CN112063649A

CN112063649A - 一种可见光下裸眼可视的植物遗传转化的无损筛选系统、构建方法及其应用

Info

Publication number: CN112063649A
Application number: CN202010934705.6A
Authority: CN
Inventors: 和玉兵
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2020-09-08
Filing date: 2020-09-08
Publication date: 2020-12-11

Abstract

本发明涉及一种植物遗传转化的无损筛选方法及其应用。植物遗传转化依赖高效的筛选系统，常用的筛选系统包括抗生素筛选、报告系统筛选。现有的报告系统筛选需要特殊的设备、昂贵的化学药品或对生物样品进行破坏性处理。本发明构建了一个新的报告基因RUBY，该基因合成的酶能将酪氨酸转化为红色的甜菜红素，本发明利用RUBY指示植物遗传转化的发生，成功实现可见光下裸眼可视的植物遗传转化的无损筛选。

Description

一种可见光下裸眼可视的植物遗传转化的无损筛选系统、构建方法及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种新的植物遗传转化报告系统及其应用。本发明的报告系统通过植物体内产生的可见光下可被裸眼直接观察的色素来指示。本发明还涉及上述报告系统的构建和应用。

背景技术

植物的遗传转化的筛选主要依赖抗生素或者除草剂进行筛选，通过在遗传转化的载体上添加一个抗生素或者除草剂抗性基因表达盒，发生遗传转化的植株则会表现出对特定抗生素或者除草剂的抗性。

但是抗生素或者除草剂筛选方法存在一些弊端。首先，不同种类植物对不同的抗生素的敏感性差异很大。少数植物，比如拟南芥、水稻、玉米、小麦、油菜等植物对潮霉素或新霉素或草甘膦较为敏感，可以用于筛选转基因植株，但是较多园艺植物或者林木对抗生素或者常用除草剂较不敏感，无法有效进行筛选。其次，一些植物在遗传转化过程中较容易发生非抗性组织逃逸现象，导致产生的遗传转化植株嵌合率高，无法有效筛选出纯合的转基因植株。第三，抗生素或者除草剂筛选策略无法较好的进行in-planta转化(直接对完整植株的某一部分组织进行遗传转化)中进行筛选。第四，抗生素或者除草剂筛选存在增加环境污染的风险。因此，通过在遗传转化的载体上添加一个报告基因表达盒，使用一些报告基因来指示和筛选植物的遗传转化成功发生也是一种常用的策略。

目前，已经开发了多种报告基因来指示和筛选转基因植株。首先，绿色荧光蛋白(GFP)及其衍生物(例如RFP、mCherry和YFP)作为报告基因是一种较常用的策略(ChalfieM,Tu Y,Euskirchen G,Ward WW,Prasher DC.Green fluorescent protein as a markerfor gene expression.Science,1994,263(5148):802-805；Heim R,Cubitt AB,TsienRY.Improved green fluorescence.Nature,1995,373(6516):663-664)。尽管GFP易于使用，但有局限性。荧光蛋白通常需要被特殊波长的光激发，并且只能观察到特殊波长的光，因此需要特殊的激发器作为光源，且观察时需要对自然光中的杂光进行遮挡，所以在植物遗传转化中使用荧光筛选较为繁琐。其次，β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)作为一种报告基因也被广泛用于植物中，用于监测转基因的成功发生(Jefferson RA,Kavanagh TA,Bevan MW.GUSfusions:beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker inhigher plants.Embo j,1987,6(13):3901-3907)。第三，荧光素酶是另一个在植物和动物中均被广泛使用的报告分子，也能被用于检测转基因的成功发生(Contag CH,BachmannMH.Advances in in vivo bioluminescence imaging of gene expression.Annu RevBiomed Eng,2002,4:235-260)。GUS和萤光素酶分别需要添加昂贵的底物X-Gluc(5-溴-4-氯-1H-吲哚-3-β-D-吡喃葡萄糖苷酸)和萤光素来进行显色反应，随后进行处理或者直接通过仪器观察，因此会对植物组织产生损伤或者破坏，或者增加无菌培养的组织被污染的可能。此外，荧光素酶催化底物产生的荧光也需要特殊的仪器进行拍照或观察。这些因素增加了这几种报告系统的检测成本并且限制了使用范围。

甜菜红素是一类可以由酪氨酸逐步合成而来的植物天然产物(Strack D,Vogt T,Schliemann W.Recent advances in betalain research.Phytochemistry,2003,62(3):247-269；Xu J-J,Fang X,Li C-Y,Yang L,Chen X-Y.General and specialized tyrosinemetabolism pathways in plants.aBIOTECH,2020,1(2):97-105)。甜菜、火龙果和其他植物中见到的鲜红色就是甜菜红素积聚的结果。目前，甜菜红素的生物合成途径已有较详尽的研究，发现仅需三个蛋白(CYP76AD1、DODA、GT)表达即可将酪氨酸转化为甜菜红素(Polturak G,Aharoni A.Advances and future directions in betalain metabolicengineering.New Phytol,2019,224(4):1472-1478)。酪氨酸首先在苯环上被羟基化，生成L-3,4-二羟基苯丙氨酸(L-DOPA)。该反应由P450氧化酶CYP76AD1催化。L-DOPA可被CYP76AD1进一步氧化为环-DOPA。同时，L-DOPA也会被L-DOPA 4，5-二加氧酶(DODA)催化生成甜菜酸，其随后与环-DOPA缩合成甜菜苷配基，缩合反应不需要酶。最后，通过GT(葡萄糖基转移酶)将糖基添加到甜菜苷配基中，生成颜色鲜亮的甜菜红素。因此我们推测这种色素也能作为一种明显的标记来指示植物转基因的发生。众所周知，酪氨酸是各类生物最常用的氨基酸之一，在各类生物体内均大量存在，因此若能使用酪氨酸作为底物来合成甜菜红素，并以甜菜红素作为报告分子，就可以完全避免添加外源底物的操作。

发明内容

针对传统遗传转化报告系统的局限性，需要开发可广泛用于无创、连续和低成本的有效监测植物遗传转化成功与否的新报告系统。本发明利用一种在自然光下肉眼可见的甜菜红色素作为报告分子，设计了一种新的指示植物遗传转化成功与否的报告系统。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明的第一个目的是提供一种可见光下裸眼可视的植物遗传转化的无损筛选系统，所述筛选系统为包括RUBY基因表达盒的报告基因载体，所述RUBY基因表达盒包括顺次设置的启动子、甜菜红素生物合成基因RUBY基因、终止子。

所述甜菜红素生物合成基因RUBY基因为系统的报告基因，其作用在于，RUBY基因表达的蛋白质可以在植物细胞中合成一种红色色素，在可见光下可以直接通过裸眼观察，通过所构建的RUBY基因表达盒获得能够产生色素的报告系统，使本发明的无损筛选系统，即该包括RUBY基因表达盒的报告基因载体能够在可见光下裸眼可视的无损判断植物遗传转化是否成功，从而筛选得到成功遗传转化的植物。

进一步的，RUBY基因包括CYP76AD1基因、DODA基因和GT(葡萄糖基转移酶)基因；分别表示细胞内甜菜红色素合成途径上的三个基因。所合成的CYP76AD1蛋白、DODA蛋白和GT蛋白分别表示细胞内甜菜红色素合成途径上的三个酶。

所述CYP76AD1基因的核苷酸序列包含编码SEQ ID NO.1所示CYP76AD1氨基酸序列的核苷酸序列，

所述DODA基因的核苷酸序列包含编码SEQ ID NO.2所示DODA氨基酸序列的核苷酸序列，

所述GT基因的核苷酸序列包含编码SEQ ID NO.3所示GT氨基酸序列的核苷酸序列；

优选的，所述CYP76AD1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述DODA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述GT基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

进一步的，所述CYP76AD1基因、DODA基因和GT基因之间通过DNA连接单元以任意顺序连接；

根据前文技术背景中甜菜红素的合成文献(Polturak G,et al.New Phytol,2019)可知，甜菜红素合成只需要这三个蛋白即可。因此，只要能同时表达这三个蛋白即可保证在植物体内产生甜菜红素，三个蛋白的连接顺序不影响三个蛋白最终功能的发挥。

在某个特定的实施例中，以CYP76AD1基因-DODA基因-GT基因的顺序，通过DNA连接单元依次连接，RUBY基因结构为：CYP76AD1基因-DNA连接单元-DODA基因-DNA连接单元-GT基因。

进一步的，所述DNA连接单元为能够转录和翻译成一种带有自切割功能多肽的DNA序列；

优选的，所述DNA连接单元的核苷酸序列包含编码SEQ ID NO.4所示2A肽氨基酸序列的DNA序列；

进一步优选的，所述DNA连接单元为核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的2A1，或核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的2A2，根据2A肽反推的核苷酸序列2A1和2A2均能表达出2A肽。

进一步的，报告基因载体的骨架质粒为任意植物载体。

在某个特定的实施例中，RUBY基因为采用2A肽编码核苷酸序列2A1、2A2作为DNA连接单元，以SEQ ID NO.5所示CYP76AD1基因-SEQ ID NO.8所示2A1-SEQ ID NO.6所示DODA基因-SEQ ID NO.9所示2A2-SEQ ID NO.7所示GT(葡萄糖基转移酶)基因-终止密码子的顺序依次顺次连接。

进一步的，所述报告基因载体还包括待转化的目的基因，所述待转化的目的基因不存在于RUBY基因表达盒内。

进一步的，所述启动子为能在植物中发挥功能的启动子，所述终止子为能在植物中发挥功能的终止子；

优选的，所述启动子为能在双子叶类植物或单子叶类植物中发挥功能的启动子，所述终止子为能在双子叶类植物或单子叶类植物中发挥功能的终止子；

进一步优选的，所述启动子为能在拟南芥或水稻中发挥功能的启动子，所述终止子为能在拟南芥或水稻中发挥功能的终止子；

更进一步优选的，所述启动子为如SEQ ID NO.10所示的35S启动子或如SEQ IDNO.11所示OsActin1的启动子，所述终止子为如SEQ ID NO.12所示tHsp。

本发明的第二个目的是提供一种可见光下裸眼可视的植物遗传转化的无损筛选系统的构建方法，包括以下步骤：

1)提供报告基因载体的骨架质粒，构建RUBY基因-终止子片段，将RUBY基因-终止子片段连接到所述骨架质粒中，构建得到含有RUBY基因和终止子的载体pRUBY-终止子；

2)将启动子连入步骤1)得到的pRUBY-终止子中，构建权利要求1所述含有RUBY基因的表达盒的报告基因载体，获得所述筛选系统p启动子-RUBY-终止子。

进一步的，所述步骤1)的具体操作为：分别获得CYP76AD1基因、DODA基因、GT基因、终止子片段；使用体外重叠延伸PCR的方法将CYP76AD1基因、DODA基因和GT基因三种DNA分子通过DNA连接单元以任意顺序组合为RUBY基因，在RUBY基因之后连接终止子，获得RUBY基因-终止子片段；将RUBY基因-终止子片段连接到所述骨架质粒中，构建得到含有RUBY基因和终止子的载体pRUBY-终止子。

在某一个特定的实施例中，当RUBY基因结构为：CYP76AD1基因-DNA连接单元-DODA基因-DNA连接单元-GT基因，所述步骤1)的具体操作为：

1-1)通过体外全基因合成的方式分别获得CYP76AD1基因、DODA基因、GT基因、终止子；

1-2)连接GT基因和终止子，获得GT基因-终止子片段；

1-3)使用体外重叠延伸PCR的方法将获得的CYP76AD1基因、DODA基因、GT基因-终止子片段之间通过DNA连接单元顺次连接，得到RUBY基因-终止子片段；

1-4)将RUBY基因-终止子片段连接到所述骨架质粒中，构建得到含有RUBY基因和终止子的载体pRUBY-终止子。

进一步的，所述步骤2)具体操作为：通过PCR扩增启动子，然后将启动子连入步骤1)得到的pRUBY-终止子中，所述启动子连接在RUBY-终止子片段上游，得到含有RUBY基因表达盒的报告基因载体p启动子-RUBY-终止子。

进一步的，所述构建方法还包括步骤3)：向报告基因载体上RUBY基因表达盒以外的区域导入待转化的目的基因。

本发明的第三个目的是提供前述的可见光下裸眼可视的植物遗传转化的无损筛选系统或前所述的可见光下裸眼可视的植物遗传转化的无损筛选系统的构建方法在判断植物是否成功遗传转化中的应用。

所述筛选系统包括前述的RUBY基因表达盒和待转化的目的基因，所述待转化的目的基因不存在于RUBY基因表达盒内，RUBY基因和待转化的目的基因各自独立表达，所述RUBY基因表达盒表达的蛋白质可以在植物细胞中合成一种红色色素，在可见光下可以直接通过裸眼观察，通过本发明的筛选系统，能够在可见光下通过裸眼无损筛选待转化的目的基因是否成功转化到植物组织中。

进一步的，当转化的植物组织表达甜菜红素的颜色，即红色，表示遗传转化成功。

进一步的，遗传转化表示通过任意方式将所述筛选系统的DNA分子导入到植物细胞内。

进一步的，所述遗传转化可以发生在各类植物整体或植物的部分组织或者器官或植物细胞中，

优选的，所述植物为双子叶类植物和/或单子叶类植物，

进一步优选的，所述植物为拟南芥和/或水稻。

本发明所述启动子为一种在DNA转录阶段能起始转录的DNA分子，所述终止子为一种在DNA转录阶段能终止转录的DNA分子。

本发明使用单个启动子有效地共表达整个甜菜红素合成途径所需的酶。在某一个特定的实施例中，RUBY基因为采用能编码2A肽的核苷酸序列2A作为DNA连接单元，以CYP76AD1基因-2A1-DODA基因-2A2-GT基因的顺序依次顺次连接。我们去除CYP76AD1、DODA和GT的终止密码子，将三者通过能编码2A肽的DNA序列顺次连接，最后接上终止密码子，组合成一个人造基因，命名为RUBY。

众所周知，酪氨酸是各类生物最常用的氨基酸之一，在各类生物体内均大量存在，植物中酪氨酸首先在苯环上被羟基化，生成L-3,4-二羟基苯丙氨酸(L-DOPA)。该反应由P450氧化酶CYP76AD1催化。L-DOPA可被CYP76AD1进一步氧化为环-DOPA。同时，L-DOPA也会被L-DOPA 4，5-二加氧酶(DODA)催化生成甜菜酸，其随后与环-DOPA缩合成甜菜苷配基，缩合反应不需要酶。最后，通过GT(Glycosyl transferase，葡萄糖基转移酶)将糖基添加到甜菜苷配基中，生成颜色鲜亮的甜菜红素。

将这三个甜菜红素生物合成基因融合成一个开放阅读框，可以使用单个启动子和终止子表达该开放阅读框。

在这三个基因之间插入了编码2A肽的序列，2A肽是一种只有20个左右氨基酸组成的短肽，蛋白质翻译时，核糖体遇到新翻译产生的2A肽时会导致核糖体发生“跳跃”，继而导致肽链在2A肽的末尾处发生自我切割(Sharma P,Yan F,Doronina VA,Escuin-Ordinas H,Ryan MD,Brown JD.2A peptides provide distinct solutions to driving stop-carryon translational recoding.Nucleic Acids Res,2012,40(7):3143-3151)，因此利用2A肽能在单个启动子的控制下同时表达多种蛋白质(Liu Z,Chen O,Wall JBJ,Zheng M,ZhouY,Wang L,Vaseghi HR,Qian L,Liu J.Systematic comparison of 2A peptides forcloning multi-genes in a polycistronic vector.Sci Rep,2017,7(1):2193)。RUBY基因转录后，能产生三种独立的酶，催化酪氨酸合成甜菜红素。在植物中有功能的启动子可以放置在RUBY DNA之前来驱动RUBY的表达，随后通过表达的甜菜红素的颜色来判断植物遗传转化成功与否。

在某一个特定的实施例中，RUBY基因表达盒启动子为花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子，RUBY基因表达盒终止子为拟南芥基因的终止子tHsp。

首先使用花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子来驱动RUBY的表达，使用tHsp作为RUBY的转录终止子。35S启动子是一种广泛使用的组成型强启动子(Benfey PN,ChuaNH.The Cauliflower Mosaic Virus 35S Promoter:Combinatorial Regulation ofTranscription in Plants.Science,1990,250(4983):959-966)。tHsp是被植物中广泛使用的来源于拟南芥的终止子(Nagaya S,Kawamura K,Shinmyo A,Kato K.The HSPterminator of Arabidopsis thaliana increases gene expression in plantcells.Plant Cell Physiol,2010,51(2):328-332)。

我们使用农杆菌介导的花浸法(Clough SJ,Bent AF.Floral dip:a simplifiedmethod for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsisthaliana.Plant J,1998,16(6):735-743)将35S-RUBY-tHsp载体转化拟南芥。收获种子之后可以轻松地通过颜色将转基因种子与非转基因种子区分开，转化的种子具有深红色，表明RUBY可用作转基因事件的选择标记。

在另一个特定的实施例中，RUBY基因表达盒启动子为水稻的组成型表达基因OsActin1的启动子，RUBY基因表达盒终止子为拟南芥基因的终止子tHsp。并且，在RUBY表达盒之外引入待转化的目的基因C9(SEQ ID NO.13)。

本发明将RUBY置于水稻的组成型表达基因OsActin1的启动子(McElroy D,ZhangW,Cao J,Wu R.Isolation of an efficient actin promoter for use in ricetransformation.Plant Cell,1990,2(2):163-171)控制之下。我们将OsActin1-RUBY-tHsp转化为水稻，RUBY的表达使水稻愈伤组织呈现出鲜艳的红色。通过对目的基因C9的检测发现：引入RUBY使得更容易区分愈伤组织中是否成功转入了目的基因C9，使得水稻遗传转化操作更加方便。

本发明的有益效果体现在：

本发明设计了一种新的指示植物遗传转化成功与否的无损筛选系统，由于本发明无损筛选系统中的报告分子甜菜红素生物合成基因RUBY能够在植物中产生在可见光下裸眼可见的甜菜红素，从而为监测植物遗传转化成功与否提供了可见的颜色指示。采用本发明的无损筛选系统可直接对植株组织进行遗传转化，能够简单地在可见光下裸眼可见的通过颜色区分目的基因遗传转化是否成功发生。不需要专用设备或昂贵的基材即可完成遗传转化筛选，也有效避免了抗生素或除草剂筛选的弊端，因此本发明提供了一种具有观察方便、节省成本的报告系统，是现有植物遗传转化报告系统的优良替代方案。

附图说明

图1为RUBY基因的构建示意图：

图1A为将酪氨酸转化为红色的甜菜红素的化学反应流程图；

图1B为在单个表达盒中表达完整的甜菜红素生物合成途径的策略。

图2为利用35S启动子驱动RUBY表达来指示拟南芥中转基因成功发生：

图2A为使用含有p35S-RUBY-tHsp质粒的农杆菌浸染拟南芥花序两天后，拟南芥的花序中出现明显的红色；

图2B为使用含有p35S-RUBY-tHsp质粒的农杆菌浸染拟南芥花序后收获的种子，其中白色箭头指示的为转基因成功发生后种子变成红色。

图2C为中左边植株为野生型拟南芥，右边植株为带有p35S-RUBY-tHsp转基因的拟南芥植株。

图3为利用本发明筛选系统与常规不带有RUBY标记的载体转化水稻后的对比图：

图3A为OsActin1:RUBY载体转化水稻后获得的抗性愈伤中部分愈伤组织有明显的红色。

图3B为常规不带有RUBY标记的载体转化水稻后获得的抗性愈伤没有出现红色。

图4为通过OsActin1启动子驱动RUBY产生的鲜艳红色来指示转化的目的基因C9成功转化到水稻中。图4A、图4B分别表示两次独立的遗传转化事件。

具体实施方式

为了使本发明的技术方案便于理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例1.构建RUBY基因-终止子片段，获得载体pRUBY-tHsp

本实施例RUBY基因采用能编码2A肽的核苷酸序列2A为DNA连接单元，以CYP76AD1基因-2A1-DODA基因-2A2-GT(葡萄糖基转移酶)基因的顺序依次顺次连接(图1B)，其中，2A1核苷酸序列为SEQ ID NO.8所示、2A2核苷酸序列为SEQ ID NO.9所示，2A1、2A2均为编码SEQID NO.4所示2A肽的核苷酸序列，以拟南芥基因的终止子tHsp为终止子。

构建方法为：

(1)通过体外全基因合成的方式分别合成：

(a)无终止密码子的CYP76AD1基因(SEQ ID NO.5)，

(b)无终止密码子的DODA基因(SEQ ID NO.6)，

(c)包括SEQ ID NO.7所示GT基因、3个连续的终止密码子TGA、TAG、TGA和SEQ IDNO.12所示终止子tHsp的无终止密码子的GT基因+终止密码子+终止子tHsp片段(SEQ IDNO.14)；

(2)使用能表达2A肽的DNA作为DNA连接单元，2A肽对应DNA的部分序列分别加在用于PCR扩增的引物的5‘端作为接头序列，通过体外重叠延伸PCR(overlap PCR)的方法组装成完整的2A肽的DNA，并将CYP76AD1基因(SEQ ID NO.5)-2A1(SEQ ID NO.8)-DODA基因(SEQID NO.6)-2A2(SEQ ID NO.9)-GT基因(SEQ ID NO.7)+终止密码子+终止子tHsp(SEQ IDNO.12)(GT基因+终止密码子+终止子tHsp片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示)依次首尾相连组合到一起，获得RUBY-tHsp的DNA；进而最终构建出pRUBY-tHsp载体。

具体构建步骤：

(1)PCR1扩增获得CYP76AD1+前部分2A1 DNA，此处前部分2A1序列为：5’-GGTAGCGGAGCTACCAATTTTAGCCTCCTTAAGCAGGCAGGTG-3’(SEQ ID NO.32)，以SEQ ID NO.5所示无终止密码子的CYP76AD1基因为模板DNA，使用引物对：

CYP76AD1+前部分2A1-F：5’

-CACTGATAGTTTAAACTAGTATGGATCATGCGACCCTCGC-3’(SEQ ID NO.15)

CYP76AD1+前部分2A1-R：5’

-CACCTGCCTGCTTAAGGAGGCTAAAATTGGTAGCTCCGCTACCGTAGCGCGGAATCGGGA-3’(SEQID NO.16)进行PCR扩增。

PCR反应体系：

2×PCR Buffer	10μl
		2.5mM dNTP	2μl
10μM CYP76AD1+前部分2A1-F	0.6μl
		10μM CYP76AD1+前部分2A1-R	0.6μl
模板DNA	0.5μl
		KOD-FX聚合酶	0.2μl
补充双蒸水加水补至	20μl

PCR扩增程序：

PCR产物为：CYP76AD1+前部分2A1，大小为1554bp，其中包括SEQ ID NO.5的无终止密码子的CYP76AD1基因序列和SEQ ID NO.32的前部分2A1，此处前部分2A1序列提供了PCR所用反向引物上额外的用于overlap PCR的接头序列。但由于PCR所用的正向引物加上了额外的用于最后Gibson连接的接头序列，所以PCR产物略大于SEQ ID NO.5的无终止密码子的CYP76AD1基因序列和此处前部分2A1总共的序列长度。

(2)PCR2扩增获得后部分2A1+DODA+前部分2A2 DNA，此处后部分2A1序列为：5’-CCTTAAGCAGGCAGGTGATGTAGAAGAGAACCCCGGGCCT-3’(SEQ ID NO.33)，前部分2A2序列为：5’-GGATCCGGAGCAACCAACTTTAGCCTGCTCAAGCAAGCAGGAG-3’(SEQ ID NO.34)，以SEQ ID NO.6所示无终止密码子的DODA基因为模板DNA，使用引物对：

后部分2A1+DODA+前部分

2A2-F:5’-CCTTAAGCAGGCAGGTGATGTAGAAGAGAACCCCGGGCCTATGAAGATGATGAACGGCGA-3’(SEQ ID NO.17)

后部分2A1+DODA+前部分

2A2-R:5’-CTCCTGCTTGCTTGAGCAGGCTAAAGTTGGTTGCTCCGGATCCGGCGGAGGTGAACTTGT-3’(SEQ ID NO.18)为引物进行PCR扩增。

PCR反应体系：

2×PCR Buffer	10μl
		2.5mM dNTP	2μl
10μM后部分2A1+DODA+前部分2A2-F	0.6μl
		10μM后部分2A1+DODA+前部分2A2-R	0.6μl
模板DNA	0.5μl
		KOD-FX聚合酶	0.2μl
补充双蒸水至	20μl

PCR扩增程序：

PCR产物为：后部分2A1+DODA+前部分2A2大小为908bp，其中包括SEQ ID NO.6的无终止密码子的DODA基因序列和SEQ ID NO.33的后部分2A1及SEQ ID NO.34的前部分2A2。由于此处后部分2A1序列及前部分2A2序列分别提供了PCR所用的正向引物和反向引物上额外的用于overlap PCR的接头序列，所以PCR产物大小等于SEQ ID NO.6的无终止密码子的DODA基因序列和此处SEQ ID NO.33的后部分2A1及SEQ ID NO.34的前部分2A2总共的序列长度。

(3)PCR3扩增获得后部分2A2+GT+tHsp DNA，此处后部分2A2的序列为：5’-GCTCAAGCAAGCAGGAGATGTTGAGGAAAATCCTGGCCCC-3’(SEQ ID NO.35)，以SEQ ID NO.14所示的：无终止密码子的GT基因(SEQ ID NO.7)+终止密码子(TGA、TAG、TGA)+终止子tHsp(SEQ IDNO.12)DNA片段为模板DNA，使用引物对：

后部分2A2+GT+tHsp

DNA-F:5’-GCTCAAGCAAGCAGGAGATGTTGAGGAAAATCCTGGCCCCATGACCGCCATCAAGATGAA-3’(SEQ ID NO.19)

后部分2A2+GT+tHsp

DNA-R:5’-GCTAGCTTACTCAGTTAGGTCTTATCTTTAATCATATTCC-3’(SEQ ID NO.20)为引物进行PCR扩增。

PCR反应体系：

2×PCR Buffer	10μl
		2.5mM dNTP	2μl
10μM后部分2A2+GT+tHsp DNA-F	0.6μl
		10μM后部分2A2+GT+tHsp DNA-R	0.6μl
模板DNA	0.5μl
		KOD-FX聚合酶	0.2μl
补充双蒸水至	20μl

PCR扩增程序：

PCR产物为：后部分2A2+GT+tHsp，大小为1819bp，其中包括SEQ ID NO.35所示的后部分2A2序列和SEQ ID NO.14所示序列：无终止密码子的GT基因(SEQ ID NO.7)+终止密码子+终止子tHsp(SEQ ID NO.12)序列，终止密码子为：串联了3个连续的终止密码子TGA、TAG、TGA。

此处SEQ ID NO.35的后部分2A2序列提供了PCR所用的正向引物上额外的用于overlap PCR的接头序列，但由于PCR所用的反向引物加上另加有额外的用于最后Gibson连接的接头序列，所以PCR产物略大于SEQ ID NO.14所示的无终止密码子的GT基因+终止密码子+终止子tHsp和SEQ ID NO.35所示的后部分2A2总共的长度。

(4)PCR扩增获得RUBY-tHspDNA：将PCR1、PCR2、PCR3三种PCR产物CYP76AD1+前部分2A1、后部分2A1+DODA+前部分2A2、后部分2A2+GT+终止密码子+tHsp混合作为模板，使用引物对：

CYP76AD1+前部分

2A1-F:5’-CACTGATAGTTTAAACTAGTATGGATCATGCGACCCTCGC-3’(SEQ ID NO.15)；

后部分2A2+GT+tHsp

DNA-R:5’-GCTAGCTTACTCAGTTAGGTCTTATCTTTAATCATATTCC-3’(SEQ ID NO.20)为引物进行PCR扩增，获得RUBY-tHsp DNA。

PCR反应体系：

2×PCR Buffer	10μl
		2.5mM dNTP	2μl
10μM CYP76AD1+前部分2A1-F	0.6μl
		10μM后部分2A2+GT+tHsp DNA-R	0.6μl
模板DNA	0.5μl
		KOD-FX聚合酶	0.2μl
补充双蒸水至	20μl

PCR扩增程序：

PCR产物大小为4247bp。

(5)构建出pRUBY-tHsp载体：使用Xba I酶切pHDE质粒(质粒信息参见文献：Gao X,Chen J,Dai X,Zhang D,Zhao Y.An Effective Strategy for Reliably IsolatingHeritable and Cas9-Free Arabidopsis Mutants Generated by CRISPR/Cas9-MediatedGenome Editing.Plant Physiol,2016,171(3):1794-1800；pHDE质粒能通过文献中的邮箱向文献的作者索取)，将步骤(4)获得的RUBY-tHsp的PCR产物通过Gibson连接的方式(Gibson连接为目前流行的公知的快速连接DNA的方法，其中的原理、详细操作步骤以及试剂信息参见文献：Gibson DG,Young L,Chuang RY,Venter JC,Hutchison CA,3rd,SmithHO.Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.NatMethods,2009,6(5):343-345)连入pHDE质粒的XbaI处，获得pRUBY-tHsp载体。

实施例2.将启动子连入实施例1得到的pRUBY-tHsp载体中，构建筛选系统p35S-RUBY-tHsp质粒

本实施例RUBY基因表达盒启动子采用花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子，RUBY基因表达盒终止子为拟南芥基因的终止子tHsp：

(1)使用pCAMBIA1300质粒(该pCAMBIA1300质粒可从公开渠道向澳大利亚CAMBIAhttp://www.cambia.org购买，本实施例所用pCAMBIA1300质粒为由澳大利亚CAMBIAhttp://www.cambia.org惠赠)作为模板，使用引物对：

35S-F:5’-CTGTCAAACACTGATAGTTTTGAGACTTTTCAACAAAGGG-3’(SEQ ID NO.21)

35S-R:5’-CGCATGATCCATACTAGTTTTCAGCGTGTCCTCTCCAAAT-3’(SEQ ID NO.22)作为引物，进行PCR扩增，获得35S启动子的PCR产物。

PCR反应体系：

2×PCR Buffer	10μl
		2.5mM dNTP	2μl
10μM35S-F	0.6μl
		10μM35S-R	0.6μl
模板DNA	0.5μl
		KOD-FX聚合酶	0.2μl
补充双蒸水至	20μl

PCR扩增程序：

35S启动子的PCR产物大小为718bp，包括SEQ ID NO.10的35S启动子序列，由于PCR所用的引物加上了额外的用于gibson连接的接头序列，所以PCR产物略大于SEQ ID NO.10所示的35S启动子序列长度。

(2)构建p35S-RUBY-tHsp质粒：通过Gibson连接的方法将该PCR产物连入PmeI酶切的实施例1获得的pRUBY-tHsp质粒中，获得p35S-RUBY-tHsp质粒。

实施例3将RUBY-tHsp连入pOsActin1-UCAS9载体质粒中(pOsActin1-UCAS9载体骨架为pCAMBIA，质粒信息参见文献：He Y,Zhang T,Yang N,Xu M,Yan L,Wang L,Wang R,Zhao Y.Self-cleaving ribozymes enable the production of guide RNAs fromunlimited choices of promoters for CRISPR/Cas9 mediated genome editing.JGenet Genomics,2017,44(9):469-472；pOsActin1-UCAS9载体质粒能通过文献中的邮箱向文献的作者索取)，其中pOsActin1-UCAS9载体质粒带有待转化的目标基因C9(SEQ IDNO.13)，构建筛选系统pOsActin1-RUBY-tHsp质粒。

本实施例RUBY基因表达盒启动子采用水稻的组成型表达基因OsActin1的启动子(SEQ ID NO.11)：

(1)获得带有能连入pOsActin1-UCAS9载体质粒的接头序列的RUBY-tHsp DNA：

使用实施例1获得的pRUBY-tHsp质粒为模板，使用引物对：

OsActin1P-RUBY-F:5’-TGCCGGACGACGATCTCGGTACCATGGATCATGCGACCCTCG-3’(SEQID NO.23)；

OsActin1P-RUBY-R:5’-CACATCCCCCTTTCGCCAGGGTTAACCTTATCTTTAATCATATTCCATAGTCCATACCA-3’(SEQ ID NO.24)为引物进行PCR扩增。

PCR反应体系：

2×PCR Buffer	10μl
		2.5mM dNTP	2μl
10μMOsActin1P-RUBY-F	0.6μl
		10μMOsActin1P-RUBY-R	0.6μl
模板DNA	0.5μl
		KOD-FX聚合酶	0.2μl
补充双蒸水至	20μl

PCR扩增程序：

PCR产物为：带有能连入pOsActin1-UCAS9载体质粒的接头序列的RUBY-tHsp DNA，大小为4256bp。

(2)构建pOsActin1-RUBY-tHsp质粒：通过Gibson连接的方法(Gibson DG,YoungL,Chuang RY,Venter JC,Hutchison CA,3rd,Smith HO.Enzymatic assembly of DNAmolecules up to several hundred kilobases.Nat Methods,2009,6(5):343-345)将本实施例第(1)步获得的PCR产物RUBY-tHsp DNA连入Kpn I酶切过的pOsActin1-UCAS9质粒，获得pOsActin1-RUBY-tHsp质粒。

对比例1构建常规的不带RUBY表达盒的载体

(1)获得DR5启动子：合成SEQ ID NO.27所示DR5启动子DNA，以此DNA作为模板，使用引物对：

DR5-DX2181-F:5’-TAAGGGACTGACCACCCGGGGATCCGGTATCGATAAGCTTGCAGCC-3’(SEQID NO.25)；

DR5-DX2181-R:5’-CAGCGCTGAAGCTTGGCTGCAGTGTAATTGTAAATAGTAATTGTAATG-3’(SEQ ID NO.26)；为引物进行PCR扩增。

PCR反应体系：

2×PCR Buffer	10μl
		2.5mM dNTP	2μl
10μMDR5-DX2181-F	0.6μl
		10μMDR5-DX2181-R	0.6μl
模板DNA	0.5μl
		KOD-FX聚合酶	0.2μl
补充双蒸水至	20μl

PCR扩增程序：

PCR产物大小为400bp，包括SEQ ID NO.27的DR5启动子序列，由于PCR所用的引物加上了额外的用于gibson连接的接头序列，所以PCR产物略大于SEQ ID NO.27的DR5启动子序列长度。

(2)获得pDR5-EGFP质粒：通过Gibson连接的方法将DR5启动子PCR产物连入Pst I酶切过的pDX2181载体(pDX2181骨架载体也为pCAMBIA，质粒信息参见文献：Ye R,Zhou F,Lin Y.Two novel positive cis-regulatory elements involved in green tissue-specific promoter activity in rice(Oryza sativa L ssp.).Plant Cell Rep,2012,31(7):1159-1172；pDX2181载体质粒能通过文献中的邮箱向文献的作者索取)获得pDR5-EGFP质粒。

应用例1通过35S启动子驱动RUBY表达产生的颜色来指示拟南芥中转基因成功发生

将实施例2获得的测序后的阳性质粒p35S-RUBY-tHsp电转化到农杆菌(GV3101)中，然后使用花浸法(花浸法为拟南芥遗传转化的普遍方法，直接使用带有质粒的农杆菌浸泡刚开花的拟南芥的花序即可，相关详细操作参见文献：Clough SJ,Bent AF.Floral dip:a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsisthaliana.Plant J,1998,16(6):735-743)对拟南芥进行遗传转化，使用含有p35S-RUBY-tHsp质粒的农杆菌浸染拟南芥花序两天后，拟南芥的花序中出现明显的红色(图2A)。使用含有p35S-RUBY-tHsp质粒的农杆菌浸染拟南芥花序后收获的种子，转基因成功发生后种子变成红色。将颜色发红的种子(图2B)播种到营养土上，p35S-RUBY-tHsp转基因成功发生的植株表现出明显的红色，即甜菜红素的颜色，表示RUBY表达盒可以在以拟南芥为模式植物的双子叶植物中成功发挥报告基因的作用，可以用于指示遗传转化成功发生(图2C)。

应用例2通过OsActin1启动子驱动RUBY表达产生的颜色来指示水稻中转基因成功发生

将实施例3获得的测序后的阳性质粒pOsActin1-RUBY-tHsp、对比例1获得的测序后的阳性质粒pDR5-EGFP分别电转化到农杆菌(EHA105)中，然后分别侵染水稻愈伤组织。转化品种为水稻“中花11”(又称ZH11，来自中国农业科学院作物科学研究所)，(水稻遗传转化现已为水稻转基因领域的普遍操作方法，其中详细的转化步骤及使用的各种培养基配方参见文献：Hiei Y,Ohta S,Komari T,Kumashiro T.Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of theboundaries of the T-DNA.Plant J,1994,6(2):271-282)。愈伤筛选阶段，在带有抗生素的筛选培养基中可观察到，转化实施例3获得的带有RUBY表达盒的载体后，大部分水稻抗性愈伤组织出现明显的红色(图3A)，而对比例1获得的无RUBY表达盒的常规载体pDR5-EGFP转化水稻后，长出的愈伤组织没有出现红色(图3B)。表示RUBY表达盒可以在以水稻为模式植物的单子叶植物中成功发挥报告基因的作用，可以用于指示遗传转化成功发生。

应用例3检测实施例3中待转化的目标基因C9是否成功转化到了水稻愈伤组织中。

对pOsActin1-RUBY-tHsp转化水稻后的抗性愈伤的转基因情况进行检测。分别进行了两次转化事件，其中根据颜色将愈伤分为有颜色的R，和无红色的N。转化事件A中愈伤组织块1、2、4均分别取了红色(R)和淡黄色(N)的愈伤组织进行检测(图4A)；愈伤组织块3、5、7只取了红色(R)愈伤块进行检测；愈伤组织块6只取了淡黄色(N)愈伤组织进行检测。转化事件B中愈伤组织块1、4、5、6均分别取了红色(R)和淡黄色(N)的愈伤组织进行检测；愈伤组织块2、3只取了红色(R)愈伤块进行检测；愈伤组织块7、8只取了淡黄色(N)愈伤组织进行检测(图4B)。

使用常规CTAB法(He Y,Yan L,Ge C,Yao XF,Han X,Wang R,Xiong L,Jiang L,Liu CM,Zhao Y.PINOID Is Required for Formation of the Stigma and Style inRice.Plant Physiol,2019,180(2):926-936)对不同愈伤组织分别抽提DNA。

通过使用引物对：水稻基因组DNA质量检测F：5’-CTCAACCCCAAGGCTAACAG-3’(SEQID NO.28)+水稻基因组DNA质量检测R：5’-ACCTCAGGGCATCGGAAC-3’(SEQ ID NO.29)进行PCR扩增，PCR产物大小为526bp，用来检测此次样品DNA质量。

使用C9-F：5’-CCCTGCCTTCATACGCTATTT-3’(SEQ ID NO.30)+C9-R：5’-GACTTGAAGTTCGGGGTGAG-3’(SEQ ID NO.31)为引物对进行PCR扩增检测基因C9是否转化到水稻中，PCR产物大小为887bp。

PCR反应体系：

10×PCR Buffer	2μl
		2.5mM dNTP	2μl
10μM F引物	0.3μl
		10μM R引物	0.3μl
10μM C9-F引物	0.3μl
		10μM C9-R引物	0.3μl
水稻基因组DNA	2μl
		rTaq聚合酶	0.15μl
补充双蒸水加水补至	20μl

PCR扩增程序：

通过电泳检测发现两次转化事件的电泳检测胶图中下面一条带表示使用能扩增水稻基因组上一段特异DNA片段的引物进行PCR扩增的结果，扩增的结果反映提取的样品DNA质粒均较好。上面一条带表示使用能扩增基因C9的特异引物进行PCR扩增的结果，扩增结果显示红色(R)愈伤块中有基因C9转化成功的概率为100％，而没有红色的淡黄色(N)愈伤组织中一半以上的愈伤块没有转入基因C9(图4A、图4B)。说明使用RUBY表达盒产生的裸眼可视的颜色报告系统可以有效指示植物遗传转化成功发生。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种可见光下裸眼可视的植物遗传转化的无损筛选系统、构建方法及其应用

<160> 35

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 497

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Asp His Ala Thr Leu Ala Met Ile Leu Ala Ile Trp Phe Ile Ser

1 5 10 15

Phe His Phe Ile Lys Leu Leu Phe Ser Gln Gln Thr Thr Lys Leu Leu

20 25 30

Pro Pro Gly Pro Lys Pro Leu Pro Ile Ile Gly Asn Ile Leu Glu Val

35 40 45

Gly Lys Lys Pro His Arg Ser Phe Ala Asn Leu Ala Lys Ile His Gly

50 55 60

Pro Leu Ile Ser Leu Arg Leu Gly Ser Val Thr Thr Ile Val Val Ser

65 70 75 80

Ser Ala Asp Val Ala Lys Glu Met Phe Leu Lys Lys Asp His Pro Leu

85 90 95

Ser Asn Arg Thr Ile Pro Asn Ser Val Thr Ala Gly Asp His His Lys

100 105 110

Leu Thr Met Ser Trp Leu Pro Val Ser Pro Lys Trp Arg Asn Phe Arg

115 120 125

Lys Ile Thr Ala Val His Leu Leu Ser Pro Gln Arg Leu Asp Ala Cys

130 135 140

Gln Thr Phe Arg His Ala Lys Val Gln Gln Leu Tyr Glu Tyr Val Gln

145 150 155 160

Glu Cys Ala Gln Lys Gly Gln Ala Val Asp Ile Gly Lys Ala Ala Phe

165 170 175

Thr Thr Ser Leu Asn Leu Leu Ser Lys Leu Phe Phe Ser Val Glu Leu

180 185 190

Ala His His Lys Ser His Thr Ser Gln Glu Phe Lys Glu Leu Ile Trp

195 200 205

Asn Ile Met Glu Asp Ile Gly Lys Pro Asn Tyr Ala Asp Tyr Phe Pro

210 215 220

Ile Leu Gly Cys Val Asp Pro Ser Gly Ile Arg Arg Arg Leu Ala Cys

225 230 235 240

Ser Phe Asp Lys Leu Ile Ala Val Phe Gln Gly Ile Ile Cys Glu Arg

245 250 255

Leu Ala Pro Asp Ser Ser Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Asp Asp Val

260 265 270

Leu Asp Val Leu Leu Gln Leu Phe Lys Gln Asn Glu Leu Thr Met Gly

275 280 285

Glu Ile Asn His Leu Leu Val Asp Ile Phe Asp Ala Gly Thr Asp Thr

290 295 300

Thr Ser Ser Thr Phe Glu Trp Val Met Thr Glu Leu Ile Arg Asn Pro

305 310 315 320

Glu Met Met Glu Lys Ala Gln Glu Glu Ile Lys Gln Val Leu Gly Lys

325 330 335

Asp Lys Gln Ile Gln Glu Ser Asp Ile Ile Asn Leu Pro Tyr Leu Gln

340 345 350

Ala Ile Ile Lys Glu Thr Leu Arg Leu His Pro Pro Thr Val Phe Leu

355 360 365

Leu Pro Arg Lys Ala Asp Thr Asp Val Glu Leu Tyr Gly Tyr Ile Val

370 375 380

Pro Lys Asp Ala Gln Ile Leu Val Asn Leu Trp Ala Ile Gly Arg Asp

385 390 395 400

Pro Asn Ala Trp Gln Asn Ala Asp Ile Phe Ser Pro Glu Arg Phe Ile

405 410 415

Gly Cys Glu Ile Asp Val Lys Gly Arg Asp Phe Gly Leu Leu Pro Phe

420 425 430

Gly Ala Gly Arg Arg Ile Cys Pro Gly Met Asn Leu Ala Ile Arg Met

435 440 445

Leu Thr Leu Met Leu Ala Thr Leu Leu Gln Phe Phe Asn Trp Lys Leu

450 455 460

Glu Gly Asp Ile Ser Pro Lys Asp Leu Asp Met Asp Glu Lys Phe Gly

465 470 475 480

Ile Ala Leu Gln Lys Thr Lys Pro Leu Lys Leu Ile Pro Ile Pro Arg

485 490 495

Tyr

<210> 2

<211> 275

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Lys Met Met Asn Gly Glu Asp Ala Asn Asp Gln Met Ile Lys Glu

1 5 10 15

Ser Phe Phe Ile Thr His Gly Asn Pro Ile Leu Thr Val Glu Asp Thr

20 25 30

His Pro Leu Arg Pro Phe Phe Glu Thr Trp Arg Glu Lys Ile Phe Ser

35 40 45

Lys Lys Pro Lys Ala Ile Leu Ile Ile Ser Gly His Trp Glu Thr Val

50 55 60

Lys Pro Thr Val Asn Ala Val His Ile Asn Asp Thr Ile His Asp Phe

65 70 75 80

Asp Asp Tyr Pro Ala Ala Met Tyr Gln Phe Lys Tyr Pro Ala Pro Gly

85 90 95

Glu Pro Glu Leu Ala Arg Lys Val Glu Glu Ile Leu Lys Lys Ser Gly

100 105 110

Phe Glu Thr Ala Glu Thr Asp Gln Lys Arg Gly Leu Asp His Gly Ala

115 120 125

Trp Val Pro Leu Met Leu Met Tyr Pro Glu Ala Asp Ile Pro Val Cys

130 135 140

Gln Leu Ser Val Gln Pro His Leu Asp Gly Thr Tyr His Tyr Asn Leu

145 150 155 160

Gly Arg Ala Leu Ala Pro Leu Lys Asn Asp Gly Val Leu Ile Ile Gly

165 170 175

Ser Gly Ser Ala Thr His Pro Leu Asp Glu Thr Pro His Tyr Phe Asp

180 185 190

Gly Val Ala Pro Trp Ala Ala Ala Phe Asp Ser Trp Leu Arg Lys Ala

195 200 205

Leu Ile Asn Gly Arg Phe Glu Glu Val Asn Ile Tyr Glu Ser Lys Ala

210 215 220

Pro Asn Trp Lys Leu Ala His Pro Phe Pro Glu His Phe Tyr Pro Leu

225 230 235 240

His Val Val Leu Gly Ala Ala Gly Glu Lys Trp Lys Ala Glu Leu Ile

245 250 255

His Ser Ser Trp Asp His Gly Thr Leu Cys His Gly Ser Tyr Lys Phe

260 265 270

Thr Ser Ala

275

<210> 3

<211> 500

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Thr Ala Ile Lys Met Asn Thr Asn Gly Glu Gly Glu Thr Gln His

1 5 10 15

Ile Leu Met Ile Pro Phe Met Ala Gln Gly His Leu Arg Pro Phe Leu

20 25 30

Glu Leu Ala Met Phe Leu Tyr Lys Arg Ser His Val Ile Ile Thr Leu

35 40 45

Leu Thr Thr Pro Leu Asn Ala Gly Phe Leu Arg His Leu Leu His His

50 55 60

His Ser Tyr Ser Ser Ser Gly Ile Arg Ile Val Glu Leu Pro Phe Asn

65 70 75 80

Ser Thr Asn His Gly Leu Pro Pro Gly Ile Glu Asn Thr Asp Lys Leu

85 90 95

Thr Leu Pro Leu Val Val Ser Leu Phe His Ser Thr Ile Ser Leu Asp

100 105 110

Pro His Leu Arg Asp Tyr Ile Ser Arg His Phe Ser Pro Ala Arg Pro

115 120 125

Pro Leu Cys Val Ile His Asp Val Phe Leu Gly Trp Val Asp Gln Val

130 135 140

Ala Lys Asp Val Gly Ser Thr Gly Val Val Phe Thr Thr Gly Gly Ala

145 150 155 160

Tyr Gly Thr Ser Ala Tyr Val Ser Ile Trp Asn Asp Leu Pro His Gln

165 170 175

Asn Tyr Ser Asp Asp Gln Glu Phe Pro Leu Pro Gly Phe Pro Glu Asn

180 185 190

His Lys Phe Arg Arg Ser Gln Leu His Arg Phe Leu Arg Tyr Ala Asp

195 200 205

Gly Ser Asp Asp Trp Ser Lys Tyr Phe Gln Pro Gln Leu Arg Gln Ser

210 215 220

Met Lys Ser Phe Gly Trp Leu Cys Asn Ser Val Glu Glu Ile Glu Thr

225 230 235 240

Leu Gly Phe Ser Ile Leu Arg Asn Tyr Thr Lys Leu Pro Ile Trp Gly

245 250 255

Ile Gly Pro Leu Ile Ala Ser Pro Val Gln His Ser Ser Ser Asp Asn

260 265 270

Asn Ser Thr Gly Ala Glu Phe Val Gln Trp Leu Ser Leu Lys Glu Pro

275 280 285

Asp Ser Val Leu Tyr Ile Ser Phe Gly Ser Gln Asn Thr Ile Ser Pro

290 295 300

Thr Gln Met Met Glu Leu Ala Ala Gly Leu Glu Ser Ser Glu Lys Pro

305 310 315 320

Phe Leu Trp Val Ile Arg Ala Pro Phe Gly Phe Asp Ile Asn Glu Glu

325 330 335

Met Arg Pro Glu Trp Leu Pro Glu Gly Phe Glu Glu Arg Met Lys Val

340 345 350

Lys Lys Gln Gly Lys Leu Val Tyr Lys Leu Gly Pro Gln Leu Glu Ile

355 360 365

Leu Asn His Glu Ser Ile Gly Gly Phe Leu Thr His Cys Gly Trp Asn

370 375 380

Ser Ile Leu Glu Ser Leu Arg Glu Gly Val Pro Met Leu Gly Trp Pro

385 390 395 400

Leu Ala Ala Glu Gln Ala Tyr Asn Leu Lys Tyr Leu Glu Asp Glu Met

405 410 415

Gly Val Ala Val Glu Leu Ala Arg Gly Leu Glu Gly Glu Ile Ser Lys

420 425 430

Glu Lys Val Lys Arg Ile Val Glu Met Ile Leu Glu Arg Asn Glu Gly

435 440 445

Ser Lys Gly Trp Glu Met Lys Asn Arg Ala Val Glu Met Gly Lys Lys

450 455 460

Leu Lys Asp Ala Val Asn Glu Glu Lys Glu Leu Lys Gly Ser Ser Val

465 470 475 480

Lys Ala Ile Asp Asp Phe Leu Asp Ala Val Met Gln Ala Lys Leu Glu

485 490 495

Pro Ser Leu Gln

500

<210> 4

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val

1 5 10 15

Glu Glu Asn Pro Gly Pro

20

<210> 5

<211> 1491

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggatcatg cgaccctcgc catgatcctc gcgatctggt tcatcagctt ccacttcatc 60

aagctgctgt tctcccagca gaccaccaag ctgcttccgc caggaccaaa gccgcttccg 120

atcatcggca acatccttga ggtgggcaag aagccgcatc ggtccttcgc caacctcgcc 180

aagattcacg gcccactcat ttccctcaga ctcggctctg tgaccaccat cgttgtgtcc 240

tctgccgacg tggccaaaga gatgttcctc aagaaggatc acccgctctc caaccgcacg 300

atcccgaata gtgttacagc cggcgaccac cacaagctca ccatgtcttg gctcccggtg 360

tctccgaagt ggcgcaactt ccgcaagatt accgccgtgc atctgctctc cccacagaga 420

ctcgatgcct gccagacatt caggcacgcc aaggtgcagc agctctacga gtacgttcaa 480

gagtgcgccc agaaaggcca ggccgtggat attggcaagg ccgcctttac gaccagcctc 540

aacctcctca gcaagctgtt cttcagcgtc gagctggcgc accacaagtc ccataccagc 600

caagagttca aagagctgat ctggaacatc atggaagata taggcaagcc gaactacgcc 660

gactacttcc cgattctcgg ctgcgttgac ccatctggca ttagaagaag gctcgcctgc 720

tccttcgaca agctgatcgc cgtgttccag ggcatcatct gcgagagact cgccccagat 780

tcctccacca caactaccac caccaccgac gacgtgctcg atgtgctcct ccagctgttc 840

aagcagaacg agctgacgat gggcgagatc aaccacctcc tcgtggacat cttcgacgcc 900

ggcaccgata ccacatcctc cacattcgag tgggtgatga ccgagctgat ccgcaatcca 960

gagatgatgg aaaaggccca agaggaaatc aagcaggtcc tcggcaagga caagcagatc 1020

caagagtccg acatcatcaa cctgccgtac ctccaggcga tcatcaaaga gacactccgc 1080

ctccatccgc cgaccgtgtt cttgctccca agaaaggccg acaccgatgt cgagctgtac 1140

ggctacatcg tgccgaagga tgcccagatc ctcgtgaacc tctgggccat tggcagggac 1200

ccaaacgcct ggcagaacgc cgatattttc agcccagagc gcttcatcgg ctgcgagatc 1260

gatgttaagg gccgcgattt cggcctcctt ccatttggcg ctggccgcag aatttgccca 1320

ggcatgaatc tcgccatcag gatgctcacc ctcatgctcg ccacactcct ccagttcttc 1380

aactggaagc tcgaaggcga catctccccg aaggacctcg acatggacga gaagttcggc 1440

attgcgctcc aaaagaccaa gccgctcaag ctcatcccga ttccgcgcta c 1491

<210> 6

<211> 822

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aagatgatga acggcgagga cgccaacgac cagatgatca aagagtcctt cttcatcacc 60

cacggcaacc cgatcctcac cgtcgaggat acacatccgc tcaggccgtt cttcgagaca 120

tggcgcgaga agattttctc caagaagccg aaggccatcc tcatcatctc cggccactgg 180

gagacagtga agccaaccgt gaacgccgtg cacatcaacg acaccatcca cgacttcgac 240

gactacccag ccgccatgta ccagttcaag tacccagctc caggcgagcc agagcttgcg 300

agaaaggtgg aagagatcct caagaagtcc gggttcgaga cagccgagac agaccaaaag 360

aggggccttg atcacggcgc ctgggttcca ctcatgctca tgtatccaga ggcggacatc 420

ccggtgtgcc agctctcagt tcagccacat ctcgacggca cctaccacta caatctcggc 480

agagccctcg cgccgctcaa gaatgatggc gtgctcatta ttggctccgg cagcgccaca 540

catccactcg atgagacacc gcactacttc gatggtgttg ccccttgggc cgctgccttc 600

gattcttggc ttaggaaggc cctcatcaac ggccgcttcg aggaagtgaa catctacgag 660

agcaaggccc cgaactggaa gctcgcccat ccatttccag agcacttcta cccgctccac 720

gttgtgctcg gcgctgctgg tgaaaagtgg aaggccgagc tgatccactc ctcctgggat 780

catggcacac tttgccacgg ctcctacaag ttcacctccg cc 822

<210> 7

<211> 1497

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

accgccatca agatgaacac caacggcgag ggcgagacac agcacatcct catgatcccg 60

ttcatggcgc agggccacct caggccattt ctcgaactcg ccatgttcct ctacaagcgc 120

tcccacgtga tcatcaccct gctcacaact ccgctcaacg ccggcttcct caggcacctc 180

cttcaccacc attcctactc ctccagcggc atcaggatcg tcgagctgcc attcaactcc 240

accaaccacg gactcccacc gggcatcgag aacaccgata agctcacact cccgctcgtg 300

gtgtccctct tccattccac catcagcctc gatccgcacc tccgcgatta catctccagg 360

catttcagcc cagccaggcc accactctgc gtgatccatg atgtgttcct cggctgggtt 420

gaccaggtgg ccaaggatgt gggctctaca ggcgtggtgt tcacaacagg cggcgcttat 480

ggcacatccg cctacgtgtc catctggaac gatctcccgc accagaacta ctccgacgac 540

caagagttcc cgctgccagg cttcccagag aaccataagt tccgcaggtc ccagctccat 600

cggttcctca gatatgccga cggctccgac gattggtcca agtatttcca gccgcagctc 660

cgccagtcca tgaagtcttt tggctggctc tgcaactccg tggaagagat cgagacactc 720

ggcttctcca tcctccgcaa ctacaccaag ctgccgatct ggggcatcgg cccacttatt 780

gcttccccag tgcagcactc ctcctccgac aacaattcaa caggcgccga gttcgtgcag 840

tggctcagcc tcaaagagcc ggactccgtc ctctacatct ccttcggctc ccagaacacg 900

atcagcccga cgcagatgat ggaactcgct gctggccttg agtcctccga gaagccattc 960

ctctgggtga tcagagcccc gttcggcttc gacatcaacg aagagatgcg cccagagtgg 1020

ctgccagagg gctttgagga acgcatgaag gtgaagaaac agggcaagct cgtgtacaag 1080

ctcggcccgc agcttgagat cctcaaccat gaatccatcg gcggctttct cacccactgc 1140

ggatggaaca gcatccttga gtctcttcgc gagggcgttc cgatgcttgg atggccactt 1200

gctgccgagc aggcctacaa cctcaagtac ctcgaagatg agatgggcgt cgcggttgag 1260

cttgctagag gcctcgaagg cgagatctcc aaagagaagg tcaagcgcat cgtcgagatg 1320

atccttgagc gcaacgaggg ctccaaaggc tgggagatga agaatcgcgc cgtggaaatg 1380

ggcaaaaagc tcaaggacgc cgtgaacgag gaaaaagagc tgaagggctc ctccgtgaag 1440

gcgatcgacg atttcctcga cgccgtcatg caggccaaac ttgagccaag cctccag 1497

<210> 8

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggtagcggag ctaccaattt tagcctcctt aagcaggcag gtgatgtaga agagaacccc 60

gggcct 66

<210> 9

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ggatccggag caaccaactt tagcctgctc aagcaagcag gagatgttga ggaaaatcct 60

ggcccc 66

<210> 10

<211> 678

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tgagactttt caacaaaggg taatatcggg aaacctcctc ggattccatt gcccagctat 60

ctgtcacttc atcaaaagga cagtagaaaa ggaaggtggc acctacaaat gccatcattg 120

cgataaagga aaggctatcg ttcaagatgc ctctgccgac agtggtccca aagatggacc 180

cccacccacg aggagcatcg tggaaaaaga agacgttcca accacgtctt caaagcaagt 240

ggattgatgt gataacatgg tggagcacga cactctcgtc tactccaaga atatcaaaga 300

tacagtctca gaagaccaaa gggctattga gacttttcaa caaagggtaa tatcgggaaa 360

cctcctcgga ttccattgcc cagctatctg tcacttcatc aaaaggacag tagaaaagga 420

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ttggagagga cacgctga 678

<210> 11

<211> 907

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gcatactcga ggtcattcat atgcttgaga agagagtcgg gatagtccaa aataaaacaa 60

aggtaagatt acctggtcaa aagtgaaaac atcagttaaa aggtggtata aagtaaaata 120

tcggtaataa aaggtggccc aaagtgaaat ttactctttt ctactattat aaaaattgag 180

gatgtttttg tcggtacttt gatacgtcat ttttgtatga attggttttt aagtttattc 240

gcttttggaa atgcatatct gtatttgagt cgggttttaa gttcgtttgc ttttgtaaat 300

acagagggat ttgtataaga aatatcttta aaaaaaccca tatgctaatt tgacataatt 360

tttgagaaaa atatatattc aggcgaattc tcacaatgaa caataataag attaaaatag 420

ctttcccccg ttgcagcgca tgggtatttt ttctagtaaa aataaaagat aaacttagac 480

tcaaaacatt tacaaaaaca acccctaaag ttcctaaagc ccaaagtgct atccacgatc 540

catagcaagc ccagcccaac ccaacccaac ccaacccacc ccagtccagc caactggaca 600

atagtctcca caccccccca ctatcaccgt gagttgtccg cacgcaccgc acgtctcgca 660

gccaaaaaaa aaaaaagaaa gaaaaaaaag aaaaagaaaa aacagcaggt gggtccgggt 720

cgtgggggcc ggaaacgcga ggaggatcgc gagccagcga cgaggccggc cctccctccg 780

cttccaaaga aacgcccccc atcgccacta tatacatacc cccccctctc ctcccatccc 840

cccaacccta ccaccaccac caccaccacc tccacctcct cccccctcgc tgccggacga 900

cgatctc 907

<210> 12

<211> 250

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atatgaagat gaagatgaaa tatttggtgt gtcaaataaa aaggttgtgt gcttaagttt 60

gtgttttttt cttggcttgt tgtgttatga atttgtggct ttttctaata ttaaatgaat 120

gtaacatctc attataatga ataaacaaat gtttctataa tccattgtga atgttttgtt 180

ggatctcttc tccagcatat aactactgta tgtgctatgg tatggactat ggaatatgat 240

taaagataag 250

<210> 13

<211> 6142

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ctgcagtgca gcgtgacccg gtcgtgcccc tctctagaga taatgagcat tgcatgtcta 60

agttataaaa aattaccaca tatttttttt gtcacacttg tttgaagtgc agtttatcta 120

tctttataca tatatttaaa ctttactcta cgaataatat aatctatagt actacaataa 180

tatcagtgtt ttagagaatc atataaatga acagttagac atggtctaaa ggacaattga 240

gtattttgac aacaggactc tacagtttta tctttttagt gtgcatgtgt tctccttttt 300

ttttgcaaat agcttcacct atataatact tcatccattt tattagtaca tccatttagg 360

gtttagggtt aatggttttt atagactaat ttttttagta catctatttt attctatttt 420

agcctctaaa ttaagaaaac taaaactcta ttttagtttt tttatttaat aatttagata 480

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aactaaggaa acatttttct tgtttcgagt agataatgcc agcctgttaa acgccgtcga 600

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acttgctccg ctgtcggcat ccagaaatgc gtggcggagc ggcagacgtg agccggcacg 780

gcaggcggcc tcctcctcct ctcacggcac ggcagctacg ggggattcct ttcccaccgc 840

tccttcgctt tcccttcctc gcccgccgta ataaatagac accccctcca caccctcttt 900

ccccaacctc gtgttgttcg gagcgcacac acacacaacc agatctcccc caaatccacc 960

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ctctagatcg gcgttccggt ccatggttag ggcccggtag ttctacttct gttcatgttt 1080

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cttttcatgc ttttttttgt cttggttgtg atgatgtggt ctggttgggc ggtcgttcta 1380

gatcggagta gaattctgtt tcaaactacc tggtggattt attaattttg gatctgtatg 1440

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tacttctgca gcccggggga tccccaatac tatggcccca aagaagaagc gcaaggtcga 2040

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tggcgatcag tacgccgatc tgttcctcgc cgccaagaat ctctccgacg ccatcctcct 2940

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caccttcaag gaggacatcc aaaaggccca ggtgtccggc caaggcgatt ccctccatga 4200

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cgagacacgc cagatcacaa agcacgtggc ccagatcctc gactcccgca tgaacaccaa 4860

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cgtgtccgac ttccgcaagg acttccagtt ctacaaggtg cgcgagatca acaactacca 4980

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cggcggcttc tccaaggagt ccatcctccc aaagcgcaac tccgacaagc tgatcgcccg 5400

caagaaggac tgggacccga agaagtatgg cggcttcgat tctccgaccg tggcctactc 5460

tgtgctcgtg gttgccaagg tcgagaaggg caagagcaag aagctcaagt ccgtcaagga 5520

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cgccttcaag tacttcgaca ccaccatcga ccgcaagcgc tacacctcta ccaaggaggt 6060

tctcgacgcc accctcatcc accagtctat cacaggcctc tacgagacac gcatcgacct 6120

ctcacaactc ggcggcgatt ga 6142

<210> 14

<211> 1756

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

accgccatca agatgaacac caacggcgag ggcgagacac agcacatcct catgatcccg 60

ttcatggcgc agggccacct caggccattt ctcgaactcg ccatgttcct ctacaagcgc 120

tcccacgtga tcatcaccct gctcacaact ccgctcaacg ccggcttcct caggcacctc 180

cttcaccacc attcctactc ctccagcggc atcaggatcg tcgagctgcc attcaactcc 240

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gaccaggtgg ccaaggatgt gggctctaca ggcgtggtgt tcacaacagg cggcgcttat 480

ggcacatccg cctacgtgtc catctggaac gatctcccgc accagaacta ctccgacgac 540

caagagttcc cgctgccagg cttcccagag aaccataagt tccgcaggtc ccagctccat 600

cggttcctca gatatgccga cggctccgac gattggtcca agtatttcca gccgcagctc 660

cgccagtcca tgaagtcttt tggctggctc tgcaactccg tggaagagat cgagacactc 720

ggcttctcca tcctccgcaa ctacaccaag ctgccgatct ggggcatcgg cccacttatt 780

gcttccccag tgcagcactc ctcctccgac aacaattcaa caggcgccga gttcgtgcag 840

tggctcagcc tcaaagagcc ggactccgtc ctctacatct ccttcggctc ccagaacacg 900

atcagcccga cgcagatgat ggaactcgct gctggccttg agtcctccga gaagccattc 960

ctctgggtga tcagagcccc gttcggcttc gacatcaacg aagagatgcg cccagagtgg 1020

ctgccagagg gctttgagga acgcatgaag gtgaagaaac agggcaagct cgtgtacaag 1080

ctcggcccgc agcttgagat cctcaaccat gaatccatcg gcggctttct cacccactgc 1140

ggatggaaca gcatccttga gtctcttcgc gagggcgttc cgatgcttgg atggccactt 1200

gctgccgagc aggcctacaa cctcaagtac ctcgaagatg agatgggcgt cgcggttgag 1260

cttgctagag gcctcgaagg cgagatctcc aaagagaagg tcaagcgcat cgtcgagatg 1320

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ggcaaaaagc tcaaggacgc cgtgaacgag gaaaaagagc tgaagggctc ctccgtgaag 1440

gcgatcgacg atttcctcga cgccgtcatg caggccaaac ttgagccaag cctccagtga 1500

tagtgaatat gaagatgaag atgaaatatt tggtgtgtca aataaaaagg ttgtgtgctt 1560

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tatgattaaa gataag 1756

<210> 15

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cactgatagt ttaaactagt atggatcatg cgaccctcgc 40

<210> 16

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

cacctgcctg cttaaggagg ctaaaattgg tagctccgct accgtagcgc ggaatcggga 60

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ccttaagcag gcaggtgatg tagaagagaa ccccgggcct atgaagatga tgaacggcga 60

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ctcctgcttg cttgagcagg ctaaagttgg ttgctccgga tccggcggag gtgaacttgt 60

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gctcaagcaa gcaggagatg ttgaggaaaa tcctggcccc atgaccgcca tcaagatgaa 60

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<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gctagcttac tcagttaggt cttatcttta atcatattcc 40

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ctgtcaaaca ctgatagttt tgagactttt caacaaaggg 40

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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cgcatgatcc atactagttt tcagcgtgtc ctctccaaat 40

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<212> DNA

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tgccggacga cgatctcggt accatggatc atgcgaccct cg 42

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<212> DNA

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cacatccccc tttcgccagg gttaacctta tctttaatca tattccatag tccatacca 59

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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taagggactg accacccggg gatccggtat cgataagctt gcagcc 46

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

cagcgctgaa gcttggctgc agtgtaattg taaatagtaa ttgtaatg 48

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

ggtatcgata agcttgcagc cgacggtatc gcagccccct tttgtctccc ttttgtctcc 60

cttttgtctc ccttttgtct cccttttgtc tcccttttgt ctcccttttg tctccctttt 120

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ttaccaacaa caacaaacaa caaacaacat tacaattact atttacaatt aca 353

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<212> DNA

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<400> 28

ctcaacccca aggctaacag 20

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<212> DNA

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acctcagggc atcggaac 18

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<212> DNA

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ccctgccttc atacgctatt t 21

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gacttgaagt tcggggtgag 20

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

ggtagcggag ctaccaattt tagcctcctt aagcaggcag gtg 43

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

ccttaagcag gcaggtgatg tagaagagaa ccccgggcct 40

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

ggatccggag caaccaactt tagcctgctc aagcaagcag gag 43

<210> 35

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

gctcaagcaa gcaggagatg ttgaggaaaa tcctggcccc 40

Claims

1.一种可见光下裸眼可视的植物遗传转化的无损筛选系统，其特征在于，所述筛选系统为包括RUBY基因表达盒的报告基因载体，所述RUBY基因表达盒包括顺次设置的启动子、甜菜红素生物合成基因RUBY基因、终止子。

2.根据权利要求1所述的无损筛选系统，其特征在于，所述RUBY基因包括CYP76AD1基因、DODA基因和GT基因；

3.根据权利要求2所述的无损筛选系统，其特征在于，所述CYP76AD1基因、DODA基因和GT基因之间通过DNA连接单元以任意顺序连接。

4.根据权利要求3所述的无损筛选系统，其特征在于，所述DNA连接单元为能够转录和翻译成一种带有自切割功能多肽的DNA序列；

进一步优选的，所述DNA连接单元为核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的2A1，或核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的2A2。

5.根据权利要求1所述的无损筛选系统，其特征在于，报告基因载体的骨架质粒为植物载体。

6.根据权利要求1所述的无损筛选系统，其特征在于，所述报告基因载体还包括待转化的目的基因。

7.根据权利要求1所述的无损筛选系统，其特征在于，所述启动子为能在植物中发挥功能的启动子，所述终止子为能在植物中发挥功能的终止子；

更进一步优选的，所述启动子为35S启动子或OsActin1的启动子，所述终止子为tHsp。

8.一种可见光下裸眼可视的植物遗传转化的无损筛选系统的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

9.根据权利要求8所述的一种可见光下裸眼可视的植物遗传转化的无损筛选系统的构建方法，其特征在于，所述步骤1)的具体操作为：分别获得CYP76AD1基因、DODA基因、GT基因、终止子片段；使用体外重叠延伸PCR的方法将CYP76AD1基因、DODA基因和GT基因三种DNA分子通过DNA连接单元以任意顺序组合为RUBY基因，在RUBY基因之后连接终止子，获得RUBY基因-终止子片段；将RUBY基因-终止子片段连接到骨架质粒中，构建得到含有RUBY基因和终止子的载体pRUBY-终止子。

10.根据权利要求8所述的一种可见光下裸眼可视的植物遗传转化的无损筛选系统的构建方法，其特征在于，所述步骤2)具体操作为：通过PCR扩增启动子，然后将启动子连入步骤1)得到的pRUBY-终止子中，所述启动子连接在RUBY-终止子片段上游，得到含有RUBY基因表达盒的报告基因载体p启动子-RUBY-终止子。

11.根据权利要求8所述的一种可见光下裸眼可视的植物遗传转化的无损筛选系统的构建方法，其特征在于，所述构建方法还包括步骤3)：向报告基因载体上RUBY基因表达盒以外的区域导入待转化的目的基因。

12.权利要求1所述的可见光下裸眼可视的植物遗传转化的无损筛选系统或权利要求8所述的可见光下裸眼可视的植物遗传转化的无损筛选系统的构建方法在判断植物是否成功遗传转化中的应用。

13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，当转化的植物组织表达甜菜红素的颜色，表示遗传转化成功。

14.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述遗传转化表示将所述筛选系统的DNA分子直接导入到植物体内。

15.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述遗传转化能够发生在各类植物整体或植物的部分或植物细胞中，

优选的，所述植物为双子叶类植物和/或单子叶类植物，

进一步优选的，所述植物为拟南芥和/或水稻。