物体、植物或植物部分中一种或多种甜菜色素 水平。在一个实施方式中，所述植物是观赏植物。在另一个实施方式中，所述植物是食物 作物。在一个实施方式中，生物体或植物不天然产生可检测水平的甜菜色素。
从核酸产生
在另一个实施方式中，本发明的方法在体内进行。在一个实施方式中，酪氨酸对细胞 是内源性的。在另一个实施方式中，将酪氨酸提供给细胞。在另一个实施方式中，细胞用增强酪氨酸可用性的基因转化。在一个实施方式中，该基因是AroG175(Tzin等，2012 NewPhytologist 194：430-439；基因库登录号JC233128.1，SEQ ID NO：28)、芳香族氨基酸羟化酶(AAH)(Pribat等，2010 Plant Cell 22：3410-3422；基因库登录号HQ003815.1，SEQ IDNO：29)或其组合。在一个实施方式中，通过转移编码酶的多核苷酸以将产生甜菜色 素所需的酶提供给细胞。
在一个实施方式中，本发明提供了产生L-DOPA的方法，其包括以下步骤：在足以产生L-DOPA的条件下，使生物体与编码CYP76AD1-β进化枝基因的核酸接触，从而产生 L-DOPA。
在另一个实施方式中，本发明提供了产生L-DOPA的方法，其包括以下步骤：在足以产生L-DOPA的条件下，使生物体与编码CYP76AD6、CYP76AD15或其组合的核酸接触， 从而产生L-DOPA。
在另一个实施方式中，本发明提供了产生L-DOPA的方法，其包括以下步骤：在足以产生L-DOPA的条件下，使生物体与编码CYP76AD6、CYP76AD15或其组合的核酸接触， 从而产生L-DOPA。
在一个实施方式中，生物体是植物。在一个实施方式中，植物是烟草植物。
在另一个实施方式中，本发明提供了产生甜菜色素的方法，其包括以下步骤：在足以 产生甜菜色素的条件下，使生物体与编码CYP76AD1-β进化枝基因的核酸、编码CYP76AD1-α进化枝基因的核酸或其组合接触，从而产生甜菜色素。
在另一个实施方式中，本发明提供了产生甜菜色素的方法，其包括以下步骤：在足以 产生甜菜色素的条件下，使生物体与编码CYP76AD6、CYP76AD15或其组合的核酸、编 码CYP76AD1的核酸或其组合接触，从而产生甜菜。
在一个实施方式中，所述方法还包括使包含酪氨酸的生物体与编码DOPA 4，5-双加氧酶 (DOD)的核酸接触的步骤。
在一个实施方式中，本发明中公开的编码基因的核酸特别包括CYP76AD6、CYP76AD15或其组合，CYP76AD1，和DOD，核酸一起存在于单个重组多核苷酸上，如 更详细描述在下文中的。
在另一个实施方式中，本发明提供了产生甜菜色素的方法，其包括以下步骤：在足以 产生甜菜色素的条件下，使生物体与编码CYP76AD6、CYP76AD15或其组合的核酸，编 码CYP76AD1的核酸，编码DOPA 4，5-双加氧酶(DOD)的核酸，以及编码甜菜色素相关 的葡糖基转移酶的核酸接触，从而产生甜菜色素。
在另一个实施方式中，本发明提供了产生橙色染料的方法，其包括以下步骤：在足以 产生甜菜色素的条件下，使包含酪氨酸的生物体与编码CYP76AD6、CYP76AD15或其组 合的核酸，编码CYP76AD1的核酸，编码核酸DOPA 4，5-双加氧酶(DOD)，以及编码甜 菜色素相关的葡糖基转移酶的核酸接触，从而产生橙色染料。
在另一个实施方式中，本发明中描述的产生甜菜色素在没有底物进料的情况下进行。
在另一个实施方式中，本发明提供了产生甜菜黄素的方法，其包括以下步骤：在足以 产生甜菜黄素的条件下，使包含酪氨酸的生物体与编码CYP76AD6、CYP76AD15或其组 合的核酸，编码DOPA 4，5-双加氧酶的核酸(DOD)，以及编码甜菜色素相关的葡糖基转移 酶的核酸接触，从而产生甜菜黄素。
在另一个实施方式中，本发明提供了产生黄色染料的方法，其包括以下步骤：在足以 产生甜菜黄素的条件下，使包含酪氨酸的生物体与编码CYP76AD6、CYP76AD15或其组 合的核酸，编码DOPA 4，5-双加氧酶(DOD)的核酸接触，从而产生黄色染料。
在另一个实施方式中，本发明提供了产生甜菜红素的方法，其包括以下步骤：在足以 产生甜菜红素的条件下，使包含酪氨酸的生物体与编码CYP76AD1的核酸、编码DOPA 4，5- 双加氧酶(DOD)的核酸、以及编码甜菜色素相关的葡糖基转移酶的核酸接触，从而产生甜菜红素。在一个实施方式中，产生甜菜红素的方法是主要产生甜菜红素的方法。
在另一个实施方式中，本发明提供了产生红紫色染料的方法，其包括以下步骤：在足 以产生甜菜红素的条件下，使包含酪氨酸的生物体与编码CYP76AD1的核酸、编码DOPA4，5-双加氧酶(DOD)的核酸、以及编码甜菜色素相关的葡糖基转移酶的核酸接触，从而 产生红紫色染料。
在一个实施方式中，上文所述的方法提供了产生天然红紫色染料的方法。在另一个实 施方式中，上文所述的方法提供了产生天然黄色染料的方法。在另一个实施方式中，上文 所述的方法提供了产生天然橙色染料的方法。在一个实施方式中，染料可以用于纺织品。
在一个实施方式中，生物体是植物。在另一个实施方式中，生物体是酵母。在另一个 实施方式中，生物体是细菌。在另一个实施方式中，生物体是藻类。
在一个实施方式中，本发明的方法在植物中进行。在一个实施方式中，植物中色素颜 色取决于植物中表达的其它天然或工程色素。因此，在一个实施方式中，本发明的方法产 生红色素、黄色素、橙色素和棕色素等，或本领域已知的任何色素颜色。
还应理解，通过改变CYP76AD6、CYP76AD15或其组合和/或CYP76AD1表达的比例，也可能改变色素颜色。
在另一个实施方式中，本发明提供了由酪氨酸产生甜菜色素的方法，其包括以下步骤： 在足以产生甜菜色素的条件下，使酪氨酸与编码CYP76AD6、CYP76AD15或其组合的核酸，编码DOPA 4，5-双加氧酶(DOD)和可选的编码CYP76AD1的核酸接触，从而产生甜 菜色素。
在另一个实施方式中，本发明提供了产生橙色染料的方法，其包括以下步骤：在足以 产生甜菜色素的条件下，使酪氨酸与编码CYP76AD1的核酸、编码CYP76AD6、 CYP76AD15或其组合的核酸、以及编码DOPA 4，5-双加氧酶(DOD)的核酸接触，从而产 生橙色染料。
在另一个实施方式中，本发明提供了由酪氨酸产生甜菜黄素的方法，其包括以下步骤： 在足以产生甜菜黄素的条件下，使酪氨酸与编码CYP76AD6、CYP76AD15或其组合的核酸，以及编码DOPA 4，5-双加氧酶(DOD)的核酸接触，从而产生甜菜黄素。
在另一个实施方式中，本发明提供了产生黄色染料的方法，其包括以下步骤：在足以 产生甜菜黄素的条件下，使酪氨酸与编码CYP76AD6、CYP76AD15或其组合的核酸，和 编码DOPA 4，5-双加氧酶(DOD)接触，从而产生黄色染料。
在另一个实施方式中，本发明提供了由酪氨酸产生甜菜红素的方法，其包括以下步骤： 在足以产生甜菜红素的条件下，使酪氨酸与编码CYP76AD1的核酸、和编码DOPA 4，5-双 加氧酶(DOD)的核酸接触，从而产生甜菜红素。
在另一个实施方式中，本发明提供了产生红紫染料的方法，其包括以下步骤：在足以 产生甜菜红素的条件下，使酪氨酸与编码CYP76AD1的核酸、编码DOPA 4，5-双加氧酶(DOD)的核酸、以及编码甜菜色素相关的葡糖基转移酶的核酸接触，从而产生红紫色染 料。
在一个实施方式中，本发明的染料是食品着色剂。在一个实施方式中，本发明用于产 生染料的方法可以应用于产生色素等。
在一个实施方式中，本发明提供了通过本发明的方法产生的或包括本发明的组合物的 食品着色剂、染料或色素。
在另一个实施方式中，本发明提供了在细胞中产生L-DOPA的方法，其包括以下步骤： 在足以产生L-DOPA的条件下，使所述细胞与包括编码CYP76AD6、CYP76AD15或其组 合的核酸的多核苷酸接触，从而产生L-DOPA。
在另一个实施方式中，本发明提供了在细胞中产生甜菜色素、橙色染料或其组合的方 法，其包括以下步骤：在足以产生甜菜色素的条件下，使所述细胞与编码CYP76AD6、CYP76AD15或其组合的核酸，编码CYP76AD1或其组合的核酸接触，从而产生甜菜色素、 橙色染料或其组合。
在另一个实施方式中，本发明提供了在细胞中产生甜菜黄素、黄色染料或其组合的方 法，其包括以下步骤：在足以产生甜菜黄素的条件下，使所述细胞与编码CYP76AD6、CYP76AD15或其组合的核酸，以及编码DOPA 4，5-双加氧酶(DOD)的核酸接触，从而产 生甜菜黄素、黄色染料或其组合。
在另一个实施方式中，本发明提供了在细胞中产生甜菜红素、红紫色染料或其组合的 方法，其包括以下步骤：在足以产生甜菜红素的条件下，使所述细胞与编码CYP76AD1的核酸、编码DOPA 4，5-双加氧酶(DOD)的核酸、以及编码甜菜色素相关的葡糖基转移 酶的核酸接触，从而产生甜菜红素、红紫色染料或其组合。
在一个实施方式中，上文所述的细胞是细胞系的一部分。
在一个实施方式中，通过本发明的方法获得的甜菜色素(包括甜菜黄素、甜菜红素或 其组合)在细胞系中产生。在一个实施方式中，细胞系是植物细胞系。在一个实施方式中， 植物细胞系是烟草BY2或拟南芥T87。
在另一个实施方式中，通过本发明的方法获得的L-DOPA在细胞系中产生。在一个实 施方式中，细胞系是烟草细胞系。在一个实施方式中，烟草细胞系是BY2。
在另一个实施方式中，本发明提供了产生L-DOPA的代谢物的方法，其包括以下步骤： 在足以产生L-DOPA的条件下，通过使细胞与编码CYP76AD6、CYP76AD15或其组合的 核酸接触以产生L-DOPA，并且允许L-DOPA代谢物的形成，或进一步使所述细胞与编码 代谢L-DOPA的酶的核酸接触，从而产生L-DOPA的代谢物。在一个实施方式中，L-DOPA 代谢物是儿茶酚胺、苄基异喹啉生物碱、甜菜色素、黑素或其组合。在一个实施方式中， 儿茶酚胺是多巴胺、去甲肾上腺素或其组合。在一个实施方式中，苄基异喹啉生物碱是阿 片剂，其在一个实施方式中是吗啡。
在一个实施方式中，代谢L-DOPA的酶是DOPA 4，5-双加氧酶(DOD)。在另一个实施方式中，酶是CYP76AD1。在另一个实施方式中，酶是葡糖基转移酶。在一个实施方式中， 葡糖基转移酶是环-DOPA 5-O-葡糖基转移酶或甜菜素-5-O-葡糖基转移酶。在一个实施方式中，环-DOPA 5-O-葡糖基转移酶是紫茉莉基因环-DOPA 5-O-葡糖基转移酶(cDOPA5GT)。
在另一个实施方式中，代谢L-DOPA的酶是DOPA脱羧酶。在另一个实施方式中，代谢L-DOPA的酶是多巴胺β-羟化酶。在另一个实施方式中，代谢L-DOPA的酶是芳香族 L-氨基酸脱羧酶。在另一个实施方式中，代谢L-DOPA的酶是儿茶酚-O-甲基转移酶。在另 一个实施方式中，代谢L-DOPA的酶是苯乙醇胺N-甲基转移酶。
在另一个实施方式中，代谢L-DOPA的酶是去甲乌药碱(norcoclaurine)合成酶(NCS)。 在另一个实施方式中，代谢L-DOPA的酶是去甲乌药碱6-O-甲基转移酶(6OMT)。在另一 个实施方式中，代谢L-DOPA的酶是乌药碱(coclaurine)-N-甲基转移酶(CNMT)。在另 一个实施方式中，代谢L-DOPA的酶是3′-羟基-N-甲基乌药碱4′-O-甲基转移酶(4′OMT)。
基因转化方法
在一个实施方式中，本发明提供了包括使细胞与本文所述的多核苷酸或表达载体“接 触”的步骤的方法。
在一个实施方式中，接触包括用本发明的核酸分子或构建体转化细胞。用核酸序列转 化植物细胞的方法是本领域已知的。如本文所用，术语“转化”(tranformation)或“转化” (transforming)可以指外源DNA(例如DNA构建体，包括表达载体)进入并改变将受体细胞为转化的、基因改造的或转基因细胞的过程。转化可以是稳定的，其中核酸序列被整合到植物基因组中并且因此呈现稳定和遗传的性状；或瞬时的，其中核酸序列由转化的细胞表达但未整合到基因组中，并且因此呈现瞬时的性状。
在一个实施方式中，本发明提供了转基因植物。在一个实施方式中，本发明的转基因 植物用外源或异源基因进行基因改造。在一个实施方式中，本发明的转基因植物用于生物 燃料。在另一个实施方式中，本发明的转基因植物是食物作物植物。
在另一个实施方式中，本发明提供了顺基因植物。在一个实施方式中，本发明的顺基 因植物是基因改造的，但不含外源或异源基因。根据该方面并且在一个实施方式中，甜菜 色素酶可以在已包含甜菜色素酶的植物中过表达，从而改变甜菜红素和甜菜黄素之间的比 例。在一个实施方式中，本发明的食物作物是顺基因的。
任何方法或递送系统可以用于在宿主细胞(例如植物原生质体)中递送和/或转化(植 物细胞)/转染(藻类细胞)编码CYP76AD6和同源物、旁系同源物等的核酸载体。载体 可以单独或与其它试剂组合递送至宿主细胞。也可以使用瞬时表达系统。也可以使用同源 重组。
在一个实施方式中，通过转化将如本文所述的多核苷酸提供给本发明的细胞。如本领 域普通技术人员已知的，可以通过各种各样的手段来完成转化。这样的方法包括但不限于 粒子轰击介导的转化(例如，Finer等，1999，Curr.Top.Microbiol.Immunol.，240：59)、 原生质体电穿孔(例如Bates，1999，111：359)，病毒感染(例如Porta和Lomonossoff，1996，Mol.Biotechnol.5：209)、显微注射、和脂质体注射。可用于促进细胞摄取核酸的 其它示例性递送系统包括磷酸钙和细胞内转运的其它化学介质、显微注射组合物和同源重组组合物(例如用于将基因整合入细胞染色体内的预选位置)。替代方法可以涉及例如使用脂质体、电穿孔或增加游离(或“裸”)DNA摄取的化学品，使用病毒或花粉的转化， 以及使用显微投影。标准分子生物学技术在本领域中是常见的(例如，Sambrook等，1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，New York)。
植物转化
存在将外源基因引入单子叶植物和双子叶植物两者中的各种方法(参见PotrykusI 1991. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 42，205-225；Shimamoto K.等，1989.Nature 338，274- 276)。转化方法可以包括例如但不限于使用脂质体、电穿孔、增加游离DNA摄取的化学 品、将DNA直接注入植物、粒子枪轰击、使用病毒和显微投影的转化。
在一个实施方式中，通过农杆菌渗入，在一个实施方式中，通过农杆菌介导的转化(例 如Komari等，1998，Curr.Opin.Plant Biol.，1：161)，包括花卉渗入转化，以将本文所述的 多核苷酸提供给细胞。在一个实施方式中，通过将含有所需一个或多个基因的根癌农杆菌 悬浮液注入植物叶中，农杆菌渗入诱导植物中基因的瞬时表达以产生期望的蛋白质。在一 个实施方式中，转化可以通过农杆菌介导的基因转移进行。农杆菌介导的系统包括使用含 有整合到植物基因组DNA中的确定的DNA片段的质粒载体。植物组织的接种方法取决于 植物物种和农杆菌递送系统而变化。转化可以用任何合适的组织外植体进行，组织外植体 提供开始全植物分化的良好来源(参见Horsch等，1988.Plant Molecular BiologyManual A5， 1-9，Kluwer Academic Publishers，Dordrecht)。
植物转化方法在美国专利申请公开US 20110209247；US 20110113514；US20100199371；US 20070079396；US 20080307541；US 20030028913；和US20030196219； 和美国专利US 5,015,580；US 5,550,318；US 5,538,880；US 6,160,208；US 6,399,861；US6,403,865；US 5,635,055；US 5,824,877；US 5,591,616；US 5,981,840和US 6,384,301中充 分描述，其全部内容通过引用并入本文。
对于基于根癌农杆菌的植物转化系统，在一个实施方式中，存在于转化构建体上的其 它部分将包括T-DNA左边界和右边界序列以促进重组多核苷酸并入植物基因组中。
在一个实施方式中，转化可以通过直接DNA摄取进行。存在多种将DNA直接转移到植物细胞中的方法。在电穿孔中，原生质体短暂暴露于强电场，打开微孔以允许DNA进 入。在显微注射中，使用微量移液管将DNA直接机械注入细胞。在微粒轰击中，DNA被 吸附在微弹如硫酸镁晶体或钨粒上，并且微弹被物理加速进入细胞或植物组织。
在另一个实施方式中，使用基因枪技术或电穿孔，使用合适的植物病毒通过病毒转化 (转导)将如本文所述的多核苷酸提供给细胞。
在一个实施方式中，将本发明多核苷酸的异源基因整合到植物染色体中。在另一个实 施方式中，本发明多核苷酸的异源基因保持在染色体外。在一个实施方式中，异源基因位 于细胞内的质粒中。本领域普通技术人员已知可用于任一应用的质粒。
在一个实施方式中，DNA被随机插入，即在非特定位置处插入到目标植物系的基因组 中。在另一个实施方式中，DNA被靶向插入以实现位点特异性整合，以便例如取代基因组中的现有基因、使用植物基因组中已有的启动子、或将重组多核苷酸插入已知对基因表达有活性的预定位点。存在已知在植物中起作用的几个位点特异性重组系统，包括cre-lox和FLP-FRT。
在一个实施方式中，本发明的转化方法在培养基上和对照环境中的组织培养物上实践。 “培养基”是指用于在体外生长细胞的多种营养混合物，即在完整活生物体外。受体细胞 靶标包括但不限于分生组织细胞、愈伤组织、未成熟胚和配子细胞，如小孢子、花粉、精 子和卵细胞。预期可再生可育植物的任何细胞可用作受体细胞。愈伤组织可以从组织来源 产生，包括但不限于未成熟胚、幼芽顶端分生组织和小孢子等。能够作为愈伤组织增殖的 细胞也是用于基因转化的受体细胞。用于制造本发明的基因改造植物的实用转化方法和材 料，例如各种培养基和受体靶细胞、未成熟胚的转化和随后可育的基因改造植物的再生在 本领域中是已知的。
在另一个实施方式中，其中将多核苷酸引入植物细胞中，可以在任何植物器官(包括 叶、茎、根、花、种子、块茎、或果实或其组合)中表达或检测到甜菜色素。
在另一个实施方式中，本发明的方法可以在整个植物中进行，使得整个植物如本文所 述表达甜菜色素。另外在一个实施方式中，本发明的组合物可以描述已被基因改造以表达 本发明的多核苷酸或多肽的整个植物。
藻类转化
在一个实施方式中，转化藻类的方法包括上文所述的任何方法。在一个实施方式中， 使用玻璃珠辅助转化、粒子枪介导(生物射弹)转化、用纤维素分解酶处理以削弱其细胞 壁、或同源重组以完成藻类的转化。
另一方面，本发明的核酸可以转化到藻类中。在一个实施方式中，藻类是单细胞藻类。 在另一个实施方式中，藻类是多细胞藻类。在一个实施方式中，藻类是蓝细菌、硅藻、衣藻、杜氏藻或血球。基因可以在藻类中过表达。甜菜色素、DOPA或其组合可以通过这种 转基因藻类产生。用于藻类转化的方法在本领域中是熟知的，并在美国专利申请公开US20150011008；US 20150004704；US 20130130389；US 20120094385；US 20120034698； US20110300633；和US 20040133937中充分描述，其通过引用整体并入本文。
在一个实施方式中，本发明的基因改造的藻类可用于生物燃料生产。
酵母转化
另一方面，本发明的核酸可以转化到酵母中。基因可以在酵母中过表达。甜菜色素、 DOPA或其组合可通过这种转基因酵母产生。用于酵母转化的方法在下文中描述并且是本 领域公知的，并且在美国专利申请公开US 20090264320；US 20010031724；US20030049785；US 20050158861；US 20070264716；US 20090325247；和US 20100190223 中充分描述，其全部内容通过引用并入本文。
病毒转化
在另一个实施方式中，本发明的核酸可以转化到病毒中。在另一个实施方式中，核酸 可以在病毒中过表达。甜菜色素、染料、色素、DOPA或其组合可以通过这种病毒过表达而产生。
基因转化标志物
在一个实施方式中，在任何一个实验中，DNA仅被引入到小百分比的靶细胞中。
在一个实施方式中，包含转移的外源DNA的细胞可以通过颜色识别，如实施例6中针 对酵母所述。在一个实施方式中，表达CYP76AD1和DODA的细胞是红紫色的。在一个 实施方式中，表达CYP76AD6、CYP76AD15或其组合、以及DODA的细胞是黄色的。在 一个实施方式中，表达CYP76AD1、CYP76AD6、CYP76AD15或其组合、以及DODA的 细胞是橙色或橙红色的。
在另一个实施方式中，使用标志物基因来提供用于识别通过接收基因改造的DNA构建 体并将其整合到其基因组中而稳定转化的那些细胞的有效系统。
在另一个实施方式中，选择基因提供赋予对选择性试剂(如抗生素或除草剂)抗性的 选择性标志物。可能转化的细胞暴露于选择性试剂。在存活细胞的群体中，通常是其中赋 予抗性的基因已经以足够的水平整合和表达以允许细胞存活的那些细胞。可以进一步测试 细胞以确认外源DNA的稳定整合。
有用的选择性标志物基因包括赋予对抗生素(例如卡那霉素(nptII)、潮霉素B(aph IV)、 nptII、hpt、aadA和庆大霉素(aac3和aacC4))或对除草剂(例如草铵膦(bar或pat)和 草甘膦(EPSPS))的抗性的那些。在另一个实施方式中，选择基因是抗代谢物。在一个实 施方式中，抗代谢物是dhf。
还可以使用提供视觉识别转化体的能力的可筛选标志物，例如表达有色或荧光蛋白(如 cat、lacZ、uidA、萤光素酶或绿色荧光蛋白(GFP))的基因，或已知各种发色底物的表达 β-葡糖醛酸酶的基因或uidA基因(GUS)。还预期可筛选标志物和可选择标志物的组合对于识别转化的细胞将是有用的。
在一个实施方式中，选择基因是阳性选择标志物基因，其以非毒性试剂为条件，非毒 性试剂可以是用于生长的底物或诱导转化的组织的生长和分化。
在一个实施方式中，暴露于选择性试剂并存活的细胞或在筛选测定中评分为阳性的细 胞可以在再生培养基中培养并允许其成熟为植物。在转移到温室或生长室进行成熟之前， 发育中的幼苗可以转移到土壤较少的植物生长混合物中，并且例如在约85％相对湿度， 600ppm CO2和25-250微爱因斯坦m-2s-1的环境控制室中硬化。植物优选在生长室或温室中 成熟。取决于最初的组织，植物在转化体被识别后约6周至10个月再生。在再生期间， 细胞在约19至28℃的固体培养基上生长成植物。在再生植物达到芽和根发育阶段后，可 将其转移至温室进行进一步生长和测试。植物可以使用本领域普通技术人员已知的常规植 物育种方法和所生产的种子进行授粉。
子代可以从转化的植物中回收并测试外源重组多核苷酸的表达。有用的测定包括，例 如“分子生物学”测定，如南方印迹法和北方印迹法和PCR；“生化”测定，如检测RNA(例如双链RNA)或蛋白质产物的存在，例如通过免疫学手段(ELISA和北方印迹法)或 通过酶促功能；植物部分测定，如叶或根测定；以及还通过分析整个再生植物的表型。
本领域普通技术人员将能够选择用于以相对完整的状态引入编码核酸序列的合适载 体。因此，将产生携带引入的编码核酸的宿主细胞(例如植物原生质体)的任何载体应该 是足够的。载体的选择或是否使用载体通常由选定的转化方法来引导。
启动子
另一方面，细胞、组织或器官特异性启动子可用于转化本发明的基因并使其在特定的 细胞、组织或器官中表达。例如，果实特异性启动子可用于将本发明的基因转化为植物(例 如番茄)或植物细胞以在果实(例如番茄果实)中产生甜菜色素。
在一个实施方式中，本发明的重组多核苷酸包括至少一个启动子。在一个实施方式中， 本发明的重组多核苷酸包括控制在相同的阅读框中的串联核酸的表达的单个启动子。在另 一个实施方式中，本发明的重组多核苷酸中的每种核酸在单独启动子的控制下。
在一个实施方式中，启动子是组成型启动子。在一个实施方式中，组成型启动子是CaMV 35S启动子。在另一个实施方式中，组成型启动子是冠瘿碱启动子。在另一个实施 方式中，组成型启动子是单子叶植物启动子。在另一个实施方式中，组成型启动子是植物 泛素启动子(Ubi)。在另一个实施方式中，组成型启动子是拟南芥泛素-10启动子。在另 一个实施方式中，组成型启动子是番茄泛素10启动子(SlUb10)。在另一个实施方式中， 组成型启动子是水稻肌动蛋白1启动子(Act-1)。在另一个实施方式中，组成型启动子是 玉米醇脱氢酶1启动子(Adh-1)。
在另一个实施方式中，启动子是诱导型启动子。在一个实施方式中，诱导型启动子是 半乳糖诱导型启动子。在另一个实施方式中，诱导型启动子选自AlcR/AlcA(乙醇诱导型)； GR融合、GVG、和pOp/LhGR(地塞米松诱导型)；XVE/OlexA(β-雌二醇诱导型)；和热 休克诱导。在另一个实施方式中，诱导型启动子选自四环素、地塞米松、铜、水杨酸和除 草剂诱导型启动子。在另一个实施方式中，mGal4：VP16/UAS或pOp/LhG4可以用于反式 激活，并且alc-开关、GVE/VGE、和XVE系统可以用于化学诱导。这些方法在本领域中 是已知的。
在另一个实施方式中，启动子是组织特异性或发育阶段特异性启动子。在另一个实施 方式中，启动子是合成启动子，其通过将来自不同来源的启动子区的主要部分汇集在一起 而产生。
在一些实施方式中，果实特异性启动子可以用于将本发明的基因与一种或多种其它基 因(例如花青素基因)的组合转化到植物(例如番茄)或植物细胞中以在果实(例如番茄 果实)中产生甜菜色素。在一个实施方式中，可以将本发明的基因转化到转基因植物(例如已经用重组花青素基因转化的转基因番茄植物)或植物细胞中以在果实(例如番茄果实)中产生甜菜色素。
因此，在一个实施方式中，本文所述的任何多核苷酸的启动子可以是果实特异性启动 子。在一个实施方式中，果实特异性启动子是E8启动子。在另一个实施方式中，启动子可以是花特异性启动子。在一个实施方式中，花特异性启动子是查耳酮合成酶(CHS)启 动子。在一个实施方式中，CHS启动子是矮牵牛CHS启动子。在另一个实施方式中，启 动子可以是根特异性启动子。在另一个实施方式中，启动子可以是茎特异性启动子。在另 一个实施方式中，启动子可以是叶特异性启动子。在另一个实施方式中，启动子可以是种 子特异性启动子。在另一个实施方式中，启动子可以是块茎特异性启动子。
在一个实施方式中，启动子可以对组织的一部分是特异性的。例如，在一个实施方式 中，启动子可以对花瓣、雄蕊、花药、柱头或其组合是特异性的。
在另一个实施方式中，相同的核酸可以在不同的非组成型启动子序列下表达，以工程 化在不同器官中或同一器官的不同部分中呈现两种颜色的色素沉着和/或表达甜菜红素和 甜菜黄素的生物体。例如，在一个实施方式中，CYP76AD6或CYP76AD15或其同源物可以在花特异性启动子下表达，并且CYP76AD1可以在果实特异性启动子下表达，使得果实 由于存在甜菜红素和甜菜黄素而是红紫色的，并且花由于仅存在甜菜黄素而是黄色的。此外，诱导型启动子可用于工程化在不同器官中或同一器官的不同部分中呈现两种颜色的色素沉着和/或表达甜菜红素和甜菜黄素的生物体。
在另一个实施方式中，启动子可以对发育阶段是特异性的。例如在一个实施方式中， 启动子可以对阶段1是特异性的，在一个实施方式中，阶段1是当花长约为1cm时。在另一个实施方式中，发育阶段是阶段2，在一个实施方式中，阶段2是当花长约为2cm时。 在另一个实施方式中，发育阶段是阶段3，在一个实施方式中，阶段3是当花长约为3cm 时。在另一个实施方式中，发育阶段是阶段4，在一个实施方式中，阶段4是当花长约为 4cm时。在另一个实施方式中，发育阶段是阶段5，在一个实施方式中，阶段5是当花长 约为5-6cm时。
在一个实施方式中，启动子可以对组织和发育阶段是特异性的。在一个实施方式中， 果实特异性E8启动子在成熟中和成熟果实中表达。在另一个实施方式中，花特异性CHS启动子在花成熟期间在花瓣中表达。
基因沉默应用
在一个实施方式中，本发明提供了治疗或抑制受试者中的多巴胺反应性疾病的方法， 其包括施用包含高水平CYP76AD1-β进化枝多肽的食物作物、细胞或细胞系的步骤，从而 为所述受试者提供L-DOPA，从而治疗或抑制所述受试者中的所述多巴胺反应性疾病。在一个实施方式中，所述食物作物、细胞或细胞系内源性产生甜菜色素。在一个实施方式中，所述食物作物、细胞或细胞系中的DOPA 4，5-双加氧酶、环-DOPA 5-O-葡糖基转移酶、和CYP76AD1-α进化枝基因的表达已被抑制。
在一个实施方式中，本发明提供了在包含甜菜色素的植物中产生黄色植物部分的方法， 其包括沉默CYP76AD1基因表达。
在一个实施方式中，本发明提供了在包含甜菜色素的植物中产生绿色植物部分的方法， 其包括沉默CYP76AD1和CYP76AD6、CYP76AD15或其组合的基因表达。
在一个实施方式中，植物部分包括叶、茎、根、花、块茎、果实、种子或其组合。
在一个实施方式中，基因沉默是基因敲落，在一个实施方式中是基因的表达降低。在 一个实施方式中，病毒诱导的基因沉默用于沉默编码CYP76AD1和/或CYP76AD6的基因。在一个实施方式中，病毒诱导的基因沉默(VIGS)是利用RNA介导的抗病毒防御机制的 技术。在感染未修饰病毒的植物中，该机制针对病毒基因组特异性靶向。但是，在病毒载 体携带来源于宿主基因的插入物的情况下，可以将该过程针对相应的mRNA另外靶向。这 种方法在下文的实施例1和3中举例说明。
可用于本发明的其它基因沉默方法包括用反义寡核苷酸、核酶、RNA干扰来对三个主 要非翻译区/微小RNA进行基因沉默。这种方法在本领域中是已知的，并且在下文的实施例1中进行了描述。
在另一个实施方式中，使用本领域已知的方法敲落编码CYP76AD1和/或CYP76AD6、CYP76AD15或其组合的基因。
在一个实施方式中，植物包含甜菜色素，甜菜色素在一个实施方式中是甜菜红素，并 且在另一个实施方式中是甜菜黄素。
在一个实施方式中，基因沉默的方法在包含甜菜色素的植物中进行。在一个实施方式 中，包含甜菜色素的植物来自石竹植物目。
在一个实施方式中，基因沉默方法在包括仙人掌、康乃馨、苋菜、冰植物、甜菜和许多食肉植物的石竹目中进行。在另一个实施方式中，该植物来自石竹科亚目。在另一个实施方式中，植物来自蓼科亚目。在另一个实施方式中，该植物来自选自以下石竹植物目的科中的一个科：毛果科；番杏科；苋科；回欢草科；钩枝藤科；翼萼茶科；苔科；落葵科； 仙人掌科；石竹科；龙树科；双钩叶科；茅膏菜；露叶茅膏菜科；瓣鳞花科；吉粟草科； 浜藜叶科；蓬粟草科；麻粟草科；黄尾蓬科；灯粟草科；鬼椒草科；粟米草科；水卷耳科； 猪笼草科；紫茉莉科；唐松木科；商陆科；蓝雪科；蓼科；马齿苋科；棒木科；肉穗果科； 油蜡树科；鹂眼果科；土人参科；和柽柳科。
在一些实施方式中，使用本领域技术人员已知的程序和方法使用PCR技术制备本发明 的多核苷酸。在一些实施方式中，该程序涉及两个不同DNA序列的合并(参见例如“Current Protocols in Molecular Biology”，eds.Ausubel等，John Wiley&Sons，1992)。
多核苷酸
在一个实施方式中，本发明提供了包含编码CYP76AD6的核酸的重组多核苷酸。在一 个实施方式中，编码CYP76AD6的核酸序列包括：
在一个实施方式中，编码CYP76AD6的核酸序列包括以下序列：
在一个实施方式中，编码CYP76AD6的核酸由CaMV 35S启动子驱动(pDOPA1；图19)。在另一个实施方式中，编码CYP76AD6的核酸由番茄泛素10启动子(S1Ub10)驱 动(pDOPA2；图19)。
在一个实施方式中，编码CYP76AD6、CYP76AD15或其组合的核酸与AroG175和芳 香族氨基酸羟化酶(AAH)一起表达。
在一个实施方式中，包括编码CYP76AD6、CYP76AD15或其组合的核酸的多核苷酸还包含新霉素磷酸转移酶II(nptII)基因，其在一个实施方式中赋予卡那霉素抗性。
在另一个实施方式中，本发明提供了包括编码CYP76AD1-α进化枝基因的核酸的重组 多核苷酸。在一个实施方式中，CYP76AD1-α进化枝基因包含CYP76AD1。在一个实施方 式中，编码CYP76AD1的核酸序列包括：
在另一个实施方式中，CYP76AD1-α进化枝基因包含A.Crocuentus，籽粒苋(CYP76AD2，登录号AET43291.1；SEQ ID NO：15)；M.jalapa，紫茉莉(CYP76AD3， 登录号AET43292.1；SEQ ID NO：16)；C.cristata，鸡冠花(CYP76AD4，登录号AGI78466.1； SEQ IDNO：17)；或其组合。
在一个实施方式中，本发明提供了包括编码DOPA 4，5-双加氧酶(DOD)的核酸的重组多核苷酸。在一个实施方式中，DOD是甜菜DODA1(BvDODA1)。在一个实施方式 中，编码BvDODA1的核酸序列包括：
aaaacaagaagaaaacaaaacaaccttttatataactagaaagcaacaaaaaaaaaagaatgaaaatgatgaatggtgaagatgctaatgatcaaatgatcaaagaaagcttcttcataacacatggaaacccaatattaacagtagaagacacacatccattaagacctttctttgaaacttggagagagaaaatcttttctaagaaacctaaggcaattcttattatttctggtcattgggaaactgttaaacctactgttaatgctgtccatatcaatgatactatccatgattttgatgactatcctgctgctatgtaccagttcaagtatccagctcctggggaaccagaattggcaagaaaagtagaggaaattctgaaaaaatcgggtttcgaaacggcggaaactgatcaaaaacgtgggcttgatcatggtgcatgggtacctctaatgctaatgtatcctgaggctgatataccagtatgtcagctctcagttcagccgcatttagatggaacataccattacaacttaggacgagcattggctcccttgaaaaacgacggcgtattaatcattggttcaggaagtgcaactcaccctttggatgaaactcctcattattttgatggagttgcaccttgggcagctgcctttgattcatggcttcgtaaagctctcattaatggaaggtttgaagaagtgaatatatatgaaagcaaagcaccaaattggaaattagcacatcctttcccagaacatttttatccattgcatgttgttcttggcgctgctggtgaaaaatggaaggcagagcttattcatagcagttgggatcatggcaccttgtgtcatggctcctacaagttcacttcagcctagttttacttttaaacactatgtctacagtctatgttattgtatttggtaatttggtatgtggtgttgtttttgttttattcttttgagttattgtacttggtatttggtgttgttttcatttggtgcataattcttttagtctatatattgctattcttttgaatgaggaataaatcgcgagctcgatgtaatagtttgttttattgtttcaaatctatcattatatatatatatatattattaaaaaaaaattattgtgttactc gcaaaaaaa(SEQ ID NO:33)。在一个实施方式中，DOD不是紫茉莉DOD。
一个实施方式中，本发明提供了包括编码甜菜色素相关的葡糖基转移酶的核酸的重组 多核苷酸。在一个实施方式中，编码甜菜色素相关的葡糖基转移酶的核酸序列是编码环 -DOPA 5-O-葡糖基转移酶(cDOPA5GT)的核酸序列。在一个实施方式中，cDOPA5GT来 自紫茉莉。在一个实施方式中，编码cDOPA5GT的核酸序列包括：
在一个实施方式中，几个核酸如本文所述组合成单个重组多核苷酸。在一个实施方式 中，本发明提供了包括编码CYP76AD6、CYP76AD15或其组合的核酸和编码DOD的核酸的重组多核苷酸。在另一个实施方式中，本发明提供了包括编码CYP76AD1的核酸和编码DOD的核酸的重组多核苷酸。在另一个实施方式中，本发明提供了包括编码CYP76AD1 的核酸和编码CYP76AD6的核酸的重组多核苷酸。在另一个实施方式中，本发明提供了包 括编码CYP76AD1的核酸，编码CYP76AD6、CYP76AD15或其组合的核酸，以及编码 DOD的核酸的重组多核苷酸。
在另一个实施方式中，将几种核酸掺入细胞中，但每种核酸是如本文所述的单独的多 核苷酸。
在一个实施方式中，本发明的多核苷酸包括编码CYP76AD6、CYP76AD15或其组合的核酸序列和编码CYP76AD1的核酸序列。在另一个实施方式中，本发明的多核苷酸包括 编码CYP76AD6、CYP76AD15或其组合的核酸序列和编码DOD酶的核酸序列。在另一个 实施方式中，本发明的多核苷酸包括编码CYP76AD1的核酸序列和编码DOD酶的核酸序 列。在另一个实施方式中，本发明的多核苷酸包括编码CYP76AD6、CYP76AD15或其组 合的核酸序列，编码CYP76AD1的核酸序列，以及编码DOD酶的核酸序列。在另一个实 施方式中，本发明的多核苷酸包括编码CYP76AD6、CYP76AD15或其组合的核酸序列， 编码CYP76AD1的核酸序列，以及编码甜菜色素相关的葡糖基转移酶的核酸序列。在另一 个实施方式中，本发明的多核苷酸包括编码CYP76AD6、CYP76AD15或其组合的核酸序 列，编码DOD酶的核酸序列，以及编码甜菜色素相关的葡糖基转移酶的核酸序列。在另 一个实施方式中，本发明的多核苷酸包括编码CYP76AD1的核酸序列、编码DOD酶的核 酸序列、以及编码甜菜色素相关的葡糖基转移酶的核酸序列。在另一个实施方式中，本发 明的多核苷酸包括编码CYP76AD6、CYP76AD15或其组合的核酸序列，编码CYP76AD1 的核酸序列，编码DOD酶的核酸序列，以及编码甜菜色素相关的葡糖基转移酶的核酸序 列。
在另一个实施方式中，上文描述的任何重组多核苷酸还包括甜菜色素相关的葡糖基转 移酶。在一个实施方式中，甜菜色素相关的葡糖基转移酶是环-DOPA 5-O-葡糖基转移酶或 甜菜素-5-O-葡糖基转移酶。在一个实施方式中，环-DOPA 5-O-葡糖基转移酶是紫茉莉基因 环-DOPA 5-O-葡糖基转移酶(cDOPA5GT)(SEQ ID NO：2)。
在另一个实施方式中，本发明提供了包括编码CYP76AD1的核酸，编码CYP76AD6、CYP76AD15或其组合的核酸，编码DOPA 4，5-双加氧酶(DOD)的核酸，以及编码甜菜色 素相关的葡糖基转移酶的核酸序列的重组多核苷酸，其中所述核酸在相同的阅读框中。
在另一个实施方式中，本发明提供了包括编码CYP76AD1的核酸、编码DOPA 4，5-双加氧酶(DOD)的核酸、以及编码甜菜色素相关的葡糖基转移酶的核酸序列的重组多核苷酸，其中所述核酸在相同的阅读框中。
在另一个实施方式中，本发明提供了包括串联表达的编码CYP76AD6、CYP76AD15或其组合的核酸，以及编码DOPA 4，5-双加氧酶(DOD)的核酸的重组多核苷酸。
在另一个实施方式中，本发明提供了包括串联表达的编码CYP76AD1、CYP76AD6、CYP76AD15或其组合，编码DOPA 4，5-双加氧酶(DOD)的核酸，以及编码甜菜色素相关 的葡糖基转移酶的核酸序列的核酸的重组多核苷酸。
在一个实施方式中，如本文所述的多核苷酸包括在相同的阅读框中的多个核酸序列。 在一个实施方式中，如本文所述的多核苷酸包括串联表达的多个核酸序列。
在一个实施方式中，本发明的多核苷酸包括编码CYP76AD1的核酸、编码DOPA 4，5-双加氧酶(DOD)的核酸、以及编码甜菜色素相关的葡糖基转移酶的核酸序列，其中所述 核酸在相同的阅读框中。在一个实施方式中，DOD基因在CaMV 35S启动子下。在一个实 施方式中，CYP76AD1基因在CaMV 35S启动子下。在一个实施方式中，甜菜色素相关的 葡糖基转移酶基因在拟南芥泛素-10启动子下。在一个实施方式中，多核苷酸还包括卡那 霉素抗性基因。在一个实施方式中，多核苷酸是pX11载体，如下文实施例8中所述。在 一个实施方式中，pX11载体的核酸序列包括(SEQ ID NO：19)。
在另一个实施方式中，CYP76AD1基因在E8启动子(pX11(E8)，SEQ ID NO：20； 图15)下。在另一个实施方式中，CYP76AD1基因在CHS启动子(pX11(CHS)SEQ ID NO：21；图15)下。
在另一个实施方式中，本发明的多核苷酸包括编码CYP76AD6、CYP76AD15或其组合的核酸，编码DOPA 4，5-双加氧酶(DOD)的核酸，以及编码甜菜色素相关的葡糖基转 移酶的核酸，其中所述核酸在相同的阅读框中。在一个实施方式中，DOD基因在CaMV 35S 启动子下。在一个实施方式中，CYP76AD6、CYP76AD15或其组合基因在CaMV 35S启 动子下。在一个实施方式中，甜菜色素相关的葡糖基转移酶基因在拟南芥泛素-10启动子 下。在一个实施方式中，多核苷酸还包括卡那霉素抗性基因。在一个实施方式中，多核苷 酸是pX13载体，如下文实施例14中所述。
在另一个实施方式中，CYP76AD6、CYP76AD15或其组合基因在E8启动子下。在另 一个实施方式中，CYP76AD6、CYP76AD15或其组合基因在CHS启动子下。
在另一个实施方式中，本发明的多核苷酸包括编码CYP76AD6、CYP76AD15或其组合的核酸，编码CYP76AD1的核酸，编码DOPA 4，5-双加氧酶(DOD)的核酸，以及编码 甜菜色素相关的葡糖基转移酶的核酸序列，其中所述核酸在相同的阅读框中。在一个实施 方式中，DOD基因在CaMV 35S启动子下。在一个实施方式中，CYP76AD6、CYP76AD15 或其组合基因在CaMV 35S启动子下。在一个实施方式中，CYP76AD1基因在CaMV 35S 启动子下。在一个实施方式中，甜菜色素相关的葡糖基转移酶基因在拟南芥泛素-10启动 子下。在一个实施方式中，多核苷酸还包含卡那霉素抗性基因。在一个实施方式中，多核 苷酸是pX12载体，如下文实施例14中所述。
在另一个实施方式中，CYP76AD6、CYP76AD15或其组合基因在E8启动子下。在另 一个实施方式中，CYP76AD6、CYP76AD15或其组合基因在CHS启动子下。在另一个实 施方式中，CYP76AD1基因在E8启动子下。在另一个实施方式中，CYP76AD1基因在CHS 启动子下。
在一个实施方式中，本发明提供了包括在启动子的控制下编码CYP76AD1-β进化枝基 因的核酸。在一个实施方式中，CYP76AD1-β进化枝基因是CYP76AD6。在另一个实施方 式中，CYP76AD1-β进化枝基因是CYP76AD15。
在一个实施方式中，本发明提供了包括来自红甜菜的CYP76AD1-β进化枝基因的重组 核酸。在一个实施方式中，本发明提供了包括不来自甜菜的CYP76AD1-β进化枝基因的重组核酸。在一个实施方式中，本发明提供包括CYP76AD1-β进化枝基因但排除来自甜菜的CYP76AD1旁系同源物的核酸序列的重组核酸(DeLoache等，2015)，其在用DOD转化 到酵母中时不产生甜菜黄素。在一个实施方式中，本发明提供了包括CYP76AD1-β进化枝 基因但排除编码SEQ ID NO：34的核酸的重组核酸。
在另一个实施方式中，CYP76AD1-β进化枝基因是如Brockington等在2015年(NewPhytol.2015年9月；207(4)：1170-80，其全部内容通过引用并入本文)所述的CYP76AD1-β进化枝基因。在一个实施方式中，CYP76AD1-β进化枝基因是Brockington等在2015年的 补充图2中所述的CYP76AD1-β进化枝基因。
在一个实施方式中，本发明提供了包括在启动子的控制下编码CYP76AD6基因、CYP76AD15基因或其组合的核酸的重组多核苷酸。
在一个实施方式中，本发明提供了包括编码CYP76AD1-β进化枝基因的核酸和编码DOPA 4，5-双加氧酶(DOD)的核酸的重组多核苷酸，其中所述核酸被框内插入多核苷酸 中。在一个实施方式中，多核苷酸还包括编码甜菜色素相关的葡糖基转移酶的核酸。
在一个实施方式中，编码CYP76AD1-β进化枝基因的核酸是BV.maritima，甜菜亚种maritima(基因库登录号AKI33834.1；SEQ ID NO：10)；F.latifolia，Froelichialatifolia(登 录号AKI33838.1；SEQ ID NO：11)；A.caracasana，刺花莲子草(登录号AKI33835.1；SEQ ID NO：12)；A.ficoidea，五色苋(登录号AKI33831.1；SEQ ID NO：13)或其组合。
在一个实施方式中，本发明提供了包括编码CYP76AD6基因、CYP76AD15基因或其组合的核酸和编码DOPA 4，5-双加氧酶(DOD)的核酸的重组多核苷酸，其中所述核酸被 框内插入多核苷酸中。在一个实施方式中，多核苷酸还包括编码甜菜色素相关的葡糖基转 移酶的核酸。
在另一个实施方式中，本发明包括编码修饰甜菜色素结构的多肽的另外的核酸。在一 个实施方式中，多肽是糖基化酶。在另一个实施方式中，多肽是酰化酶。在另一个实施方 式中，另外的核酸编码参与亚细胞转运的多肽。在另一个实施方式中，另外的核酸编码参 与解毒的多肽。
同源物和变体
在另一个实施方式中，本发明的重组多核苷酸或多肽与本文所述的序列同源，或明确 地或通过参考基因库条目。当涉及任何氨基酸或核酸序列时，术语“同源性”、“同源的” 等在一个实施方式中分别指候选序列中与相应的原生多肽或多核苷酸的残基相同的氨基 酸或核苷酸的百分比，在比对序列和引入缺口后，如果需要，达到最大百分比同源性，并 且不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分。用于比对的方法和计算机程序在本领域 中是已知的，例如BLAST、DOMAIN、BEAUTY(BLAST增强比对实用程序)、GENPEPT 和TREMBL包。
在一个实施方式中，根据本发明的组合物和方法，可以使用CYP76AD1的同源物代替 CYP76AD1。
在另一个实施方式中，根据本发明的组合物和方法，可以使用CYP76AD6的同源物代 替CYP76AD6。
在另一个实施方式中，根据本发明的组合物和方法，可以使用DOPA 4，5-双加氧酶(DOD)的同源物代替DOPA 4，5-双加氧酶(DOD)。
同源性可以在核苷酸序列和/或编码的氨基酸序列水平。在一个实施方式中，核酸和/ 或氨基酸序列共享至少约50％、或60％、或70％或80％的同源性。在另一个实施方式中， 核酸和/或氨基酸序列与本发明的序列共享至少约90％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性。同源性可以在核苷酸序列和/或编码的氨基酸序列水平。在一个实施方式中，核酸和/或氨基酸序列共享至少约72％的同源性。在一个实施方式中，核酸和/或氨基酸序列共享至少约75％的同源性。
在另一个实施方式中，通过确定候选序列杂交来确定同源性，其方法在本领域中有充 分描述(参见例如“Nucleic Acid Hybridization″Hames，B.D.，和Higgins S.J.，Eds.(1985)； Sambrook等，2001，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Press，N.Y.； 和Ausubel等，1989，Current Protocols in Molecular Biology，Green Publishing Associates and Wiley Interscience，N.Y)。
在一个实施方式中，同源物从另一个石竹目植物中分离。在一个实施方式中，同源物 从仙人掌、康乃馨、苋菜、冰植物、甜菜、食肉植物或其组合中分离。在一个实施方式中，食肉植物是双钩叶科(例如穗叶藤属)、茅膏菜(例如貉藻属(水车植物)、捕蝇草属(VenusFlytrap)、茅膏菜属(Sundew))、露叶毛毡苔科(例如露松属(Dewy Pine或PortugeseSundew))、或猪笼草科(例如热带猪笼草或猴杯)。
在一个实施方式中，基于时间表达分离同源物。在一个实施方式中，基于发育阶段分 离同源物。在一个实施方式中，发育阶段是阶段1，在一个实施方式中，阶段1是当花长约为1cm时。在另一个实施方式中，发育阶段是阶段2，在一个实施方式中，阶段2是当 花长约为2cm时。在另一个实施方式中，发育阶段是阶段3，在一个实施方式中，阶段3 是当花长约为3cm时。在另一个实施方式中，发育阶段是阶段4，在一个实施方式中，阶 段4是当花长约为4cm时。在另一个实施方式中，发育阶段是阶段5，在一个实施方式中， 阶段5是当花长约为5-6cm时。
在另一个实施方式中，基于组织表达分离同源物。在一个实施方式中，CYP76AD1、CYP76AD6、CYP76AD15或其组合或DOD同源物的组织表达在花组织中。在一个实施方 式中，花组织是花瓣。在另一个实施方式中，花组织是雄蕊。在另一个实施方式中，花组 织是花药。在另一个实施方式中，花组织是柱头。
在另一个实施方式中，本发明的重组多核苷酸或多肽是本文所述序列的变体。在另一 个实施方式中，本发明的重组多核苷酸或多肽是本文所述序列的同种型。在另一个实施方 式中，本发明的重组多核苷酸或多肽是本文所述序列的片段。在一个实施方式中，本发明 的重组多核苷酸或多肽是本文所述序列的功能变体。在另一个实施方式中，本发明的重组 多核苷酸或多肽是本文所述序列的功能同种型。在另一个实施方式中，本发明的重组多核 苷酸或多肽是本文所述序列的功能片段。在另一个实施方式中，本发明的重组多核苷酸或 多肽是本文所述序列的功能同源物。
在另一个实施方式中，本发明提供了包括编码如本文所述的多肽的核酸的重组多核苷 酸。
在一个实施方式中，编码CYP76AD6的核酸序列如SEQ ID NO：30所示。在另一个 实施方式中，本发明的多核苷酸可选地包括编码CYP76AD6的核酸序列。在一个实施方式 中，CYP76AD6的核酸序列如SEQ ID NO：30所示。在另一个实施方式中，用于本发明 的方法和组合物中的CYP76AD6是SEQ ID NO：30的同源物。在另一个实施方式中，用 于本发明的方法和组合物中的CYP76AD6是SEQ ID NO：30的变体。在另一个实施方式 中，用于本发明的方法和组合物中的CYP76AD6是SEQ ID NO：30的片段。在另一个实 施方式中，用于本发明的方法和组合物中的CYP76AD6是SEQ ID NO：30的同种型。在 另一个实施方式中，用于本发明的方法和组合物中的CYP76AD6是SEQ ID NO：30的功 能同源物、功能变体、功能片段或功能同种型。
如实施例19中所证明的，紫茉莉中CYP76AD6的直系同源物CYP76AD15，在本氏烟草中瞬时表达期间具有与CYP76AD6相同的活性。在另一个实施方式中，在本发明的组合 物和方法中，CYP76AD15或其同源物、同种型或变体可用于代替CYP76AD6。在一个实 施方式中，来自紫茉莉的CYP76AD15基因产物具有与来自甜菜的CYP76AD6基因产物相 似的功能。在一个实施方式中，来自紫茉莉的CYP76AD15是编码参与将酪氨酸转化为 L-DOPA的酶的基因。
在一个实施方式中，本发明提供了包括编码CYP76AD15的核酸的重组多核苷酸。在一个实施方式中，编码CYP76AD15的核酸序列包含：
在另一个实施方式中，本发明的多核苷酸包括编码BvCYP76new的核酸序列，如实施 例3中所述。在另一个实施方式中，本发明的多核苷酸包括编码来自紫茉莉的MjCYP76的核酸序列(SEQ ID NO：1)。在一个实施方式中，CYP76AD15、BvCYP76new或MjCYP76 可以用于本发明的组合物和方法中。在另一个实施方式中，与用作诱饵的一种或多种已知 的甜菜色素相关基因共表达的其它细胞色素P450编码基因可以用于本发明的组合物和方 法中。在一个实施方式中，CYP82G1样(SEQ ID NO：36)、CYP78A9样(SEQ ID NO： 37)、CYP86B1样(SEQ ID NO：38)或其组合可用于本发明的组合物和方法中。在一个 实施方式中，可以用来代替CYP76AD6。
在一个实施方式中，本发明的多核苷酸包括编码CYP76AD1的核酸序列。在一个实施 方式中，本发明的多核苷酸可选地包括编码CYP76AD1的核酸序列。在一个实施方式中，CYP76AD1的核酸序列如SEQ ID NO：32所示。在另一个实施方式中，用于本发明的方 法和组合物中的CYP76AD1是SEQ ID NO：32的同源物。在另一个实施方式中，用于本 发明的方法和组合物中的CYP76AD1是SEQ ID NO：32的变体。在另一个实施方式中， 用于本发明的方法和组合物中的CYP76AD1是SEQ ID NO：32的片段。在另一个实施方 式中，用于本发明的方法和组合物中的CYP76AD1是SEQ ID NO：32的同种型。在另一 个实施方式中，用于本发明的方法和组合物中的CYP76AD1是SEQ ID NO：32的功能同 源物、功能变体、功能片段或功能同种型。
在另一个实施方式中，本发明的多核苷酸包括编码CYP76AD3的核酸序列(SEQ IDNO：4)，如实施例9中所述。在一个实施方式中，在本发明的组合物和方法中，可以使用CYP76AD3代替CYP76AD1。
在一个实施方式中，本发明的多核苷酸包括编码甜菜DODA1(BvDODA1)的核酸序列。在一个实施方式中，本发明的多核苷酸可选地包括编码BvDODA1的核酸序列。在一 个实施方式中，BvDODA1的核酸序列如SEQ ID NO：33所示。在另一个实施方式中，用 于本发明的方法和组合物中的BVDODA1是SEQ ID NO：33的同源物。在另一个实施方 式中，用于本发明的方法和组合物中的BVDODA1是SEQ ID NO：33的变体。在另一个 实施方式中，用于本发明的方法和组合物中的BVDODA1是SEQ ID NO：33的片段。在 另一个实施方式中，用于本发明的方法和组合物中的BVDODA1是SEQ ID NO：33的同 种型。在另一个实施方式中，用于本发明的方法和组合物中的BVDODA1是SEQ ID NO： 33的功能同源物、功能变体、功能片段或功能同种型。
在另一个实施方式中，DOD酶是来自大花马齿苋的PgDOD(登录号AJ580598；SEQ IDNO：39)，来自紫茉莉的MjDOD(登录号AB435372；SEQ ID NO：3)，来自光叶子花的 BgDOD(登录号AB435373；SEQ ID NO：40)或来自捕蝇蕈的AmDOD(登录号P87064； SEQ ID NO：41)。
在一个实施方式中，本发明的多核苷酸包括编码环-DOPA 5-O葡糖基转移酶(cDOPA5GT)的核酸序列。在一个实施方式中，本发明的多核苷酸可选地包含包括 cDOPA5GT的核酸序列。在一个实施方式中，cDOPA5GT的核酸序列如SEQ ID NO：2所 示。在另一个实施方式中，用于本发明的方法和组合物中的cDOPA5GT是SEQ ID NO：2 的同源物。在另一个实施方式中，用于本发明的方法和组合物中的cDOPA5GT是SEQ ID NO：2的变体。在另一个实施方式中，用于本发明的方法和组合物中的cDOPA5GT是SEQ ID NO：2的片段。在另一个实施方式中，用于本发明的方法和组合物中的cDOPA5GT是 SEQ ID NO：2的同种型。在另一个实施方式中，用于本发明的方法和组合物中的 cDOPA5GT是SEQ ID NO：2的功能同源物、功能变体、功能片段或功能同种型。
在一个实施方式中，“变体”是指与大多数群体不同但仍与共同模式足够相似而被认为 是其中之一的氨基酸或核酸序列(或在其它实施方式中，生物体或组织)，例如剪接变体。 在一个实施方式中，变体可以是序列保守性变体，而在另一个实施方式中，变体可以是功 能保守性变体。在一个实施方式中，变体可以包含1个氨基酸的添加、缺失或取代。在一个实施方式中，变体可以包含2个氨基酸的添加、缺失、取代，或其组合。在一个实施方 式中，变体可以包含3个氨基酸的添加、缺失或取代，或其组合。在一个实施方式中，变 体可以包含4个氨基酸的添加、缺失或取代，或其组合。在一个实施方式中，变体可以包 含5个氨基酸的添加、缺失或取代，或其组合。在一个实施方式中，变体可以包含7个氨 基酸的添加、缺失或取代，或其组合。在一个实施方式中，变体可以包含10个氨基酸的 添加、缺失或取代，或其组合。在一个实施方式中，变体可以包含2-15个氨基酸的添加、 缺失或取代，或其组合。在一个实施方式中，变体可以包含3-20个氨基酸的添加、缺失或 取代，或其组合。在一个实施方式中，变体可以包含4-25个氨基酸的添加、缺失或取代， 或其组合。
在一个实施方式中，术语“片段”在本文中用于指与全长蛋白质或多肽相比更短或包 含更少氨基酸的蛋白质或多肽。在另一个实施方式中，片段是指比全长核酸更短或包含更 少核苷酸的核酸。在另一个实施方式中，片段是N-末端片段。在另一个实施方式中，片段是C-末端片段。在一个实施方式中，片段是蛋白质、肽或核酸的序列内部分。在另一个实 施方式中，片段是蛋白质、肽或核酸内的功能部分。
在一个实施方式中，“同种型”是指蛋白质同种型或基因同种型。在一个实施方式中， 蛋白质同种型是由相同基因编码的蛋白质、或来自具有氨基酸序列和功能相似性的不同基 因的蛋白质的不同形式。在一个实施方式中，基因同种型是从相同基因座产生但具有不同 转录起始位点(TSS)、蛋白质编码DNA序列(CDS)和/或非翻译区(UTR)的mRNA。 在一个实施方式中，基因同种型具有改变的活性，而在另一个实施方式中，基因同种型不 具有改变的活性。因此，在一个实施方式中，同种型是分子的替代形式(例如蛋白质)， 其具有与第一分子相同的功能，但在结构或序列上可能具有小的差异。在一个实施方式中， 同种型可以由不同的但相关的基因产生，或者在另一个实施方式中，可以由相同的基因通 过可变剪接产生。在另一个实施方式中，同种型由单核苷酸多态性引起。
在一个实施方式中，本发明含义内的“功能”在本文中用于指蛋白质、肽、核酸、片段或其变体显示生物活性或功能的先天性能力。在一个实施方式中，这种生物学功能是其与相互作用配偶体(例如膜相关受体)的结合性质，并且在另一个实施方式中是其三聚化性质。在本发明的功能片段和功能变体的情况下，实际上可以改变这些生物学功能，例如对于其特异性或选择性，但保留基础生物学功能。
用于测量蛋白质、多肽或分子的生物活性的许多方法是相关领域已知的，例如使用标 记底物的蛋白质测定法、通过色谱方法(例如HPLC或薄层色谱法)的底物分析、分光光度法等(参见例如Maniatis等(2001)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)。
表达载体
在另一个实施方式中，本发明提供了包括本文所述的本发明的任何多核苷酸的表达载 体。
在另一个实施方式中，本发明提供了包括重组多核苷酸的表达载体，重组多核苷酸包 括编码CYP76AD1的核酸、编码DOPA 4，5-双加氧酶(DOD)的核酸、以及可选的编码甜菜色素相关葡糖基转移酶的核酸序列，其中所述核酸在相同的阅读框中。
在另一个实施方式中，本发明提供了包括重组多核苷酸的表达载体，重组多核苷酸包 括串联表达的编码CYP76AD6、CYP76AD15或其组合的核酸和编码DOPA 4，5-双加氧酶(DOD)的核酸。
在另一个实施方式中，本发明提供了包括重组多核苷酸的表达载体，重组多核苷酸包 括串联表达的编码CYP76AD1、CYP76AD6、CYP76AD15或其组合的核酸，编码DOPA 4，5-双加氧酶(DOD)的核酸，以及可选的编码与甜菜色素相关的葡糖基转移酶的核酸序列。
在一个实施方式中，将本发明的多核苷酸插入表达载体(即核酸构建体)中以使重组 多肽能够表达。在一个实施方式中，本发明的表达载体包括使这种载体适于在原核生物中 复制和整合的额外序列。在一个实施方式中，本发明的表达载体包括使得该载体适于在真 核生物中复制和整合的额外序列。在一个实施方式中，本发明的表达载体包括使该载体适 于在原核生物和真核生物中复制和整合的穿梭载体。在一些实施方式中，克隆载体包含转 录和翻译起始序列(例如启动子、增强子)和转录和翻译终止子(例如聚腺苷酸化信号)。
在一个实施方式中，多种原核或真核细胞可以用作宿主表达系统以表达本发明的多肽。 在一些实施方式中，这些包括但不限于微生物，如用含有多肽编码序列的重组噬菌体DNA、 质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌；用含有多肽编码序列的重组酵母表达载体转 化的酵母；用重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV) 感染或用含有多肽编码序列的重组质粒表达载体(如Ti质粒)转化的植物细胞系统。
在一个实施方式中，本发明的病毒载体过表达本文所述的途径基因。在另一个实施方 式中，表达本文所述的途径基因的细胞的病毒感染诱导细胞过表达途径基因。
在一些实施方式中，使用非细菌表达系统(例如哺乳动物表达系统如CHO细胞)来表 达本发明的多肽。在一个实施方式中，用于在哺乳动物细胞中表达本发明的多核苷酸的表 达载体是包含CMV启动子和新霉素抗性基因的pCI-DHFR载体。
在一些实施方式中，在本发明的细菌系统中，取决于意图用于表达多肽的用途，可以 有利地选择许多表达载体。在一个实施方式中，期望大量的多肽。在一个实施方式中，期望引导高水平蛋白质产物表达的载体，其可能与疏水性信号序列融合，以将表达产物引导至细菌的周质或蛋白质产物易于纯化的培养基中。在一个实施方式中，某种融合蛋白被工程化为有特异性切割位点以帮助回收多肽。在一个实施方式中，适于这种操作的载体包括但不限于pET系列大肠杆菌表达载体(Studier等，Methods in Enzymol.185：60-89 1990)。
在一个实施方式中，使用酵母表达系统。在一个实施方式中，如美国专利号5,932,447 中所公开的，许多含有组成型或诱导型启动子的载体可用于酵母中。在另一个实施方式中， 使用促进外源DNA序列整合到酵母染色体中的载体。
在一个实施方式中，本发明的表达载体可以进一步包括另外的多核苷酸序列，多核苷 酸序列允许例如来自单个mRNA(例如内部核糖体进入位点(IRES))和用于启动子嵌合多肽的基因组整合的序列的几种蛋白质的翻译。
在一些实施方式中，哺乳动物表达载体包括但不限于pcDNA3、pcDNA3.1(+/-)、pGL3、 pZeoSV2(+/-)、pSecTag2、pDisplay、pEF/myc/cyto、pCMV/myc/cyto、pCR3.1、pSinRep5、 DH26S、DHBB、pNMT1、pNMT41、pNMT81(可从Invitrogen获得)、pCI(可从Promega获得)、pMbac、pPbac、pBK-RSV和pBK-CMV(可从Strategene获得)、pTRES(可从Clontech 获得)，以及它们的衍生物。
在一些实施方式中，本发明使用含有来自真核病毒如逆转录病毒的调控部分的表达载 体。SV40载体包括pSVT7和pMT2。在一些实施方式中，源自牛乳头状瘤病毒的载体包括pBV-1MTHA，并且源自Epstein Bar病毒的载体包括pHEBO和p2O5。其它示例性载体 包括pMSG、pAV009/A+、pMTO10/A+、pMAMneo-5、杆状病毒pDSVE，以及允许在SV-40 早期启动子、SV-40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠科动物乳腺肿瘤病毒启动子、劳 氏肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子或其它有效地在真核细胞中表达的启动子的引导下 表达蛋白质的任何其它载体。
在一些实施方式中，重组病毒载体可用于体内表达本发明的多肽，因为它们提供诸如 横向感染和靶向特异性的优点。在一个实施方式中，横向感染在例如逆转录病毒的生命周 期中是固有的，并且是单个感染细胞产生许多发芽并感染相邻细胞的子代病毒粒子的过 程。在一个实施方式中，结果是大面积迅速感染，其中大部分最初未被原始病毒颗粒感染。 在一个实施方式中，产生不能横向传播的病毒载体。在一个实施方式中，如果期望的目的 是将特定基因仅引入局部数目的靶细胞中，则该特征可能是有用的。
在一个实施方式中，可以使用各种方法将本发明的表达载体引入细胞中。这些方法包 括例如稳定或瞬时转染、脂质转染、电穿孔和用重组病毒载体感染。
在一些实施方式中，通过病毒感染引入核酸提供了优于诸如脂质转染和电穿孔等其它 方法的若干优点，因为病毒的传染性质可以获得更高的转染效率。
在一个实施方式中，应该理解，本发明的多肽还可以由采用上文所述的任何合适的施 用模式(即体内基因治疗)施用于个体的核酸构建体表达。在一个实施方式中，根据需要 通过合适的基因递送载体/方法(转染、转导、同源重组等)和表达系统将核酸构建体引入 合适的细胞中，然后将修饰的细胞在培养物中扩增并返回到个体(即离体基因治疗)。
在一个实施方式中，使用植物表达载体。在一个实施方式中，多肽编码序列的表达由 多种启动子驱动。在一些实施方式中，使用病毒启动子，如CaMV的35S RNA和19S RNA 启动子[Brisson等，Nature 310：511-514(1984)]或TMV的外壳蛋白启动子[Takamatsu 等，EMBO J.6：307-311(1987)]。在另一个实施方式中，使用植物启动子，例如RUBISCO 的小亚基[Coruzzi等，EMBO J.3：1671-1680(1984)；和Brogli等，Science 224：838-843 (1984)]或热激启动子，例如大豆hsp17.5-E或hsp17.3-B[Gurley等，Mol.Cell.Biol.6： 559-565(1986)]。在一个实施方式中，使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA 转化、显微注射、电穿孔和本领域普通技术人员熟知的其它技术将构建体引入植物细胞中。 参见例如Weissbach&Weissbach[Methods for Plant Molecular Biology，Academic Press，NY，Section VIII，pp 421-463(1988)]。本领域公知的其它表达系统如昆虫和哺乳动物宿主细胞系统也可用于本发明。
应该理解，除了包含用于插入的编码序列(编码多肽)的转录和翻译的必需部分之外， 本发明的表达构建体还可以包括被工程化以优化表达多肽的稳定性、生产、纯化、产量或 活性的序列。
在一些实施方式中，可以使用各种方法将本发明的表达载体引入宿主细胞系统。在一 些实施方式中，此类方法通常在Sambrook等人的Molecular Cloning：A LaboratoryManual， Cold Springs Harbor Laboratory，New York(1989，1992)、Ausubel等人的Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，Baltimore，MD(1989)、Chang等人的Somatic Gene Therapy，CRC Press，Ann Arbor，Mich.(1995)、Vega等人的Gene Targeting，CRC Press， Ann Arbor Mich.(1995)、Vectors：A Survey ofMolecular Cloning Vectors and Their Uses， Butterworths，Boston Mass.(1988)和Gilboa等[Biotechniques 4(6)：504-512，1986]中描 述，并且包括例如稳定或瞬时转染、脂质转染、电穿孔和用重组病毒载体感染。另外，参 见美国专利号5,464,764和5,487,992的正负选择方法。
在一些实施方式中，转化的细胞在有效条件下培养，这允许表达大量的重组多肽。在 一些实施方式中，有效的培养条件包括但不限于允许蛋白质产生的有效培养基、生物反应 器、温度、pH和氧气条件。在一个实施方式中，有效培养基是指在其中培养细胞以产生本发明的重组多肽的任何培养基。在一些实施方式中，培养基通常包括具有可同化的碳源、氮源和磷源的水溶液，以及适当的盐、矿物质、金属和其它营养物质，例如维生素。在一 些实施方式中，可以在常规发酵生物反应器、摇瓶、试管、微量滴定盘和培养皿中培养本 发明的细胞。在一些实施方式中，培养在适于重组细胞的温度、pH和氧含量下进行。在一 些实施方式中，培养条件在本领域普通技术人员的专业知识范围内。
在一些实施方式中，取决于用于生产的载体和宿主系统，本发明所得的多肽或保留在 重组细胞内、分泌到发酵培养基中、分泌到两个细胞膜之间的空间中(例如大肠杆菌中的 周质空间)；或保留在细胞或病毒膜的外表面上。
组合物
在另一个实施方式中，本发明提供了包括一种或多种如本文所述的重组多核苷酸的组 合物。在另一个实施方式中，本发明提供了包括如本文所述的重组核酸的组合物。
在一个实施方式中，本发明提供了包括编码CYP76AD1的核酸、编码DOPA 4，5-双加氧酶(DOD)的核酸、以及可选的编码甜菜色素相关的葡糖基转移酶的核酸序列的重组多 核苷酸，其中所述核酸在相同的阅读框中。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种包括重组多核苷酸的组合物，重组多核苷酸 包括串联表达的编码CYP76AD6、CYP76AD15或其组合的核酸，和编码DOPA 4，5-双加氧酶(DOD)的核酸。
在另一个实施方式中，本发明提供了包括如本文所述的重组多核苷酸的表达载体。
在另一个实施方式中，本发明提供了包括表达载体的组合物，表达载体包括重组多核 苷酸，重组多核苷酸包括编码CYP76AD1的核酸、编码DOPA 4，5-双加氧酶(DOD)的核酸、以及可选的编码甜菜色素相关的葡糖基转移酶的核酸序列，其中所述核酸在相同的阅读框中。
在另一个实施方式中，本发明提供了包括表达载体的组合物，表达载体包括重组多核 苷酸，重组多核苷酸包括串联表达的编码CYP76AD6、CYP76AD15或其组合的核酸，和编码DOPA 4，5-双加氧酶(DOD)的核酸。
在一个实施方式中，提供了包括本发明的重组多核苷酸或嵌合多肽的组合物。在一个 实施方式中，可以将本发明的多肽和多核苷酸提供给个体本身。
在另一个实施方式中，本发明提供了包含如本文所述的表达载体或重组多核苷酸的细 胞。在另一个实施方式中，本发明提供了包括如本文所述的细胞的组合物。
细胞
在另一个实施方式中，本发明提供了包含如本文所述的重组多核苷酸的细胞。在另一 个实施方式中，本发明提供了包含如本文所述的表达载体的细胞。
在另一个实施方式中，本发明提供了包含重组多核苷酸的细胞，重组多核苷酸包括编 码CYP76AD1的核酸、编码DOPA 4，5-双加氧酶(DOD)的核酸、以及可选的编码甜菜色素相关的葡糖基转移酶的核酸序列，其中所述核酸在相同的阅读框中。
在另一个实施方式中，本发明提供了包含重组多核苷酸的细胞，重组多核苷酸包括串 联表达的编码CYP76AD6、CYP76AD15或其组合的核酸，和编码DOPA 4，5-双加氧酶(DOD)的核酸。
在另一个实施方式中，本发明提供了包含重组多核苷酸的细胞，重组多核苷酸包括串 联表达的编码CYP76AD1、CYP76AD6、CYP76AD15或其组合的核酸，编码DOPA 4，5- 双加氧酶(DOD)的核酸，以及可选的编码甜菜色素相关的葡糖基转移酶的核酸序列。
在另一个实施方式中，本发明提供了包含表达载体的细胞，表达载体包括重组多核苷 酸，重组多核苷酸包括编码CYP76AD1的核酸、编码DOPA 4，5-双加氧酶(DOD)的核酸、以及可选的编码甜菜色素相关的葡糖基转移酶的核酸序列，其中所述核酸在相同的阅读框中。
在另一个实施方式中，本发明提供了包含表达载体的细胞，表达载体包括重组多核苷 酸，重组多核苷酸包括串联表达的编码CYP76AD6、CYP76AD15或其组合的核酸和编码DOPA4，5-双加氧酶(DOD)的核酸。
在另一个实施方式中，本发明提供了包含表达载体的细胞，表达载体包括重组多核苷 酸，重组多核苷酸包括串联表达的编码CYP76AD1、CYP76AD6、CYP76AD15或其组合 的核酸，编码DOPA 4，5-双加氧酶(DOD)的核酸，以及可选的编码甜菜色素相关的葡糖 基转移酶的核酸序列。
在一个实施方式中，当本发明的基因可以转化到植物细胞中时，可以产生植物细胞悬 浮培养物。在一个实施方式中，植物细胞是植物干细胞。甜菜色素、L-DOPA或其组合可以从植物悬浮培养物中分离。制备植物细胞悬浮培养物的方法在本领域中是熟知的并且在美国专利申请公开US2014/0051135；US 2011/0251408；US 2010/0159545；和US 2007/0026506中充分描述，其全部内容通过引用并入本文。
在一个实施方式中，植物细胞选自烟草(Nicotiana tabacum)、番茄(Solanumlycopersicum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、茄子(Solanum melongena)、树烟草(Nicotiana glauca)、欧洲黑龙葵(Solanum nigrum)、矮牵牛(Petunia x hybrida)和本氏烟草细胞。在 另一个实施方式中，植物细胞来自下文所述的任何植物。
在一个实施方式中，将多核苷酸引入植物细胞，植物细胞可以来自任何感兴趣的植物 器官，如下文所述。在一个实施方式中，将多核苷酸引入植物器官的一部分中。在一个实 施方式中，将多核苷酸引入花的一部分。在一个实施方式中，花的一部分是花瓣、雄蕊、花药、柱头或其组合。
本发明还提供了用于制造转基因种子的方法，转基因种子可以用于生产具有由稳定整 合的重组DNA构建体的表达产生的增强性状的转基因植物作物。
在另一个实施方式中，本发明的细胞是来自微生物的细胞。在另一个实施方式中，细 胞是酵母细胞。在一个实施方式中，酵母细胞是酿酒酵母细胞。在另一个实施方式中，本发明的细胞是细菌细胞。在一个实施方式中，细菌细胞是大肠杆菌细胞。在另一个实施方式中，细胞是顶孢霉、米曲霉、解脂耶氏酵母、芽孢杆菌属JPJ、布鲁菌属SGJ、草生欧 文氏菌、弗氏柠檬酸杆菌、共生杆菌、或绿脓假单胞菌细胞。在另一个实施方式中，细菌 细胞来自参与乳制品发酵的细菌。在一个实施方式中，细菌是乳链球菌。在另一个实施方 式中，细菌是乳酸杆菌。在一个实施方式中，乳酸杆菌是保加利亚乳杆菌。在另一个实施 方式中，细菌是乳球菌或明串珠菌。
植物和植物部分
在另一个实施方式中，本发明提供了通过提高植物或植物部分中的一种或多种甜菜色 素或L-DOPA水平的方法而产生的植物或其部分，方法包括在所述植物或植物部分中引起 或允许表达DOPA 4，5-双加氧酶(DOD)，CYP76AD6、CYP76AD15或其组合，CYP76AD1 或其组合。在一个实施方式中，表达DOD和CYP76AD1而不表达CYP76AD6或 CYP76AD15的植物也表达甜菜色素相关的葡糖基转移酶。
在一个实施方式中，植物不会天然产生甜菜色素。在另一个实施方式中，植物产生低 水平的甜菜色素。在另一个实施方式中，植物不会天然产生可检测水平的甜菜色素。
在另一个实施方式中，如本文所述的植物或植物部分天然产生甜菜色素；然而，基因 改造的植物或植物部分具有改变水平的甜菜色素或特定甜菜色素，从而改变基因改造植物 的颜色和/或性质。在一个实施方式中，甜菜色素的水平改变是水平增加。在另一个实施方 式中，甜菜色素的水平改变是水平降低。
在另一个实施方式中，本发明提供了植物或其部分，其包含编码CYP76AD1的核酸序 列，编码CYP76AD6、CYP76AD15或其组合的核酸序列，编码DOPA 4，5-双加氧酶(DOD) 或其组合的核酸序列。
在另一个实施方式中，在整个植物中如本文所述产生甜菜色素或L-DOPA。在一个实 施方式中，将种子基因改造以使得在整个植物中产生甜菜色素或L-DOPA。在另一个实施方式中，甜菜色素或L-DOPA在植物的特定器官中产生。在另一个实施方式中，甜菜色素 或L-DOPA在植物器官的一部分中产生。例如，可以在植物的叶子或其它器官中的一些植 物细胞中产生甜菜色素或L-DOPA。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种通过提高植物或其植物部分中的一种或多种 甜菜色素水平的方法而产生的观赏植物，方法包括在所述植物或植物部分中引起或允许表 达DOPA 4，5-双加氧酶(DOD)和CYP76AD6、CYP76AD15或其组合，CYP76AD1或其 组合。在一个实施方式中，如果观赏植物表达CYP76AD1和DOD而不表达CYP76AD6 或CYP76AD15，则进一步表达甜菜色素相关的葡糖基转移酶。
在另一个实施方式中，本发明提供了观赏植物，其包含编码CYP76AD1、CYP76AD6、CYP76AD15或其组合的核酸序列，和编码DOPA 4，5-双加氧酶(DOD)的核酸序列。
在一个实施方式中，本发明生物体的不同部分或器官包含不同的色素沉着，这是由于 多种细胞色素P450(例如CYP76AD6、CYP76AD1)在不同的非组成型启动子序列(例如果实特异性、花特异性或诱导型启动子)下的表达。在一个实施方式中，生物体是植物并 且不同的色素沉着在植物的不同部分。在一个实施方式中，植物是观赏植物。
在另一个实施方式中，本发明提供了通过提高用作食物作物的植物或其部分中的一种 或多种甜菜色素水平的方法而产生的食物作物，方法包括在所述植物或其部分中引起或允 许表达DOPA 4，5-双加氧酶(DOD)和CYP76AD6、CYP76AD15或其组合，CYP76AD1 或其组合。在一个实施方式中，如果食物作物表达CYP76AD1和DOD而不表达CYP76AD6 或CYP76AD15，则进一步表达甜菜色素相关的葡糖基转移酶。
在另一个实施方式中，本发明提供了用作食物作物的植物或其部分，其包含编码CYP76AD1、CYP76AD6、CYP76AD15或其组合的核酸序列，和编码DOPA 4，5-双加氧酶 (DOD)的核酸序列。
在一个实施方式中，本发明的组合物和方法包括一种或多种植物部分。在一个实施方 式中，如本文所述的植物部分是植物器官。在一个实施方式中，植物部分是叶、茎、根、花、种子、块茎或果实。在一个实施方式中，植物部分是植物的可食用部分。在一个实施 方式中，本发明的组合物和方法包括一种或多种植物部分的一个或多个部分。在一个实施 方式中，植物部分的一部分是花的一部分。在一个实施方式中，花的一部分是花瓣、雄蕊、 花药或柱头。
在一个实施方式中，可以将CYP76AD6、CYP76AD15或其组合以及本文所述的本发明的其它基因转化到植物或植物细胞中。如本文所用的术语“植物”可以涉及任何单子叶或双子叶植物。单子叶植物的实例包括但不限于玉米、小麦、水稻、甘蔗、和香蕉。双子 叶植物的实例包括但不限于大豆、豆类、豌豆、扁豆、花生、番茄、马铃薯、棉花、和多 年生果树(包括葡萄、苹果、和桔子)。
在一个实施方式中，植物是烟草(Nicotiana tabacum)、番茄(Solanumlycopersicum)、 马铃薯(Solanum tuberosum)、茄子(Solanum melongena)、树烟草(Nicotiana glauca)、欧 洲黑龙葵(Solanum nigrum)、矮牵牛(Petunia x hybrida)或本氏烟草。在另一个实施方式 中，植物是甜菜。在另一个实施方式中，植物是紫茉莉。
在一个实施方式中，本发明的植物是作物植物。在一个实施方式中，作物植物是Solanum tuberosum(马铃薯)。在另一个实施方式中，作物植物是Zeamays(玉米)。在另一个实施 方式中，作物植物是Oryza sativa(水稻)。在另一个实施方式中，作物植物是Manihotesculenta(木薯)。在另一个实施方式中，作物植物是Hordeum vulgare(大麦)。在另一个实施方式中，作物植物是Triticum aestivum(小麦)。在另一个实施方式中，作物植物是高粱(Sorghum bicolor)。在另一个实施方式中，作物植物是Brassica napus(西洋油菜)。在另一个实施方式中，作物植物是Ricinus communis(蓖麻)。在另一个实施方式中，作物植物是Phaseolus vulgaris(菜豆)。在另一个实施方式中，作物植物是Gossypium histrum(棉 花)。在另一个实施方式中，作物植物是Glycine max(大豆)。在另一个实施方式中，作物 植物是Beta vulgaris(甜菜)。在另一个实施方式中，作物植物是Musa acuminate(香蕉)。 在另一个实施方式中，作物植物是Capsicum annuum(甜椒和辣椒)。在另一个实施方式中， 作物植物是Cicer arietinum(鹰嘴豆)。在另一个实施方式中，作物植物是Solanumlycopersicum(番茄)。在另一个实施方式中，作物植物是Elaeis guineensis(非洲油棕)。在另一个实施方式中，作物植物是Setaria italic(小米)。
在另一个实施方式中，本发明的植物是竹子，其在一个实施方式中是过江藤(Arundinaria gigantea)和开关藤(Arundinaria tecta)。在另一个实施方式中，植物是浮萍。
在另一个实施方式中，本发明的植物是苔藓。在一个实施方式中，苔藓是泥炭藓。在 一个实施方式中，泥炭藓属物种是cristatum种或subnitens种。在一个实施方式中，苔藓 用于泥炭。在一个实施方式中，泥炭用作燃料，作为园艺土壤添加剂，并且用于生产苏格兰威士忌的吸麦芽中。在另一个实施方式中，苔藓用于装饰目的，例如在花园和花店贸易中。在另一个实施方式中，苔藓用作绝缘体。在另一个实施方式中，苔藓用作液体吸收剂。在另一个实施方式中，苔藓用于急救敷料、尿布或餐巾。在另一个实施方式中，苔藓是小 立碗藓。在另一个实施方式中，苔藓是水藓，其在一个实施方式中用于消灭火灾。
包括在本发明中的植物是适于转化技术的任何植物，包括裸子植物和被子植物(包括 单子叶植物和双子叶植物两者)。
单子叶被子植物的实例包括但不限于芦笋、糯玉米和甜玉米、大麦、小麦、水稻、高粱、洋葱、珍珠粟、黑麦和燕麦以及其它谷粒。
双子叶被子植物的实例包括但不限于番茄、烟草、棉花、西洋油菜、蚕豆、大豆、辣椒、莴苣、豌豆、苜蓿、三叶草、油菜作物或甘蓝(例如卷心菜、西兰花、花椰菜、芽甘 蓝)、萝卜、胡萝卜、甜菜、茄子、菠菜、黄瓜、南瓜、甜瓜、哈密瓜、向日葵和各种观 赏植物。
在另一个实施方式中，可以在本文提供的组合物和方法中使用木本的、观赏性的或装 饰性的、作物或谷物、水果或蔬菜植物、以及藻类(例如莱茵衣藻)的任何物种。植物的非限制性实例包括来自拟南芥属或水稻属的植物。其它实例包括来自以下属的植物：菖蒲、山羊草、葱、无油樟、金鱼草、芹菜、花生、甜菜、桦木、芸苔、辣椒、水蕨、柑橘、柳 杉、苏铁、播娘蒿、花菱草、桉树、大豆、棉、耳草、向日葵、大麦、番薯属、莴苣、亚 麻、鹅掌楸、莲花、羽扇豆、番茄、苜蓿、松叶菊、烟草、黄睡莲、狼尾草、鳄梨、菜豆、 小立碗藓、云杉、松、枳、杨、李、刺槐、罗莎、蔗糖、长花序、黑麦、芝麻、茄、高粱、 甜叶菊、盐芥、可可、直果草、小麦、葡萄、玉蜀黍、或百日草。
木质物种的实例包括杨树、松木、红杉、雪松、橡木等。
在某些实施方式中，本发明的植物是作物植物(例如谷类和豆类、玉米、小麦、马铃薯、木薯、水稻、高粱、小米、卡萨亚、大麦、豌豆，和其它根、块茎或种子作物)。用 于本发明组合物和方法的示例性谷类作物包括但不限于任何物种的草或谷物植物(例如大 麦、玉米、燕麦、水稻、野生稻、黑麦、小麦、小米、高粱、小黑麦等)、非草植物(例 如荞麦亚麻、豆类或大豆等)。提供感兴趣的种子的谷类植物包括油籽植物和豆科植物。 其它感兴趣的种子包括谷物种子，如玉米、小麦、大麦、水稻、高粱、黑麦等。油籽植物 包括棉花、大豆、红花、向日葵、芸苔、玉米、苜蓿、棕榈、椰子等。其他重要的种子作 物是油籽油菜、甜菜、玉米、向日葵、大豆和高粱。豆科植物包括豆类和豌豆。豆类包括 瓜尔豆、刺槐豆、胡芦巴、大豆、花园豆、豇豆、绿豆、利马豆、蚕豆、扁豆、鹰嘴豆等。
可以应用本发明的园艺植物可以包括莴苣、菊苣、和蔬菜芸苔(包括卷心菜、西兰花 和花椰菜)以及康乃馨和天竺葵。本发明还可以应用于烟草、葫芦、胡萝卜、草莓、向日葵、番茄、胡椒、菊花、杨树、桉树和松树。
本发明可用于其它植物物种的转化，包括但不限于油菜(Brassica napus，Brassica rapa 亚种)、苜蓿(Medicago sativa)、黑麦(Secale cereale)、高粱(Sorghumbicolor)、向日葵(Helianthus)、小麦(Triticum aestivum)、大豆(Glycine max)、烟草(Nicotiana tabacum， Nicotiana benthamiana)、树烟草(Nicotiana glauca)、花生(Arachis hypogaea)、棉花 (Gossypium hirsutum)、甘薯(Ipomoea batatus)、木薯(Manihot esculenta)、咖啡(Coffea 属)、椰子(Cocos nucifera)、菠萝(Ananascomosus)、柑橘树(Citrus属)、可可(Theobroma cacao)、茶(Camellia sinensis)、香蕉(Musa属)、鳄梨(Persea americana)、无花果(Ficus casica)、番石榴(Psidium guajava)、芒果(Mangifera indica)、橄榄油(Olea europaea)、 番木瓜(Carica papaya)、腰果(Anacardium occidentale)、澳洲坚果(Macadamia integrifolia)、 杏仁(Prunusamygdalus)、甜菜(Beta vulgaris)、番茄(Solanum lycopersicum)、茄子(Solanummelongena)、欧洲黑龙葵(Solanum nigrum)、矮牵牛(Petunia x hybrida)、燕麦、大麦、 小米、水果、蔬菜、观赏植物、草皮草、和针叶树。
除了植物，本发明提供了这样的植物、种子、自交或杂交后代和子代、以及任何这些 的任何部分(例如插条、种子)的任何克隆。本发明提供了任何植物繁殖体，即可用于有性或无性生殖或繁殖的任何部分，包括插条、种子等。本发明还包括这样的植物，它是这 种植物的有性或无性繁殖的后代、克隆或子代，或所述植物、后代、克隆或子代的任何部 分或繁殖体。还提供了植物提取物和衍生物。
在本申请中，用构建体转化或可互换地由构建体转化，或用核酸或由核酸转化的植物、 植物部分、种子或植物细胞应理解为意指携带所述构建体或所述核酸作为转基因的植物、 植物部分、种子或植物细胞，即由于通过生物学方式将所述构建体或所述核酸引入的结果。 植物、植物部分、种子或植物细胞因此包含所述重组构建体或所述重组核酸。在过去引入 后不再含有所述重组构建体或所述重组核酸的任何植物、植物部分、种子或植物细胞被称 为无效分离子、无效合子或无效对照，但不被认为是本申请含义内的用所述构建体或用所 述核酸转化的植物、植物部分、种子或植物细胞。
在一个实施方式中，酪氨酸对本发明的生物体或生物体的部分是内源性的。在另一个 实施方式中，本发明的生物体或生物体的部分合成酪氨酸。在另一个实施方式中，本发明 的生物体或生物体的部分被基因改造以产生酪氨酸。在另一个实施方式中，本发明的生物 体或生物体的部分被提供或供给酪氨酸。在另一个实施方式中，包含内源性酪氨酸的生物 体或生物体的部分如本文所述被基因改造以产生更大量的酪氨酸，以便增加L-DOPA或甜 菜色素的产生。在另一个实施方式中，包含内源性酪氨酸的生物体或生物体的部分被供给 酪氨酸以具有更大量的可用酪氨酸，从而增加L-DOPA或甜菜色素的产生。
提取L-DOPA和甜菜色素的方法
在一个实施方式中，本发明的方法进一步提供了如实施例1中所述的提取L-DOPA或 甜菜色素的方法，以及使用本领域已知的其它L-DOPA或甜菜色素提取方法，例如Misra和Wagner(Indian J Biochem Biophys.2007年2月；44(1)：56-60)，其通过引用整体并入本文。
在另一个实施方式中，使用本领域已知的方法从藻类、酵母或细菌培养物提取L-DOPA 或甜菜色素。
在另一个实施方式中，本发明提供了收获L-DOPA或甜菜色素的方法，方法包括如本 文所述的产生L-DOPA或甜菜色素的步骤，并且还包括从植物、植物部分、集落、器官、 组织或细胞中提取所述L-DOPA或所述甜菜色素的步骤，以产生所述L-DOPA或所述甜菜 色素。在一个实施方式中，植物部分是叶、茎、根、花、种子、块茎、或果实。
在一个实施方式中，从植物的根提取L-DOPA或甜菜色素。在一个实施方式中，L-DOPA 或甜菜色素通过植物的根分泌到液体或其它介质中，然后从液体或其它介质中收获。在另 一个实施方式中，从植物细胞悬浮液(例如BY2烟草)的培养基中提取L-DOPA或甜菜色素。
在另一个实施方式中，从水植物中提取L-DOPA或甜菜色素。在一个实施方式中，水植物是浮萍。在一个实施方式中，浮萍是细脉萍；稀脉萍；浮萍；膨胀浮萍；青萍；单脉 品藻(Lemna trisulcaUninerves)；小浮萍；Lemna valdiviana；Lemna japonica；Lemnaobscura； Lemna tenera；Lemna turionifera；Lemna yungensis；或其组合。
多肽
在一个实施方式中，本发明提供了包括编码CYP76AD6的核酸的重组多核苷酸编码的 嵌合多肽。在一个实施方式中，编码CYP76AD6的氨基酸序列包括：
在另一个实施方式中，本发明提供了由包括编码CYP76AD1的核酸的重组多核苷酸编 码的嵌合多肽。在一个实施方式中，编码CYP76AD1的氨基酸序列包括：
在另一个实施方式中，本发明提供了由包括编码DOPA 4，5-双加氧酶(DOD)的核酸的重组多核苷酸编码的嵌合多肽。在一个实施方式中，DOD酶是甜菜DODA1(BvDODA1)。 在一个实施方式中，编码BvDODA1的氨基酸序列包括：
在一个实施方式中，本发明提供了由包括编码环-DOPA 5-O-葡糖基转移酶(cDOPA5GT)的核酸的重组多核苷酸编码的嵌合多肽。在一个实施方式中，编码 cDOPA5GT的氨基酸序列包括：
在一个实施方式中，本发明的多肽包括编码CYP76AD6、CYP76AD15或其组合的氨基酸序列，和编码CYP76AD1的氨基酸序列。在另一个实施方式中，本发明的多肽包括编 码CYP76AD6、CYP76AD15或其组合的氨基酸序列，和编码DOD酶的氨基酸序列。在另 一个实施方式中，本发明的多肽包括编码CYP76AD1的氨基酸序列和编码DOD酶的氨基 酸序列。在另一个实施方式中，本发明的多肽包括编码CYP76AD6、CYP76AD15或其组 合的氨基酸序列，编码CYP76AD1的氨基酸序列，和编码DOD酶的氨基酸序列。在另一 个实施方式中，本发明的多肽包括编码CYP76AD6、CYP76AD15或其组合的氨基酸序列， 编码CYP76AD1的氨基酸序列，以及编码甜菜色素相关的葡糖基转移酶的氨基酸序列。在 另一个实施方式中，本发明的多肽包括编码CYP76AD6、CYP76AD15或其组合的氨基酸 序列，编码DOD酶的氨基酸序列，以及编码甜菜色素相关的葡糖基转移酶的氨基酸序列。 在另一个实施方式中，本发明的多肽包括编码CYP76AD1的氨基酸序列、编码DOD酶的 氨基酸序列、以及编码甜菜色素相关的葡糖基转移酶的氨基酸序列。在另一个实施方式中， 本发明的多肽包括编码CYP76AD6、CYP76AD15或其组合的氨基酸序列，编码CYP76AD1 的氨基酸序列，编码DOD酶的氨基酸序列，以及编码甜菜色素相关的葡糖基转移酶的氨 基酸序列。
在另一个实施方式中，上文所述的任何多肽还包括甜菜色素相关的葡糖基转移酶。在 一个实施方式中，甜菜色素相关的葡糖基转移酶是环-DOPA 5-O-葡糖基转移酶或甜菜素 -5-O-葡糖基转移酶。在一个实施方式中，环-DOPA 5-O-葡糖基转移酶是紫茉莉基因环 -DOPA 5-O-葡糖基转移酶(cDOPA5GT)(SEQ ID NO：43)。
在一个实施方式中，本发明提供了由本文所述的重组多核苷酸编码的嵌合多肽。
在另一个实施方式中，本发明提供了嵌合多肽，其包括CYP76AD6、CYP76AD15或 其组合，CYP76AD1，DOPA 4，5-双加氧酶(DOD)，甜菜色素相关的葡糖基转移酶或其组 合，其中所述蛋白质是串联表达的。
在另一个实施方式中，本发明提供了嵌合多肽，其包括CYP76AD1、DOPA 4，5-双加氧 酶(DOD)和可选的甜菜色素相关的葡糖基转移酶，其中所述蛋白质是串联表达的。
在另一个实施方式中，本发明提供了嵌合多肽，其包括CYP76AD6、CYP76AD15或 其组合以及DOPA 4，5-双加氧酶(DOD)，其中所述蛋白质是串联表达的。
在另一个实施方式中，本发明提供了嵌合多肽，其包括CYP76AD6、CYP76AD15或 其组合，CYP76AD1或其组合，DOPA 4，5-双加氧酶(DOD)和可选的甜菜色素相关的葡 糖基转移酶，其中所述蛋白质是串联表达的。
在一个实施方式中，“嵌合”或“融合”多肽或蛋白质是通过连接最初编码单独蛋白质 的两个或更多个基因而产生的多肽或蛋白质。
应当理解，根据本发明，来自除甜菜以外的植物的CYP76AD6和CYP76AD6样多肽 可以用于本文所述的组合物和方法并替代来自甜菜的CYP76AD6。在一个实施方式中，CYP76AD6样多肽来自石竹目。在一个实施方式中，CYP76AD6样多肽是CYP76AD1-β 进化枝内的同源物，如Brockington等(2015)(New Phytol.2015年9月；207(4)：1170-80) 中所述，其通过引用整体并入本文。
在一个实施方式中，CYP76AD15或其同源物、同种型或其变体可用于代替本发明的组 合物和方法中的CYP76AD6。来自紫茉莉的CYP76AD15具有与来自甜菜的CYP76AD6 类似的功能。在一个实施方式中，CYP76AD15是参与酪氨酸转化为L-DOPA的酶。在一 个实施方式中，CYP76AD15的氨基酸序列包括：
在一个实施方式中，本发明提供了分离的多肽，其包括编码CYP76AD6、CYP76AD15或其组合的氨基酸序列，或本文所述的另一种多肽。在另一个实施方式中，本发明提供了非天然存在的多肽，其包括编码CYP76AD6、CYP76AD15或其组合的氨基酸序列，或本 文所述的另一种多肽。在一个实施方式中，CYP76AD6、CYP76AD15或其组合序列是修 饰的序列。在一个实施方式中，它是增强的序列。在一个实施方式中，它是优化的序列。
在一个实施方式中，本发明的多肽可选地包括CYP76AD6。在一个实施方式中，CYP76AD6的氨基酸序列如SEQ ID NO：18所示。在另一个实施方式中，用于本发明的 方法和组合物中的CYP76AD6是SEQ ID NO：18的同源物。在另一个实施方式中，用于 本发明的方法和组合物中的CYP76AD6是SEQ ID NO：18的变体。在另一个实施方式中， 用于本发明的方法和组合物中的CYP76AD6是SEQ ID NO：18的片段。在另一个实施方 式中，用于本发明的方法和组合物中的CYP76AD6是SEQ ID NO：18的同种型。在另一 个实施方式中，用于本发明的方法和组合物中的CYP76AD6是SEQ ID NO：18的功能同 源物、功能变体、功能片段或功能同种型。
在一个实施方式中，本发明的多肽可选地包括CYP76AD15。在一个实施方式中，CYP76AD15的氨基酸序列如SEQ ID NO：44所示。在另一个实施方式中，用于本发明的 方法和组合物中的CYP76AD15是SEQ ID NO：44的同源物。在另一个实施方式中，用于 本发明的方法和组合物中的CYP76AD15是SEQ ID NO：44的变体。在另一个实施方式中， 用于本发明的方法和组合物中的CYP76AD15是SEQ ID NO：44的片段。在另一个实施方 式中，用于本发明的方法和组合物中的CYP76AD15是SEQ ID NO：44的同种型。
在另一个实施方式中，用于本发明的方法和组合物中的CYP76AD15是SEQ ID NO：44的功能同源物、功能变体、功能片段或功能同种型。
在一个实施方式中，本发明的多肽可选地包括CYP76AD1。在一个实施方式中，CYP76AD1的氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示。在另一个实施方式中，用于本发明的 方法和组合物中的CYP76AD1是SEQ ID NO：14的同源物。在另一个实施方式中，用于 本发明的方法和组合物中的CYP76AD1是SEQ ID NO：14的变体。在另一个实施方式中， 用于本发明的方法和组合物中的CYP76AD1是SEQ ID NO：14的片段。在另一个实施方 式中，用于本发明的方法和组合物中的CYP76AD1是SEQ ID NO：14的同种型。
在另一个实施方式中，用于本发明的方法和组合物中的CYP76AD1是SEQ ID NO：14的功能同源物、功能变体、功能片段或功能同种型。
在一个实施方式中，本发明的多肽可选地包括BvDODA1。在一个实施方式中，BvDODA1的氨基酸序列如SEQ ID NO：42所示。在另一个实施方式中，用于本发明的方 法和组合物中的BVDODA1是SEQ ID NO：42的同源物。在另一个实施方式中，用于本 发明的方法和组合物中的BVDODA1是SEQ ID NO：42的变体。在另一个实施方式中， 用于本发明的方法和组合物中的BVDODA1是SEQ ID NO：42的片段。在另一个实施方 式中，用于本发明的方法和组合物中的BVDODA1是SEQ ID NO：42的同种型。
在另一个实施方式中，用于本发明的方法和组合物中的BVDODA1是SEQ ID NO：42的功能同源物、功能变体、功能片段或功能同种型。
在一个实施方式中，本发明的多肽可选地包括cDOPA5GT。在一个实施方式中，cDOPA5GT的氨基酸序列如SEQ ID NO：43所示。在另一个实施方式中，用于本发明的 方法和组合物中的cDOPA5GT是SEQ ID NO：43的同源物。在另一个实施方式中，用于 本发明的方法和组合物中的cDOPA5GT是SEQ ID NO：43的变体。在另一个实施方式中， 用于本发明的方法和组合物中的cDOPA5GT是SEQ ID NO：43的片段。在另一个实施方 式中，用于本发明的方法和组合物中的cDOPA5GT是SEQ ID NO：43的同种型。
在另一个实施方式中，用于本发明的方法和组合物中的cDOPA5GT是SEQ ID NO：43的功能同源物、功能变体、功能片段或功能同种型。
在一些实施方式中，本文使用的“多肽”、“工程化多肽”或“蛋白质”包括原生多肽(降解产物、人工合成的多肽或重组多肽)和拟肽(通常地，人工合成的多肽)以及作为 多肽类似物的类肽和半肽，它们在一些实施方式中具有使得多肽在体内更稳定或更能够穿 透细胞的修饰。
在一些实施方式中，修饰包括但不限于C-末端修饰、多肽键修饰(包括但不限于CH2-NH、CH2-S、CH2-S＝O、O＝C-NH、CH2-O、CH2-CH2、S＝C-NH、CH＝CH或CF＝CH)、 主链修饰和残基修饰。用于制备拟肽化合物的方法在本领域中是已知的，并且在例如 QuantitativeDrug Design，C.A.Ramsden Gd.，第17.2章，F.Choplin Pergamon Press(1992) 中详细说明，该文献以引用方式并入本文，如同在本文中充分阐述一样。下文提供了这方 面的进一步细节。
在一些实施方式中，多肽内的多肽键(-CO-NH-)被取代。在一些实施方式中，多肽键被N-甲基化键(-N(CH3)-CO-)取代。在一些实施方式中，多肽键被酯键 (-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-)取代。在一些实施方式中，多肽键被酮亚甲基键(-CO-CH2-) 取代。在一些实施方式中，多肽键被α-氮杂键(-NH-N(R)-CO-)(其中R为任何烷基，例 如甲基)、卡巴键(-CH2-NH-)取代。在一些实施方式中，多肽键被羟基乙烯键 (-CH(OH)-CH2-)取代。在一些实施方式中，多肽键被硫代酰胺键(-CS-NH-)取代。在 一些实施方式中，多肽键被烯双键(-CH＝CH-)取代。在一些实施方式中，多肽键被逆向 酰胺键(-NH-CO-)取代。在一些实施方式中，多肽键被多肽衍生物(-N(R)-CH2-CO-)取 代，其中R是天然存在于碳原子上的“正常”侧链。在一些实施方式中，这些修饰发生在 沿着多肽链的任何键处，并且在一个实施方式中同时发生在几个(2-3个)键处。
在一些实施方式中，多肽的天然芳香族氨基酸(例如Trp、Tyr和Phe)被取代为合成的非天然酸(例如苯基甘氨酸、TIC、萘基丙氨酸(Nol)、Phe的环甲基化衍生物、Phe的 卤化衍生物或邻甲基-Tyr)。在一些实施方式中，本发明的多肽包括一个或多个修饰的氨基 酸或一个或多个非氨基酸单体(例如脂肪酸、复合碳水化合物等)。
在一个实施方式中，“氨基酸”或“氨基酸序列”被理解为包括20种天然存在的氨基酸；那些经常在体内翻译后修饰的氨基酸，包括例如羟脯氨酸、磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸；和其它不常见的氨基酸，包括但不限于2-氨基己二酸、羟赖氨酸、异锁链碱、正缬氨酸、 正亮氨酸和鸟氨酸。在一个实施方式中，“氨基酸”包括D-和L-氨基酸。
在一些实施方式中，本发明的多肽用于需要多肽处于可溶形式的治疗剂中。在一些实 施方式中，本发明的多肽包括一种或多种非天然或天然极性氨基酸(包括但不限于丝氨酸 和苏氨酸)，它们由于含羟基侧链能够增加多肽溶解性。
在一些实施方式中，本发明的工程化多肽以线形形式使用，但本领域普通技术人员将 理解，在其中环化不严重干扰工程化多肽特征的情况下，环形形式的工程化多肽也可以被 利用。
在一些实施方式中，本发明的工程化多肽例如通过使用标准固相技术而进行生化合成。 在一些实施方式中，这些生化方法包括专有固相合成、部分固相合成、片段缩合或经典溶 液合成。
在一些实施方式中，重组蛋白技术用于产生本发明的工程化多肽。在一些实施方式中， 重组蛋白技术用于产生相对较长的多肽(例如，长于18-25个氨基酸)。在一些实施方式中， 重组蛋白技术用于产生大量本发明的工程化多肽。在一些实施方式中，重组技术描述于 Bitter等，(1987)Methods in Enzymol.153：516-544、Studier等(1990)Methods inEnzymol. 185：60-89、Brisson等(1984)Nature 310：511-514、Takamatsu等(1987)EMBOJ.6： 307-311、Coruzzi等(1984)EMBO J.3：1671-1680、和Brogli等，(1984)Science 224：838-843、Gurley等(1986)Mol.Cell.Biol.6：559-565、和Weissbach&Weissbach，1988，Methods for Plant Molecular Biology，Academic Press，NY，Section VIII，pp 421-463，其全 部内容通过引用并入本文。
在一个实施方式中，本发明提供了包括CYP76AD1-β进化枝多肽的嵌合多肽。在一个 实施方式中，CYP76AD1-β进化枝多肽是CYP76AD6。在另一个实施方式中，CYP76AD1-β 进化枝多肽是CYP76AD15。在一个实施方式中，本发明提供了包括CYP76AD1-β进化枝 多肽但排除来自被称为Bv9_228610_yqeq或Bv9_228860_ickx的甜菜的CYP76AD1旁系同 源物的氨基酸序列(其在用DOD转化到酵母中时不产生甜菜黄素)的嵌合多肽。在一个 实施方式中，本发明提供了包括CYP76AD1-β进化枝多肽但排除以下氨基酸序列的嵌合多 肽：
在一个实施方式中，本发明提供了包括使酪氨酸与本文描述的一个或多个多肽“接触”的 步骤的方法。在一个实施方式中，所述接触步骤在允许产生L-DOPA或甜菜色素的条件下 在体外进行，如本文所述。
多肽回收
在一个实施方式中，本发明的方法进一步提供了如实施例1中所述的从植物提取甜菜 色素或L-DOPA的方法，以及使用本领域已知的其它甜菜色素提取方法。在另一个实施方 式中，使用本领域已知的方法从藻类、酵母或细菌培养物提取甜菜色素。在一个实施方式 中，藻类、酵母或细菌培养物被基因改造以表达甜菜色素或L-DOPA。
在一个实施方式中，在培养预定时间后，多肽的回收受到影响。
在一个实施方式中，本文使用的短语“回收多肽”是指收集含有多肽的全部发酵培养 基，并且不需要额外的分离或纯化步骤。
在一个实施方式中，使用多种标准蛋白质纯化技术纯化本发明的多肽，标准蛋白质纯 化技术例如但不限于亲和层析、离子交换层析、过滤、电泳、疏水相互作用层析、凝胶过 滤层析、反相层析、伴刀豆球蛋白A层析、层析聚焦和差异溶解。
在一个实施方式中，为了促进回收，表达的编码序列可以被工程化以编码本发明的多 肽和融合的可切割部分。在一个实施方式中，可以设计融合蛋白使得可以通过亲和层析容 易地分离多肽；例如通过固定在对可切割部分特异的柱上。在一个实施方式中，在多肽和 可切割部分之间工程化切割位点，并且可以通过用在该位点特异性切割融合蛋白的适当酶 或试剂处理以从多色谱柱中释放多肽[例如参见Booth等，Immunol.Lett.19：65-70(1988)； 和Gardella等，J.Biol.Chem.265：15854-15859(1990)]。
在一个实施方式中，本发明的多肽以“基本上纯的”形式被回收。
在一个实施方式中，短语“基本上纯的”是指允许在本文所述的应用中有效使用蛋白 质的纯度。
在一个实施方式中，本发明的多肽也可以使用体外表达系统合成。在一个实施方式中， 体外合成方法在本领域中是熟知的，并且该系统的组分是可商购的。
使用DOD酶及其底物L-DOPA和添加氨基酸以在体外产生甜菜黄素的方法在Sekiguchi等(2010)(Journal of Agricultural and Food Chemistry 58，12504-12509)中描述， 其通过引用整体并入本文。在一个实施方式中，本发明的甜菜色素的体外合成方法如在 Sekiguchi等中描述，但是增加了由酪氨酸合成L-DOPA的步骤，而不是如Sekiguchi等所 述的提供L-DOPA。
在一个实施方式中，使用与产生甜菜黄素相同或相似的条件进行红紫色甜菜素(甜菜 红素)的体外生产，不同之处在于CYP76AD1酶与DOD酶一起提供，并且底物可以是酪氨酸或L-DOPA。在一个实施方式中，可以添加辅因子NADPH以活化CYP76AD1酶。
在一些实施方式中，合成并纯化重组多肽；他们的治疗功效可以在体内或体外测定。
药物组合物
在另一个实施方式中，提供了包括本发明的重组多核苷酸或嵌合多肽的药物组合物。 在一个实施方式中，本发明的多肽和多核苷酸可作为药物组合物的一部分提供给个体，在 个体中与药学上可接受的载体混合。
在一个实施方式中，“药物组合物”是指本文所述的一种或多种活性成分与其它化学组 分(例如生理上合适的载体和赋形剂)的制剂。药物组合物的目的是促进将化合物施用于 生物体。
在一个实施方式中，“活性成分”是指导致生物学或生化作用的重组多核苷酸或嵌合多 肽。
在其它实施方式中，组合物包括另外的组分。在一个实施方式中，这种另外的组分可 以包括载体或稀释剂，包括但不限于胶、淀粉(例如玉米淀粉、预胶化淀粉)、糖(例如 乳糖、甘露醇、蔗糖、右旋糖)、纤维素材料(例如微晶纤维素)、丙烯酸酯(例如聚丙烯 酸甲酯)、碳酸钙、氧化镁、滑石或其混合物。
在其它实施方式中，用于液体制剂的药学上可接受的载体是水或非水溶液、悬浮液、 乳液或油。非水溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇和可注射有机酯(如油酸乙酯)。水性载体包括水、酒精/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。油的实例是动物、植物或 合成来源的油，例如花生油、大豆油、橄榄油、葵花油、鱼肝油、另一种海产油、或来自 牛奶或鸡蛋的脂质。
在另一个实施方式中，肠胃外载体(用于皮下、静脉内、动脉内或肌内注射)包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏液和不挥发油。静脉内载体包括 流体和营养补充剂，电解质补充剂如基于林格氏右旋糖的电解质补充剂等。实例是无菌液体，例如水和油，添加或不添加表面活性剂和其它药学上可接受的佐剂。通常，水、盐水、 水性右旋糖和相关糖溶液、以及二醇(如丙二醇或聚乙二醇)是优选的液体载体，特别是 用于可注射溶液。油的实例是动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油、橄榄油、 葵花油、鱼肝油，另一种海产油或来自牛奶或鸡蛋的脂质。
在其它实施方式中，组合物还包括粘合剂(例如阿拉伯胶、玉米淀粉、明胶、卡波姆、 乙基纤维素、瓜尔胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚维酮)、崩解剂(例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸、二氧化硅、交联羧甲基纤维素钠、交联聚维酮、瓜尔胶、羟基 乙酸淀粉钠)、各种pH和离子强度的缓冲剂(例如Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐)、防止吸 附到表面的添加剂(如白蛋白或明胶)、清洁剂(例如吐温20、吐温80、Pluronic F68、胆 汁酸盐)、蛋白酶抑制剂、表面活性剂(例如月桂基硫酸钠)、渗透增强剂、增溶剂(例如 甘油、聚乙烯甘油)、抗氧化剂(例如抗坏血酸、焦亚硫酸钠、丁基羟基茴香醚)、稳定剂 (例如羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素)、增粘剂(例如卡波姆、胶体二氧化硅、乙基 纤维素、瓜尔胶)、甜味剂(例如阿斯巴甜、柠檬酸)、防腐剂(例如硫柳汞、苯甲醇、对 羟基苯甲酸酯)、润滑剂(例如硬脂酸、硬脂酸镁、聚乙二醇、月桂基硫酸钠)、流动助剂 (例如胶体二氧化硅)、增塑剂(例如邻苯二甲酸二乙酯、柠檬酸三乙酯)、乳化剂(例如 卡波姆、羟丙基纤维素、月桂基硫酸钠)、聚合物涂层(例如泊洛沙姆或泊洛沙胺)、涂层 和成膜剂(例如乙基纤维素、丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯)和/或佐剂。上述赋形剂中的每 一种代表本发明的单独实施方式。
在另一个实施方式中，本文提供的药物组合物是控释组合物，即在施用后一段时间内 释放抗原的组合物。控释或缓释组合物包括在亲脂性储库(例如脂肪酸、蜡、油)中的制 剂。在另一个实施方式中，组合物是速释组合物，即其中全部抗原在施用后立即释放的组 合物。
在另一个实施方式中，药物组合物以控释系统递送。在另一个实施方式中，该药剂使 用静脉内输注、植入式渗透泵、透皮贴剂、脂质体或其它施用模式施用。在另一个实施方式中，使用泵(参见Langer，supra；Sefton，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14：201(1987)；Buchwald等，Surgery 88：507(1980)；Saudek等，N.Engl.J.Med.321：574(1989))。 在另一个实施方式中，使用聚合物材料；例如在微球体或植入物中。
在另一个实施方式中，所述组合物还包括将活性材料掺入聚合化合物(如聚乳酸、聚 乙醇酸、水凝胶等)的颗粒制剂中或上，或掺入脂质体、微乳液、胶束、单层或多层囊泡、红细胞影或原生质球上。这种组合物将影响物理状态、溶解度、稳定性、体内释放速率和 体内清除速率。
本发明还包括用聚合物(例如泊洛沙姆或泊洛沙胺)和偶联到针对组织特异性受体、 配体或抗原的抗体或偶联到组织特异性受体的配体的化合物涂覆的颗粒组合物。
本发明还包括用共价连接的水溶性聚合物(如聚乙二醇、聚乙二醇和聚丙二醇的共聚 物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮或聚脯氨酸)修饰的化合物。已知修饰的化合物在静脉内注射后在血液中显示出比相应的未修饰化合物显著更长的半衰期(Abuchowski等，1981；Newmark等，1982；Katre等，1987)。在另一个实施方式中， 这样的修饰还增加了化合物在水溶液中的溶解度、消除了聚结、提高了化合物的物理和化 学稳定性，并大大降低了化合物的免疫原性和反应性。在另一个实施方式中，与未经修饰 的化合物相比的期望的体内生物活性通过以较低频率或以较低剂量施用这种聚合物-化合 物加合物来实现。
含有活性组分的药物组合物的制备，例如通过混合、制粒或制片工艺，在本领域中已 被很好地理解。在另一个实施方式中，活性组分以中性的药学上可接受的盐形式配制到组 合物中。药学上可接受的盐包括用无机酸(例如盐酸或磷酸)或有机酸(例如乙酸、草酸、酒石酸和扁桃酸等)形成的酸加成盐(用多肽或抗体分子的游离氨基形成)。由游离羧基 形成的盐也可以衍生自无机碱(例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化 铁)以及有机碱(例如异丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸和普鲁卡因等)。
上述添加剂、赋形剂、制剂和施用方法中的每一种代表本发明的单独实施方式。
在一个实施方式中，本发明的方法包括在药学上可接受的载体中施用本发明的多核苷 酸或多肽。
在另一个实施方式中，含有多肽的药物组合物可以通过本领域普通技术人员已知的任 何方法施用于受试者，例如胃肠外、透粘膜、透皮、肌内、静脉内、皮内、鼻内、皮下、 腹膜内、心室内、颅内或阴道内。在另一个实施方式中，本发明的组合物通过表皮注射施 用，在另一个实施方式中，通过肌内注射施用，在另一个实施方式中，通过皮下注射施用， 并且在另一个实施方式中，通过呼吸道内粘膜注射施用。
在本发明方法和组合物的另一个实施方式中，药物组合物通过口服施用，并因此配制 成适于口服施用的形式，即作为固体或液体制剂。合适的固体口服制剂包括片剂、胶囊、 丸剂、颗粒剂和微丸剂等。合适的液体口服制剂包括溶液、悬浮液、分散剂、乳液和油等。 在本发明的另一个实施方式中，组合物配制成胶囊。在另一个实施方式中，本发明的组合 物包括硬凝胶胶囊。
在另一个实施方式中，药物组合物通过静脉内、动脉内或肌内注射液体制剂来施用。 合适的液体制剂包括溶液、悬浮液、分散剂、乳液和油等。在另一个实施方式中，药物组合物通过静脉内施用，并因此配制成适于静脉内施用的形式。在另一个实施方式中，药物组合物通过动脉内施用，并因此配制成适于动脉内施用的形式。在另一个实施方式中，药物组合物通过肌内施用，并因此配制成适于肌内施用的形式。
在另一个实施方式中，药物组合物局部施用于身体表面，并因此配制成适于局部施用 的形式。合适的局部制剂包括凝胶、软膏、乳膏、洗剂和滴剂等。
在另一个实施方式中，药物组合物以栓剂的形式施用，例如直肠栓剂或尿道栓剂。在 另一个实施方式中，药物组合物通过皮下植入微丸剂来施用。在另一个实施方式中，微丸 剂在一段时间内提供抗原剂的受控释放。
在另一个实施方式中，药物组合物在囊泡中递送，例如脂质体。
植物再生
在一个实施方式中，本发明的转基因植物在适于表达重组DNA构建体的条件下生长。 从单植物原生质体转化体或从各种转化的外植体再生、发育和培养植物是本领域所熟知的 (参见Weissbach和Weissbach，In.：Methods for Plant Molecular Biology，(编)，1988 Academic Press，Inc.，San Diego，Calif.)。这种再生和生长过程通常包括选择转化的细胞、 培养那些个体化细胞经过胚胎发育的通常阶段到生根胚芽的步骤。转基因胚胎和种子类似 地再生。此后将所得的转基因生根枝条种植在合适的植物生长培养基(如土壤)中。
转化后，根据标准植物组织培养技术，用植物表达载体转化的植物细胞可以例如从单 细胞、愈伤组织或叶片再生植物细胞再生。使用本领域已知的方法，几乎任何植物都可以 从植物的细胞、组织和器官完全再生。
然后可以使转化的植物生长，并用相同的转化品系或不同品系授粉，并且所得到的杂 种具有识别的所需表型特征的表达。可以生长两代或更多代以确保所需表型特征的表达稳 定地保持和遗传，然后收获种子以确保已经实现了所需表型特征的表达。
在一个实施方式中，植物细胞被再生以从转化过程获得整个植物。如本文所用的术语 “生长”或“再生”是指从植物细胞、植物细胞组、植物部分(包括种子)或植物切片(例如来自原生质体、愈伤组织、或组织部分)生长整个植物。
原生质体的再生因植物物种而异，但通常首先制备原生质体悬浮液。然后，在某些物 种中，可以从原生质体悬浮液诱导胚胎形成。在一个实施方式中，培养基将含有生长和再 生所必需的各种氨基酸和激素。所用激素的实例包括生长素和细胞分裂素。有效的再生将 取决于培养基、基因型和培养过程。如果这些变量被控制，则再生是可重复的。从植物愈伤组织、外植体、器官或部分中也会发生再生。
在无性繁殖的作物中，通过利用插条或组织培养技术繁殖成熟的基因改造植物以产生 多个相同的植物。选择想要的基因改造植物并获得新品种并无性繁殖用于商业用途。
在种子繁殖的作物中，成熟的基因改造植物可以自交以产生纯合近交植物。所得的近 交植物产生含有基因突变的种子。可以使这些种子生长以产生会产生所选表型的植物，例 如侧根生长、营养物质吸收、总体植物生长和/或营养或生殖产量增加。
从再生植物获得的部分(例如花、种子、叶、枝条和果实等)包括在本发明中，只要这些部分所包含的细胞包含本发明的分离的核酸。再生植物的后代和变体以及突变体也包括在本发明的范围内，只要这些部分包含引入的核酸序列。在一个实施方式中，可以通过例如标准免疫印迹和DNA检测技术来筛选表达可选择标记的基因改造植物以用于本发明的核酸的传递。在另一个实施方式中，基因改造的植物细胞可以在基因改造的核酸的表达水平上进行评估。在RNA水平的表达可以首先被确定以识别和定量表达阳性植物。用于 RNA分析的标准技术可以被使用，并且包括使用寡核苷酸引物的PCR扩增测定(寡核苷 酸引物被设计为仅扩增基因改造的RNA模板)和使用基因改造的核酸特异性探针的溶液 杂交测定。然后可以使用本发明的特异性反应性抗体通过西方免疫印迹分析来分析RNA 阳性植物的蛋白质表达。另外，根据标准方案的原位杂交和免疫细胞化学可以分别使用基 因改造的核酸特异性多核苷酸探针和抗体来定位基因改造组织内的表达位点。在一个实施 方式中，针对掺入的核酸筛选许多基因改造的品系以识别和选择具有最适合表达谱的植 物。
在一个实施方式中，本发明提供了对引入的核酸纯合的基因改造植物；即含有两个添 加的核酸序列的基因改造植物，一个基因位于染色体对的每个染色体上的相同基因座上。 纯合基因改造植物可以通过性交配(自交)杂合基因改造植物来获得，杂合基因改造植物 包含单个添加的基因改造的核酸，以萌发一些产生的种子，并分析产生的所得植物相对于 对照植物(即原生的、非基因改造的)对本发明的改变的多核苷酸表达。也考虑回交到亲 本植物并与非基因改造植物杂交。
可以培养通过任何上述转化技术获得的转化植物细胞以再生具有转化的基因型的整个 植物。在一个实施方式中，这种再生技术依赖于组织培养生长基中某些植物激素的处理。
然后，如本领域所熟知的那样，含有编码感兴趣的蛋白质的外来、外源基因的再生植 物可以进一步繁殖。繁殖的具体方法将取决于起始植物组织和待繁殖的特定植物物种。
在一个实施方式中，产生的转化植物被无性繁殖。在另一个实施方式中，所产生的转 化植物通过传统育种技术繁殖。在一个具体的实施方式中，再生植物自花授粉以提供纯合 的转基因植物。或者，将从再生植物获得的花粉与农艺重要的品系的种子生长植物杂交， 或将来自这些重要品系的植物的花粉用于对再生植物进行授粉。使用本领域普通技术人员 熟知的方法培养含有想要的多肽的本发明的转基因植物。
基因改造的植物的产品
在一个实施方式中，本发明提供了包含甜菜色素的食物作物。在一个实施方式中，食 物作物不内源性地包含甜菜色素。在另一个实施方式中，食物作物内源性地包含甜菜色素， 并且本发明的方法用于增加或提高存在于食物作物中的甜菜色素的量。
在一个实施方式中，包含甜菜色素或增加量的甜菜色素的食物作物被营养增强。在一 个实施方式中，包含甜菜色素或增加量的甜菜色素的食物作物包含抗氧化性质。在一个实 施方式中，摄入包含甜菜色素或增加量的甜菜色素的食物作物保护受试者免于退行性疾病 或病症。在一个实施方式中，摄入甜菜色素或含甜菜色素的食物作物可保护受试者免于癌 症(例如皮肤、肺癌、宫颈癌、卵巢癌和膀胱癌)、心脏病或神经变性疾病。甜菜色素还 可以抑制脂质过氧化和血红素分解；防止红血细胞氧化性溶血；并与人低密度脂蛋白结合， 增加其抗氧化能力。
在一个实施方式中，本发明提供了包含本发明的甜菜色素的水果。在另一个实施方式 中，本发明提供了包含本发明的甜菜色素的蔬菜。在另一个实施方式中，本发明提供了包 含本发明的甜菜色素的地下器官，例如马铃薯。在另一个实施方式中，本发明提供了来源 于包含本发明的甜菜色素的水果或蔬菜的果汁。
在一个实施方式中，除本发明的甜菜色素之外，植物器官或其衍生物(如果汁)还包 含天然或工程化的花青素、胡萝卜素或其组合。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种膳食补充剂，其包含如本文所述的方法或如 本文所述的植物或植物部分产生的甜菜色素。
在另一个实施方式中，本发明提供了化感物质，其包含如本文所述的方法或如本文所 述的植物或植物部分产生的L-DOPA。
另外的用途
甜菜色素的异源生产使得能够生物强化和增强基本食物的营养品质，以及开发新的观 赏植物品种。这些色素的简单生物合成途径从普遍存在的前体酪氨酸开始且需要表达2至 3个基因，并允许在许多植物物种或其它物种中产生这些色素。
在另一个实施方式中，本发明提供了生产观赏植物的方法，其包括以下步骤：在足以 产生甜菜色素的条件下，使植物细胞与编码CYP76AD1、CYP76AD6、CYP76AD15或其 组合的核酸序列和编码DOPA 4，5-双加氧酶(DOD)的核酸序列接触，其中如果所述细胞 与编码CYP76AD1和DOD的核酸序列且不是编码CYP76AD6或CYP76AD15的核酸序列 接触，则使所述细胞与编码甜菜色素相关的葡糖基转移酶的核酸序列接触，从而产生观赏 植物。在一个实施方式中，植物不是天然的甜菜色素表达植物。在一个实施方式中，植物 不是石竹目植物。在一个实施方式中，植物物种是：合果芋、波士顿蕨、加拿利海枣、粗 肋草、鸟巢蕨、棕竹、一叶兰、橙株花、欧洲凤尾蕨、大王黛粉叶、欧洲矮棕、绿萝、变 叶木、观音莲、琴叶榕、绿绒海芋、蔓绿绒、龙血树藻、铁线蕨、袖珍椰子、豪威椰、缘 叶龙血树、马拉巴栗、孔雀竹芋、兔脚蕨、彩虹竹芋、苏铁树、百合竹、箭羽竹芋、橡皮 树、富贵椰子、蜘蛛植物吊兰、捕蝇草、草胡椒、银脉单药花、雪铁芋、紫露草、垂叶榕、 天鹅绒竹芋或仙人掌。
在一个实施方式中，改变植物的颜色，特别是植物的花的颜色将影响植物的授粉。在 一个实施方式中，本发明的方法将增加或提高植物的授粉。在另一个实施方式中，本发明 的方法将减少植物的授粉。在另一个实施方式中，本发明的方法将改变被植物吸引的生物 体，从而改变植物的授粉。在一个实施方式中，本发明提供了增加植物授粉的方法，其包括将本发明的重组多核苷酸或一种或多种核酸插入所述植物的至少一个细胞中的步骤。
在另一个实施方式中，本发明提供了增加植物授粉的方法，所述方法包括以下步骤： 在足以产生甜菜色素的条件下，使植物与编码CYP76AD1、CYP76AD6、CYP76AD15或 其组合的核酸序列，和可选的编码DOPA 4，5-双加氧酶(DOD)的核酸序列接触，从而改 变植物的颜色，从而增加植物的授粉。在一个实施方式中，植物不是天然的甜菜色素表达 植物。在一个实施方式中，植物不是石竹目植物。
在另一个实施方式中，本发明的方法提供了改变生物体颜色的方法。在一个实施方式 中，生物体是鱼。
在另一个实施方式中，本发明的方法提供了生产生物体的方法，其中所述生物体的一 个或多个部分是红紫色的，方法包括以下步骤：使所述生物体的一个或多个细胞与重组多 核苷酸接触，重组多核苷酸包括编码CYP76AD1的核酸、编码DOPA 4，5-双加氧酶(DOD)的核酸、以及编码甜菜色素相关的葡糖基转移酶的核酸，其中所述核酸被框内插入多核苷酸中。
在另一个实施方式中，本发明的方法提供了生产生物体的方法，其中所述生物体的一 个或多个部分是黄色的，方法包括以下步骤：使所述生物体的一个或多个细胞与重组多核 苷酸接触，重组多核苷酸包括编码CYP76AD6的核酸和编码DOPA 4，5-双加氧酶(DOD)的核酸，其中所述核酸被框内插入多核苷酸中。
在另一个实施方式中，本发明的方法提供了生产生物体的方法，其中所述生物体的一 个或多个部分是橙色的，方法包括以下步骤：使所述生物体的一个或多个细胞与重组多核 苷酸接触，重组多核苷酸包括编码CYP76AD6的核酸、编码CYP76AD1的核酸、编码DOPA4，5-双加氧酶(DOD)的核酸、以及编码甜菜色素相关的葡糖基转移酶的核酸，其中所述 核酸被框内插入多核苷酸中。
在一个实施方式中，生物体是鱼。在一个实施方式中，鱼是观赏鱼。
在一个实施方式中，本发明提供了一种生产观赏鱼的方法，方法包括使鱼的细胞与多 核苷酸接触，所述多核苷酸包括编码DOPA 4，5-双加氧酶(DOD)的核酸和编码CYP76AD6 的核酸、编码CYP76AD15的核酸、编码CYP76AD1的核酸，或其组合，其中如果所述细 胞与编码CYP76AD1的核酸和编码DOD的核酸且不是编码CYP76AD6的核酸或编码CYP76AD15的核酸接触，则还使所述细胞与编码甜菜色素相关的葡糖基转移酶的核酸接触。
在另一个实施方式中，本发明提供了生产表达甜菜色素的植物的方法，方法包括以下 步骤：使所述植物的一个或多个细胞与编码CYP76AD1、CYP76AD6、CYP76AD15或其 组合的核酸序列，和编码DOPA 4，5-双加氧酶(DOD)的核酸序列接触，筛选所述一个或 多个细胞以识别包含所述核酸序列的细胞，以及从所述细胞再生植物或植物部分，从而产 生表达甜菜色素的植物。
在一个实施方式中，植物不天然表达甜菜色素。在另一个实施方式中，植物表达甜菜 色素并且本发明的方法用于增加植物所表达的一种或多种甜菜色素的量。
在另一个实施方式中，本发明提供了生产表达甜菜色素的食物作物的方法，其包括以 下步骤：使食物作物植物的一个或多个细胞与编码CYP76AD1、CYP76AD6、CYP76AD15或其组合的核酸序列，和编码DOPA 4，5-双加氧酶(DOD)的核酸序列接触，筛选所述一 个或多个细胞以识别包含所述核酸序列的细胞，以及从所述细胞再生植物或植物部分，从 而产生表达甜菜色素的食物作物。
在一个实施方式中，“食物作物”或“农作物”是意图生长的植物，其主要目的是被人 或动物食用。在一个实施方式中，食物作物是大蕉、山药、高粱、甘薯、大豆、木薯、水 稻、小麦、或玉米。在另一个实施方式中，食物作物是茄子、椒、西兰花、花茎甘蓝、荞 麦、玉米、大麦、葡萄、浆果、西红柿、黄瓜、朝鲜蓟、洋葱、大黄、黑莓、蓝莓、西葫 芦、萝卜、胡萝卜、抱子甘蓝、生菜、甜瓜、豆类、豌豆、谷物、花生、甘蔗、西瓜、木 瓜、苹果、梨、桃、樱桃、草莓、或南瓜。
在一个实施方式中，甜菜色素的强抗氧化活性对人类健康有益。
已经广泛研究了它们潜在的促进健康的性质，包括抗癌、降血脂、抗炎症、保肝和抗 糖尿病活性。因此，在一个实施方式中，本发明提供了治疗或抑制癌症、高脂血症、炎症、肝脏疾病和糖尿病的方法，方法包括向有需要的受试者喂食表达甜菜色素、甜菜红素和/或甜菜黄素的本发明的植物或植物部分的步骤，从而治疗或抑制所述受试者的癌症、高脂血症、炎症、肝脏疾病或糖尿病。
在一个实施方式中，受试者摄入包含甜菜色素或增加量的甜菜色素的本发明的食物作 物以保护受试者抵抗炎症-免疫损伤(包括但不限于肾小球肾炎、血管炎、自身免疫疾病、 成人呼吸窘迫综合征、类风湿性关节炎、炎性肠病、胰腺炎)；癌症(包括但不限于辐射诱导的癌症、宫颈癌、肝细胞癌、癌发生的促进剂、炎症性肠病中的癌症)；缺血/复氧(包 括但不限于中风、心肌梗塞、器官移植(心脏、肺、皮肤、角膜、肾脏)、器官保存、切 断肢体的再连接、冻伤、杜普征氏掌挛缩、失血性休克、内毒素休克、挤压伤)；金属过 载(包括但不限于血色沉着病、地中海贫血、夸休可尔症、用于白血病的化疗、暴发性肝 功能衰竭、威尔逊病、酒精诱导的铁过载、镍诱导的癌变、铅中毒)；毒素(包括但不限 于溶血药、铅、卤代烃、臭氧、氮氧化物、石棉、其它矿物粉尘、二氧化硫、百草枯、铝、 香烟烟雾、致糖尿病药物、蚕豆(溶血剂)、蒽环类(心脏毒性)、重金属(肾毒性)、光 敏药物、接触性皮炎)；眼病(包括但不限于白内障发展、眼出血后恶化、光化学视网膜 损伤、早产儿视网膜病变(晶状体后纤维组织增生))；先天性疾病(包括但不限于卟啉症、 镰状细胞性贫血、范可尼氏贫血症、神经元蜡样脂褐质炎、地中海贫血)；抗氧化保护不 足(包括但不限于克山病(严重硒缺乏症)、早产儿溶血病、早产儿视网膜病变、支气管 肺发育不良、颅内出血、严重维生素E缺乏引起的神经变性(影响肠道脂肪吸收的先天性 缺陷)、后天免疫机能丧失综合症)；脑和中枢神经系统障碍(包括但不限于中风、创伤、 神经毒性(例如铝)、高压氧影响、帕金森病、创伤性损伤的加强、脑疟疾)。
在另一个实施方式中，本发明提供了在非天然甜菜色素表达物种中产生甜菜色素的新 方法，其中甜菜色素可以用作天然食品着色剂。因此，本发明还提供了包含如本文所述产 生的甜菜色素的天然食品着色剂。在一个实施方式中，如本文所述的从表达甜菜色素的植 物中提取甜菜色素。在另一个实施方式中，甜菜色素在细胞系中体外产生。甜菜色素的异 源生产使得能够生物强化和增强基本食物的营养品质。
在另一个实施方式中，本发明的方法可以通过基因工程化植物来表达一种或多种甜菜 色素以改变其颜色，从而用于提高食物作物或产品的美学品质。
因此，在一个实施方式中，本发明提供了治疗或抑制上文提及的疾病、障碍和病症的 方法，方法包括向受试者提供如本文所述的已经被基因改造以表达甜菜色素的食物作物的 步骤。在另一个实施方式中，本发明提供了本文所述的多核苷酸、核酸和其它组合物在制 备用于治疗或抑制上述疾病、障碍和病症的组合物中的用途。在一个实施方式中，组合物 是药物组合物。在另一个实施方式中，本发明提供了本文所述的多核苷酸、核酸和其它组 合物在治疗或抑制上述的疾病、障碍和病症中的用途。
在另一个实施方式中，与缺乏甜菜色素或具有较低水平甜菜色素的相同食物作物相比， 包含甜菜色素或增加量的甜菜色素的食物作物具有增加的保质期。在另一个实施方式中， 与缺乏甜菜色素或具有较低水平甜菜色素的相同食物作物相比，包含甜菜色素或增加量的 甜菜色素的食物作物具有增加的对真菌疾病的抗性。
在另一个实施方式中，通过本文所述的方法产生的甜菜色素可用于食物保存。
因此，在一个实施方式中，本发明提供了增加食物作物保质期的方法，方法包括以下 步骤：在足以产生甜菜色素的条件下，使包含酪氨酸的食物作物植物的一个或多个细胞与 编码CYP76AD6、CYP76AD15或其组合的核酸，编码CYP76AD1的核酸，或其组合接触， 从而产生甜菜色素并增加所述食物作物的保质期。
在植物界内，甜菜色素仅在一组被子植物中发现，即石竹目。在这个目中，甜菜色素 和花青素以相互排斥的方式出现，即没有植物物种产生两种类型的色素。石竹目最突出的 特征之一是它在干旱和半干旱地区以及盐碱土壤栖息地的主导地位。虽然石竹目内的一些 科分布在世界各地的各种栖息地，但几个科的成员特别适应干旱或盐地区，包括番杏(冰 植物科)、马齿苋(马齿苋科)，并且最显著的是仙人掌(仙人掌科；www.britannica.com/plant/Caryophyllales)。下文使用植物中的异源甜菜色素生产来研究这些 色素在赋予对与干旱地区相关的不同非生物胁迫线索(如干旱、高紫外线辐射、过量光线 和高盐度)的耐受性以及作为植物防御化合物对抗病原真菌中的作用。
在另一个实施方式中，本发明提供了增加生物体或生物体部分对一种或多种胁迫因子 的抗性的方法，方法包括以下步骤：在足以产生甜菜色素的条件下，使所述生物体的一个 或多个细胞与编码CYP76AD6、CYP76AD15或其组合的核酸，编码CYP76AD1的核酸， 或其组合接触，从而产生甜菜色素并增加所述生物体或所述生物体部分对所述一种或多种胁迫因子的抗性。在一个实施方式中，生物体是植物。在一个实施方式中，生物体包含酪 氨酸。在一个实施方式中，胁迫因子是非生物胁迫因子。在另一个实施方式中，胁迫因子 是高渗透压、高盐度条件或其组合。在另一个实施方式中，胁迫因子是干旱。在另一个实 施方式中，胁迫因子是过量光线。在一个实施方式中，植物部分是种子。在一个实施方式 中，植物是食物作物。
在一个实施方式中，所述方法包括以下步骤：使植物或植物部分的一个或多个细胞与 编码CYP76AD1的核酸、编码DOPA 4，5-双加氧酶(DOD)的核酸、以及编码甜菜色素相关的葡糖基转移酶的核酸接触。
在另一个实施方式中，本发明提供了增加植物或植物部分对高渗透压的抗性的方法， 方法包括以下步骤：在足以产生甜菜色素的条件下，使包含酪氨酸的植物或植物部分的一 个或多个细胞与编码CYP76AD6、CYP76AD15或其组合的核酸，编码CYP76AD1的核酸，或其组合接触，从而产生甜菜色素并增加所述植物或植物部分对高渗透压的抗性。
在另一个实施方式中，本发明提供了增加植物或植物部分对高盐度条件的抗性的方法， 方法包括以下步骤：在足以产生甜菜色素的条件下，使包含酪氨酸的植物或植物部分的一 个或多个细胞与编码CYP76AD6、CYP76AD15或其组合的核酸，编码CYP76AD1的核酸，或其组合接触，从而产生甜菜色素并增加所述植物或植物部分对高盐度条件的抗性。
在另一个实施方式中，本发明提供了增加植物的种子发芽率的方法，方法包括以下步 骤：在足以产生甜菜色素的条件下，使植物或植物部分的一个或多个细胞与包括编码CYP76AD1的核酸、编码DODA1的核酸、以及编码cDOPA5GT的核酸的多核苷酸接触， 从而增加所述植物的种子发芽率。
在另一个实施方式中，本发明提供了增加生物体或生物体部分对一种或多种真菌疾病 的抗性的方法，方法包括以下步骤：在足以产生甜菜色素的条件下，使所述生物体的一个 或多个细胞与编码CYP76AD6、CYP76AD15或其组合的核酸，编码CYP76AD1的核酸， 或其组合接触，从而产生甜菜色素并增加所述生物体或所述生物体部分对所述一种或多种真菌疾病的抗性。在一个实施方式中，生物体包含酪氨酸。在一个实施方式中，生物体是 植物。在一个实施方式中，植物是食物作物。
在一个实施方式中，引起所述真菌疾病的真菌是植物病原真菌。在一个实施方式中， 引起所述真菌疾病的真菌是灰霉菌。在一个实施方式中，植物是烟草植物。在一个实施方 式中，植物部分是叶。
在另一个实施方式中，本发明提供了增加植物或植物部分对一种或多种真菌疾病的抗 性的方法，方法包括以下步骤：在足以产生甜菜色素的条件下，使植物或植物部分的一个 或多个细胞与编码CYP76AD1的核酸、编码DOPA 4，5-双加氧酶(DOD)的核酸、以及编码甜菜色素相关的葡糖基转移酶的核酸接触，从而产生甜菜色素并增加所述植物或植物部分对一种或多种真菌疾病的抗性。在一个实施方式中，植物是食物作物。
在另一个实施方式中，本发明提供了减少由植物或植物部分中由真菌疾病引起的病变 面积的方法，方法包括以下步骤：在足以产生甜菜色素的条件下，使所述植物或植物部分 的一个或多个细胞与编码CYP76AD1的核酸、编码DOPA 4，5-双加氧酶(DOD)的核酸、以及编码甜菜色素相关的葡糖基转移酶的核酸接触，从而产生甜菜色素并从而减少所述植物或植物部分中由真菌疾病引起的所述病变面积。
在另一个实施方式中，本发明提供了减少植物或植物部分中由真菌疾病引起的坏死的 方法，方法包括以下步骤：在足以产生甜菜色素的条件下，使所述植物或植物部分的一个 或多个细胞与编码CYP76AD1的核酸、编码DOPA 4，5-双加氧酶(DOD)的核酸、以及编码甜菜色素相关的葡糖基转移酶的核酸接触，从而产生甜菜色素并从而减少所述植物或植物部分中由真菌疾病引起的坏死。
在另一个实施方式中，本发明提供了抑制第一植物或植物部分附近的植物物种生长的 方法，方法包括以下步骤：在足以产生和分泌L-DOPA的条件下，使所述第一植物或植物 部分的一个或多个细胞与编码CYP76AD1-β进化枝基因的核酸接触，从而抑制所述第一植 物或植物部分附近的植物物种生长。在一个实施方式中，植物物种是第一植物的异源植物 物种。
在另一个实施方式中，本发明提供了生物体的化感生长方法，方法包括以下步骤：在 足以使生物体或其部分产生和分泌L-DOPA的条件下，使所述生物体或其部分的一个或多 个细胞与编码CYP76AD1-β进化枝基因的核酸接触，从而允许所述生物体的化感生长。
在一个实施方式中，化感作用是生物体产生影响其它生物体的发芽、生长、存活和繁 殖的一种或多种生化物质的生物学现象。
在另一个实施方式中，本发明提供了杂草控制的方法，方法包括以下步骤：在足以使 植物或植物部分产生和分泌L-DOPA的条件下，使所述植物或植物部分的一个或多个细胞 与编码CYP76AD1-β进化枝基因的核酸接触，从而抑制所述植物或植物部分附近的杂草生 长。
在一个实施方式中，在足以产生甜菜色素的条件下，使植物或植物部分的一个或多个 细胞与编码CYP76AD6、CYP76AD15或其组合的核酸，编码CYP76AD1的核酸，或其组 合接触的步骤包括使所述一个或多个细胞与编码CYP76AD1的核酸、编码DOPA 4，5-双加 氧酶(DOD)的核酸、以及编码甜菜色素相关的葡糖基转移酶的核酸接触。在一个实施方 式中，DOD是甜菜DODA1。在一个实施方式中，甜菜色素相关的葡糖基转移酶是环-DOPA 5-O-葡糖基转移酶或甜菜素-5-O-葡糖基转移酶。在一个实施方式中，环-DOPA 5-O-葡糖基 转移酶是紫茉莉基因环-DOPA 5-O-葡糖基转移酶(cDOPA5GT)。
在一个实施方式中，多核苷酸包括核酸。在一个实施方式中，多核苷酸是pX11。在另 一个实施方式中，多核苷酸是pX12。在另一个实施方式中，该多核苷酸是pX13。
在一个实施方式中，表达pX11的物种由于产生比甜菜黄素更高量的甜菜红素而表现出 主要为红紫色。
本文描述的本发明在各种不同的行业中具有许多应用，包括例如但不限于农业、食品 和饮料、药物、化妆品、纺织品和消费品。
在一个实施方式中，本发明的应用包括生产用于鱼饲料的甜菜色素和/或L-DOPA。在 另一个实施方式中，甜菜色素和/或L-DOPA的产生用于包含在食品补充剂中。在一个实施 方式中，食品补充剂用于人。在另一个实施方式中，食品补充剂用于非人动物。在另一个实施方式中，食品补充剂用于兽医用途。在另一个实施方式中，食品补充剂用于水产养殖。在另一个实施方式中，食品补充剂是维生素的形式。在另一个实施方式中，食品补充剂被添加到牛奶或其它乳制品中。
在另一个实施方式中，本发明提供了增加乳制品中一种或多种甜菜色素的方法，方法 包括以下步骤：a)使细菌细胞与多核苷酸接触，多核苷酸包括编码DOPA 4，5-双加氧酶 (DOD)的核酸和编码CYP76AD6的核酸、编码CYP76AD15的核酸、编码CYP76AD1 的核酸，或其组合，其中如果所述细胞与编码CYP76AD1的核酸和编码DOD的核酸且不 是编码CYP76AD6的核酸或编码CYP76AD15的核酸接触，则使所述细胞还与编码甜菜色 素相关的葡糖基转移酶的核酸接触，以及b)用从所述细胞生长的细菌发酵乳制品，从而 增加所述乳制品中的一种或多种甜菜色素。在一个实施方式中，细菌是用于制备乳制品的 发酵中的细菌。在一个实施方式中，细菌是乳酸杆菌。
另一方面，可以将本发明的基因转化到植物或植物细胞中以免受一种或多种生物胁迫， 例如但不限于真菌、细菌和病毒，和/或一种或多种非生物胁迫，例如但不限于热、冷、盐、 干旱和紫外线暴露。
在一个实施方式中，表达本发明的多核苷酸或多肽的植物器官可以用作食品着色剂、 染料或色素。在另一个实施方式中，表达本发明的多核苷酸或多肽的植物器官的衍生产物 可以用作食品着色剂、染料或色素。
在另一个实施方式中，来自转化的水果的果汁可以从这种水果中提取以制造饮料。在 另一个实施方式中，来自表达本发明多核苷酸或多肽的植物器官的果汁或其它提取物可以 用作食品着色剂、染料或色素。在一个实施方式中，这种果汁可以用于染色酸奶、糖果、 口香糖和冰淇淋等。这种染料或着色剂也可用于在纺织工业中染色衣服。
在另一个实施方式中，如本文所述，可将如本文所述的转基因植物或植物细胞的提取 物喷雾在易受害植物上以保护它们免受生物和非生物胁迫，如上文所述。因此，本发明包 括如本文所述的植物或食物作物的提取物以及保护植物免受生物胁迫、非生物胁迫或其组 合的方法，方法包括使所述植物与通过如本文所述的本发明的方法产生的植物或植物提取 物接触。
在另一个实施方式中，甜菜色素和/或L-DOPA的生产用于化妆品用途。在一个实施方 式中，甜菜色素和/或L-DOPA的生产用于包含在防晒剂中。在另一个实施方式中，在酵母中产生用于防晒剂中的甜菜色素和/或L-DOPA。
在另一个实施方式中，本发明提供了治疗、抑制、压制或预防受试者中多巴胺反应性 疾病的方法，方法包括施用包含高水平CYP76AD1-β进化枝基因的食物作物、细胞或细胞系的步骤，从而为所述受试者提供L-DOPA，从而治疗、抑制、压制或预防所述受试者中 的多巴胺反应性病症。
在另一个实施方式中，本发明提供了CYP76AD1-β进化枝基因或包含高水平的所述CYP76AD1-β进化枝基因的食物作物、细胞或细胞系在制备用于治疗或抑制受试者中的多巴胺反应性病症的组合物中的用途。
在另一个实施方式中，本发明提供了CYP76AD1-β进化枝基因或包含高水平的所述CYP76AD1-β进化枝基因的食物作物、细胞或细胞系在治疗或抑制受试者中的多巴胺反应性病症中的用途。
在一个实施方式中，CYP76AD1-β进化枝多肽是CYP76AD6、CYP76AD15或其组合。 在一个实施方式中，所述多巴胺反应性疾病是帕金森病、多巴胺敏感性肌张力障碍或其组合。
在另一个实施方式中，本发明提供了治疗、抑制、压制或预防受试者中的帕金森病或 多巴胺敏感性肌张力障碍的方法，方法包括向所述受试者提供经基因改造以表达CYP76AD6、CYP76AD15或其组合的酪氨酸表达植物或植物部分，从而为所述受试者提 供L-DOPA，从而治疗、抑制、压制或预防所述受试者中的帕金森病或多巴胺敏感肌张力 障碍。
在另一个实施方式中，本发明提供了治疗、抑制、压制或预防受试者中的帕金森病或 多巴胺敏感性肌张力障碍的方法，方法包括向所述受试者施用CYP76AD6、CYP76AD15 或其组合和酶，可选地与苯丙氨酸或酪氨酸一起，从而由酪氨酸产生L-DOPA，从而治疗、 抑制、压制或预防所述受试者中的帕金森病或多巴胺敏感肌张力障碍。
在另一个实施方式中，本发明提供了使受试者抑制症状、稳定症状、延迟发作和/或减 缓进展帕金森病或多巴胺敏感肌张力障碍的方法，方法包括向所述受试者提供经基因改造 以表达CYP76AD6、CYP76AD15或其组合的酪氨酸表达植物或植物部分，从而为所述受 试者提供L-DOPA，从而使所述受试者抑制症状、稳定症状、延迟发作和/或减缓进展帕金森病或多巴胺反应性肌张力障碍。
在另一个实施方式中，本发明提供了使受试者抑制症状、稳定症状、延迟发作和/或减 缓进展帕金森病或多巴胺敏感肌张力障碍的方法，方法包括向所述受试者施用CYP76AD6、CYP76AD15或其组合和酶，可选地与苯丙氨酸或酪氨酸一起，从而由酪氨 酸产生L-DOPA，从而使所述受试者抑制症状、稳定症状、延迟发作和/或减缓进展帕金森 病或多巴胺敏感性肌张力障碍。
在一个实施方式中，帕金森病是特发性帕金森病、脑炎后帕金森综合征或症状性帕金 森综合征。
在一个实施方式中，向受试者另外施用外周DOPA脱羧酶抑制剂(DDCI)。在一个实施方式中，DDCI是卡比多巴、苄丝肼或其组合。
在另一个实施方式中，向所述受试者另外施用吡哆醇。
在一个实施方式中，如本文所述的CYP76AD6、CYP76AD15或其组合、由CYP76AD6、CYP76AD15或其组合产生的酶和/或L-DOPA、酶的施用是通过口服施用。在另一个实施 方式中，通过导管施用。在另一个实施方式中，酶被硬膜外、大脑内或脑室内施用。下文 描述了其它合适的施用方法。
根据本发明的任何方法，并且在一个实施方式中，受试者是人。在另一个实施方式中， 受试者是鼠类，鼠类在一个实施方式中是小鼠，并且在另一个实施方式中是大鼠。在另一 个实施方式中，受试者是犬、猫、牛、绵羊或猪。在另一个实施方式中，受试者是哺乳动物。在另一个实施方式中，受试者是对帕金森病易感的任何生物体。
在一个实施方式中，本发明的方法用于兽医学。在一个实施方式中，本发明提供了对 驯化哺乳动物的治疗，驯化哺乳动物作为人伴侣(例如狗、猫、马)而供养、具有显著的商业价值(例如奶牛、肉牛、运动动物)、具有显著的科学价值(例如濒危物种的圈养或 自由样本)、或者其它价值。
在一个实施方式中，本发明的方法包括将所述组合物用于治疗和/或预防疾病、障碍或 病症。在一个实施方式中，本发明的方法包括治疗性治疗或预防性或保护性措施，其中目 的是预防或减轻如上文所述的靶向病理性病症或障碍。因此，在一个实施方式中，本发明 的方法可以包括对与疾病、障碍或病症直接影响或治愈、抑制、压制、预防、减轻严重程 度、延迟发作、减轻相关的症状，或其组合。因此，在一个实施方式中，“治疗”尤其是 指延迟进展、加快缓解、诱导缓解、增加缓解、加速恢复、提高替代疗法的功效或降低对 替代疗法的抗性，或其组合。在一个实施方式中，“预防”尤其是指延迟症状发作、预防 疾病复发、减少复发事件的次数或频率、增加症状发作之间的潜伏期，或其组合。在一个 实施方式中，“抑制”或“压制”尤其是指降低症状的严重程度、降低急性发作的严重程 度、减少症状的数量、减少疾病相关症状的发生率、减少症状的潜伏期、改善症状、减少 继发症状、减少继发感染、延长患者存活期，或其组合。
在一个实施方式中，症状是原发性的，而在另一个实施方式中，症状是继发性的。在 一个实施方式中，“原发性”是指疾病、障碍或病症的直接结果的症状，而在一个实施方式中，“继发性”是指源自原发性原因或由其导致的症状。在一个实施方式中，本发明中 的多核苷酸、多肽、组合物、细胞及其用途治疗或抑制与帕金森病相关的原发性或继发性 症状或继发性并发症。
在另一个实施方式中，“症状”可以是帕金森病的任何表现，包括震颤、运动徐缓、刚 性肌肉、姿势和平衡受损、自动运动损失、言语改变、书写改变或其组合。
在另一个实施方式中，本发明提供了标记基因转化的方法，方法包括以下步骤：在足 以在所述细胞中产生甜菜色素的条件下，使细胞与多核苷酸接触，多核苷酸包括：a)编码 CYP76AD1、CYP76AD6、CYP76AD15或其组合的核酸序列，b)编码DOPA 4，5-双加氧 酶(DOD)的核酸序列；和c)另外感兴趣的核酸序列，其中通过由所述细胞中甜菜色素 的产生所产生的颜色标记所述细胞中的所述基因转化。在一个实施方式中，接触步骤还包 括与甜菜色素相关的葡糖基转移酶接触。
在一个实施方式中，所述方法还包括使生长培养基与作为还原剂的抗坏血酸接触以防 止自发的甜菜素氧化，该氧化会导致色素聚合并失去其紫色。
在另一个实施方式中，本发明提供了识别生物体中甜菜色素相关基因的方法，方法包 括以下步骤：在植物基因组数据库中搜索具有与本文所述的甜菜色素相关基因的表达模式 高度相关的表达模式的基因。在一个实施方式中，基因是MjDOD、cDOPA5GT、CYP76AD3 或其组合。在另一个实施方式中，基因是CYP76AD1、CYP76AD6、CYP76AD15或其组合。
组合
在一个实施方式中，使用本发明的组合物和方法产生的甜菜色素可以单独施用或提供。 在另一个实施方式中，使用本发明的组合物和方法产生的甜菜色素可以与另外的膳食补充 剂一起施用或提供。在另一个实施方式中，使用本发明的组合物和方法产生的甜菜色素可 以与萜烯一起施用或提供，在一个实施方式中，萜烯是虾青素。在另一个实施方式中，使 用本发明的组合物和方法产生的甜菜色素可以与花青素、类胡萝卜素或其组合一起施用或 提供。
在另一个实施方式中，使用本发明的组合物和方法产生的甜菜色素可以与另外的组分 一起产生，在一个实施方式中，另外的组分可以用作膳食补充剂。在另一个实施方式中， 使用本发明的组合物和方法产生的甜菜色素可以与萜烯一起产生，在一个实施方式中，萜 烯是虾青素。在另一个实施方式中，使用本发明的组合物和方法产生的甜菜色素可以与花 青素、类胡萝卜素或其组合一起产生。
在另一个实施方式中，本发明提供了包含本发明的多核苷酸的食物作物。在一个实施 方式中，包含本发明多核苷酸的食物作物还包含花青素、胡萝卜素或其组合。在一个实施 方式中，包含本发明多核苷酸的食物作物被基因改造以包含花青索、胡萝卜素或其组合。
在一个实施方式中，食物作物是紫色花青素番茄。
本文引用的任何参考文献(包括专利、专利申请或科学出版物)通过引用整体并入。
呈现以下实施例是为了更全面地说明本发明的优选实施方式。然而，它们决不应被解 释为限制本发明的广泛范围。
实施例
实施例1.材料和方法(1)
植物材料和生长条件
使紫茉莉植物在具有长日光条件(25℃)的温室中土壤生长。使甜菜和本氏烟草植物 在气候室(22℃；70％湿度；18/6小时的光照/黑暗)中土壤生长。从红花的五个发育阶段(阶段1-花长度约1cm；阶段2-2cm；阶段3-3cm；阶段4-4cm；阶段5-5-6cm)、红色 幼叶或绿色成熟叶、以及茎节(红色)或节间(绿色)区域的表皮收集用于紫茉莉RNA 测序的植物材料。从三个品种(红甜菜、波比金甜菜和基奥贾‘条纹’甜菜)的10日龄 幼苗的胚轴收集用于甜菜RNA测序的植物材料。收集的组织立即在液氮中冷冻并保持在 -80℃直至处理。
转录组测序、组装和分析
用于Illumina高通量链特异性RNA序列的紫茉莉和甜菜文库如下制备：使用基于TRI 试剂用户手册(Sigma-Aldrich)的TRIzol方法从取样组织提取总RNA。使用本领域已知的方法且有少量修改，将来自每个样品的5μg总RNA用于制备RNA序列库。简而言之： 使用Dynabeads Oligo(dT)25(Invitrogen)从总RNA中分离poly(A)RNA，在94℃下 片段化5分钟并洗脱。使用逆转录酶SuperScript III(Invitrogen)用随机引物和dNTP合成 第一链cDNA，使用DNA聚合酶I(Enzymatics)和dUTP产生第二链cDNA。末端修复 (Enzymatics)后，用Klenow 3′-5′(Enzymatics)和衔接子连接(Quick T4 DNA Ligase， NEB)进行dA末端延长(tailing)，用尿嘧啶DNA糖基化酶(Enzymatics)消化含有dUTP 的第二链。所得的第一链衔接子连接的cDNA用于用NEBNext高保真PCR Master Mix (NEB)进行13-15个循环的PCR富集。将收录的文库合并并用Illumina HiSeq2000仪器 测序。根据标准程序，用Trinity软件Trinityrnaseq_r2013-02-25版本完成紫茉莉数据集的 标准化计数值的从头组装和计算。重叠群注释使用Blast2GO进行分配。使用B.vulgaris(甜 菜)基因组资源作为参考(http：//bvseq.molgen.mpg.de)，使用Trinity的 Trinityrnaseq_r2014-07-17版本完成甜菜数据集的从头基因组引导组装。用综合Trinotate模 块获得基因注释。
DNA构建体的产生
本研究中使用的基因序列；cDOPA5GT(基因库登录号AB182643.1；SEQ ID NO：2)、DODA1(登录号HQ656027.1；SEQ ID NO：33)、CYP76AD1(登录号HQ656023.1；SEQ ID NO：32)。其它序列在材料和方法中提供。CYP76AD6由美国田纳西州大学David R. Nelson博士命名，以保持命名上的一致性。紫茉莉cDOPA5GT和甜菜CYP76AD1、 BvDODA1、BvCYP76new和CYP76AD6转录物是从紫茉莉红色花瓣和甜菜红色胚轴cDNA 文库扩增的，其使用高容量cDNA逆转录试剂盒(Life technologies)制备。使用‘Phusion’ DNA聚合酶(Finnzyme)和表1中指定的寡核苷酸进行PCR扩增。对于VIGS测定，使 用XhoI和SacI限制将所有基因片段克隆到pTRV2载体中。通过使用EcoRI和BamHI限 制将CYP76AD1片段克隆到pTRV2：BvCYP76new和pTRV2：CYP76AD6中以构建用于 共沉默的载体。用Goldenbraid克隆构建用于本氏烟草农杆菌渗入和用于农杆菌介导的植 物转化的DNA构建体。使用表1中指定的寡核苷酸将CYP76AD1、BvDODA1、CYP76AD6 和cDOPA5GT克隆到pUPD载体中。pDODA、pAD1-GT、pYFP、pAD6和pX11分别是2α2、 2Ω2、2α1、2α1和3α1载体，所有这些载体都基于pCAMBIA骨架。
表1.本研究中使用的寡核苷酸
甜菜中病毒诱导的基因沉默
将BvDODA1(407bp)、CYP76AD1(418bp)、BvCYP76new(471bp)和CYP76AD6 (420bp)的片段克隆到pTRV2载体中，转化到农杆菌品系GV3101，并使用先前描述的 真空渗入方法引入甜菜‘Bull’的‘Blood’种类的10日龄幼苗中。在VIGS渗入缓冲液 (10mM MES，10mMMgCl2，200μM乙酰丁香酮)中使农杆菌达到O.D.600 2.0，在室温 下孵育3小时，并在渗入前与携带pTRV1的农杆菌以1∶1的比例混合。对于每个实验， 感染48个幼苗。在得到可见表型的实验中，在2-3周内通常在超过一半的感染幼苗中观察 到脱色素斑。用于分光光度分析的组织在感染后3.5周进行采样。
定量实时PCR(qRT-PCR)分析
在VIGS感染的红甜菜植物上进行qRT-PCR分析。分析来自每个实验的三个生物学重 复，每个重复由两到三个植物的叶组织组成，在感染后3.5周取样。根据制造商的说明，用TRIzol方法(根据用于TRI试剂的Sigma-Aldrich用户手册中)提取RNA，进行DNase 处理并用高容量cDNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)逆转 录为cDNA。使用PRIMEREXPRESS软件(Applied Biosystems)设计所有寡核苷酸(表1)。 在以下条件下用Fast SYBR Green试剂和StepOnePlus仪器(Applied Biosystems)进行 qRT-PCR：初始步骤在热循环仪中，在95℃下持续20s，然后在95℃下持续3s和在59℃ 下持续30秒PCR扩增40个循环，最后进行解离分析以证实PCR产物的特异性。每个反 应由10μl总体积组成，含有2.5μM的每种引物。根据ΔΔCt方法(Livak&Schmittgen，2001) 计算相对转录水平，使用‘housekeeping’基因GAPDH作为参考。
本氏烟草中的瞬时表达
含有pDODA、pAD1-GT、pYFP、pAD6和pX11载体的本氏烟草中的瞬时基因表达测 定基于先前描述的农杆菌渗入方法。将所有构建体转化到根癌农杆菌GV3101菌株，不包 括转化到根癌农杆菌EHA105菌株的pX11。在所有情况下，农杆菌在LB培养基中生长过 夜并在渗入缓冲液中达到最终O.D.600 0.2。当共同渗入时，携带独立构建体的农杆菌各自 达到O.D.600 0.2并在渗入之前以1∶1的比例混合。用于随后的LC-MS分析的组织从渗 入后第7天的叶采样。对于L-DOPA和甜菜色素的LC-MS分析，对每个实验的3-4个生物 学重复进行取样，每个重复由2-3个不同叶的渗入组织组成。
代谢物提取和分析
对于甜菜色素分析，将提取溶液(包含80％乙醇和0.1％甲酸的DDW)以200μL0.1g-1组织的比例添加至冷冻研磨的植物组织(0.1-0.25g)。样品在室温下孵育30分钟，接着超 声处理5分钟，离心5分钟，并通过0.22μm PVDF过滤器(Millipore)过滤。使用高分辨率UPLC/PDA-qTOF系统分析在DDW中稀释3倍的样品，UPLC/PDA-qTOF系统由在线 连接至Acquity PDA检测器(200-700nm)的UPLC(Waters Acquity)和配备有电喷雾电 离(ESI)源的qTOF检测器(串联四极/飞行时间质谱仪，XEVO，Waters)组成。ESI以 正离子化模式在50至1600Da的m/z范围内使用。使用以下设置：毛细管-1kV，锥形-27V， 碰撞能量-6eV。对于MS/MS或MSE运行，使用从15到40eV的碰撞能量斜坡。如下使 用洗脱液A(1％乙腈，0.1％甲酸)和B(100％乙腈，0.1％甲酸)以在UPLC HSS T3柱 (Waters Acquity，1.8μm，2.1x100mm)上进行化合物的分离：开始3分钟-在100％A的 等度洗脱；3.0-22.0分钟-线性梯度至75％A，22.0-22.5分钟-线性梯度至100％B，22.5-25.5 分钟-在100％B的洗涤，25.5-26.0分钟-返回至100％A，和26.0-28.0min-在100％A的 平衡。柱温设定为35℃，流速为0.3ml/min。使用红甜菜叶提取物作为参考分配了甜菜苷 和异甜菜苷。基于精确质量、紫外-可见光谱和MS/MS或MSE片段(详见表2)，推测性 地识别了其它甜菜色素化合物。
表2.通过LC-MS分析识别的甜菜色素化合物。
在apAD1-GT+pDODA1、bpAD6+pDODA1和cpX11、d本氏烟草愈伤组织、e树烟草愈 伤组织、fpX11转化的烟草的本氏烟草农杆菌渗入实验，以及gCYP76AD1+DODA1、 hCYP76AD6+DODA1和iCYP76AD1/AD6+DODA1的酵母表达实验中通过LC-MS分析识 别甜菜色素化合物。所有片段均以MS/MS模式获得，除了甜菜素和异甜菜素的片段以MS (E)模式确定。Rt，保留时间；MS片段，以正离子化模式获得的片段质量；紫外/可见光， 在紫外/可见光范围内最大吸收；Hex，己糖。
对于L-DOPA分析，如上所述提取样品并使用UPLC/PDA-MSMS仪器进行分析，其中将UPLC分离模块(Waters Acquity)连接到光电二极管阵列检测器(Waters Acquity 2996，190-800nm)和(在线)连接到配备有ESI源的三重四极杆MS检测器(Waters Xevo TQ MS)上。用Phenomenex Luna柱(2×150mm，3μm)使用以下梯度分离化合物：开始1分钟-从 100％A线性梯度至90％A，1-4分钟-90-75％A，4-5分钟-75-0％A，5-9.5分钟-在100％ B的洗涤，9.5-10分钟-返回到100％A，和10-12分钟-在100％A的平衡，其中A是含 有0.1％甲酸的水，并且B是含有0.1％甲酸的乙腈。柱温设定为35℃，流速-0.25ml/min。 使用以下设置对样品进行正离子化模式分析：毛细管-2kV，锥-26eV，其具有用于化合物 分配的198.1＞152.1(碰撞-15eV)和198.1＞181.1(碰撞-10eV)的两个转变。通过与溶于 DDW(5μM)并注射相同LC-MS条件的L-DOPA商业标准(Sigma-Aldrich)比较来识别 L-DOPA。
为了通过分光光度法相对定量VIGS沉默的甜菜叶中的甜菜黄素，使用与上文详述的 相同程序提取样品，不同之处在于使用80％甲醇代替80％乙醇。将提取物在提取溶液中稀释4倍，置于96孔板上并用Biotek Synergy HT微孔板读数器分析。通过测量475nm处 的吸收并减去600nm处的吸收值来评估每个样品的相对甜菜黄素含量。
为了通过分光光度法评估甜菜红素含量，如上使用相同的提取方法。样品在DDW中稀释以获得O.D.535＜2.0的溶液。甜菜红素定量基于535nm和600nm处的吸收测量，并使 用先前描述的方法计算。
酵母中的重组表达
根据制造商的手册，使用Gateway克隆(Life technologies，Invitrogen)将CYP76AD1、 CYP76AD6和BvDODA1编码序列PCR扩增并克隆至pDONR207载体的BP位点，并且接着将其重组至pAG423GAL-ccdB(对于CYP76AD6)、pAG425GAL(对于BvDODA1) 和pYES-DEST52(对于CYP76AD1，Invitrogen)载体的LR位点。另外，将β-葡糖醛酸 酶(GUS)编码序列引入这些载体以用于对照测定。使用PEG/LiAc方法将目标载体转化 到酿酒酵母菌株BY4742，依次转化。每个酵母克隆最终用三种目的载体转化，表达 CYP76AD1、CYP76AD6、BvDODA1和GUS的不同组合。酵母菌株在含有2％葡萄糖并 缺少组氨酸、亮氨酸和尿嘧啶的标准SD培养基中生长过夜。将酵母颗粒化并在含有2mM 抗坏血酸、1％棉子糖和2％半乳糖并缺少组氨酸、亮氨酸和尿嘧啶的2ml SD培养基中重 新悬浮至O.D.600 1.0，并生长过夜。图8中的图像是在半乳糖诱导过夜后生长酵母的培养 基。对于LC-MS分析，将1ml液体培养基在蒸发器中干燥并重新悬浮于100μl DDW中。
生物信息学分析
对于共表达分析，分别使用对应于DOPA 4，5-双加氧酶(MjDOD)、环-DOPA-5-O-葡糖 基转移酶(cDOPA5GT)和CYP76AD3的重叠群作为‘诱饵’。基于所有24个文库中每个 基因的归一化计数值，通过使用R脚本来识别与‘诱饵’中任一个共表达的基因以计算皮 尔逊相关值。
为了产生CYP76AD1样蛋白的系统发生树，首先将CYP76AD6蛋白序列用于NCBI nr数据库的BLASTp查询。选择具有最高序列同一性和完整蛋白质序列的BLASTp前四个匹 配与CYP76AD1蛋白及其先前描述的直系同源物CYP76AD2、CYP76AD3和CYP76AD4 一起用于多序列比对。使用Clustal Omega进行多序列比对，并使用MEGA软件版本6.06 处理成邻接系统发生树。使用100次迭代的自举来验证。用Clustal Omega使用默认参数完 成CYP76AD6和CYP76AD1成对比对，并用GeneDoc软件编辑。
植物转化和再生
根据本领域已知的方法在烟草叶片、茄子、本氏烟草、番茄、马铃薯、矮牵牛、树烟草中进行农杆菌介导的植物转化和再生。下文提供了用于龙葵转化的方案。使用农杆菌GV3101菌株转化所有植物物种。植物组织培养在气候室(22℃；70％湿度；光照/黑暗16/8小时，2500Lux光强度)中进行。
本研究中使用的基因序列
提供的序列是从甜菜和紫茉莉转录组(RNA序列)数据的从头组装获得的重叠群序列。 所有序列均以5′-3′方向呈现。
＞来自紫茉莉的MjCYP76
＞来自甜菜的BvCYP76new
＞来自紫茉莉的CYP82G1样
＞来自紫茉莉的CYP78A9样
＞来自紫茉莉的CYP86B1样
龙葵的胚轴转化
培养基
Jones液体(pH5.2)
基础培养基(在添加琼脂之前用NaOH调节至pH 5.8)
含维生素的MS(cat M0222)＝4.41g/L
蔗糖3％＝30g/L
琼脂糖(植物琼脂)0.6％＝6g/L
表3：IND1(第一愈伤组织诱导培养基)
表4：IND2(第二愈伤组织透导培养基)
*制备没有Kan的培养基用于对照
表5：SHOOT(芽诱导培养基)
*制备没有Kan的培养基用于对照
表6：MAT(成熟培养基)
*制备没有Kan的培养基用于对照
表7：ROOT(洋红色的生根培养基)
*制备没有Kan的培养基用于对照
程序
*总是在流动通风橱中工作，接近火焰
*使用用EtOH和火焰灭菌的镊子和解剖刀
*在从流动通风橱中取出之前用石蜡密封板
制备农杆菌：
从新转化到农杆菌GV3101的菌落中挑取菌落，并在50ml falcon管中接种7.5mlLB缓 冲液
在28℃o/n下振荡生长
添加Jones液体(pH5.2)至总体积为25ml
处理外植体：
使用具有扩大的子叶但没有真叶的幼苗-使用无菌镊子移除单个幼苗并将其置于无菌 培养皿中(每个平板约30个胚轴)。
使用无菌解剖刀切割胚轴，在每次切割之前将解剖刀浸入农杆菌混合物中。
用于对照，在每次切割之前将解剖刀浸入Jones液体中。
将所有外植体置于IND1平板上并放置在生长室中在黑暗中3天(包裹在箔中)。
随后的子培养：
将外植体移到IND2平板上(将它们间隔放置超过约20个/平板)并放置在生长室中进 行光照/黑暗循环。
*如果污染可见，则每隔几天检查平板是否污染并且将健康的外植体更快地转移到新鲜 培养基中。
2-3周后，愈伤组织将在外植体的末端(它们被切割的地方)形成。将愈伤组织从组织 的其余部分切下并转移到SHOOT培养基上。
如果愈伤组织尚未形成-移至新鲜的IND2培养基中。
1-2周后，绿芽将从愈伤组织开始发育。将这些愈伤组织转移到MAT培养基上。
如果芽没有形成-移至新鲜的SHOOT培养基中。
1-2周后，芽应当足够大以从愈伤组织切下并转移至ROOT培养基(洋红色)中。
如果芽仍然很小-移至新鲜的MAT培养基中。
每2-3周将幼苗移至新鲜ROOT培养基中，直到它们具有足够的根移至土壤中。
实施例2.紫茉莉中的转录组分析和共表达分析表明CYP76AD1亚家族成员的参与 在甜菜色素生物合成中的作用
本研究的主要目的是阐明植物中甜菜色素的生物合成的第一关键(committed)步骤， 其从芳香族氨基酸酪氨酸开始。实现这一目标将弥补我们目前对植物酶和基因在核心甜菜 色素途径中发挥作用的认识上的差距(图1)。由于来自产生甜菜色素的植物的基因组和转 录组序列数据目前非常有限，我们从甜菜色素着色的紫茉莉(即四点钟)植物生成了全面 的转录组数据集。测序24个紫茉莉组织的文库，包括产生和不产生甜菜色素的组织。选 择的一组组织提供了甜菜色素合成的时间和空间呈现，因为在五个发育阶段中对四个不同 的花部分(即花瓣、雄蕊、花药和柱头)进行取样，各自在发育期间呈现增加的色素沉着 (图2A至图2F)。
转录组数据首先通过检查先前在紫茉莉中识别的甜菜色素相关基因(即DOPA 4，5-双加 氧酶(MjDOD)、环-DOPA-5-O-葡糖基转移酶(cDOPA5GT)和细胞色素P450(CYP76AD3)) 的基因表达模式来分析。发现这三种基因表现出平行色素积累(即在花发育过程中增加表 达，红色比绿色组织中表达更高)的表达模式(图2G)。因此可以通过共表达分析发现另 外的甜菜色素相关基因，寻找具有与MjDOD、cDOPA5GT或CYP76AD3高度相关的表达 模式的基因。
通常认为产生甜菜色素的植物中的酪氨酸羟化是由酪氨酸酶(多酚氧化酶)催化的。 因此我们首先寻找与MjDOD、cDOPA5GT或CYP76AD3共表达的酪氨酸酶编码基因，然 而没有发现。以平行甜菜色素积累的模式表达的多酚氧化酶也不能通过人工检查紫茉莉数据集中注释为多酚氧化酶的基因来检测(图3)。或者，L-DOPA形成在理论上可以通过细 胞色素P450型酶而在紫茉莉中催化。发现四种细胞色素P450编码基因与用作诱饵的一种 或多种已知的甜菜色素相关基因共表达，即CYP82G1样(SEQ ID NO：36)、CYP78A9 样(SEQ IDNO：37)、CYP86B1样(SEQ ID NO：38)和CYP76AD1样(SEQ ID NO：1)。 后者在下文中称为MjCYP76，作为有希望的候选者脱颖而出，在整个数据集中表现出高表 达值，与甜菜色素积累高度相关(图2G)。
实施例3.CYP76AD1和CYP76AD6共沉默抑制甜菜中甜菜色素的产生
为了检查MjCYP76是否确实参与甜菜色素生物合成，需要基因沉默测定法。由于任何 产生甜菜色素的植物都没有坚固和稳定的转化程序，因此我们决定应用病毒诱导基因沉默 (VIGS)，这是一种广泛用于植物中瞬时基因沉默的非常适于跟踪色素沉着表型的方法。 然而，之前已经证明，利用VIGS方法的基因沉默在紫茉莉中特别具有挑战性(最可能是由于紫茉莉抗病毒蛋白(MAP)的抑制活性)，并且只有当MAP基因与感兴趣的基因共沉 默时才能实现。尝试使用VIGS在紫茉莉中进行基因沉默在我们手中是不成功的，包括尝 试沉默cDOPA5GT，其应该导致植物中甜菜色素沉着的部分损失。因此，我们继续尝试在 不同的产生甜菜色素的植物物种中识别MjCYP76直系同源物，其中可以有效实施基因沉 默测定。先前在红甜菜中描述了使用真空渗入的高效VIGS方法，其被成功用于沉默甜菜 色素相关基因。红甜菜中MjCYP76直系同源物的识别因此可以帮助评估该基因与甜菜色 素生物合成的相关性。
为此，我们对三个品种的甜菜的胚轴组织的转录组进行测序；仅产生黄色甜菜黄素的 “金甜菜”品种、以及均具有红色素沉积的胚轴的红甜菜和“条纹甜菜”品种。预计甜菜中的MjCYP76直系同源基因将在所有三种组织中高度表达，其推测性地在甜菜色素生物 合成中起关键作用。通过tBLASTx查询甜菜转录组数据集和MjCYP76编码序列来识别同 源物。代表具有与MjCYP76具有高度序列同源性(在蛋白质水平上超过50％的同一性) 的8个不同细胞色素P450基因的重叠群被发现，包括先前表征的CYP76AD1(图4A)。 最高得分的基因BvCYP76new被选为潜在候选者以成为甜菜中MjCYP76的功能直系同源 物。该组中的另一基因，在下文中称为CYP76AD6，其与MjCYP76在核苷酸水平上具有 60％的同一性，并且在氨基酸水平上具有53％的同一性，与其它旁系同源物相比表现出显 著更高的表达值，因此也被选择用于随后的分析。
将来自BvCYP76new和CYP76AD6的片段克隆到VIGS载体pTRV2中并引入‘Bull’ 的‘Blood’红甜菜品种的幼苗中，该品种产生具有高度着色的暗红色叶片的植物，因此 特别适用于甜菜色素相关基因的基因沉默测定。由于形成L-DOPA的酪氨酸羟化酶反应对 于形成包括红色甜菜红素和黄色甜菜黄素的所有甜菜色素化合物是必要的，由于缺乏甜菜 色素沉着，预期BvCYP76new或CYP76AD6沉默会产生显示绿色斑块的植物。pTRV2： BvDODA1和pTRV2：CYP76AD1也被引入到甜菜幼苗中并作为测定的阳性对照。正如先 前报道的，BvCYP76new或CYP76AD6的沉默没有导致任何可见的表型(数据未显示)， 而沉默BvDODA1和CYP76AD1分别产生绿色或黄色的斑块。当使推定编码导致L-DOPA 产生的酶的基因沉默时缺乏可见表型的一个可能解释是，该酶可能与也催化相同反应的另 一种或多种酶重复。一个这种候选者是CYP76AD1，除了其经实验证明的将L-DOPA转化 为环-DOPA的活性外，其还可能催化酪氨酸羟化步骤。由于CYP76AD1的沉默不会阻止 甜菜黄素的形成，而L-DOPA是甜菜黄素必需的前体(图1)，因此CYP76AD1将不得不 与另一种酶重复作用。这个假设可以通过共沉默BvCYP76new或CYP76AD6与CYP76AD1 一起来检验。
因此，我们构建了其中携带与BvCYP76new或CYP76AD6候选者之一串联的CYP76AD1片段的pTRV2载体。除了使CYP76AD1与每种CYP76候选者共沉默外，还进 行了后续实验，以沉默BvDODA1、CYP76AD1、BvCYP76new或CYP76AD6，如前述VIGS 实验中所做的。在其中CYP76AD1和BvCYP76new共沉默的植物在叶片中产生黄色斑块， 类似于只有CYP76AD1沉默的植物。然而，共沉默CYP76AD1和CYP76AD6引起明显的 绿色斑块表型，其缺乏甜菜红素和甜菜黄素，类似于通过BvDODA1沉默获得的表型(图 5A、B)。通过蓝光成像也可以观察到甜菜黄素积累水平的差异(图5C)，在蓝光下甜菜黄 素通常表现出强烈的荧光。通过分光光度分析(图6A)进一步证实CYP76AD1-CYP76AD6 共沉默组织对比CYP76AD1沉默组织中的甜菜色素积累降低。这些发现支持红甜菜中甜菜 色素生物合成的酪氨酸羟化步骤中的重复概念，通过上述，CYP76AD1或CYP76AD6可 以催化该步骤。此外，单独CYP76AD1沉默阻碍甜菜红素而不是甜菜黄素的产生的事实表 明CYP76AD6不催化L-DOPA向环DOPA的转化，而仅催化由酪氨酸形成L-DOPA。
进行qRT-PCR分析以检测在感染有pTRV2：CYP76AD1或pTRV2： CYP76AD1-CYP76AD6载体的植物中CYP76AD1和CYP76AD6的表达。发现CYP76AD1 在感染有两种载体后均下调，而CYP76AD6仅在感染有pTRV2：CYP76AD1-CYP76AD6 后表现出下调(图6B)。还检测了四种CYP76AD1和CYP76AD6旁系同源物的表达。所 检测的四种旁系同源物中的三种在感染有pTRV2：CYP76AD1或pTRV2： CYP76AD1-CYP76AD6载体中的至少一种的组织中显示出下调(图4A)。因此，目前不能 排除一种或多种这些旁系同源物参与甜菜色素生物合成的可能性。然而，三种旁系同源物 之一BvCYP76new与甜菜素生物合成的不相关性可以从沉默实验的结果推断，因为单独沉 默BvCYP76new不会导致表型的可见变化，并且该基因与CYP76AD1一起的沉默产生了 与当CYP76AD1单独沉默时观察到的相同表型。
实施例4.CYP76AD1在本氏烟草中的瞬时表达使得能够产生L-Dopa和甜菜红素
如果CYP76AD1确实催化L-DOPA的形成及其向环-DOPA的转化，则CYP76AD1的 异源表达与DOD酶和甜菜色素相关的葡糖基转移酶(例如环-DOPA 5-O-葡糖基转移酶或 甜菜素-5-O-葡糖基转移酶)一起应该足以用于广泛常见的葡糖基化甜菜红素、甜菜苷的生 物合成。为了测试这一点，我们产生了用于甜菜BvDODA1和CYP76AD1基因以及紫茉莉 基因环-DOPA 5-O-葡糖基转移酶(cDOPA5GT)的过表达构建体，以用于本氏烟草叶中的 瞬时、农杆菌渗入介导的过表达。为此目的制作了两种载体；一种用于在CaMV 35S启动 子(pDODA)下过表达BvDODA1，另一种用于分别由CaMV 35S和拟南芥泛素-10启动 子(pAD1-GT)驱动的CYP76AD1和cDOPA5GT的串联表达。携带pDODA和pAD1-GT 载体的农杆菌(根瘤农杆菌)共渗入本氏烟草叶中导致渗入后的2-3天内在渗入区域中出 现暗红色素沉着(图7A)。液相色谱-质谱(LC-MS)分析揭示了色素着色的叶组织含有高 水平的甜菜苷，以及甜菜苷异构体异甜菜苷(图7B；表2)。这一结果为在没有底物进料 的情况下在工厂内工程化甜菜色素产生的可能性提供了第一个概念验证。另外，不需要 L-DOPA进料或过表达酪氨酸羟化酶(例如酪氨酸酶)的甜菜红素的形成表明除了其先前 已知的将L-DOPA转化为环-DOPA的活性之外，CYP76AD1还催化L-DOPA的形成。
然而，归因于通过内源性酶的酪氨酸羟化酶活性，由于在本氏烟草叶中出现L-DOPA， 所以产生甜菜色素也许已经是可能的。为了检测是否由于CYP76AD1的表达而使得L-DOPA产生，将pAD1-GT渗入没有pDODA的本氏烟草叶中。过表达YFP蛋白质(pYFP) 的载体的引入被用作本实验的对照。LC-MS分析证实了在pAD1-GT渗入的组织中存在 L-DOPA，但在pYFP渗入的组织中不存在(图7C)。
实施例5.CYP76AD6在本氏烟草中的瞬时表达使得能够产生L-DOPA和甜菜黄素
CYP76AD6的酪氨酸羟化酶活性还通过在本氏烟草叶中的瞬时过表达来评估。构建在 CaMV 35S启动子(pAD6)下的CYP76AD6的过表达载体并将其插入农杆菌。pAD6和 pDODA的共渗入导致渗入区域出现黄色素沉着，在渗入后几天内可见(图7D)。黄色素 沉积的组织的LC-MS分析揭示了一种主要的甜菜黄素化合物的出现，其被识别为梨果仙 人掌黄素(脯氨酸-甜菜黄素)(图7E)。基于准确的质量和片段(表2)，发现另外两种化 合物表现出典型的细胞黄素光吸收光谱，其中一种被推定性地识别为多巴黄素-己糖苷。值 得注意的是，就我们所知，糖基化的甜菜黄素在天然产生甜菜色素的物种中并未出现。 CYP76AD6和BvDODA1共渗入诱导产生甜菜黄素但不诱导产生甜菜红素的事实与上述基 因沉默测定中获得的数据一致，证实了CYP76AD6仅催化L-DOPA形成的单个步骤，而不 催化其随后转化为环-DOPA。通过LC-MS验证，单独pAD6载体的农杆菌渗入导致在本氏 烟草叶中产生L-DOPA(图7F)。
实施例6.CYP76AD1和CYP76AD6的重组表达允许在酵母中合成甜菜色素
CYP76AD1和CYP76AD6活性进一步通过酵母中两种酶的每一种的重组表达来与BvDODA1一起评估。为此，将BvDODA1、CYP76AD1和CYP76AD6的完整编码序列克 隆到半乳糖诱导型酵母过表达载体中并转化到酿酒酵母细胞中。随后使酵母在不补充 L-DOPA的标准SD培养基中生长。与上文讨论的本氏烟草瞬时表达测定类似，在表达 CYP76AD1和BvDODA1的酵母培养基中观察到红紫色素沉着，而在表达CYP76AD6和 BvDODA1的酵母培养基中有明显的黄色素沉着。没有BvDODA1或单独表达BvDODA1 的每种细胞色素P450酶的表达不导致形成红色或黄色色素。此外，CYP76AD1、CYP76AD6 和BvDODA1一起表达导致在培养基中形成橙色素沉着(图8A)。使用LC-MS分析来验 证甜菜色素在黄色、红紫色和橙色色素着色的培养基中的出现(图7C；表2)。
实施例7.CYP76AD6属于先前不与甜菜色素生物合成相关的系统发生进化枝
在最近公布的研究中，对石竹目植物的大规模系统发生分析表明在石竹目植物进化史 中早期出现了CYP76AD1基因座的几个基因复制事件。表明这些事件在CYP76AD1谱系中产生三个进化枝，分别命名为CYP76AD1-α、CYP76AD1-β和CYP76AD1-γ。发明人推 断CYP76AD1-α进化枝与甜菜色素生物合成直接相关，因为其中它包括功能特征性的甜菜CYP76AD1基因及其紫茉莉直系同源物CYP76AD3(其被暗示在甜菜色素生物合成中起相 似作用)。然而，目前对于属于CYP76AD1-β和CYP76AD1-γ进化枝的基因的功能没有任 何已知的。有趣的是，这里报道的CYP76AD6基因[在甜菜基因组中的登录号 ‘Bv9_228610_yqeq.t1’]位于CYP76AD1-β进化枝中，如Brockington及其同事提供的系 统发生分析中所证明的，并且这里进一步呈现在最大可能性系统发生树中(图8B)。 CYP76AD6和CYP76AD1蛋白序列的成对比对显示72％的同一性(图9)。它们的相应基 因在核苷酸水平上显示出70％的序列同一性。
实施例8.代谢工程化转基因植物中的红色甜菜色素在需要三个生物合成基因的 异源表达
如上所述，通过本氏烟草叶中的瞬时基因过表达，我们能够产生红色甜菜红素和黄色 甜菜黄素。我们随后试图通过稳定转化来工程化天然不生产植物物种中的甜菜色素产生。 为此，使用Goldenbraid克隆来产生四基因构建体(以下称为pX11)，其中除了用于转基因 选择的卡那霉素抗性基因之外，CYP76AD1、BvDODA1和cDOPA5GT被串联表达并由组 成型启动子驱动(图10)。最初通过农杆菌渗入本氏烟草来测试pX11载体。类似于pDODA 和pAD1-GT的共渗入，pX11的引入导致渗入组织的红色素沉着(图12B)。进行pX11渗 入组织的LC-MS分析以确定甜菜色素组合物。如先前通过pDODA和pAD1-GT过表达载 体的共渗入所观察到的，发现对应于甜菜苷和异甜菜苷的峰(图11A)。也识别为甜菜黄素 化合物的是梨果仙人掌黄素(脯氨酸-甜菜黄素)，表明向甜菜黄素形成有一定水平的变化。 基于光吸收光谱和片段，其包括几乎无处不在的甜菜红素片段甜菜素(m/z＝389；表2)， 另外两种代谢物被识别为甜菜黄素。pX11-渗入的叶组织出现强烈的红色色素着色，似乎 高产量地生成甜菜红素(图12B)。因此，通过分光光度分析评估渗入组织的总甜菜红素含 量，发现含有330mg kg-1的评估值，高于光叶子花的红色苞片和紫茉莉的红色花瓣(分别 含有120mg kg-1和250mg kg-1甜菜红素)，并且比红甜菜根低2.3倍(含有760mg kg-1)(图 12C)。
接着，pX11载体用于几种植物物种的稳定转化，包括烟草(Nicotiana tabacum)、番茄 (Solanum lycopersicum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、茄子(Solanummelongena)、树 烟草(Nicotiana glauca)、欧洲黑龙葵(Solanum nigrum)、矮牵牛(Petunia x hybrida)和 本氏烟草。将不同物种的外植体与农杆菌共培养并置于选择性培养基上。在与本发明的农 杆菌共培养的两天内，在本氏烟草、树烟草、矮牵牛和番茄中，在外植体表面上可见到红 紫色素沉着的小斑块。在所有转化的物种中，pX11的引入导致形成红紫色愈伤组织，愈伤 组织通常出现在培养1-2周内(图11A)。通过LC-MS发现着色的本氏烟草和树烟草愈伤 组织含有甜菜苷和异甜菜苷。此外，在树烟草愈伤组织中发现了新的未识别的甜菜红素化 合物(图10B，表2)。
pX11转化的烟草(Nicotiana tabacum L.，简称Samsun-NN)的组织培养物最终导致产 生成熟的、红色素强烈着色的植物，其在所有主要植物器官(包括茎、叶、根和花)中显示甜菜色素积累(图13)。转基因pX11烟草叶的LC-MS分析证实了甜菜红素、甜菜苷和 异甜菜苷以及甜菜黄素化合物仙人掌黄素I(谷酰胺-甜菜黄素)的出现(表2)。分光光度 法另外测量pX11烟草叶中的甜菜红素含量为135mg kg-1(图12C)。
实施例9.讨论
CYP76AD1和CYP76AD6重复催化酪氨酸羟化，植物中甜菜色素生物合成的第一关键步 骤
在该研究中，除了其之前报道的催化导致环-DOPA形成的后续反应的作用之外，我们 已经证明CYP76AD1参与酪氨酸羟化为红甜菜中的L-DOPA。此外，我们识别了另外的甜菜细胞色素P450酶CYP76AD6，CYP76AD6与CYP76AD1重复催化第一羟化步骤(图1)。CYP76AD6直系同源物MjCYP76主要在紫茉莉中识别，表现出平行甜菜红素积累的表达 模式。MjCYP76和先前识别的CYP76AD3很可能分别在紫茉莉中与CYP76AD6和在红甜 菜中与CYP76AD1发挥相同的功能，尽管这仍然要通过功能分析(主要是紫茉莉中的基因 沉默测定)进行结论性验证。
最初通过基因沉默测定证实参与L-DOPA形成的CYP76AD6；虽然沉默CYP76AD1 本身抑制甜菜红素而不是甜菜黄素的形成，但是平行沉默CYP76AD1和CYP76AD6会阻 碍两种甜菜色素基团的形成。CYP76AD6单独沉默不产生可见的表型，因为L-DOPA和环 -DOPA的形成继续被CYP76AD1催化。这种可见表型的缺乏可能部分解释了为什么 CYP76AD6和酪氨酸羟化步骤在核心甜菜色素生物合成途径中被最后发现。尽管DOD和 CYP76AD1样基因可以通过导致明显可见表型的自然发生或人工诱导突变而在产生甜菜 色素的物种中被识别，但CYP76AD6由于与CYP76AD1功能重复而不能被识别。这表示 CYP76AD1和CYP76AD6在甜菜色素生物合成中的作用通过本氏烟草和酵母细胞中的重 组表达进一步得到证实，当与BvDODA1表达联合时，分别导致形成甜菜红素或甜菜黄素。 另外，当CYP76AD1或CYP76AD6在没有BvDODA1的情况下过表达时，在本氏烟草中 检测到形成L-DOPA。
CYP76AD1和CYP76AD6属于CYP76AD1亚家族内的两个分开的进化枝，分别命名 为CYP76AD1-α和CYP76AD1-β进化枝。可以想象，两种细胞色素P450酶将共享某种程 度的结构相关性，因为它们重复地催化相同的酶促反应。此外，之前报道了属于单个亚家 族的细胞色素P450催化相同生物合成途径中的后续步骤。似乎合理的是，尽管 CYP76AD1-α进化枝可以由具有L-DOPA和环-DOPA形成的双重活性的酶组成，但是 CYP76AD1-β可以包括仅催化L-DOPA形成的酶。然而，需要来自另外的产生甜菜色素的 物种的相应基因的功能分析来支持这一假设。
酪氨酸酶催化单酚的邻羟基化和邻二苯酚到邻醌的氧化，因此直接将酪氨酸转化为 L-DOPA的氧化形式多巴醌。在目前未知的反应机理中，CYP76AD1还催化酪氨酸羟化和L-DOPA转化成环-DOPA。我们的实验结果表明，CYP76AD6是独特的，因为它催化酪氨 酸的邻羟基化，但不催化L-DOPA转化为多巴醌或环-DOPA。与当前生产方法相比， CYP76AD6酶的独特活性可用于高规模生产L-DOPA，这是非常有利且意想不到的。 CYP76AD6直接由底物酪氨酸形成L-DOPA。酪氨酸的无处不在的性质使得CYP76D6在 各种生物平台(包括植物和微生物)中的表达具有可能性。
发现一类新的酪氨酸羟化酶也可以促进另外的细胞色素P450基因的识别，并可以催化 其它L-DOPA衍生代谢物的生物合成中的L-DOPA形成。例如，在另一个特征明显的途径中，在苄基异喹啉生物碱(BIA)生物合成中导致酪氨酸羟化的基因迄今仍未知。有可能 在BIA产生植物中，L-DOPA也可以被类似于CYP76AD1和CYP76AD6的细胞色素P450 催化。
揭示CYP76AD1和CYP76AD6在L-DOPA形成中的作用提高了我们对植物中甜菜色 素生物合成的理解，并且基本上完成了对形成核心甜菜色素结构的基因和酶的识别。然而，对于通过“装饰”酶(例如糖基化和酰化酶)、亚细胞转运和解毒的甜菜色素结构修饰， 甜菜色素途径仍然相对理解得较差。对参与这些色素生物合成的基因和调控因子的进一步 表征将有希望通过阐明核心途径和通过增加来自产生甜菜色素的植物的序列数据的可用 性而被促进。
植物中产生甜菜色素的代谢工程
虽然花青素和类胡萝卜素在植物界普遍存在，但甜菜色素是特异于石竹植物目的色素， 其中它们以系统发生学顺序的、与花青素相互排斥的方式产生。它们神秘的进化史，以及 它们作为天然食用色素的营养有益品质和经济价值近年来引起了对这些色素的兴趣增加， 包括在微生物和植物中合成它们的前景。
在这项研究中，我们首次证明了通过瞬时基因表达和稳定转化两种方式在没有底物进 料的情况下对植物中的甜菜色素产生进行工程化。这可以通过识别CYP76AD1的额外酪氨 酸羟化酶活性而变得可能。因此，发现了CYP76AD1与BvDODA1和cDOPA5GT组合的 表达足以用于生物合成甜菜苷，而不需要外源供应L-DOPA。包括CYP76AD1、BvDODA1 和cDOPA5GT基因的pX11载体的用途首先通过在本氏烟草中瞬时的农杆菌渗入介导的表 达来证明，该表达导致在渗入后两天内可见的高产量甜菜色素。试图将pX11稳定转化到 植物中并随后在组织培养物中培养，导致外植体的色素沉着，并在几天内在多种植物物种 中形成红紫色愈伤组织和芽，表明甜菜色素作为可见的基因转化标记的潜在用途。用pX11 稳定转化烟草植物最终导致产生完全着色的成熟植物。产生甜菜色素的烟草植物的LC-MS 分析证实了甜菜苷作为主要产生的甜菜色素而出现。
因此，该研究中的发现为额外植物物种中甜菜色素的异源产生开辟了道路，可能导致 开发营养增强的食物作物以及新观赏品种。除了工程化红色着色的产生甜菜红素的植物 外，通过表达CYP76AD6而不是CYP76AD1，例如在本氏烟草中的瞬时表达实验，甜菜 色素产生可以主要被修饰为限于甜菜黄素。通过在不同的非组成型启动子序列(例如果实 特异性的、花特异性的或诱导型启动子)下表达两种细胞色素P450，可以假设性地实现同 时表现红色和黄色色素沉着的植物的工程化。工程化的产生甜菜色素的植物也将作为特殊的基因资源，用于检测花对传粉者和果实对果食动物的基于色素的吸引力，以及色素在协助植物器官抵抗非生物和生物线索方面的作用。
实施例10.材料和方法(2)
DNA构建体的产生
本研究中使用的基因序列；本文提供了cDOPA5GT(基因库登录号AB182643.1)、BvDODA1(登录号HQ656027.1)、CYP76AD1(HQ656023.1)、CYP76AD6(KT962274)、AroG175(JC233128.1)、AAH(HQ003815.1)、CYP76AD15序列。紫茉莉cDOPA5GT、 CYP76AD15和甜菜CYP76AD1、BvDODA1和CYP76AD6转录体从紫茉莉红色花瓣和甜 菜红色胚轴cDNA文库扩增。用Goldenbraid克隆(Sarrion-Perdigones等，2013；GoldenBraid 2.0：A ComprehensiveDNA Assembly Framework for Plant Synthetic Biology.Plant Physiology 162：1618-1631)构建用于本氏烟草农杆菌渗入和用于农杆菌介导的植物转化的DNA构 建体。首先将BvDODA1、CYP76AD1、CYP76AD6、CYP76AD15、cDOPA5GT、AroG175 和AAH克隆到pUPD载体中。pX11、pX11(E8)、pX11(CHS)、pX13、pDOPA3和pDOPA4 是3α1载体。pX12、pDOPA1和pDOPA2是3Ω1载体。所有载体均基于pCAMBIA骨架 (Roberts等，1997；A Comprehensive Set ofModular Vectors for Advanced Manipulations and Efficient Transformation ofPlants.In pCAMBIA Vector Release Manual Rockefeller Foundation Meeting of theInternational Program on Rice Biotechnology，September 15-19，Malacca，Malaysia)。
植物转化和再生
根据以下方法进行农杆菌介导的植物转化和再生；烟草叶片(Horsch等，1985；Science 227：1229-1231)、茄子(Van Eck和Snyder，2006；Eggplant(Solanum melongenaL.).In K Wang编辑，Agrobacterium Protocols.Springer，pp 439-448)、番茄(McCormick，1997； Transformation of tomato with Agrobacterium tumefaciens.In KLindsey编辑，Plant tissue culture manual.Springer，pp311-319)、马铃薯(Perl等，1992；Plant Molecular Biology 19： 815-823)、和矮牵牛(Conner等，2009；Transformation and regeneration of Petunia.In T Gerats，J Strommer编辑，Petunia.Springer，pp 395-409)。根据An，1985(Plant Physiology 79：568-570)进行BY2的转化和培养。使用农杆菌GV3101菌株转化所有植物物种。植 物组织培养在气候室(22℃；70％湿度；光照/黑暗16/8小时，2500Lux光强度)中进行。
本氏烟草的瞬时表达
如上文所述进行本氏烟草中BvDODA1和CYP76AD15基因的瞬时基因表达测定和随后的LC-MS分析取样。
代谢物提取和分析
为了LC-MS分析，如前所述进行从番茄果实(果肉和果皮)、茄子果实(果肉)、马铃薯块茎(果肉)、烟草花瓣和本氏烟草叶提取植物组织(Polturak等，2016)。为了提取BY2 细胞，从培养皿取样的愈伤组织(约500mg)通过两次液氮冷冻-解冻循环溶解，然后用金 属珠破碎。离心细胞提取物以除去细胞碎片，收集上清液并在分析前通过0.22μm PVDF过 滤器(Millipore)过滤。如先前所述进行L-DOPA和甜菜色素的LC-MS分析(Polturak等， 2016)。通过基于198＞152转变的峰面积来确定BY2细胞中L-DOPA的相对定量。
种子发芽测定
将pX11和野生型(WT)烟草植物的种子播种在含有完整Murashige-Skoog(MS)培养基(4.4克/升)和1％琼脂的培养皿上。用于胁迫条件测定，MS培养基另外含有150mM NaCl或400mM甘露醇。将种子播种在三个培养皿中，每个基因型各含有50个种子。将 密封板在黑暗中保持1周，然后移至气候室(22℃；70％湿度；光照/黑暗16/8小时，2500Lux 光强度)。在26天期间检测种子发芽率。
植物材料和生长条件
将紫茉莉、烟草、马铃薯、甜瓜和番茄植物在具有长日光条件(25℃)的温室中土壤生长。将甜菜和本氏烟草植物在气候室(22℃；70％湿度；光照/黑暗18/6小时)中土壤 生长。
实施例11.番茄、马铃薯和茄子中的pX11表达导致红色素着色植物
为了检查在食物作物中异源甜菜色素产生的可行性，通过农杆菌介导的稳定转化将 pX11载体引入番茄(Solanum lycopersicum变种MicroTom)、马铃薯(Solanumtuberosum 变种Désirée)和茄子(Solanum melongena系DR2)中。在与农杆菌共培养后几天内观察 到所有三个物种的转化的外植体中的红紫色素沉着迹象。正如先前用表达pX11的烟草植 物所观察到的，转化的外植体最终演变成完全红色素着色的植物。番茄和茄子果实以及马 铃薯块茎表现出红紫色的强烈着色(图14)。对番茄果实、茄子果实和马铃薯块茎的LC-MS 分析证实了甜菜色素的出现，其中甜菜苷和异甜菜苷被识别为主要出现的甜菜红素(图 14)。
实施例12.甜菜色素在番茄植物中的果实特异性积累
在所有表达pX11的植物物种中，归因于用于基因表达的组成型表达启动子序列(即 BvDODA1和CYP76AD1基因的CaMV 35S以及cDOPA5GT的拟南芥泛素蛋白-10启动 子)，在几乎所有植物组织和器官中都可见甜菜色素积累。我们最初假设含氮化合物的组 成性生产可能导致转基因植物的显著代谢负担。因此，我们构建了在番茄中表达的二元载 体，这将导致色素积累限制于成熟中和成熟果实。为此，将pX11被修饰为具有由果实特 异性E8启动子而非CaMV 35S驱动的CYP76AD1(图15)。将pX11(E8)载体转化到番 茄变种M-82确实导致产生具有限于成熟果实的甜菜色素沉着的植物(图16)，尽管甜菜色 素浓度低于表达pX11的MicroTom番茄的果实。值得注意的是，表达pX11的番茄、马铃 薯和茄子植物最终没有表现出任何明显的发育表型或生长迟缓。
实施例13.甜菜色素在矮牵牛中的花特异性积累
以类似的方法，构建pX11载体的另外形式，其中CYP76AD1由花特异性矮牵牛查耳酮合成酶(CHS)启动子而非CaMV 35S驱动(图15)。预计将pX11(CHS)转化到矮 牵牛植物中会导致在花成熟过程中仅在花瓣中积累甜菜色素的植物的产生。
实施例14.烟草中pX11、pX12和pX13的表达导致不同颜色的花
由于甜菜红素相对于甜菜黄素的大量积累，表达pX11的植物显示主要为红紫色。pX11 整合CYP76AD1的表达，CYP76AD1编码在甜菜色素生物合成中具有双重活性的酶，以催化酪氨酸羟化成L-DOPA和将L-DOPA转化为环-DOPA。如上文和Polturak等2016(NewPhytol.2016年4月；210(1)：269-83，其全部内容通过引用并入本文)所述，红甜菜中 的相关酶CYP76AD6独特地显示酪氨酸3-羟基化活性，以形成L-DOPA。由于环-DOPA 衍生物是形成甜菜红素所必需的，CYP76AD6代替CYP76AD1的植物内表达导致甜菜黄 素而不是甜菜红素的形成，正如之前在本氏烟草中瞬时表达所观察到的。为了探索产生仅 积累甜菜黄素型甜菜色素的转基因植物的可能性，构建了用于表达BvDODA1和 CYP76AD6的二元载体，下文称为pX13。另外的载体pX12被设计用于表达细胞色素P450 基因CYP76AD1和CYP76AD6，以及BvDODA1和cDOPA5GT(图15)。接着通过稳定 转化将pX12和pX13引入烟草。虽然表达pX13的烟草植物仅产生甜菜黄素，导致黄色素 着色的花的形成，但在烟草植物中pX12的表达产生具有橙粉红色调的花的植物(图17)。 来自pX11、pX12和pX13植物的花瓣的LC-MS分析证实了，在三种品系的花中观察到的 不同颜色是不同的甜菜红素/甜菜黄素比例的结果；pX11花提取物主要含有甜菜红素， pX13提取物只含有甜菜黄素，而pX12提取物含有两组甜菜色素，其甜菜红素/甜菜黄素比 例低于pX11(图17)。通过蓝光成像也可以观察到甜菜黄素相对甜菜红素积累的差异，其 中甜菜黄素具有典型的强烈荧光(Gandia-Herrero等，2005)。因此，可以通过表达CYP76AD1、CYP76AD6或两者的组合来操纵朝向生物合成红紫色甜菜红素或黄色甜菜黄 素的变化。
实施例15.在BY2细胞中的pX11和pX13表达
甜菜色素的生物技术生产可为其用作食品、制药和化妆品工业的天然着色剂提供新的 可行来源。迄今为止，大多数研究主要集中在用于甜菜色素生产的甜菜毛状根培养或细 胞培养物的培育。
用于异源甜菜色素产生的基因工程能够开发这些色素的许多新来源。一个可行来源可 以是深入研究的植物细胞系如烟草BY2或拟南芥T87品系的培养。之前报道的使用这些 品系进行甜菜色素产生的尝试涉及紫茉莉DOD基因MjDOD与香菇酪氨酸酶基因的表达。证明了在BY2和T87细胞中产生甜菜黄素。然而，在几周内，归因于外源性酪氨酸酶的 活性，培养的细胞变成褐色并发育不良，这最可能是由于多巴醌及其衍生物的毒性积累(Nakatsuka等，2013)。
为了探索通过仅表达甜菜色素相关基因以生产甜菜色素的植物细胞培养物的潜在用 途，我们在烟草细胞系BY2中表达了pX11和pX13载体，分别导致产生红紫色或黄色细胞(图18)。表达pX11的细胞的细胞提取物的LC-MS分析显示甜菜苷和异甜菜苷是主要 的甜菜红素。在pX11和pX13两种细胞系中均识别了几种甜菜黄素，包括谷氨酰胺-甜菜 黄素和丙氨酸-甜菜黄素(图18)。值得注意的是，pX11和pX13细胞系没有表现出如先前 报道的表达酪氨酸酶的愈伤组织的褐变或发育不良的迹象(Nakatsuka等，2013)。
实施例16.通过表达CYP76AD6在烟草和BY2细胞中产生L-DOPA
L-DOPA是经济上重要的化合物，其已经用于治疗帕金森病并且是高价值代谢物的前 体，包括儿茶酚胺、苯并异喹啉生物碱和甜菜色素等。目前用于工业规模产生L-DOPA的方法显示出关键限制。与目前的产生方法相比，可以用CYP76AD6酶的酪氨酸3-羟化酶活 性实现产生L-DOPA的方法更有优势，而在目前的产生方法中L-DOPA将由酪氨酸直接形 成。我们研究了通过烟草植物和烟草细胞系BY2的表达用CYP76AD6实现L-DOPA生产。 为此，构建了四种不同的表达CYP76AD6的载体(图19)。在一种载体中，CYP76AD6由 CaMV 35S启动子(以下称为pDOPA1)驱动。在另一种载体pDOPA2中，CYP76AD6由 番茄泛素10启动子(SlUb10)驱动。在载体pDOPA3中，CYP76AD6在35S启动子下与 另外两个基因AroG175(Tzin等，2012)和芳香族氨基酸羟化酶(AAH)(Pribat等，2010) 一起表达，二者均用于增加酪氨酸的可用性。在载体pDOPA4中，CYP76AD6在SlUb10 启动子下与AroG175和AAH一起表达。所有四种载体另外表达新霉素磷酸转移酶II(nptII) 基因以赋予转化体选择的卡那霉素抗性。通过农杆菌介导的稳定转化将pDOPA1、pDOPA2、 pDOPA3和pDOPA4引入烟草植物。第一代(t0)植物的LC-MS分析证实了L-DOPA在表 达四种不同载体的品系中产生。图20中给出了pDOPA1和pDOPA3烟草植物的分析。四 种pDOPA载体也被引入到BY2细胞系中。表达pDOPA2或pDOPA4载体的BY2细胞在 培养数周后表现出不同程度的灰色至黑色素沉着，这很可能是由于形成L-DOPA衍生物， 可能是由L-DOPA的酶促或非酶促氧化造成的。从表达pDOPA2和pDOPA4的愈伤组织中 获得的提取物的LC-MS分析示出了不同浓度的L-DOPA的出现(图20)。
实施例17.甜菜色素赋予植物对高渗透和高盐度胁迫条件的抗性
考虑到甜菜色素在赋予植物对各种非生物胁迫因子如干旱、高盐度和过量光照的抗性 中的显示的作用，使得甜菜色素在天然非生产植物中生产可以用于增加它们对非生物胁迫 因子的耐受性。因此，我们继续通过产生甜菜色素的烟草植物的种子发芽测定来检验这种 假设。将pX11和野生型(WT)烟草的种子置于含有补充有400mM甘露糖醇或150mMNaCl 的Murashige-Skoog(MS)培养基的培养皿中以分别模拟高渗透胁迫或高盐度胁迫的条件。 含有MS培养基而没有另外补充剂的培养皿用作对照。播种在所有平板上的种子的发芽率 在26天期间内确定。在整个实验时间段内，虽然pX11和WT烟草种子在对照MS培养基中表现出相似的发芽率，但pX11种子在含有400mM甘露醇的平板中显示出与WT种子相 比显著更高的发芽率。在含有150mM NaCl的平板中，pX11种子在孵育一周后显示出显著 更高的发芽率，但WT种子在两周内和之后获得相似的发芽率(图21)。因此，与野生型 植物相比，产生甜菜色素的烟草植物对高渗透和高盐度条件表现出增加的耐受性，在高渗 透胁迫条件下具有更高的发芽率并且在高盐度条件下具有更快的发芽速度。
实施例18.甜菜色素赋予烟草叶中对灰霉菌感染的抗性
之前已经提出甜菜色素在防御针对病原真菌方面发挥作用，但科学文献中对甜菜色素 的抗真菌活性的证据是稀缺的。植物中的异源甜菜色素产生为研究植物内甜菜色素的抗真 菌活性提供了极好的平台，并且还可以实施用于赋予目标作物物种抗植物病原真菌的抗 性。为了检测甜菜色素可能的抗真菌作用，将野生型和pX11烟草植物用灰霉菌(Botrytis cinerea)进行叶感染，这是一种致死性植物病原体，其在收获前和收获后阶段对农产品造 成重大损失。将不同浓度的灰霉菌孢子悬浮液的液滴施用在植物叶上，每个植物总共约 100、250或500个孢子。然后通过每天测量感染点周围的病变大小来评估灰霉菌感染的程 度。与野生型烟草叶相比，pX11烟草叶在感染后表现出显著更小的病变面积(图22)。在 感染后几天内，感染的野生型烟草叶与pX11叶相比也表现出坏死迹象(图22)。总之，这 些结果表明产生甜菜色素的植物对灰霉菌感染的抗性增加。
实施例19.CYP76AD15是紫茉莉中CYP76AD6的功能直系同源物
考虑到由红色或黄色品种组成的另外的产生甜菜色素的植物物种的天然存在，似乎合 理的是，这些物种具有类似于在红甜菜中观察到的分子机制，其中一种细胞色素P450酶 仅催化酪氨酸羟化，而另一种催化酪氨酸羟化和环-DOPA形成。CYP76AD1和CYP76AD6 的功能直系同源物也可能分别在CYP76AD1-α和CYP76AD1-β亚进化枝中发现。然而，需 要另外的产生甜菜色素的物种的相应基因的功能分析来支持这一假设。
CYP76AD1的功能直系同源物先前已在几种植物中被识别，包括紫茉莉，其中CYP76AD3基于与CYP76AD1的序列相似性而被识别(Hatlestad等，2012)。然而， CYP76AD6直系同源物先前没有描述过。为了评估紫茉莉中CYP76AD6直系同源物的出 现，使用CYP76AD1核苷酸序列在先前获得的紫茉莉转录组数据集(Polturak等，2016) 中进行tBLASTx查询。该查询导致识别了几个相关基因，包括与CYP76AD6具有最高序 列相似性的一个基因，下文中称为CYP76AD15。有趣的是，根据紫茉莉转录组分析中获 得的数据，CYP76AD15没有表现出平行甜菜色素积累的表达模式。相反，观察到该基因 的通常组成型表达模式。在本氏烟草中通过农杆菌浸润试验测试CYP76AD15活性。与 CYP76AD6相似，当与BvDODA1共渗入时，发现CYP76AD15允许在本氏烟草叶中产生 甜菜黄素，而当单独渗入时，产生L-DOPA(图23)。通过LC-MS分析证实了几种甜菜黄 素的出现，包括基于通常吸收模式和MS/MS片段确定的多巴胺-甜菜黄素和缬氨酸-甜菜黄 素。因此CYP76AD15被识别为CYP76AD6的功能直系同源物，催化由酪氨酸形成 L-DOPA。序列分析表明，CYP76AD15与CYP76AD6一起属于CYP76AD1-β亚进化枝， 而CYP76AD3与CYP76AD1属于与CYP76AD1-α进化枝，从而证实了每个亚进化枝与特 定催化活性的关联。
虽然本文已经说明和描述了本发明的某些特征，但是本领域的普通技术人员现在将想 到许多修改、替换、改变和等同。因此，应该理解的是，所附权利要求意图覆盖落入本发 明真实精神内的所有这些修改和变化。

Claims (182)

1.一种重组多核苷酸，其包括：在启动子的控制下编码CYP76AD6基因的核酸、编码CYP76AD15基因的核酸、或编码其组合的核酸。
2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中，所述CYP76AD6基因的核酸序列如SEQ ID NO：31中所示。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的多核苷酸，其中，所述CYP76AD15基因的核酸序列如SEQ ID NO：35中所示。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的多核苷酸，其中，所述多核苷酸还包括编码选择基因的核酸。
5.根据权利要求4所述的多核苷酸，其中，所述选择基因是新霉素磷酸转移酶II(nptII)基因。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的多核苷酸，其中，所述启动子是组成型启动子。
7.根据权利要求6所述的多核苷酸，其中，所述组成型启动子是CaMV 35S启动子。
8.根据权利要求7所述的多核苷酸，其中，所述多核苷酸是pDOPA1表达载体。
9.根据权利要求6所述的多核苷酸，其中，所述组成型启动子是泛素10启动子。
10.根据权利要求9所述的多核苷酸，其中，所述泛素10启动子是番茄泛素10启动子(S1Ub10)或拟南芥泛素-10启动子。
11.根据权利要求10所述的多核苷酸，其中，所述多核苷酸是pDOPA2表达载体。
12.根据权利要求1-5中任一项所述的多核苷酸，其中，所述启动子是诱导型启动子。
13.根据权利要求12所述的多核苷酸，其中，所述诱导型启动子是半乳糖诱导型启动子。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的多核苷酸，其中，所述启动子是果实特异性启动子。
15.根据权利要求14所述的多核苷酸，其中，所述果实特异性启动子是E8。
16.根据权利要求1-13中任一项所述的多核苷酸，其中，所述启动子是花特异性启动子。
17.根据权利要求16所述的多核苷酸，其中，所述花特异性启动子是矮牵牛查耳酮合成酶(CHS)启动子。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的多核苷酸，其中，所述多核苷酸还包括编码增加细胞中酪氨酸可用性的基因的核酸。
19.根据权利要求18所述的多核苷酸，其中，增加酪氨酸可用性的基因是AroG175、芳香族氨基酸羟化酶(AAH)或其组合。
20.根据权利要求18-19中任一项所述的多核苷酸，其中，所述细胞是植物细胞。
21.根据权利要求18-20中任一项所述的多核苷酸，其中，所述多核苷酸包括pDOPA3或pDOPA4。
22.一种重组多核苷酸，其包括：编码CYP76AD1的核酸、编码DOPA 4，5-双加氧酶(DOD)的核酸、以及编码甜菜色素相关的葡糖基转移酶的核酸，其中，所述核酸被框内插入所述多核苷酸中。
23.根据权利要求22所述的多核苷酸，其中，所述甜菜色素相关的葡糖基转移酶是环-DOPA 5-O-葡糖基转移酶或甜菜苷-5-O-葡糖基转移酶。
24.根据权利要求23所述的多核苷酸，其中，所述环-DOPA 5-O-葡糖基转移酶是紫茉莉基因环-DOPA 5-O-葡糖基转移酶(cDOPA5GT)。
25.根据权利要求24所述的多核苷酸，其中，cDOPA5GT的核酸序列如SEQ ID NO：4中所示。
26.根据权利要求25所述的多核苷酸，其中，所述多核苷酸是pX11表达载体。
27.根据权利要求1-21中任一项所述的多核苷酸，其还包括编码DOPA 4，5-双加氧酶(DOD)的核酸，其中，所述核酸被框内插入多核苷酸中。
28.根据权利要求22-27中任一项所述的多核苷酸，其中，所述DOD酶是甜菜DODA1。
29.根据权利要求28所述的多核苷酸，其中，DODA1的核酸序列如SEQ ID NO：33中所示。
30.根据权利要求29所述的多核苷酸，其中，所述多核苷酸是pX13表达载体。
31.根据权利要求22-25和28-29中任一项所述的多核苷酸，其还包括：编码CYP76AD6基因的核酸、编码CYP76AD15基因的核酸、或编码其组合的核酸。
32.根据权利要求31所述的多核苷酸，其中，所述编码CYP76AD6基因的核酸序列如SEQID NO：31中所示，所述CYP76AD15基因的核酸序列如SEQ ID NO：35中所示，或其组合。
33.根据权利要求32所述的多核苷酸，其中，所述多核苷酸是pX12表达载体。
34.根据权利要求4-33中任一项所述的多核苷酸，其中，每个核酸在单独启动子的控制下。
35.一种组合物，其包括根据权利要求1-34中任一项所述的重组多核苷酸。
36.一种表达载体，其包括根据权利要求1-34中任一项所述的重组多核苷酸。
37.一种细胞，其包括根据权利要求36所述的表达载体。
38.根据权利要求37所述的细胞，其中，所述细胞来自细胞系。
39.根据权利要求38所述的细胞，其中，所述细胞系是植物细胞系。
40.根据权利要求39所述的细胞，其中，所述植物细胞系是烟草细胞系。
41.根据权利要求40所述的细胞，其中，所述烟草细胞系是BY2。
42.一种嵌合多肽，其由根据权利要求18-34中任一项所述的重组多核苷酸编码。
43.一种在细胞中产生L-DOPA的方法，其包括以下步骤：在足以产生L-DOPA的条件下，使所述细胞与根据权利要求1-21中任一项所述的多核苷酸接触，从而产生L-DOPA。
44.根据权利要求43所述的方法，其中，酪氨酸对于所述细胞是内源性的。
45.根据权利要求43所述的方法，其中，所述细胞被基因改造以产生酪氨酸。
46.根据权利要求43所述的方法，其中，所述细胞提供有酪氨酸。
47.根据权利要求43-46中任一项所述的方法，其中，所述细胞是酵母细胞。
48.根据权利要求47所述的方法，其中，所述酵母细胞是酿酒酵母细胞。
49.根据权利要求43-46中任一项所述的方法，其中，所述细胞是细菌细胞。
50.根据权利要求49所述的方法，其中，所述细菌细胞是大肠杆菌细胞。
51.根据权利要求43-46中任一项所述的方法，其中，所述细胞是植物细胞。
52.根据权利要求51所述的方法，其中，所述植物细胞是烟草(Nicotiana tabacum)细胞。
53.根据权利要求51所述的方法，其中，所述植物细胞是番茄(Solanum lycopersicum)细胞。
54.根据权利要求51所述的方法，其中，所述植物细胞是马铃薯(Solanum tuberosum)细胞。
55.根据权利要求51所述的方法，其中，所述植物细胞是茄子(Solanum melongena)细胞。
56.根据权利要求51所述的方法，其中，所述植物细胞是树烟草(Nicotiana glauca)、欧洲黑龙葵(Solanum nigrum)、矮牵牛(Petunia x hybrida)或本氏烟草细胞。
57.根据权利要求43-56中任一项所述的方法，其中，所述细胞来自细胞系。
58.根据权利要求57所述的方法，其中，所述细胞系是植物细胞系。
59.根据权利要求58的方法，其中，所述植物细胞系是烟草细胞系。
60.根据权利要求59的方法，其中，所述烟草细胞系是BY2。
61.根据权利要求43-60中任一项所述的方法，其中，所述L-DOPA是从所述细胞提取的。
62.根据权利要求43-60中任一项所述的方法，其中，所述细胞生长成植物。
63.根据权利要求62所述的方法，其中，所述L-DOPA是从所述植物中提取的。
64.一种由酪氨酸产生L-DOPA的方法，其包括以下步骤：在足以产生L-DOPA的条件下，使CYP76AD6、CYP76AD15或其组合与酪氨酸组合，从而产生L-DOPA。
65.根据权利要求64所述的方法，其中，所述方法在体外进行。
66.根据权利要求64-65中任一项所述的方法，其中，所述CYP76AD6的氨基酸序列如SEQID NO：18中所示。
67.根据权利要求64-66中任一项所述的方法，其中，所述CYP76AD15的氨基酸序列如SEQ ID NO：44中所示。
68.包含高水平的所述CYP76AD1-β进化枝基因的生物体中的CYP76AD1-β进化枝基因或一个或多个细胞在制备用于治疗或抑制受试者中多巴胺反应性疾病的组合物中的用途。
69.根据权利要求68所述的用途，其中，所述CYP76AD1-β进化枝基因包括：编码CYP76AD6基因的核酸、编码CYP76AD15基因的核酸、或编码其组合的核酸。
70.根据权利要求68-69中任一项所述的用途，其中，所述生物体不内源性地产生甜菜色素。
71.根据权利要求68-70中任一项所述的用途，其中，所述生物体是酵母。
72.根据权利要求71所述的用途，其中，所述酵母细胞是酿酒酵母。
73.根据权利要求68-70中任一项所述的用途，其中，所述生物体是细菌。
74.根据权利要求73所述的用途，其中，所述细菌是大肠杆菌。
75.根据权利要求68-70中任一项所述的用途，其中，所述生物体是植物。
76.根据权利要求75所述的用途，其中，所述植物是烟草(Nicotiana tabacum)。
77.根据权利要求75所述的用途，其中，所述植物是食物作物。
78.根据权利要求77所述的用途，其中，所述植物是番茄(Solanum lycopersicum)。
79.根据权利要求77所述的用途，其中，所述植物是马铃薯(Solanum tuberosum)。
80.根据权利要求72所述的用途，其中，所述植物是茄子(Solanum melongena)。
81.根据权利要求77所述的用途，其中，所述植物是树烟草(Nicotiana glauca)、欧洲黑龙葵(Solanum nigrum)、矮牵牛(Petunia x hybrida)或本氏烟草。
82.根据权利要求68-81中任一项所述的用途，其中，通过用根据权利要求1-21中任一项所述的多核苷酸转化所述一个或多个细胞来基因改造了所述一个或多个细胞，以表达所述CYP76AD6基因、所述CYP76AD15基因或所述组合基因。
83.根据权利要求68-82中任一项所述的用途，其中，所述病症是帕金森病。
84.根据权利要求68-82中任一项所述的用途，其中，所述病症是多巴胺反应性肌张力疾病。
85.根据权利要求68-84中任一项所述的用途，其中，所述一个或多个细胞来自细胞系。
86.根据权利要求85所述的用途，其中，所述细胞系是植物细胞系。
87.根据权利要求86所述的用途，其中，所述植物细胞系是烟草细胞系。
88.根据权利要求87所述的用途，其中，所述烟草细胞系是BY2。
89.一种产生甜菜色素的方法，其包括以下步骤：在足以产生甜菜色素的条件下，使根据权利要求22-34中任一项所述的重组多核苷酸与一个或多个细胞接触，从而产生甜菜色素。
90.根据权利要求89所述的方法，其中，所述方法产生甜菜红素和甜菜黄素的混合物。
91.根据权利要求89-90所述的方法，其中，所述方法产生橙色色素。
92.一种产生甜菜黄素的方法，其包括以下步骤：在足以产生甜菜黄素的条件下，使根据权利要求27-30中任一项所述的重组多核苷酸与一个或多个细胞接触，从而产生甜菜黄素。
93.根据权利要求90-92中任一项所述的方法，其中，所述甜菜黄素包括组胺-甜菜黄素、丙氨酸-甜菜黄素、多巴胺-甜菜黄素、缬氨酸-甜菜黄素或其组合。
94.根据权利要求93所述的方法，其中，所述方法产生黄色色素。
95.一种产生甜菜红素的方法，其包括以下步骤：在足以产生甜菜红素的条件下，使根据权利要求22-26和28-29中任一项所述的重组多核苷酸与一个或多个细胞接触，从而产生甜菜红素。
96.根据权利要求90和95中任一项所述的方法，其中，所述甜菜红素是糖基化的。
97.根据权利要求96所述的方法，其中，所述糖基化的甜菜红素包括甜菜苷、异甜菜苷或其组合。
98.根据权利要求95-97中任一项所述的方法，其中，所述方法产生红紫色色素。
99.根据权利要求89-98中任一项所述的方法，其中，所述甜菜红素是从所述一个或多个细胞中提取的。
100.根据权利要求89-98中任一项所述的方法，其中，所述一个或多个细胞生长成植物。
101.根据权利要求100所述的方法，其中所述甜菜红从所述植物提取。
102.一种增加植物或植物部分对一种或多种胁迫因子的抗性的方法，其包括以下步骤：在足以产生甜菜色素的条件下，使所述植物或植物部分的一个或多个细胞与编码CYP76AD6的核酸、编码CYP76AD15的核酸、编码CYP76AD1的核酸或其组合接触，从而产生甜菜色素并增加所述植物或植物部分对所述一种或多种胁迫因子的抗性。
103.根据权利要求102所述的方法，其中，所述胁迫因子是非生物胁迫因子。
104.根据权利要求102-103中任一项所述的方法，其中，所述胁迫因子是高渗透压。
105.根据权利要求102-103中任一项所述的方法，其中，所述胁迫因子是高盐度条件。
106.一种增加植物或植物部分对一种或多种真菌疾病的抗性的方法，其包括以下步骤：在足以产生甜菜色素的条件下，使植物或植物部分的一个或多个细胞与编码CYP76AD6的核酸、编码CYP76AD15的核酸、编码CYP76AD1的核酸或其组合接触，从而产生甜菜色素并增加所述植物或植物部分对所述一种或多种真菌疾病的抗性。
107.根据权利要求106所述的方法，其中，引起所述真菌疾病的真菌是植物病原真菌。
108.根据权利要求106-107中任一项所述的方法，其中，引起所述真菌疾病的真菌是灰霉菌。
109.根据权利要求102-108中任一项所述的方法，其中，所述抗性通过增加的种子发芽率来证明。
110.根据权利要求102-109中任一项所述的方法，其中，所述植物是观赏植物。
111.根据权利要求102-109中任一项所述的方法，其中，所述植物是烟草(Nicotianatabacum)。
112.根据权利要求102-109中任一项所述的方法，其中，所述植物是食物作物。
113.根据权利要求112所述的方法，其中，所述植物是番茄(Solanum lycopersicum)。
114.根据权利要求112所述的方法，其中，所述植物是马铃薯(Solanum tuberosum)。
115.根据权利要求112所述的方法，其中，所述植物是茄子(Solanum melongena)。
116.根据权利要求112所述的方法，其中，所述植物是树烟草(Nicotiana glauca)、欧洲黑龙葵(Solanum nigrum)、矮牵牛(Petunia x hybrida)或本氏烟草。
117.根据权利要求102-116中任一项所述的方法，其中，所述植物不内源性地表达甜菜色素。
118.根据权利要求102-116中任一项所述的方法，其中，所述植物部分是种子。
119.根据权利要求102-116中任一项所述的方法，其中，所述植物部分是叶。
120.根据权利要求102-116中任一项所述的方法，其中，所述植物部分是根、花、种子、块茎或果实。
121.根据权利要求102-120中任一项所述的方法，其中，所述植物部分再生成植物。
122.根据权利要求102-121中任一项所述的方法，其中，所述方法包括以下步骤：使植物或植物部分的一个或多个细胞与根据权利要求22-34中任一项所述的重组多核苷酸接触。
123.根据权利要求89-122中任一项所述的方法，其中，所述核酸一起在表达载体中。
124.根据权利要求89-123中任一项所述的方法，其中，酪氨酸对于所述一个或多个细胞是内源性的。
125.根据权利要求89-123中任一项所述的方法，其中，所述一个或多个细胞被基因改造以产生酪氨酸。
126.根据权利要求89-123中任一项所述的方法，其中，所述一个或多个细胞提供有酪氨酸。
127.根据权利要求89-123中任一项所述的方法，其中，一个或多个细胞是酵母细胞。
128.根据权利要求127所述的方法，其中，所述细胞是酿酒酵母细胞。
129.根据权利要求89-123中任一项所述的方法，其中，所述一个或多个细胞是细菌细胞。
130.根据权利要求129所述的方法，其中，所述细菌细胞是大肠杆菌细胞。
131.根据权利要求89-123中任一项所述的方法，其中，所述一个或多个细胞是植物细胞。
132.根据权利要求131所述的方法，其中，所述植物细胞是烟草(Nicotiana tabacum)、番茄(Solanum lycopersicum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、茄子(Solanum melongena)、树烟草(Nicotiana glauca)、欧洲黑龙葵(Solanum nigrum)、矮牵牛(Petunia x hybrida)或本氏烟草细胞。
133.根据权利要求89-132中任一项所述的方法，其中，所述接触借助转化。
134.根据权利要求133所述的方法，其中，所述转化是通过农杆菌渗入。
135.根据权利要求89-134中任一项所述的方法，其中，所述一个或多个细胞来自细胞系。
136.根据权利要求135所述的方法，其中，所述细胞系是植物细胞系。
137.权利要求136的方法，其中，所述植物细胞系是烟草细胞系。
138.根据权利要求137所述的方法，其中，所述烟草细胞系是BY2。
139.一种增加生物体或生物体部分中的一种或多种甜菜色素的水平的方法，其包括：在所述生物体的至少一部分内引起或允许表达DOPA 4，5-双加氧酶(DOD)和CYP76AD6、CYP76AD1或其组合，其中，如果所述生物体表达CYP76AD1和DOD而不是CYP76AD6或CYP76AD15，则所述生物体还表达甜菜色素相关的葡糖基转移酶，从而增加所述生物体或所述生物体所述部分中的一种或多种甜菜色素的水平。
140.根据权利要求139所述的方法，其中，所述生物体是植物。
141.一种生物体或其部分，其包括根据权利要求1-33中任一项所述的多核苷酸。
142.一种生物体或其部分，其包括编码CYP76AD1-α进化枝基因的重组核酸序列、编码CYP76AD1-β进化枝基因的核酸序列、或编码其组合的核酸序列、以及编码DOPA 4，5-双加氧酶(DOD)的核酸序列。
143.根据权利要求141-142中任一项所述的生物体或其部分，其中，所述生物不天然产生甜菜色素。
144.根据权利要求142-143中任一项所述的生物体或其部分，其中，所述CYP76AD1-β进化枝基因是CYP76AD6。
145.根据权利要求144所述的生物体或其部分，其中，所述CYP76AD6基因的核酸序列如SEQ ID NO：31中所示。
146.根据权利要求142-145中任一项所述的生物体或其部分，其中，所述CYP76AD1-β进化枝基因是CYP76AD15。
147.根据权利要求146所述的生物体或其部分，其中，所述CYP76AD15基因的核酸序列如SEQ ID NO：35中所示。
148.根据权利要求142-147中任一项的生物体或其部分，其中，编码CYP76AD1-α进化枝基因或CYP76AD1-β进化枝基因的核酸与增加酪氨酸可用性的基因一起表达。
149.根据权利要求148的生物体或其部分，其中，增加酪氨酸可用性的基因是AroG175、芳族氨基酸羟化酶(AAH)或其组合
150.根据权利要求142-149中任一项的生物体或其部分，其中，所述DOD酶是甜菜DODA1。
151.根据权利要求150所述的生物体或其部分，其中，所述DODA1的核酸序列如SEQ IDNO：33中所示。
152.根据权利要求142-151中任一项所述的生物体或其部分，其还包括编码甜菜色素相关的葡糖基转移酶的核酸。
153.根据权利要求152所述的生物体或其部分，其中，所述甜菜色素相关的葡糖基转移酶是环-DOPA 5-O-葡糖基转移酶或甜菜素-5-O-葡糖基转移酶。
154.根据权利要求153所述的生物体或其部分，其中，所述环-DOPA 5-O-葡糖基转移酶是紫茉莉基因环-DOPA 5-O-葡糖基转移酶(cDOPA5GT)。
155.根据权利要求154所述的生物体或其部分，其中，所述cDOPA5GT的核酸序列如SEQID NO：2中所示。
156.根据权利要求141-155中任一项所述的生物体或其部分，其中，所述生物体是植物。
157.根据权利要求156所述的生物体或其部分，其中，所述植物是烟草(Nicotianatabacum)、番茄(Solanum lycopersicum)、马铃薯(Solanum tuberosum)或茄子(Solanummelongena)。
158.根据权利要求156所述的生物体或其部分，其中，所述植物是树烟草(Nicotianaglauca)、欧洲黑龙葵(Solanum nigrum)、矮牵牛(Petunia x hybrida)或本氏烟草。
159.一种由酪氨酸产生甜菜色素的方法，其包括以下步骤：在足以产生甜菜色素的条件下，使包括CYP76AD1、DOPA 4，5-双加氧酶(DOD)以及CYP76AD6、CYP76AD15或其组合的组合物与酪氨酸接触，从而产生甜菜色素。
160.一种由酪氨酸产生甜菜黄素的方法，其包括以下步骤：在足以产生甜菜黄素的条件下，使包括CYP76AD6、CYP76AD15或其组合及DOPA4，5-双加氧酶(DOD)的组合物与酪氨酸接触，从而产生甜菜黄素。
161.一种由酪氨酸产生甜菜红素的方法，其包括以下步骤：在足以产生甜菜红素的条件下，使包括CYP76AD1、DOPA 4，5-双加氧酶(DOD)和甜菜色素相关的葡糖基转移酶的组合物与酪氨酸接触，从而产生甜菜红素。
162.根据权利要求159-160中任一项所述的方法，其中，所述CYP76AD6的氨基酸序列如SEQ ID NO：18中所示。
163.根据权利要求159-160中任一项所述的方法，其中，所述CYP76AD15的氨基酸序列如SEQ ID NO：44中所示。
164.根据权利要求159-163中任一项所述的方法，其中，所述DOD酶是甜菜DODA1。
165.根据权利要求164所述的方法，其中，所述DODA1的氨基酸序列如SEQ ID NO：42中所示。
166.根据权利要求159-160和162-165中任一项所述的方法，其中，所述组合物还包括甜菜色素相关的葡糖基转移酶。
167.根据权利要求166所述的方法，其中，所述甜菜色素相关的葡糖基转移酶是环-DOPA5-O-葡糖基转移酶或甜菜素-5-O-葡糖基转移酶。
168.根据权利要求167所述的方法，其中，所述环-DOPA 5-O-葡糖基转移酶是紫茉莉环-DOPA 5-O-葡糖基转移酶(cDOPA5GT)。
169.根据权利要求168所述的方法，其中，所述cDOPA5GT的氨基酸序列如SEQ ID NO：43中所示。
170.根据权利要求159-168中任一项所述的方法，其中，所述接触在体外进行。
171.一种产生观赏鱼或植物的方法，其包括以下步骤：在足以产生甜菜色素的条件下，使所述鱼或植物的细胞与编码CYP76AD1、CYP76AD6、CYP76AD15或其组合的多核苷酸及编码DOPA 4，5-双加氧酶(DOD)的核酸序列接触，其中，如果所述细胞与编码CYP76AD1和DOD的核酸序列而不是编码CYP76AD6或CYP76AD15的核酸序列接触，则使所述细胞与编码甜菜色素相关的葡糖基转移酶的核酸序列接触，并使所述细胞生长成鱼或植物，从而产生观赏鱼或植物。
172.一种产生包含一种或多种甜菜色素的食品补充剂的方法，其包括以下步骤：在足以产生甜菜色素的条件下，使细胞与编码CYP76AD1、CYP76AD6、CYP76AD15或其组合的多核苷酸及编码DOPA 4，5-双加氧酶(DOD)的核酸序列接触，其中，如果所述细胞与编码CYP76AD1和DOD的核酸序列而不是编码CYP76AD6或CYP76AD15的核酸序列接触，则使所述细胞与编码甜菜色素相关的葡糖基转移酶的核酸序列接触，并使所述细胞生长为成熟生物体，从而产生包含一种或多种甜菜色素的食品补充剂。
173.根据权利要求172所述的方法，其中，所述食品补充剂用于人。
174.根据权利要求172所述的方法，其中，所述食品补充剂用于动物。
175.根据权利要求172所述的方法，其中，所述食品补充剂用于海洋食物。
176.一种产生天然黄色染料的方法，其包括以下步骤：在足以产生甜菜黄素的条件下，使细胞与编码CYP76AD6、CYP76AD15或其组合的核酸及编码DOPA 4，5-双加氧酶(DOD)的核酸接触，从而产生天然黄色染料。
177.一种产生天然橙色染料的方法，其包括以下步骤：在足以产生甜菜红素和甜菜黄素的组合的条件下，使细胞与编码CYP76AD1的核酸、编码DOPA4，5-双加氧酶(DOD)的核酸、编码CYP76AD6、CYP76AD15或其组合的核酸以及编码甜菜色素相关的葡糖基转移酶的核酸接触，从而产生天然橙色染料。
178.一种产生天然红紫色染料的方法，其包括以下步骤：在足以产生甜菜红素的条件下，使细胞与编码CYP76AD1的核酸、编码DOPA4，5-双加氧酶(DOD)的核酸、以及编码甜菜色素相关的葡糖基转移酶的核酸接触，从而产生天然红紫色染料。
179.根据权利要求176-178中任一项所述的方法，其中所述染料是纺织染料。
180.根据权利要求176-178中任一项所述的方法，其中所述染料是食用色素。
181.一种增加食物作物保质期的方法，其包括以下步骤：在足以产生甜菜色素的条件下，使食物作物植物的一个或多个细胞与编码CYP76AD1、CYP76AD6、CYP76AD15或其组合的核酸及编码DOPA 4，5-双加氧酶(DOD)的核酸序列接触，其中，如果所述一个或多个细胞与编码CYP76AD1和DOD的核酸序列而不是编码CYP76AD6或CYP76AD15的核酸序列接触，则使所述一个或多个细胞与编码甜菜色素相关的葡糖基转移酶的核酸序列接触，并使所述细胞生长成产生甜菜色素的植物或植物部分，从而增加食物作物的保质期。
182.一种杂草控制方法，其包括以下步骤：在足以使所述植物或植物部分产生和分泌L-DOPA的条件下，使植物或植物部分的一个或多个细胞与编码CYP76AD1-β进化枝基因的核酸接触，从而抑制所述植物或植物部分附近的杂草生长。
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