CN110945133A - 转化用载体和转化体以及来自转化体的产品 - Google Patents
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Abstract
[课题]本发明提供包含在植物、特别是棉的纤维组织中特异性表达的启动子和转录因子的载体。[解决手段]一种载体，其包含在棉的种子表面和/或棉纤维中特异性表达的至少1个以上的启动子、以及激活由该启动子起始的转录的至少1个反式激活因子。使用转化有该载体的农杆菌进行了转化的细胞、组织、愈伤组织、转化植物和/或其种子。
Description
技术领域
本发明涉及植物的转化用载体和转化体以及来自转化体的产品。更详细而言，涉及棉的转化用载体和转化体以及来自转化体的产品。
背景技术
以往，有色棉仅有棕色、绿色这两种，纤维长、强度、收获量、纺织性等低，商业加工困难，因此希望实现高品质棉的多色化。另外，已知目前的有色棉在其纤维部分蓄积有类黄酮类化合物，但是没有通过交叉育种将这些性状导入商业品种的实例。
关于棉的转化方法，在二十世纪八十年代进行了开发(专利文献1、2)，但是多色化尚未成功。
另一方面，已经开发了利用基因重组技术克隆并导入类黄酮、类胡萝卜素、甜菜红素等的色素合成系基因来改变花或叶的颜色的技术，但尚无法通过基因重组自由地改变棉的颜色。
因此，要求开发出适于使棉纤维发色的载体和/或转化方法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特表平2-502253号公报
专利文献2：日本专利第4463456号公报
发明内容
发明所要解决的课题
本发明提供一种包含在植物、特别是棉的纤维组织中特异性表达的启动子和转录因子的载体；由它们进行了转化的棉；来自转化棉的产品。
用于解决课题的手段
根据本发明，提供以下的发明。
(1)一种载体，其包含在棉的种子表面和/或棉纤维中特异性表达的至少1个以上的启动子；或者，一种载体，其包含在棉纤维中特异性表达的至少1个以上的启动子、以及激活由该启动子起始的转录的至少1个反式激活因子基因。
(2)如(1)所述的载体，其中，上述在棉的种子表面和/或棉纤维中特异性表达的启动子为下述启动子中的任一种：
(i)RDL1和/或EXPA启动子；
(ii)在严格条件下与GhRDL1或GhEXPA启动子杂交并在棉的种子表面和/或棉纤维中特异性表达的启动子；
(iii)与GhRDL1或GhEXPA启动子具有70％以上的同源性并在棉的种子表面和/或棉纤维中特异性表达的启动子。
(3)如(1)或(2)所述的载体，其中，上述反式激活因子基因为下述中的任一种：
(i)编码GhHOX3蛋白的DNA；
(ii)编码与GhHOX3蛋白具有60％以上的氨基酸一致性并具有与GhHOX3蛋白同等的转录激活功能的蛋白的DNA；
(iii)与(i)的DNA具有70％以上的同源性并编码具有与GhHOX3蛋白同等的转录激活功能的蛋白的DNA；
(iv)在严格条件下与(i)的DNA杂交并编码具有与GhHOX3蛋白同等的转录激活功能的蛋白的DNA。
(4)如(1)～(3)中任一项所述的载体，其中，进一步包含至少1个功能性地连接的、促进色素生物合成基因群的表达的转录因子基因和/或色素生物合成基因。
(5)如(4)所述的载体，其中，上述促进色素生物合成基因群的表达的转录因子为下述中的任一种：
(i)编码Atpap1蛋白的DNA；
(ii)编码与Atpap1蛋白具有60％以上的氨基酸一致性并具有与Atpap1蛋白同等的转录激活功能的蛋白的DNA；
(iii)与(i)的DNA具有70％以上的同源性并编码具有与Atpap1蛋白同等的转录激活功能的蛋白的DNA；
(iv)在严格条件下与(i)的DNA杂交并编码具有与Atpap1蛋白同等的转录激活功能的蛋白的DNA。
(6)一种载体，其具有序列号1～3中的任一种序列。更优选为由序列号1～3中的任一种序列构成的载体。
(7)如(1)～(6)中任一项所述的载体，其中，包含T-DNA的边界区域。
(8)一种农杆菌，其转化有(7)所述的载体。
(9)一种组织、愈伤组织、转化植物和/或其种子，其使用(8)所述的农杆菌进行了转化。
(10)一种克隆植物、后代植物和/或它们的种子，其来自(9)所述的转化植物或其种子。
(11)如(9)或(10)所述的细胞、组织、愈伤组织、转化植物和/或其种子、以及克隆植物、后代植物和它们的种子，其中，上述进行了转化的细胞、组织、愈伤组织、转化植物和/或其种子、以及克隆植物、后代植物和它们的种子来自棉。
(12)一种生产(4)、(6)或(7)所述的载体、和/或使用(7)所述的农杆菌进行了转化的棉细胞、组织、愈伤组织、转化植物和/或其种子、以及克隆植物、后代植物和它们的种子的方法。
(13)一种棉纤维、布料或衣服，其由(11)或(12)所述的上述转化植物体获得。
(14)一种棉纤维、布料或衣服，其包含外源花色相关基因。
发明的效果
根据本发明，能够在棉植物中高效地表达基因。
附图说明
图1是示出类黄酮的生物合成途径的图。
图2是本发明中使用的载体pRI-GhRDL1p-Atpap1/35Sp-GhHOX3的质粒图谱。
图3是本发明中使用的载体pRI-GhEXPAp-Atpap1/35Sp-GhHOX3的质粒图谱。
图4是本发明中使用的载体pRI-GhRDL1p-Atpap1/GhEXPAp-Atpap1/35Sp-GhHOX3的质粒图谱。
图5是示出GhRDL1启动子区的碱基序列的图。
图6是示出GhEXPA启动子区的碱基序列的图。
图7是载体pRI-35Sp-Atpap1的质粒图谱。
图8是示出棉纤维中的利用各种质粒进行的色素表达的照片。
图9是示出仅使用了pRI-GhRDL1p-Atpap1/GhEXPAp-Atpap1/35Sp-GhHOX3的转化体烟草的叶的毛状体细胞着色成红色的照片。
图10是示出在使用了pRI-GhRDL1p-Atpap1/GhEXPAp-Atpap1/35Sp-GhHOX3的转化体烟草中幼叶的毛状体细胞显著着色成红色的照片。
图11是示出在使用了pRI-GhRDL1p-Atpap1/GhEXPAp-Atpap1/35Sp-GhHOX3的转化体烟草中花瓣着色成红色的照片。
图12是示出使用了pRI-GhRDL1p-Atpap1/GhEXPAp-Atpap1的转化体烟草的叶的毛状体细胞更深地着色成红色的照片。
图13是使用了pRI-GhRDL1p-Atpap1/GhEXPAp-Atpap1的转化体烟草的花瓣的基部的红色着色和将其放大的照片。
具体实施方式
本发明提供一种能够在植物、特别是棉的组织中特异性表达的载体。本发明中，棉优选指棉属中包含的商业栽培的下述种类：陆地棉(Gossypium hirsutum)、海岛棉(Gossypium barbadense)、树棉(Gossypium arboretum)、草棉(Gossypium herbaceum)，但不限于这些。
本发明的载体包含在棉的种子表面和/或棉纤维中特异性表达的至少1个以上的启动子。作为该启动子，例如，优选使用作为棉种子表面和/或纤维特异性启动子的GhRDL1、GhEXPA、GhCesA4、GhACT1、GhDET2等，但不限于这些。总之，只要是能够在棉种子表面和/或纤维中特异性表达的启动子即可。这些启动子优选具有用于在棉的种子表面和/或棉纤维中特异性表达的顺式元件(顺式因子)，但也可以通过除此以外的调控在种子表面和/或棉纤维中特异性表达。
另外，也可以使用作为构成性地表达的启动子且在棉的种子表面和/或棉纤维中也表达的启动子。该情况下，在不需要表达的组织中，使用抑制目的基因表达的系统即可。例如，通过在不需要的组织中特异性表达RNAi或反义RNA，能够抑制目的基因在不需要的组织中的表达。
作为功能性地连接在该启动子的下游并在目标组织中表达的基因，没有特别限制，例如优选与色素生产相关的基因群或对这些基因群进行调控的转录因子。作为与色素生产相关的基因群，可以举出：与类黄酮色素生物合成有关的基因群、与类胡萝卜素色素生物合成有关的基因群、与甜菜红素色素生物合成有关的基因群等，但不限于这些，只要是与色素生产有关的基因即可。色素生物合成基因群的来源可以为植物、动物、微生物等，也没有特别限制。作为对色素生物合成基因群进行调控的转录因子，例如可以举出激活类黄酮生物合成基因群表达的拟南芥的Atpap1基因(激活图1的下划线基因)等，但不限于这些。例如，也可以为对具有MYB、bHLH、WDR结构域的色素生物合成进行调控的转录因子。
本发明的载体也可以进一步含有激活上述顺式元件的反式激活因子(transacting factor)。作为该反式激活因子没有特别限制，可以举出例如棉的GhHOX3、GhMYB109、GhMYB25、GhMYB2A、GhMYB2D基因，但不限于这些。该反式激活因子通过与上述顺式元件结合，促进由上述启动子起始的转录，由此能够促进基因的表达。作为结合在编码该反式激活因子的基因的上游的启动子，可以是构成性地表达的启动子，也可以是组织和/或时间特异性地表达的启动子，优选为至少在希望表达目的基因的组织中表达的启动子。
本发明的载体也可以进一步包含参与色素的生物合成的基因。作为参与色素生物合成的基因，可以举出例如类黄酮系色素生物合成系基因、类胡萝卜素系色素生物合成系基因、甜菜红素生物合成系基因等，但不限于这些，只要是参与生产色素的生物合成途径的基因，就可以包含在本发明的载体中。
作为类黄酮系色素生物合成系基因的示例，例如可以举出参与蓝色色素生物合成的类黄酮3’,5’-脱氢酶等。通过在具有花青素合成途径而不具有类黄酮3’,5’-脱氢酶的植物中导入该酶基因并使其表达，能够使颜色向紫～蓝色的方向转变。进而，通过一并导入生物合成使飞燕草素稳定化的糖链的基因、以及将该糖链附加到飞燕草素上的基因，能够使飞燕草素稳定化，能够使紫～蓝色稳定化。另外，为了更接近蓝色，优选通过RNAi或反义法抑制DFR基因的表达。
另外，作为黄色系色素生物合成系基因，可以举出橙酮合酶、芦丁合酶、类胡萝卜素合成系酶等的基因。
关于启动子区的DNA、转录因子的基因、色素生物合成系基因，也可以直接使用天然存在的DNA序列，但只要具有所需要的功能，也可以使用部分发生了突变(添加、缺失、置换等)的DNA序列。
例如，关于棉纤维特异性启动子，可以使用在严格条件下与序列号14或15的DNA杂交并在棉纤维中特异性表达的启动子。
此处，严格条件可以为低严格条件、中严格条件和高严格条件中的任一者。“低严格条件”例如为5×SSC、5×Denhardt溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、32℃的条件。此处，1×SSC为150mM NaCl和15mM柠檬酸钠、pH7.0，5×Denhardt溶液为0.1％(w/v)BSA、0.1％(w/v)Ficol(注册商标)400、0.1％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。另外，“中严格条件”例如为50℃、2×SSC、0.1％SDS的条件。“高严格条件”例如为65℃、0.1×SSC和0.1％SDS的条件。在这些条件下，可以期待随着温度升高、可以高效地获得具有更高同源性的DNA。其中，作为影响杂交的严格度的因素，可考虑温度、探针浓度、探针长度、离子强度、时间、盐浓度等多种因素，本领域技术人员可以通过适当选择这些因素而实现同样的严格度。
在该严格条件下通过噬菌斑杂交或菌落杂交等从文库进行杂交而获得的DNA通过与GFP或荧光素酶等报告基因连接、并用基因枪轰击到棉的纤维中，能够容易地确认是否具有棉纤维特异性的启动子活性。
另外，与序列号14或15的棉纤维特异性启动子的DNA序列的同源性为99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％以上且显示出棉纤维特异性表达的DNA也能够用作本发明的启动子。该情况下，同源性的上限为100％。DNA的同源性可以通过本领域技术人员公知的NCBI的BLAST(注册商标)等程序来确定。本说明书中所说的DNA序列的同源性、氨基酸序列的一致性为NCBI的BLAST的标准设定中的同源性、一致性。
另外，关于转录因子或色素生物合成系基因，也可以将DNA的同源性为99％以上、98％以上、97％以上、96％以上、95％以上、94％以上、93％以上、92％以上、91％以上、90％以上、85％以上、80％以上、75％以上、70％以上、65％以上、60％以上且与原基因具有同等的转录激活能力或色素合成活性的基因连接到本发明的载体中来使用。该情况下，同源性的上限为100％。此处，“同等的”是指相同种类的，不需要连活性强度也相同。这些具有同源性的基因可以通过噬菌斑杂交、菌落杂交等从cDNA文库或基因组文库中筛选得到，关于转录因子活性、色素生物合成活性，也可以通过将本领域技术人员公知的方法进行组合来确认。
另外，关于转录因子或色素合成系基因，也可以是编码下述蛋白的DNA，该蛋白与原基因所编码的蛋白的同源性为99％以上、98％以上、97％以上、96％以上、95％以上、94％以上、93％以上、92％以上、91％以上、90％以上、85％以上、80％以上、75％以上、70％以上、65％以上、60％以上且具有与原基因同等的转录激活能力或色素合成活性。此处，“同等的”是指相同种类的，不需要连活性强度也相同。
通过使用包含与本发明的启动子连接的色素生物合成途径的转录因子(例如，Atpap1)和反式激活因子的载体来转化植物，特别是使其在棉的种子表面和/或棉纤维中特异性表达，能够使色素在棉的纤维中表达。但是，该情况下，需要备齐与转录因子对应的色素生物合成系基因群。例如，在Atpap1的情况下，需要备齐能够使类黄酮系色素生物合成系基因发出至少一种颜色的基因群。但是，不需要达到备齐全部的花青素、天竺葵色素、飞燕草素的生物合成系基因的程度。或者，也可以导入全部各色素合成系基因群而对色素进行生物合成。
本发明的载体优选包含下述中的任一者：农杆菌的T-DNA的两端的边界区域DNA(右边界区域(Rb)和左边界区域(Lb)这两者；或者Rb。
为了将基因导入植物中，可以使用农杆菌的Ti质粒系统或Ri质粒系统。使用通过双交换重组在Ti质粒中置换了T-DNA区域的中间载体法将该重组Ti质粒导入农杆菌中，使其感染植物细胞，由此能够将T-DNA区域插入到植物细胞的核基因组中。
本发明的载体更优选为Ti质粒的双元载体系统。双元载体的情况下，是指T-DNA和用于将T-DNA区域导入植物中所需要的基因群包含在不同的质粒中。该情况下，对预先含有包含具有将T-DNA区域导入到植物中的功能的基因群的质粒(例如，LBA4404等)的农杆菌，转化包含T-DNA的质粒。作为转化法，可以优选使用三亲杂交法、电穿孔法(Electroporation)等。
转化(或双交换重组)有包含T-DNA的质粒的农杆菌在LB培养基等中进行液体培养，之后与植物组织片接触，进行共培养。根据需要，也可以添加乙酰丁香酮。使农杆菌与植物组织片接触的方法优选使用真空渗透法、浸渍法等。接触后的共培养优选保护培养(饲养培养)，但对许多植物来说，无需饲养培养也能获得转化体。共培养的时间优选为2天～1周左右，但不限于此。总之，只要以不发生农杆菌过度生长，植物组织片死亡；或者感染量过少，无法获得足够数量的转化愈伤组织等问题的范围内的时间进行培养即可。
作为植物组织片，优选使用叶片、茎、下胚轴、胚、茎尖、根、愈伤组织等，但不限于这些。
为了除去农杆菌，经共培养的植物组织片可以在包含抗生素羧苄青霉素等的培养基中进一步培养。
除去农杆菌后的植物组织来源的转化愈伤组织等之后利用通常的组织培养方法进行再分化，通过生根、驯化而得到通常的植物体。
所使用的组织片的植物若为固定的品种，通过取得种子能够得到后代的植物。在来自F1种子的植物的情况下，可以进行营养繁殖(扦插繁殖等)而以克隆植物的形式进行繁殖，也可以通过重复回交而作为品种固定下来。
另外，也可以从转化体诱导胚来制成人工种子。
可以利用本领域技术人员公知的方法由上述得到的棉的种子制备棉的纤维，制成线、布料，进而制造衣服。即，摘取棉的果实(棉桃)，在轧棉厂将棉纤维和种子分离后，纺织成线，经编织、染色、精加工、缝制等工序，可以制造最终产品。
更详细而言，布料、产品的制造方法如下所述。在松解被压缩的原料棉的同时，去除原料中包含的叶片、种子片、砂尘等，制成片状。接着，通过梳理片状的棉卷而将纤维一根一根地分离，使其平行，由此去除小的灰尘和短的纤维。使剩下的长纤维大致平行，将其集束，形成绳状的条子。将条子反复进行多次并条和牵伸，使其变细且均匀。一边将变细的条子拉伸至线的粗细，一边加捻而纺线，由此制造称为单线的一根线。进而将两条该单线以相反方向捻合，由此可以形成双线。之后，根据需要，将线复卷成圆柱或圆锥的形态。将制成的线用作经线和纬线，利用织机等可以织成作为布料的布。使用如此得到的织布，通过本领域技术人员公知的方法等可以制造衣服、包等。
作为由本发明的转化棉制造的线、布料、衣服，可以举出例如棉织物、由棉织物制成的衣服等。作为棉织物的布料，可以举出例如细布、密织平纹布、阔幅平布、CB府绸、牛津布、葛城厚斜纹布·棉麻帆布、帆布等，但不限于这些。作为衣服，可以举出内衣、衬衫、罩衫、裤子、裙子、T恤衫、开衫、束腰外衣等，但不限于这些。总之，只要是由棉的纤维制造的机织物、针织物、衣服，就可以由本发明的棉来制造。
对于由包含本发明的基因的种子得到的棉的纤维、线、布料或衣服，可以通过常规方法提取DNA，利用PCR法确认外源基因的存在。从棉的纤维、线、布料、衣服提取DNA的方法可以使用市售的DNA提取试剂盒，也可以使用CTAB法等进行提取(例如，美国专利9938586、WO2010/056642)。
[实施例]
1.双元载体的制作方法
pRI-GhRDL1p-Atpap1/35Sp-GhHOX3(图2、序列号1)
pRI-GhEXPAp-Atpap1/35Sp-GhHOX3(图3、序列号2)
pRI-GhRDL1p-Atpap1/GhEXPAp-Atpap1/35Sp-GhHOX3(图4、序列号3)
以下示出所使用的引物序列。
引物序列：
Atpap1 U-XbaI：CCAGTGTCTAGACTATCTTTGTTCCATGGAGGG(序列号4)
Atpap1 L-SacI：CCAGTGGAGCTCCACAAACGCAAACAAATGTTC(序列号5)
GhRDL1p U-HindIII：CCAGTGAAGCTTAATTAGTTATGTTTGGTAAAT(序列号6)
GhRDL1p L-XbaI：CCAGTGTCTAGACTAGAACAGGAGTGACTAATT(序列号7)
GhEXPAp U-HindIII：CCAGTGAAGCTTTTTAAGCAAAAAATTAATAGT(序列号8)
GhEXPAp L-XbaI：CCAGTGTCTAGATTGAGTAAGAGCTAGCTAGCT(序列号9)
GhHOX3 U-XbaI：CCAGTGTCTAGAATGGATTGCGGAAGCGGCGGC(序列号10)
GhHOX L-SacI：CCAGTGGAGCTCTCAAGAACTAGGACAATTCAA(序列号11)
hspT L-PstI：ACTACTCTGCAGAATTCCTTATCTTTAATCATA(序列号12)
GhRDL1p U-SphI：CCAGTGGCATGCAATTAGTTATGTTTGGTAAAT(序列号13)
启动子区的碱基序列：
将GhRDL1启动子区(序列号14)和GhEXPA启动子区(序列号15)的碱基序列和顺式因子示于图5和图6。
另外，将编码Atapa1(登录号AK221639)和GhHOX3(登录号KJ595847)的蛋白的区域的碱基序列示于序列号16和17。
pRI-GhRDL1p-Atpap1、pRI-GhEXPAp-Atpap1和35Sp-GhHOX3的制作：
使用引物Atpap1 U-XbaI和Atpap1 L-SacI，通过PCR法由拟南芥(Arabidopsisthaliana)的cDNA扩增Atpap1基因(787bp、花色苷生物合成转录因子)。使用以下引物，通过PCR法由棉(陆地棉，Gossypium hirsutum)基因组DNA扩增棉纤维特异性启动子序列的GhRDL1p(302bp)和GhEXPAp(2000bp)、棉纤维特异性转录因子的GhHOX3基因(2142bp)。GhRDL1p U-HindIII和GhRDL1p L-XbaI、GhEXPAp U-HindIII和GhEXPAp L-XbaI、GhHOX3 U-XbaI和GhHOX L-SacI。
将这些分离基因导入到基本载体pRI201-AN-GUS(TaKaRa)中。将插入序列XbaI-Atpap1-SacI片段插入到利用限制酶XbaI和SacI除去了GUS基因的pRI201-AN-GUS载体中，制成pRI-35Sp-Atpap1。进而，利用限制酶HindIII和XbaI除去pRI-35Sp-Atpap1的CaMV35S启动子基因，将插入片段HindIII-GhRDL1p-XbaI或HindIII-GhEXPAp-XbaI片段作为启动子序列插入，制成pRI-GhRDL1p-Atpap1和pRI-GhEXPAp-Atpap1。
将插入序列XbaI-GhHOX3-SacI片段插入到利用限制酶XbaI和SacI除去了GUS基因的pRI201-AN-GUS载体中，制成pRI-35Sp-GhHOX3。
pRI-GhRDL1p-Atpap1/35Sp-GhHOX3和pRI-GhEXPAp-Atpap1/35Sp-GhHOX3的制作：
使用以下的PCR引物、GhRDL1p U-HindIII和hspT L-PstI、GhEXPAp U-HindIII和hspT L-PstI，由pRI-GhRDL1p-Atpap1扩增HindIII-[pRI-GhRDL1p-Atpap1]-PstI片段，由pRI-GhEXPAp-Atpap1扩增HindIII-[GhEXPAp-Atpap1]-PstI片段。将各插入片段插入到用限制酶HindIII和PstI切断的pRI-35Sp-GhHOX3载体中，制成pRI-GhRDL1p-Atpap1/pp-GhHOX3和pRI-GhEXPAp-Atpap1/35Sp-GhHOX3。
pRI-GhRDL1p-Atpap1/GhEXPAp-Atpap1/35Sp-GhHOX3的制作：
使用以下的PCR引物、GhRDL1p U-SphI和hspT L-PstI，由pRI-GhRDL1p-Atpap1扩增SphI-[pRI-GhRDL1p-Atpap1]-PstI片段。将该片段作为插入片段，插入到用限制酶SphI和PstI切断的pRI-GhEXPAp-Atpap1/35Sp-GhHOX3载体中，制成pRI-GhRDL1p-Atpap1/GhEXPAp-Atpap1/35Sp-GhHOX3。
使用TaKaRa Ex Taq、NucleoSpin Gel and PCR Clean-up(TaKaRa)，按照手册进行了PCR反应、琼脂糖凝胶电泳、目标片段从琼脂糖凝胶中的回收和纯化。使用DNALigation Kit Long(TaKaRa)、E.coli DH5α感受态细胞、NucleoSpin Plasmid EasyPure，按照手册进行了连接反应、向大肠杆菌中的转化、质粒提取。
双元质粒向农杆菌中的导入：
将50μL具有卸甲型Ti质粒的农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105或LBA4404与质粒溶液2μL在小杯(cuvette)内混合，使用GENEPULSER II(BIORAD)以2.5KV、125μFD和200Ω的条件进行了电穿孔。将电穿孔后的农杆菌菌液移至1.5ml管内的500μL的SOC液体培养基中，在28℃培养1小时。使用细菌接种环将该培养液涂铺到调整成卡那霉素30ppm的YEP培养基平板上。用封口膜(Parafilm)将平板密封，在28℃温育一晩，第二天确认到菌落的形成。双元质粒的导入通过利用菌落PCR法扩增目的基因序列来进行确认。
2.棉花的转化方法
接种材料的准备：
将棉(陆地棉，Gossypium hirsutum)籽放入1.5ml Eppendorf管中，在80％乙醇中浸渍30秒进行表面杀菌，弃去乙醇使其蒸发后，加入少量添加有tween 20的有效氯浓度为1％的安替佛民，一边颠倒混合一边进行10分钟杀菌。在超净工作台内除去安替佛民，用灭菌水清洗10次。将灭菌后的种子播种至MS培养基中进行培养。关于培养条件，使用90mm×20mm灭菌培养皿，在25℃、黑暗中进行培养。
农杆菌悬浮液的制作
将用甘油储存液冷冻保存的导入有各载体的农杆菌解冻后，加入到添加有30ppm卡那霉素的YEP培养基10mL中，在28℃振荡24小时，进行选择和繁殖。之后，以3000rpm离心10分钟，去除上清。向沉淀的菌体中加入添加有10ppm乙酰丁香酮的YEP培养基10mL并重悬，制成农杆菌悬浮液。
农杆菌的接种和共培养：
准备将无菌播种的种子在25℃无菌播种后、在黑暗中培养第3天的幼苗的下胚轴。在超净工作台内将幼苗置于铺有滤纸的90mm×20mm灭菌培养皿中，向其中倒入制成的农杆菌悬浮液。将幼苗的下胚轴以浸渍于农杆菌悬浮液中的状态切断成2～3mm，接种农杆菌。之后，用滤纸吸取附着在下胚轴上的多余的农杆菌悬浮液，置床于共培养用培养基(1)中进行培养。关于培养条件，使用培养皿在25℃黑暗中进行3天培养。
植物体的再生：
共培养后，用灭菌水将下胚轴冲洗3次，为了农杆菌的除菌和转化体的选择，将下胚轴移植到愈伤组织诱导选择培养基(2)中。每5～7天进行一次传代。在诱导的愈伤组织足够肥大时(接种2个月以后)，将愈伤组织移植到不定芽诱导选择培养基(3)中。从愈伤组织上切取由愈伤组织产生的约1～2cm的不定芽，为了促进生根而移植到不定根诱导培养基(4)中。在25℃连续照明下培养至不定芽充分伸长为止。从愈伤组织诱导至不定芽产生为止的过程中的培养条件均设定为使用灭菌培养皿90mm×20mm、25℃连续照明下。仅不定根诱导培养基在植物箱(72×72×100mm)中进行培养。
植物体的驯化：
将不定根充分伸长的个体从培养基中取出，用流水清洗根后，使用灭菌的园艺植物用土壤移植到直径90mm的盆中。为了保持湿度，用塑料袋被覆，在25℃的人工气候室(14h/10h日长)中培育。之后，缓慢地除去塑料袋，进行驯化。
转化体的确认：
从所得到的植物体的叶中提取DNA，通过PCR法扩增卡那霉素抗性基因(nptII基因)的一部分，由此进行了转化的确认。
(1)共培养用培养基：MS培养基(Murashige and Skoog medium)+0.1ppm NAA(1-萘乙酸)+0.1ppm BAP(6-苄基氨基嘌呤)
(2)愈伤组织诱导选择培养基：MS培养基+0.1ppm NAA+0.1ppm BAP+75ppm卡那霉素+10ppm美罗培南(水合美罗培南)
(3)不定芽诱导选择培养基：MS培养基+1ppm GA3(Gibberellin)+75ppm卡那霉素+10ppm美罗培南
(4)不定根诱导培养基：1/2MS培养基+0.3ppm IBA(吲哚-3-乙酸)+10ppm美罗培南
(棉纤维细胞中的基因的瞬时表达)
pRI-35Sp-Atpap1的制作
使用引物Atpap1 U-XbaI和Atpap1 L-SacI，通过PCR法由拟南芥(Arabidopsisthaliana)的cDNA扩增Atpap1基因(787bp、花色苷生物合成转录因子)。将插入序列XbaI-Atpap1-SacI片段插入到利用限制酶XbaI和SacI除去了GUS基因的pRI201-AN-GUS(TaKaRa)载体中，制成pRI-35Sp-Atpap1(图7)。
利用粒子枪法(基因枪)的棉未成熟种子中的Atpap1的瞬时表达
为了目的基因的导入和瞬时表达的确认，使用粒子枪式基因导入装置(PDS-1000/He、Bio-Rad)。
金粒子的预处理
称取12mg金粒子(直径1μm)，加入200μL的100％乙醇，涡旋振荡5分钟。在室温下静置约5分钟后，以5000rpm进行离心。弃去上清，加入250μL的75％乙醇，用手指剧烈弹动、充分混合，涡旋振荡3分钟后，静置约5分钟，以5000rpm进行离心，弃去上清。之后，加入300μL的灭菌水，用手指剧烈弹动、充分混合，涡旋振荡1分钟，静置1分钟，以5000rpm进行离心并弃去上清，将上述步骤重复3次。加入50％甘油200μL，涡旋振荡进行混合。
质粒DNA向金粒子上的包覆
将各种质粒预先制备成1μg/μL，将5μg质粒放入1.5mL的管中，加入50μL如上制备的60mg/mL金属粒子，通过吹吸进行混合。在开盖状态下涡旋振荡，确认充分混合后加入2.5M CaCl2 50μL，进而迅速加入0.1M亚精胺10μL，盖上盖子涡旋振荡3分钟，静置1分钟。之后，以5000rpm进行离心，去除上清。以不扰乱金粒子的沉淀的方式缓慢地加入140μL的70％乙醇，立即吸出并丢弃。同样地用100％乙醇进行2次清洗，加入80μL的100％乙醇，剧烈弹动管，使金属微粒浮起，进行包覆。
粒子枪的轰击条件
在超净工作台内将载体膜置于纸巾上，将12μL包覆有质粒的金粒子的乙醇溶液置于载体膜的中央，使其风干。通过一次轰击，使用了0.45mg的金粒子和750ng的质粒DNA。干燥后，将载体膜和阻挡网设置于装置中。轰击的气压设定为900psi，使用900psi用的可裂膜。从阻挡网至作为标靶的棉未成熟种子的距离为6cm。
轰击用的棉未成熟种子的预处理
用手术刀沿纵向将包含未成熟种子的长度约10mm的棉子房器官切断，以切断面朝上的方式固定在粘土上。在切断面中可看到5～8个约2mm的未成熟种子的状态下，未成熟种子表面的纤维细胞的长度为0.5mm以下。将固定的样品设置于主体装置的载台上，进行轰击。
棉未成熟种子中的Atpap1的瞬时表达的结果
轰击处理后，将未成熟种子置于用灭菌水充分润湿的Kimwipe擦拭纸上，直接放入塑料培养皿中，放置于25℃的弱光条件下。处理后，每隔1天观察未成熟种子的状态。
在将未包覆质粒的金粒子导入未成熟种子的情况下，即使经过3天以上也保持白色(图8A)。在导入了pRI-35Sp-Atpap1的情况下，每个未成熟种子在1处～最多4处的纤维细胞中观察到变红(图8B)。在导入了pRI-GhRDL1p-Atpap1/GhEXPAp-Atpap1的情况下，每个未成熟种子在1处～最多6处的纤维细胞中观察到变红(图8C)。在导入了pRI-GhRDL1p-Atpap1/GhEXPAp-Atpap1/35Sp-GhHOX3的情况下，每个未成熟种子在1处～最多6处的纤维细胞中观察到变红，并且观察到红色程度最深(图8D)。结果，与由通常利用的构成性启动子35Sp所调控的Atpap1相比，在由棉种子表面特异性的启动子GhRDL1p与GhEXPAp、以及转录因子GhHOX3所调控的Atpap1中，观察到变红的频率和深浅度的增加。
烟草转化体中的基因表达
使包含质粒pRI-GhRDL1p-Atpap1/GhEXPAp-Atpap1/35Sp-GhHOX3或pRI-GhRDL1p-Atpap1/GhEXPAp-Atpap1的农杆菌感染烟草，通过常规方法得到转化体。
其结果，在使用pRI-GhRDL1p-Atpap1/GhEXPAp-Atpap1/35Sp-GhHOX3得到的转化体中，仅叶的毛状体细胞着色成红色(图9)。叶的表面细胞保持绿色，特别是幼叶的毛状体细胞更显著地变红(图10、上侧)。
使用了质粒pRI-GhRDL1p-Atpap1/GhEXPAp-Atpap1和pRI-GhRDL1p-Atpap1/GhEXPAp-Atpap1/35Sp-GhHOX3的转化烟草均发生了花瓣的着色(图11的中央、右侧。左侧为对照)。
工业实用性
本发明能够用于纤维工业、纤维产品工业等中。
序列表
<110> 国立大学法人东京农工大学(Tokyo University of Agriculture andTechnology)
<120> 棉着色(Cotton coloring)
<130> 2018-089
<150> JP2017-149274
<151> 2017-08-01
<160> 17
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 13772
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 质粒pRI-GhRDL1p-Atpap1/35Sp-GhHOX3(plasmid pRI-GhRDL1p-Atpap1/35Sp-GhHOX3)
<400> 1
gttgccatgt tttacggcag tgagagcaga gatagcgctg atgtccggcg gtgcttttgc 60
cgttacgcac caccccgtca gtagctgaac aggagggaca gctgatagaa acagaagcca 120
ctggagcacc tcaaaaacac catcatacac taaatcagta agttggcagc atcacccata 180
attgtggttt caaaatcggc tccgtcgata ctatgttata cgccaacttt gaaaacaact 240
ttgaaaaagc tgttttctgg tatttaaggt tttagaatgc aaggaacagt gaattggagt 300
tcgtcttgtt ataattagct tcttggggta tctttaaata ctgtagaaaa gaggaaggaa 360
ataataaatg gctaaaatga gaatatcacc ggaattgaaa aaactgatcg aaaaataccg 420
ctgcgtaaaa gatacggaag gaatgtctcc tgctaaggta tataagctgg tgggagaaaa 480
tgaaaaccta tatttaaaaa tgacggacag ccggtataaa gggaccacct atgatgtgga 540
acgggaaaag gacatgatgc tatggctgga aggaaagctg cctgttccaa aggtcctgca 600
ctttgaacgg catgatggct ggagcaatct gctcatgagt gaggccgatg gcgtcctttg 660
ctcggaagag tatgaagatg aacaaagccc tgaaaagatt atcgagctgt atgcggagtg 720
catcaggctc tttcactcca tcgacatatc ggattgtccc tatacgaata gcttagacag 780
ccgcttagcc gaattggatt acttactgaa taacgatctg gccgatgtgg attgcgaaaa 840
ctgggaagaa gacactccat ttaaagatcc gcgcgagctg tatgattttt taaagacgga 900
aaagcccgaa gaggaacttg tcttttccca cggcgacctg ggagacagca acatctttgt 960
gaaagatggc aaagtaagtg gctttattga tcttgggaga agcggcaggg cggacaagtg 1020
gtatgacatt gccttctgcg tccggtcgat cagggaggat atcggggaag aacagtatgt 1080
cgagctattt tttgacttac tggggatcaa gcctgattgg gagaaaataa aatattatat 1140
tttactggat gaattgtttt agtcacatac aaatggacga acggataaac cttttcacgc 1200
ccttttaaat atccgattat tctaataaac gctcttttct cttaggttta cccgccaata 1260
tatcctgtca aacactgata gtttaaactg aaggcgggaa acgacaatct gatcctggcg 1320
aaagggggat gtgctgcaag gcgattaagt tgggtaacgc cagggttttc ccagtcacga 1380
cgttgtaaaa cgacggccag tgccaagctt gcatgcctgc aggaattagt tatgtttggt 1440
aaatgaattt gaatacatgc accaccactc tcaatgctca cccacctaag cccatgacat 1500
aaactgcatt taagtgaacc agtggcagtt ggagccatta tgttggttga aaaatattgt 1560
tggcagtgtt attcagcagt acttgttcta aggctcctac tacatttctc attataaatg 1620
tggagaaatc ttgttctact ttccattcca tgcaacacta acttttagat tccctttcca 1680
ttgcactgct ctttctttct atagaattag tcactcctgt tctagtctag actatctttg 1740
ttccatggag ggttcgtcca aagggctgcg aaaaggtgct tggactactg aagaagatag 1800
tctcttgaga cagtgcatta ataagtatgg agaaggcaaa tggcaccaag ttcctgtaag 1860
agctgggcta aaccggtgca ggaaaagttg tagattaaga tggttgaact atttgaagcc 1920
aagtatcaag agaggaaaac ttagctctga tgaagtcgat cttcttcttc gccttcatag 1980
gcttctaggg aataggtggt ctttaattgc tggaagatta cctggtcgga ccgcaaatga 2040
cgtcaagaat tactggaaca ctcatctgag taagaaacat gaaccgtgtt gtaagataaa 2100
gatgaaaaag agagacatta cgcccattcc tacaacaccg gcactaaaaa acaatgttta 2160
taagcctcga cctcgatcct tcacagttaa caacgactgc aaccatctca atgccccacc 2220
aaaagttgac gttaatcctc catgccttgg acttaacatc aataatgttt gtgacaatag 2280
tatcatatac aacaaagata agaagaaaga ccaactagtg aataatttga ttgatggaga 2340
taatatgtgg ttagagaaat tcctagagga aagccaagag gtagatattt tggttcctga 2400
agcgacgaca acagaaaagg gggacacctt ggcttttgac gttgatcaac tttggagtct 2460
tttcgatgga gagactgtga aatttgatta gtgtttcgaa catttgtttg cgtttgtgga 2520
gctcttatga agatgaagat gaaatatttg gtgtgtcaaa taaaaagcta gcttgtgtgc 2580
ttaagtttgt gtttttttct tggcttgttg tgttatgaat ttgtggcttt ttctaatatt 2640
aaatgaatgt aagatctcat tataatgaat aaacaaatgt ttctataatc cattgtgaat 2700
gttttgttgg atctcttcgc atataactac tgtatgtgct atggtatgga ctatggaata 2760
tgattaaaga taaggaattg aattcaagct tgcatgcctg caggtcccca gattagcctt 2820
ttcaatttca gaaagaatgc taacccacag atggttagag aggcttacgc agcaggtctc 2880
atcaagacga tctacccgag caataatctc caggaaatca aataccttcc caagaaggtt 2940
aaagatgcag tcaaaagatt caggactaac tgcatcaaga acacagagaa agatatattt 3000
ctcaagatca gaagtactat tccagtatgg acgattcaag gcttgcttca caaaccaagg 3060
caagtaatag agattggagt ctctaaaaag gtagttccca ctgaatcaaa ggccatggag 3120
tcaaagattc aaatagagga cctaacagaa ctcgccgtaa agactggcga acagttcata 3180
cagagtctct tacgactcaa tgacaagaag aaaatcttcg tcaacatggt ggagcacgac 3240
acacttgtct actccaaaaa tatcaaagat acagtctcag aagaccaaag ggcaattgag 3300
acttttcaac aaagggtaat atccggaaac ctcctcggat tccattgccc agctatctgt 3360
cactttattg tgaagatagt ggaaaaggaa ggtggctcct acaaatgcca tcattgcgat 3420
aaaggaaagg ccatcgttga agatgcctct gccgacagtg gtcccaaaga tggaccccca 3480
cccacgagga gcatcgtgga aaaagaagac gttccaacca cgtcttcaaa gcaagtggat 3540
tgatgtgata tctccactga cgtaagggat gacgcacaat cccactatcc ttcgcaagac 3600
ccttcctcta tataaggaag ttcatttcat ttggagagaa cacgggggac tctagaatgg 3660
attgcggaag cggcggcggc ggcttaggag cgagtggttc cggcggagac catgattcct 3720
ccgacctttc acgacggaaa aagccttacc atcgtcacac agctcaccag attcagaggc 3780
ttgaatcgat gttcaaggaa tgtccacacc cagacgagaa acaaaggtta cagctaagta 3840
gggaattggg attagcacca agacagatca agttttggtt tcaaaatagg aggacacaaa 3900
tgaaggcaca acatgaaaga gccgataact ctgcacttcg tgctgagaac gataagatcc 3960
gatgtgaaaa catagccata agagaagcac ttaagaatgt gatttgtcct tcttgtggtg 4020
gtcctcctgc taatgaggat tcttattttg atgaccagaa aatgagaatg gagaatgctc 4080
aattaaagga agagcttgat agagtatcca gcattgcagc caagtacata gggagaccaa 4140
tatcccaact cccaccagta caacctgttc atatctcttc attagatttc aggatggcga 4200
gttttgacgg ctatggtgtc ggcgctggtc cttcactcga tctcgatctc ctccccggaa 4260
gttcgtcatc aatgccgaat ttaccgttcc aaccggtcgt tatttcagac attgacaagt 4320
ccctcatgtc tgatatagcc gcaaatgcaa tggaagaact gcttaggcta ttacaaacca 4380
atgaaccatt gtggattaaa tccactaatg atggcaaaga tgctcttaat ctcgaaagtt 4440
atgaaagaat cttccctaag cctaataata ctcattttaa atctcctaat attagggtcg 4500
aagcttctcg agattccggt gttgttatta tgaatggctt agctttggtt gacatgttca 4560
tggattccaa caaatggttg gagctatttc ccaccattgt gtcaattgcc aaaacaatcg 4620
aagtgatttc acctgggatg ttgggtacac atagtggttc tttgcaattg atgtatgaag 4680
aactacaggt cttgtctcca ttagtaccaa cacgtgaatt ttatacactt cgatattgtc 4740
aacaaattga acaagggtta tgggctattg tcaatgtttc atatgatttg ccacaatttg 4800
cttctcaatg tcgatctcat agactccctt ctggttgttt gattcaagac atgcctaatg 4860
gttactccaa ggttacttgg ttagaacatg tggagattga agacaaaact ccgattcatc 4920
gattgtatcg agaccttgtt catagtggtt cagcatttgg agccgaacgg tggctcacga 4980
cccttcaaag gatgtgcgaa cggtttgctt gcttaatggt atcaagcact tcgactcggg 5040
atctcggtgg agtgattcca tctcccgatg gcaggagaag catgatgaag ctagctcaaa 5100
ggatggtaaa caatttctgc acgagcgtcg gcacgtcgaa tagtcatcgg tcgacaacac 5160
tttccggttc gaatgaaatt ggtgttcggg tcaccgttca taagagttct gatcccggac 5220
aacccaacgg tatagttctt agtgcagcta ctacattttg gctccctgtt agtccacaaa 5280
atgtcttcaa tttcttcaaa gatgaaagaa ctagaccaca gtgggatgtt ctatccaacg 5340
gcaacgcagt ccaagaagtt gctcatatcg caaacggatc acatcccggc aactgtatat 5400
ccgttttacg agcctttaat acaagtcaca acaacatgtt aatactacaa gagagttgca 5460
ttgacagttc tggttcactg gtggtatact gtccagttga tttaccagct attaatgtag 5520
caatgagcgg cgaagatcca tcttacattc cgttacttcc gtcaggtttt acgataacac 5580
ccgacggtca tctcgagcaa ggtgacggag catcgacgag ttctagtact gggcacggaa 5640
gatcgtccgg tggttcattg attacggtag cgtttcaaat actagtgagc agcttgccat 5700
cggcaaaatt aaacttggat tcggtcacaa ttgttaataa ccttattgct aatactgtac 5760
aacaaattaa ggctgctttg aattgtccta gttcttgaga gctcttatga agatgaagat 5820
gaaatatttg gtgtgtcaaa taaaaagcta gcttgtgtgc ttaagtttgt gtttttttct 5880
tggcttgttg tgttatgaat ttgtggcttt ttctaatatt aaatgaatgt aagatctcat 5940
tataatgaat aaacaaatgt ttctataatc cattgtgaat gttttgttgg atctcttcgc 6000
atataactac tgtatgtgct atggtatgga ctatggaata tgattaaaga taaggaattg 6060
aattcgtaat catggtcata gctgtttcct gtgtgaaatt gttatccgct cacaattcca 6120
cacaacatac gagccggaag cataaagtgt aaagcctggg gtgcctaatg agtgagctaa 6180
ctcacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc gctttccagt cgggaaacct gtcgtgccag 6240
gatcatgagc ggagaattaa gggagtcacg ttatgacccc cgccgatgac gcgggacaag 6300
ccgttttacg tttggaactg acagaaccgc aacgttgaag gagccactca gccgcgggtt 6360
tctggagttt aatgagctaa gcacatacgt cagaaaccat tattgcgcgt tcaaaagtcg 6420
cctaaggtca ctatcagcta gcaaatattt cttgtcaaaa atgctccact gacgttccat 6480
aaattcccct cggtatccaa ttagagtctc atattcactc tcaatccaaa taatctgcac 6540
cggatctgga tcgtttcgca tgattgaaca agatggattg cacgcaggtt ctccggccgc 6600
ttgggtggag aggctattcg gctatgactg ggcacaacag acaatcggct gctctgatgc 6660
cgccgtgttc cggctgtcag cgcaggggcg cccggttctt tttgtcaaga ccgacctgtc 6720
cggtgccctg aatgaactac aggacgaggc agcgcggcta tcgtggctgg ccacgacggg 6780
cgttccttgc gcagctgtgc tcgacgttgt cactgaagcg ggaagggact ggctgctatt 6840
gggcgaagtg ccggggcagg atctcctgtc atctcacctt gctcctgccg agaaagtatc 6900
catcatggct gatgcaatgc ggcggctgca tacgcttgat ccggctacct gcccattcga 6960
ccaccaagcg aaacatcgca tcgagcgagc acgtactcgg atggaagccg gtcttgtcga 7020
tcaggatgat ctggacgaag agcatcaggg gctcgcgcca gccgaactgt tcgccaggct 7080
caaggcgcgt atgcccgacg gcgatgatct cgtcgtgacc catggcgatg cctgcttgcc 7140
gaatatcatg gtggaaaatg gccgcttttc tggattcatc gactgtggcc ggctgggtgt 7200
ggcggaccgc tatcaggaca tagcgttggc tacccgtgat attgctgaag agcttggcgg 7260
cgaatgggct gaccgcttcc tcgtgcttta cggtatcgcc gctcccgatt cgcagcgcat 7320
cgccttctat cgccttcttg acgagttctt ctgagcggga ctctggggtt cgaaatgacc 7380
gaccaagcga cgcccaacct gccatcacga gatttcgatt ccaccgccgc cttctatgaa 7440
aggttgggct tcggaatcgt tttccgggac gccggctgga tgatcctcca gcgcggggat 7500
ctcatgctgg agttcttcgc ccacgggatc tctgcggaac aggcggtcga aggtgccgat 7560
atcattacga cagcaacggc cgacaagcac aacgccacga tcctgagcga caatatgatc 7620
gggccccgat cgttcaaaca tttggcaata aagtttctta agattgaatc ctgttgccgg 7680
tcttgcgatg attatcatat aatttctgtt gaattacgtt aagcatgtaa taattaacat 7740
gtaatgcatg acgttattta tgagatgggt ttttatgatt agagtcccgc aattatacat 7800
ttaatacgcg atagaaaaca aaatatagcg cgcaaactag gataaattat cgcgcgcggt 7860
gtcatctatg ttactagatc gggaatttgg gccatcgccc tgatagacgg tttttcgccc 7920
tttgacgttg gagtccacgt tctttaatag tggactcttg ttccaaactg gaacaacact 7980
caaccctatc tcgggctatt cttttgattt ataagggatt ttgccgattt cggaaccacc 8040
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accccagtac attaaaaacg tccgcaatgt gttattaagt tgtctaagcg tcaatttgtt 8220
tacaccacaa tatatcctgc cacaagctag ctttctgagc cgccgatttt cctcctcgag 8280
ttggatgaac tcgccgagtt catcgtcaac tgaaacagac acggccggat tctgtgagac 8340
aggttgaacc gcagctctct tccattgata ataggtctga acggaaatac ccacgatctt 8400
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cagtttttct cggttgctga ggccgcgggt tttcggcttc acggatttga acgatcccgt 8520
gcgggctgtt tcggctggtg ctttctttgc tcttctacct ctaggagcag ccggctcaac 8580
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gcagtaaata ggcagtgctc cgcgactaca tgcctcggcc ggcaaaatac cgccgcatgt 8760
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gttatcgctc ccatcagagc acgcttggta ctccgggaat cggatggtct gtcgatcatc 8880
caaaaaacgc tcatgttttc aacctattag gtctgtggtc agctgaccac agaccatcct 8940
gctccatact cgctaattct agccaaaccg caacgtcccc tgcccgctag ccttcaagag 9000
cgccattatc atcgggccaa gtgaaaactt cccgagttcg ctccgccgtg tcagatctcg 9060
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tgccgcattc tccggtccca ttgcctcaca cgcgtcttgg taagccgacg ggctgacccc 9180
cagcatagac cgaaccacca ccgcagccga catgaggtca cgccagctag caaccgcacc 9240
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cgctccctct tccatagctg ccgtaattag cttccgaacg tcccgtcggc aaatcgtcag 9660
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tagctcttcg gaccgcgcga gaagcggaga caaatcgaag ccaaacgcgc gctcgatctg 9780
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ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag 13260
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aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg 13440
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ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta 13740
cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct ca 13772
<210> 2
<211> 15470
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> pRI-GhEXPAp-Atpap1/35Sp-GhHOX3
<400> 2
gttgccatgt tttacggcag tgagagcaga gatagcgctg atgtccggcg gtgcttttgc 60
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cgagctattt tttgacttac tggggatcaa gcctgattgg gagaaaataa aatattatat 1140
tttactggat gaattgtttt agtcacatac aaatggacga acggataaac cttttcacgc 1200
ccttttaaat atccgattat tctaataaac gctcttttct cttaggttta cccgccaata 1260
tatcctgtca aacactgata gtttaaactg aaggcgggaa acgacaatct gatcctggcg 1320
aaagggggat gtgctgcaag gcgattaagt tgggtaacgc cagggttttc ccagtcacga 1380
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taaataaata taatttatta tatttacaaa taaatatttg tatttattca tatgcaaatt 1680
tttttaaaaa tataaatatt aaaaaaatta tataatttca taaaagtgga aattaattat 1740
taaaaaatga aaattaaata agattaattc attttcctaa gaaatataaa aattctagga 1800
gctaacatat ttaataatat tatcatattt ctaaaattag ttaatatttt aaattatgga 1860
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gggatgttct atccaacggc aacgcagtcc aagaagttgc tcatatcgca aacggatcac 7080
atcccggcaa ctgtatatcc gttttacgag cctttaatac aagtcacaac aacatgttaa 7140
tactacaaga gagttgcatt gacagttctg gttcactggt ggtatactgt ccagttgatt 7200
taccagctat taatgtagca atgagcggcg aagatccatc ttacattccg ttacttccgt 7260
caggttttac gataacaccc gacggtcatc tcgagcaagg tgacggagca tcgacgagtt 7320
ctagtactgg gcacggaaga tcgtccggtg gttcattgat tacggtagcg tttcaaatac 7380
tagtgagcag cttgccatcg gcaaaattaa acttggattc ggtcacaatt gttaataacc 7440
ttattgctaa tactgtacaa caaattaagg ctgctttgaa ttgtcctagt tcttgagagc 7500
tcttatgaag atgaagatga aatatttggt gtgtcaaata aaaagctagc ttgtgtgctt 7560
aagtttgtgt ttttttcttg gcttgttgtg ttatgaattt gtggcttttt ctaatattaa 7620
atgaatgtaa gatctcatta taatgaataa acaaatgttt ctataatcca ttgtgaatgt 7680
tttgttggat ctcttcgcat ataactactg tatgtgctat ggtatggact atggaatatg 7740
attaaagata aggaattgaa ttcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt 7800
tatccgctca caattccaca caacatacga gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt 7860
gcctaatgag tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg 7920
ggaaacctgt cgtgccagga tcatgagcgg agaattaagg gagtcacgtt atgacccccg 7980
ccgatgacgc gggacaagcc gttttacgtt tggaactgac agaaccgcaa cgttgaagga 8040
gccactcagc cgcgggtttc tggagtttaa tgagctaagc acatacgtca gaaaccatta 8100
ttgcgcgttc aaaagtcgcc taaggtcact atcagctagc aaatatttct tgtcaaaaat 8160
gctccactga cgttccataa attcccctcg gtatccaatt agagtctcat attcactctc 8220
aatccaaata atctgcaccg gatctggatc gtttcgcatg attgaacaag atggattgca 8280
cgcaggttct ccggccgctt gggtggagag gctattcggc tatgactggg cacaacagac 8340
aatcggctgc tctgatgccg ccgtgttccg gctgtcagcg caggggcgcc cggttctttt 8400
tgtcaagacc gacctgtccg gtgccctgaa tgaactacag gacgaggcag cgcggctatc 8460
gtggctggcc acgacgggcg ttccttgcgc agctgtgctc gacgttgtca ctgaagcggg 8520
aagggactgg ctgctattgg gcgaagtgcc ggggcaggat ctcctgtcat ctcaccttgc 8580
tcctgccgag aaagtatcca tcatggctga tgcaatgcgg cggctgcata cgcttgatcc 8640
ggctacctgc ccattcgacc accaagcgaa acatcgcatc gagcgagcac gtactcggat 8700
ggaagccggt cttgtcgatc aggatgatct ggacgaagag catcaggggc tcgcgccagc 8760
cgaactgttc gccaggctca aggcgcgtat gcccgacggc gatgatctcg tcgtgaccca 8820
tggcgatgcc tgcttgccga atatcatggt ggaaaatggc cgcttttctg gattcatcga 8880
ctgtggccgg ctgggtgtgg cggaccgcta tcaggacata gcgttggcta cccgtgatat 8940
tgctgaagag cttggcggcg aatgggctga ccgcttcctc gtgctttacg gtatcgccgc 9000
tcccgattcg cagcgcatcg ccttctatcg ccttcttgac gagttcttct gagcgggact 9060
ctggggttcg aaatgaccga ccaagcgacg cccaacctgc catcacgaga tttcgattcc 9120
accgccgcct tctatgaaag gttgggcttc ggaatcgttt tccgggacgc cggctggatg 9180
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gcggtcgaag gtgccgatat cattacgaca gcaacggccg acaagcacaa cgccacgatc 9300
ctgagcgaca atatgatcgg gccccgatcg ttcaaacatt tggcaataaa gtttcttaag 9360
attgaatcct gttgccggtc ttgcgatgat tatcatataa tttctgttga attacgttaa 9420
gcatgtaata attaacatgt aatgcatgac gttatttatg agatgggttt ttatgattag 9480
agtcccgcaa ttatacattt aatacgcgat agaaaacaaa atatagcgcg caaactagga 9540
taaattatcg cgcgcggtgt catctatgtt actagatcgg gaatttgggc catcgccctg 9600
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ccaaactgga acaacactca accctatctc gggctattct tttgatttat aagggatttt 9720
gccgatttcg gaaccaccat caaacaggat tttcgcctgc tggggcaaac cagcgtggac 9780
cgcttgctgc aactctctca gggccaggcg gtgaagggca atcagctgtt gcccgtctca 9840
ctggtgaaaa gaaaaaccac cccagtacat taaaaacgtc cgcaatgtgt tattaagttg 9900
tctaagcgtc aatttgttta caccacaata tatcctgcca caagctagct ttctgagccg 9960
ccgattttcc tcctcgagtt ggatgaactc gccgagttca tcgtcaactg aaacagacac 10020
ggccggattc tgtgagacag gttgaaccgc agctctcttc cattgataat aggtctgaac 10080
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gatttgaccg atcttctcca gtttttctcg gttgctgagg ccgcgggttt tcggcttcac 10200
ggatttgaac gatcccgtgc gggctgtttc ggctggtgct ttctttgctc ttctacctct 10260
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ctgaccacag accatcctgc tccatactcg ctaattctag ccaaaccgca acgtcccctg 10680
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tacgcttgat acagcgctgg cacatgatcg agcacgaagg tcgcaaaatc gggcgtcgcc 12120
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ccgaaggcaa cctgatatcg gcccggctgg ctcggatgcg gtcgcacaag gattgggact 12720
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cggtggtttt aagcatcgga aaattgagga cattttcgcc aaaaatcgac cgcagataac 13260
ctaccatttg gttctgtggt ccgtcgctcg gttcgaaacg ggttatcaga tagcgcatcc 13320
aattaaactt gaacttggcg ccagcattct cgatttcacg caaaaggttc gatgtcattg 13380
ccagaaactg gttcatcgac atcacatcca gcatctgcgg atggaccgtg acaagaatgg 13440
acgtcgccgc agtcaatgcg gatagcgtga gatacccaag ctggggaggg cagtcgatga 13500
ccacgacgtc atagttatcc gcgatatctt caattacttg gctgatgcga ccataaaaga 13560
gcgtgtcgcc ctctttgcgg ttcatcagcg cgcgtggcgt atcgtgttca aactccatca 13620
gctcaaggtt accaggaatc aggtggaggt cgggaatgta agtccctcgg acgactcgtt 13680
cgattgccac ctgctcatca tcatacctta tagcgccgta gagcgtttcg ttcgggccaa 13740
cgtccgtctc cggttggctc ccaaagagtg cagaaaggct cgcttgagga tcgagatcaa 13800
tggccaagac tcgatatccg cgcatagcga ggtactgcgc cagatgcgcg gcggtggtgg 13860
tcttacccga cccacctttg aaattcatca cagagataac ctgaagctgc tcgccgcctc 13920
gacgatgtgg caggtagcgc cggttcccgc ggccgacctg atccatatac ttccgaatca 13980
catggatatc ttcaattgag aacattcgcc tgccacctgg gctcatgcta acattcaact 14040
ctggcatctc agacgcggtc tgccgtaaat atgactcgcc aacgccgagc agcttggacg 14100
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gatgtgcttg aagttggctc gagagggcat cggcatgacg ctccatcaag gccgtcaacc 14220
ctacaactac aggcgctgct tttaggacag acttcgccat ctcaaaccca ttccttgcca 14280
gtggcgatat ttttcgcgaa actggaaaag ttccgccgct ggcaattagc gccgattctg 14340
ctgtttgggc aagagctttt aggttaacag aaggttaacg ccctcaggtc gaaaaactcc 14400
acccaactgt tatttgtatt tatttccaat gccttagaga gattgccatt tgaatatgtt 14460
catgtattgt tttagtgata atcctacaat cgtaacccaa aaagaggtcg ccctctgcgc 14520
gccgtcgtcc aatataggcg aagtcaccct tgcgactcag gcggattcta ccttgtagga 14580
tcgagtcagg caactatgga tgaacgaaat agacagatcg ctgagatagg tgcctcactg 14640
attaagcatt ggtaactgtc agaccaagtt tactcatata tactttagat tgatttaaaa 14700
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ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact 14940
ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gttcttctag tgtagccgta gttaggccac 15000
cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg 15060
gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg 15120
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acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc 15240
gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg 15300
agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc 15360
tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc 15420
agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca 15470
<210> 3
<211> 16845
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 质粒pRI-GhRDL1p-Atpap1/GhEXPAp-Atpap1/35Sp-GhHOX3(plasmid pRI-GhRDL1p-Atpap1/GhEXPAp-Atpap1/35Sp-GhHOX3)
<400> 3
gttgccatgt tttacggcag tgagagcaga gatagcgctg atgtccggcg gtgcttttgc 60
cgttacgcac caccccgtca gtagctgaac aggagggaca gctgatagaa acagaagcca 120
ctggagcacc tcaaaaacac catcatacac taaatcagta agttggcagc atcacccata 180
attgtggttt caaaatcggc tccgtcgata ctatgttata cgccaacttt gaaaacaact 240
ttgaaaaagc tgttttctgg tatttaaggt tttagaatgc aaggaacagt gaattggagt 300
tcgtcttgtt ataattagct tcttggggta tctttaaata ctgtagaaaa gaggaaggaa 360
ataataaatg gctaaaatga gaatatcacc ggaattgaaa aaactgatcg aaaaataccg 420
ctgcgtaaaa gatacggaag gaatgtctcc tgctaaggta tataagctgg tgggagaaaa 480
tgaaaaccta tatttaaaaa tgacggacag ccggtataaa gggaccacct atgatgtgga 540
acgggaaaag gacatgatgc tatggctgga aggaaagctg cctgttccaa aggtcctgca 600
ctttgaacgg catgatggct ggagcaatct gctcatgagt gaggccgatg gcgtcctttg 660
ctcggaagag tatgaagatg aacaaagccc tgaaaagatt atcgagctgt atgcggagtg 720
catcaggctc tttcactcca tcgacatatc ggattgtccc tatacgaata gcttagacag 780
ccgcttagcc gaattggatt acttactgaa taacgatctg gccgatgtgg attgcgaaaa 840
ctgggaagaa gacactccat ttaaagatcc gcgcgagctg tatgattttt taaagacgga 900
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gaaagatggc aaagtaagtg gctttattga tcttgggaga agcggcaggg cggacaagtg 1020
gtatgacatt gccttctgcg tccggtcgat cagggaggat atcggggaag aacagtatgt 1080
cgagctattt tttgacttac tggggatcaa gcctgattgg gagaaaataa aatattatat 1140
tttactggat gaattgtttt agtcacatac aaatggacga acggataaac cttttcacgc 1200
ccttttaaat atccgattat tctaataaac gctcttttct cttaggttta cccgccaata 1260
tatcctgtca aacactgata gtttaaactg aaggcgggaa acgacaatct gatcctggcg 1320
aaagggggat gtgctgcaag gcgattaagt tgggtaacgc cagggttttc ccagtcacga 1380
cgttgtaaaa cgacggccag tgccaagctt gcatgcctgc aggaattagt tatgtttggt 1440
aaatgaattt gaatacatgc accaccactc tcaatgctca cccacctaag cccatgacat 1500
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ttgcactgct ctttctttct atagaattag tcactcctgt tctagtctag actatctttg 1740
ttccatggag ggttcgtcca aagggctgcg aaaaggtgct tggactactg aagaagatag 1800
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cgtcaagaat tactggaaca ctcatctgag taagaaacat gaaccgtgtt gtaagataaa 2100
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tatataaaat ataaaattta gacactataa tattaaaata attcagacaa ctattatcat 2940
ttttaataag ttttctaaaa taatgtatgc gaaaaacact tactttatta atacttaaat 3000
aaatataatt tattatattt acaaataaat atttgtattt attcatatgc aaattttttt 3060
aaaaatataa atattaaaaa aattatataa tttcataaaa gtggaaatta attattaaaa 3120
aatgaaaatt aaataagatt aattcatttt cctaagaaat ataaaaattc taggagctaa 3180
catatttaat aatattatca tatttctaaa attagttaat attttaaatt atggagacta 3240
aataagaaaa ttaaaaaagt gaaagcgctt tataaaataa agtaaaaata ttgaggggtt 3300
tatgttacaa ataacccaat cgcgtttccc atagagaaaa ggaattttct ttcttttatt 3360
ttcatgtcat tttttcatac aatttctttg gtcacttaaa ttctcaataa aattagaaaa 3420
cagccctcaa aaataatatt gatacgttga aagatttatc aactttcgac catcgacact 3480
ttaaaaaaat tagaaagtta taattttttt ttcaaaaaaa ctataatacc tctctagttt 3540
tagctaatta aattattatt attttattat tttattgtta ttaaaagtgt aacttgcact 3600
caactattag taagtttacg ttttgatcac ttaatttcag aaagttaaaa aatggtcttt 3660
gaactattcg aaaattttca tttaagttac tggaatattt aaaagttttt atttaagtca 3720
ccgggctatt aagttttttt ttaaaaattc gattagcaag ttccaagcta cgattcgata 3780
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ttacggtcag tgttgaaaat cgaaaaaaaa tatttggatt ttgattcata aatttatgac 3900
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tcttcacctt cagtccttcc ctgatcggcg cttgtgaaaa acgaaaaacc tgagtctgat 4260
tggctgactg aaaatgaacc tactcatcac cattcactat taccaacttc aaatgatagg 4320
ggaattaact ggtaaagtgt aactccaccg atggttgagg tggttggctg gagttaaatg 4380
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tgattgatgg agataatatg tggttagaga aattcctaga ggaaagccaa gaggtagata 5460
ttttggttcc tgaagcgacg acaacagaaa agggggacac cttggctttt gacgttgatc 5520
aactttggag tcttttcgat ggagagactg tgaaatttga ttagtgtttc gaacatttgt 5580
ttgcgtttgt ggagctctta tgaagatgaa gatgaaatat ttggtgtgtc aaataaaaag 5640
ctagcttgtg tgcttaagtt tgtgtttttt tcttggcttg ttgtgttatg aatttgtggc 5700
tttttctaat attaaatgaa tgtaagatct cattataatg aataaacaaa tgtttctata 5760
atccattgtg aatgttttgt tggatctctt cgcatataac tactgtatgt gctatggtat 5820
ggactatgga atatgattaa agataaggaa ttgaattcaa gcttgcatgc ctgcaggtcc 5880
ccagattagc cttttcaatt tcagaaagaa tgctaaccca cagatggtta gagaggctta 5940
cgcagcaggt ctcatcaaga cgatctaccc gagcaataat ctccaggaaa tcaaatacct 6000
tcccaagaag gttaaagatg cagtcaaaag attcaggact aactgcatca agaacacaga 6060
gaaagatata tttctcaaga tcagaagtac tattccagta tggacgattc aaggcttgct 6120
tcacaaacca aggcaagtaa tagagattgg agtctctaaa aaggtagttc ccactgaatc 6180
aaaggccatg gagtcaaaga ttcaaataga ggacctaaca gaactcgccg taaagactgg 6240
cgaacagttc atacagagtc tcttacgact caatgacaag aagaaaatct tcgtcaacat 6300
ggtggagcac gacacacttg tctactccaa aaatatcaaa gatacagtct cagaagacca 6360
aagggcaatt gagacttttc aacaaagggt aatatccgga aacctcctcg gattccattg 6420
cccagctatc tgtcacttta ttgtgaagat agtggaaaag gaaggtggct cctacaaatg 6480
ccatcattgc gataaaggaa aggccatcgt tgaagatgcc tctgccgaca gtggtcccaa 6540
agatggaccc ccacccacga ggagcatcgt ggaaaaagaa gacgttccaa ccacgtcttc 6600
aaagcaagtg gattgatgtg atatctccac tgacgtaagg gatgacgcac aatcccacta 6660
tccttcgcaa gacccttcct ctatataagg aagttcattt catttggaga gaacacgggg 6720
gactctagaa tggattgcgg aagcggcggc ggcggcttag gagcgagtgg ttccggcgga 6780
gaccatgatt cctccgacct ttcacgacgg aaaaagcctt accatcgtca cacagctcac 6840
cagattcaga ggcttgaatc gatgttcaag gaatgtccac acccagacga gaaacaaagg 6900
ttacagctaa gtagggaatt gggattagca ccaagacaga tcaagttttg gtttcaaaat 6960
aggaggacac aaatgaaggc acaacatgaa agagccgata actctgcact tcgtgctgag 7020
aacgataaga tccgatgtga aaacatagcc ataagagaag cacttaagaa tgtgatttgt 7080
ccttcttgtg gtggtcctcc tgctaatgag gattcttatt ttgatgacca gaaaatgaga 7140
atggagaatg ctcaattaaa ggaagagctt gatagagtat ccagcattgc agccaagtac 7200
atagggagac caatatccca actcccacca gtacaacctg ttcatatctc ttcattagat 7260
ttcaggatgg cgagttttga cggctatggt gtcggcgctg gtccttcact cgatctcgat 7320
ctcctccccg gaagttcgtc atcaatgccg aatttaccgt tccaaccggt cgttatttca 7380
gacattgaca agtccctcat gtctgatata gccgcaaatg caatggaaga actgcttagg 7440
ctattacaaa ccaatgaacc attgtggatt aaatccacta atgatggcaa agatgctctt 7500
aatctcgaaa gttatgaaag aatcttccct aagcctaata atactcattt taaatctcct 7560
aatattaggg tcgaagcttc tcgagattcc ggtgttgtta ttatgaatgg cttagctttg 7620
gttgacatgt tcatggattc caacaaatgg ttggagctat ttcccaccat tgtgtcaatt 7680
gccaaaacaa tcgaagtgat ttcacctggg atgttgggta cacatagtgg ttctttgcaa 7740
ttgatgtatg aagaactaca ggtcttgtct ccattagtac caacacgtga attttataca 7800
cttcgatatt gtcaacaaat tgaacaaggg ttatgggcta ttgtcaatgt ttcatatgat 7860
ttgccacaat ttgcttctca atgtcgatct catagactcc cttctggttg tttgattcaa 7920
gacatgccta atggttactc caaggttact tggttagaac atgtggagat tgaagacaaa 7980
actccgattc atcgattgta tcgagacctt gttcatagtg gttcagcatt tggagccgaa 8040
cggtggctca cgacccttca aaggatgtgc gaacggtttg cttgcttaat ggtatcaagc 8100
acttcgactc gggatctcgg tggagtgatt ccatctcccg atggcaggag aagcatgatg 8160
aagctagctc aaaggatggt aaacaatttc tgcacgagcg tcggcacgtc gaatagtcat 8220
cggtcgacaa cactttccgg ttcgaatgaa attggtgttc gggtcaccgt tcataagagt 8280
tctgatcccg gacaacccaa cggtatagtt cttagtgcag ctactacatt ttggctccct 8340
gttagtccac aaaatgtctt caatttcttc aaagatgaaa gaactagacc acagtgggat 8400
gttctatcca acggcaacgc agtccaagaa gttgctcata tcgcaaacgg atcacatccc 8460
ggcaactgta tatccgtttt acgagccttt aatacaagtc acaacaacat gttaatacta 8520
caagagagtt gcattgacag ttctggttca ctggtggtat actgtccagt tgatttacca 8580
gctattaatg tagcaatgag cggcgaagat ccatcttaca ttccgttact tccgtcaggt 8640
tttacgataa cacccgacgg tcatctcgag caaggtgacg gagcatcgac gagttctagt 8700
actgggcacg gaagatcgtc cggtggttca ttgattacgg tagcgtttca aatactagtg 8760
agcagcttgc catcggcaaa attaaacttg gattcggtca caattgttaa taaccttatt 8820
gctaatactg tacaacaaat taaggctgct ttgaattgtc ctagttcttg agagctctta 8880
tgaagatgaa gatgaaatat ttggtgtgtc aaataaaaag ctagcttgtg tgcttaagtt 8940
tgtgtttttt tcttggcttg ttgtgttatg aatttgtggc tttttctaat attaaatgaa 9000
tgtaagatct cattataatg aataaacaaa tgtttctata atccattgtg aatgttttgt 9060
tggatctctt cgcatataac tactgtatgt gctatggtat ggactatgga atatgattaa 9120
agataaggaa ttgaattcgt aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc 9180
gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta 9240
atgagtgagc taactcacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 9300
cctgtcgtgc caggatcatg agcggagaat taagggagtc acgttatgac ccccgccgat 9360
gacgcgggac aagccgtttt acgtttggaa ctgacagaac cgcaacgttg aaggagccac 9420
tcagccgcgg gtttctggag tttaatgagc taagcacata cgtcagaaac cattattgcg 9480
cgttcaaaag tcgcctaagg tcactatcag ctagcaaata tttcttgtca aaaatgctcc 9540
actgacgttc cataaattcc cctcggtatc caattagagt ctcatattca ctctcaatcc 9600
aaataatctg caccggatct ggatcgtttc gcatgattga acaagatgga ttgcacgcag 9660
gttctccggc cgcttgggtg gagaggctat tcggctatga ctgggcacaa cagacaatcg 9720
gctgctctga tgccgccgtg ttccggctgt cagcgcaggg gcgcccggtt ctttttgtca 9780
agaccgacct gtccggtgcc ctgaatgaac tacaggacga ggcagcgcgg ctatcgtggc 9840
tggccacgac gggcgttcct tgcgcagctg tgctcgacgt tgtcactgaa gcgggaaggg 9900
actggctgct attgggcgaa gtgccggggc aggatctcct gtcatctcac cttgctcctg 9960
ccgagaaagt atccatcatg gctgatgcaa tgcggcggct gcatacgctt gatccggcta 10020
cctgcccatt cgaccaccaa gcgaaacatc gcatcgagcg agcacgtact cggatggaag 10080
ccggtcttgt cgatcaggat gatctggacg aagagcatca ggggctcgcg ccagccgaac 10140
tgttcgccag gctcaaggcg cgtatgcccg acggcgatga tctcgtcgtg acccatggcg 10200
atgcctgctt gccgaatatc atggtggaaa atggccgctt ttctggattc atcgactgtg 10260
gccggctggg tgtggcggac cgctatcagg acatagcgtt ggctacccgt gatattgctg 10320
aagagcttgg cggcgaatgg gctgaccgct tcctcgtgct ttacggtatc gccgctcccg 10380
attcgcagcg catcgccttc tatcgccttc ttgacgagtt cttctgagcg ggactctggg 10440
gttcgaaatg accgaccaag cgacgcccaa cctgccatca cgagatttcg attccaccgc 10500
cgccttctat gaaaggttgg gcttcggaat cgttttccgg gacgccggct ggatgatcct 10560
ccagcgcggg gatctcatgc tggagttctt cgcccacggg atctctgcgg aacaggcggt 10620
cgaaggtgcc gatatcatta cgacagcaac ggccgacaag cacaacgcca cgatcctgag 10680
cgacaatatg atcgggcccc gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc ttaagattga 10740
atcctgttgc cggtcttgcg atgattatca tataatttct gttgaattac gttaagcatg 10800
taataattaa catgtaatgc atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc 10860
cgcaattata catttaatac gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat 10920
tatcgcgcgc ggtgtcatct atgttactag atcgggaatt tgggccatcg ccctgataga 10980
cggtttttcg ccctttgacg ttggagtcca cgttctttaa tagtggactc ttgttccaaa 11040
ctggaacaac actcaaccct atctcgggct attcttttga tttataaggg attttgccga 11100
tttcggaacc accatcaaac aggattttcg cctgctgggg caaaccagcg tggaccgctt 11160
gctgcaactc tctcagggcc aggcggtgaa gggcaatcag ctgttgcccg tctcactggt 11220
gaaaagaaaa accaccccag tacattaaaa acgtccgcaa tgtgttatta agttgtctaa 11280
gcgtcaattt gtttacacca caatatatcc tgccacaagc tagctttctg agccgccgat 11340
tttcctcctc gagttggatg aactcgccga gttcatcgtc aactgaaaca gacacggccg 11400
gattctgtga gacaggttga accgcagctc tcttccattg ataataggtc tgaacggaaa 11460
tacccacgat cttaacggcg tccttcaagg ttgcgccgcc agcgacctga gcttcgattt 11520
gaccgatctt ctccagtttt tctcggttgc tgaggccgcg ggttttcggc ttcacggatt 11580
tgaacgatcc cgtgcgggct gtttcggctg gtgctttctt tgctcttcta cctctaggag 11640
cagccggctc aacttcggca gcagcagtac cgtccggcgg attctggatc tcttcgtcag 11700
ccattaatcg tcctctgtgt gggttattgc tttgtctgcc agctcgatcc aagagtcaac 11760
gtttgtgcct agggcagtaa ataggcagtg ctccgcgact acatgcctcg gccggcaaaa 11820
taccgccgca tgtagagcag gctctccttc acgatcaacg atcggcatgg ggccttcgtg 11880
cttgttgagt aatgttatcg ctcccatcag agcacgcttg gtactccggg aatcggatgg 11940
tctgtcgatc atccaaaaaa cgctcatgtt ttcaacctat taggtctgtg gtcagctgac 12000
cacagaccat cctgctccat actcgctaat tctagccaaa ccgcaacgtc ccctgcccgc 12060
tagccttcaa gagcgccatt atcatcgggc caagtgaaaa cttcccgagt tcgctccgcc 12120
gtgtcagatc tcggagatag cccccaggcg aattgatgaa gttcgctcgc tccaaaatgc 12180
acgccatcgc tgctgccgca ttctccggtc ccattgcctc acacgcgtct tggtaagccg 12240
acgggctgac ccccagcata gaccgaacca ccaccgcagc cgacatgagg tcacgccagc 12300
tagcaaccgc accgctcggc ccataattgc caatggtcgg gcacgctttc aggatcatcc 12360
cgagggggaa cgcttttatc ggctcgctcc ttgcccggtc tatttcactc ggcttagcgc 12420
cctgctcctt ttcagagcga ggttcaagtt cattaacgga ttcgggtttt gagttctgta 12480
tgtgctgctc gctctgggca gcattggtgc tattattttc tgaattgtct ctaatttcca 12540
accggttgat tatctcttcc tggagcatcc acatctcttc gagaattgac tctacatcag 12600
caagcgtcgg ggcgcgtggg attctaccca caagttccac atagacttcc tcgacagctt 12660
gccagtcgcc ctccgctccc tcttccatag ctgccgtaat tagcttccga acgtcccgtc 12720
ggcaaatcgt cagactttct ttggccatcc tgaatgctgc tcgatcggcc atcacctgct 12780
gtgccatcat cgctagctct tcggaccgcg cgagaagcgg agacaaatcg aagccaaacg 12840
cgcgctcgat ctgaccagcg ccatccttac gagcgtaacg ctttccgttg gcgctatcct 12900
tccggacgat caagcctgac tccacgagca tggcgatgtg cctacgcaaa gtcgcgccag 12960
ccatcccatg cgcccgaagg gcaagctgag cattcgacgg gaagacgatc agctgtgcct 13020
cctgacgcaa ctccgtttcc gggtgaaagc tcaatagcgc atcaaggacg gcaagactgt 13080
tggactggat tccaagtagt tccatggccg cggacgcgtc cctaaagacc ttccacttgt 13140
ccgctgtctt gccttgtttg atatcggcca gcgccgtctg gcgccgcaca agcgcaagcg 13200
tcattggccg ccgcccgaat ggcgtcgtta cacttcctgt ctgcatcatc tttcaccttt 13260
cagcaggcaa aggaaatcag ctcaccaaaa cggcgctaaa aactcttgac gaggattcga 13320
ggaaatgcga ttctgttcgc gctagagaga cagaagggct tccgcgacgg cgacgttgag 13380
ggggctcttt tcttttgcgg tttactctcc ccgtttccgt tggttctcag cgtggtacgc 13440
ttgatacagc gctggcacat gatcgagcac gaaggtcgca aaatcgggcg tcgccttcct 13500
gtcaatcgtg atttccagtt tggccttgct ctgcgtcacc tgtgcaattc tggtgccgtc 13560
tggggtggcc atgacctcgg gaagtccacg cgcaacccga ctgggcttca gactagcgat 13620
caccgccttg aatcgttctg ccgatggcag cgcttgaact tcctccgaca tagcatattt 13680
agccacgtcg gccggtgaag aaactttctc aatcagctcg gcaagttgtt gccaactcgg 13740
ccgtccaaca ccaggagcgg caccaatagc atcggtcagt tcagagggga gggcgtcaac 13800
gagcagaagc atcttggaca aattgctctt gtcgatcgac atcgcggcga tgacaatctc 13860
tcgagaaaac tgcctgttca ggcgatgtgc gaagcgcgcc ttttcgatga aggtaagatc 13920
ttcgcgcaca ttgttttcct gaccctgtgc tacgaccact tgctcgtccg tcagttcgcg 13980
aacgaccgcc ctgaccggaa gtccgagttc tgaaacggcg cgtagccggc ggtggccgaa 14040
ggcaacctga tatcggcccg gctggctcgg atgcggtcgc acaaggattg ggacttgctg 14100
tccttgttcc cggatcgaag taaggagccc gtcaatgtcc cctcgcatac gatcctgcac 14160
gaaagacggt tctattgacg aggcatccaa ctctatcact gcctgacctt cagcgagacg 14220
ccgctcgatc tcttcggcac ggctaagacg atcgttttgc tctcgcagtg cgttaccaat 14280
gttcgctgtg agcttcgttg ccggatcgcg ctccttcctt gttacgccga ggagcggcat 14340
ggagcggttc tttgccgtcc tattgtcggc gggcgacgtc tcaggggcgt cagttgagac 14400
gccaaggatg tgcttccggc tcatgtgggc ctaccccatg cttttttgat cagtgtttcg 14460
atctcgtcgt tgacggcgtt catcgcctcc aaggctcgat cataggtcga gcgcgtgaac 14520
aggccacgct ccacttcgaa tagagtctgg tttgtcaggc cagcgtccga aaccgcggtg 14580
gttttaagca tcggaaaatt gaggacattt tcgccaaaaa tcgaccgcag ataacctacc 14640
atttggttct gtggtccgtc gctcggttcg aaacgggtta tcagatagcg catccaatta 14700
aacttgaact tggcgccagc attctcgatt tcacgcaaaa ggttcgatgt cattgccaga 14760
aactggttca tcgacatcac atccagcatc tgcggatgga ccgtgacaag aatggacgtc 14820
gccgcagtca atgcggatag cgtgagatac ccaagctggg gagggcagtc gatgaccacg 14880
acgtcatagt tatccgcgat atcttcaatt acttggctga tgcgaccata aaagagcgtg 14940
tcgccctctt tgcggttcat cagcgcgcgt ggcgtatcgt gttcaaactc catcagctca 15000
aggttaccag gaatcaggtg gaggtcggga atgtaagtcc ctcggacgac tcgttcgatt 15060
gccacctgct catcatcata ccttatagcg ccgtagagcg tttcgttcgg gccaacgtcc 15120
gtctccggtt ggctcccaaa gagtgcagaa aggctcgctt gaggatcgag atcaatggcc 15180
aagactcgat atccgcgcat agcgaggtac tgcgccagat gcgcggcggt ggtggtctta 15240
cccgacccac ctttgaaatt catcacagag ataacctgaa gctgctcgcc gcctcgacga 15300
tgtggcaggt agcgccggtt cccgcggccg acctgatcca tatacttccg aatcacatgg 15360
atatcttcaa ttgagaacat tcgcctgcca cctgggctca tgctaacatt caactctggc 15420
atctcagacg cggtctgccg taaatatgac tcgccaacgc cgagcagctt ggacgcctcc 15480
gatggcccga atgttcgaat acccttctcg gaatgcggcg ggaaaacctt aagatgatgt 15540
gcttgaagtt ggctcgagag ggcatcggca tgacgctcca tcaaggccgt caaccctaca 15600
actacaggcg ctgcttttag gacagacttc gccatctcaa acccattcct tgccagtggc 15660
gatatttttc gcgaaactgg aaaagttccg ccgctggcaa ttagcgccga ttctgctgtt 15720
tgggcaagag cttttaggtt aacagaaggt taacgccctc aggtcgaaaa actccaccca 15780
actgttattt gtatttattt ccaatgcctt agagagattg ccatttgaat atgttcatgt 15840
attgttttag tgataatcct acaatcgtaa cccaaaaaga ggtcgccctc tgcgcgccgt 15900
cgtccaatat aggcgaagtc acccttgcga ctcaggcgga ttctaccttg taggatcgag 15960
tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca gatcgctgag ataggtgcct cactgattaa 16020
gcattggtaa ctgtcagacc aagtttactc atatatactt tagattgatt taaaacttca 16080
tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc 16140
ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc 16200
ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc 16260
agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt 16320
cagcagagcg cagataccaa atactgttct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt 16380
caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc 16440
tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa 16500
ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac 16560
ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg 16620
gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga 16680
gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact 16740
tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa 16800
cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt gctca 16845
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物Atpap1 U-XbaI(primer Atpap1 U-XbaI)
<400> 4
ccagtgtcta gactatcttt gttccatgga ggg 33
<210> 5
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Atpap1 L-SacI
<400> 5
ccagtggagc tccacaaacg caaacaaatg ttc 33
<210> 6
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> GhRDL1p U-HindIII
<400> 6
ccagtgaagc ttaattagtt atgtttggta aat 33
<210> 7
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物GhRDL1p L-XbaI(primer GhRDL1p L-XbaI)
<400> 7
ccagtgtcta gactagaaca ggagtgacta att 33
<210> 8
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物GhEXPAp U-HindIII(primer GhEXPAp U-HindIII)
<400> 8
ccagtgaagc tttttaagca aaaaattaat agt 33
<210> 9
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物GhEXPAp L-XbaI(primer GhEXPAp L-XbaI)
<400> 9
ccagtgtcta gactagaaca ggagtgacta att 33
<210> 10
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物GhHOX3 U-XbaI(primer GhHOX3 U-XbaI)
<400> 10
ccagtgtcta gaatggattg cggaagcggc ggc 33
<210> 11
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物GhHOX L-SacI(primer GhHOX L-SacI)
<400> 11
ccagtggagc tctcaagaac taggacaatt caa 33
<210> 12
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物hspT L-PstI(primer hspT L-PstI)
<400> 12
actactctgc agaattcctt atctttaatc ata 33
<210> 13
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 引物GhRDL1p U-SphI(primer GhRDL1p U-SphI)
<400> 13
ccagtggcat gcaattagtt atgtttggta aat 33
<210> 14
<211> 302
<212> DNA
<213> 陆地棉(Gossypium hirsutum)
<400> 14
aattagttat gtttggtaaa tgaatttgaa tacatgcacc accactctca atgctcaccc 60
acctaagccc atgacataaa ctgcatttaa gtgaaccagt ggcagttgga gccattatgt 120
tggttgaaaa atattgttgg cagtgttatt cagcagtact tgttctaagg ctcctactac 180
atttctcatt ataaatgtgg agaaatcttg ttctactttc cattccatgc aacactaact 240
tttagattcc ctttccattg cactgctctt tctttctata gaattagtca ctcctgttct 300
ag 302
<210> 15
<211> 2000
<212> DNA
<213> 陆地棉(Gossypium hirsutum)
<400> 15
tttaagcaaa aaattaatag taagttctat attagaaaat tatttaattt caatcaaaca 60
atgcttaaat aaattaaaaa gttatataaa atataaaatt tagacactat aatattaaaa 120
taattcagac aactattatc atttttaata agttttctaa aataatgtat gcgaaaaaca 180
cttactttat taatacttaa ataaatataa tttattatat ttacaaataa atatttgtat 240
ttattcatat gcaaattttt ttaaaaatat aaatattaaa aaaattatat aatttcataa 300
aagtggaaat taattattaa aaaatgaaaa ttaaataaga ttaattcatt ttcctaagaa 360
atataaaaat tctaggagct aacatattta ataatattat catatttcta aaattagtta 420
atattttaaa ttatggagac taaataagaa aattaaaaaa gtgaaagcgc tttataaaat 480
aaagtaaaaa tattgagggg tttatgttac aaataaccca atcgcgtttc ccatagagaa 540
aaggaatttt ctttctttta ttttcatgtc attttttcat acaatttctt tggtcactta 600
aattctcaat aaaattagaa aacagccctc aaaaataata ttgatacgtt gaaagattta 660
tcaactttcg accatcgaca ctttaaaaaa attagaaagt tataattttt ttttcaaaaa 720
aactataata cctctctagt tttagctaat taaattatta ttattttatt attttattgt 780
tattaaaagt gtaacttgca ctcaactatt agtaagttta cgttttgatc acttaatttc 840
agaaagttaa aaaatggtct ttgaactatt cgaaaatttt catttaagtt actggaatat 900
ttaaaagttt ttatttaagt caccgggcta ttaagttttt ttttaaaaat tcgattagca 960
agttccaagc tacgattcga taagtgatac aatggattta tacttattga caaatagaat 1020
atacattagg tccaagttga tattacggtc agtgttgaaa atcgaaaaaa aatatttgga 1080
ttttgattca taaatttatg acttcaaagc tggttcatga aaaagaacta aagtgtaaga 1140
gggaaggaaa aaaatatctt ttgattggca caaacagtgc gaacaaagaa gaccacacaa 1200
taacaatttt aacaatatac taatttaaat gaaaaatttt caataattta ataagttaac 1260
cgaggaaaac ttactaagag ttagttaccc ctgttaaaat aactttcatg aagtaataga 1320
aacttttagt acgtatcatc ttatatagaa caatttctat tttcagaaag tcaagaaaat 1380
tgtattctag aaaatggcga cttcttcacc ttcagtcctt ccctgatcgg cgcttgtgaa 1440
aaacgaaaaa cctgagtctg attggctgac tgaaaatgaa cctactcatc accattcact 1500
attaccaact tcaaatgata ggggaattaa ctggtaaagt gtaactccac cgatggttga 1560
ggtggttggc tggagttaaa tgagattttt ttagttttgt ttcaagtggc ttcaattgca 1620
agcaattagg agactgcgct ggaataaccc ctcgctcaac cttccgccat tgttatggtt 1680
taattaaaca ttatgtttcc atccatctat atttatatcc attaaaacaa gtcgttgagc 1740
aaataatgga tactggatac catcatatct atgattaaaa ttttgcatgt gcccttttaa 1800
tgtatagctt aagccttaat tatcctccaa atttgtactc tttcaccact taattagcta 1860
cgtacggtac ttagcgttgc ttgtcatctt ctgtactaca aactctttct cattttgtat 1920
aaatagctat acactttttc tctcctcaaa tcaataaggt taggtcagcc aattgtttga 1980
gctagctagc tcttactcaa 2000
<210> 16
<211> 747
<212> DNA
<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<400> 16
atggagggtt cgtccaaagg gctgcgaaaa ggtgcttgga ctactgaaga agatagtctc 60
ttgagacagt gcattaataa gtatggagaa ggcaaatggc accaagttcc tgtaagagct 120
gggctaaacc ggtgcaggaa aagttgtaga ttaagatggt tgaactattt gaagccaagt 180
atcaagagag gaaaacttag ctctgatgaa gtcgatcttc ttcttcgcct tcataggctt 240
ctagggaata ggtggtcttt aattgctgga agattacctg gtcggaccgc aaatgacgtc 300
aagaattact ggaacactca tctgagtaag aaacatgaac cgtgttgtaa gataaagatg 360
aaaaagagag acattacgcc cattcctaca acaccggcac taaaaaacaa tgtttataag 420
cctcgacctc gatccttcac agttaacaac gactgcaacc atctcaatgc cccaccaaaa 480
gttgacgtta atcctccatg ccttggactt aacatcaata atgtttgtga caatagtatc 540
atatacaaca aagataagaa gaaagaccaa ctagtgaata atttgattga tggagataat 600
atgtggttag agaaattcct agaggaaagc caagaggtag atattttggt tcctgaagcg 660
acgacaacag aaaaggggga caccttggct tttgacgttg atcaactttg gagtcttttc 720
gatggagaga ctgtgaaatt tgattag 747
<210> 17
<211> 2142
<212> DNA
<213> 陆地棉(Gossypium hirsutum)
<400> 17
atggattgcg gaagcggcgg cggcggctta ggagcgagtg gttccggcgg agaccatgat 60
tcctccgacc tttcacgacg gaaaaagcct taccatcgtc acacagctca ccagattcag 120
aggcttgaat cgatgttcaa ggaatgtcca cacccagacg agaaacaaag gttacagcta 180
agtagggaat tgggattagc accaagacag atcaagtttt ggtttcaaaa taggaggaca 240
caaatgaagg cacaacatga aagagccgat aactctgcac ttcgtgctga gaacgataag 300
atccgatgtg aaaacatagc cataagagaa gcacttaaga atgtgatttg tccttcttgt 360
ggtggtcctc ctgctaatga ggattcttat tttgatgacc agaaaatgag aatggagaat 420
gctcaattaa aggaagagct tgatagagta tccagcattg cagccaagta catagggaga 480
ccaatatccc aactcccacc agtacaacct gttcatatct cttcattaga tttcaggatg 540
gcgagttttg acggctatgg tgtcggcgct ggtccttcac tcgatctcga tctcctcccc 600
ggaagttcgt catcaatgcc gaatttaccg ttccaaccgg tcgttatttc agacattgac 660
aagtccctca tgtctgatat agccgcaaat gcaatggaag aactgcttag gctattacaa 720
accaatgaac cattgtggat taaatccact aatgatggca aagatgctct taatctcgaa 780
agttatgaaa gaatcttccc taagcctaat aatactcatt ttaaatctcc taatattagg 840
gtcgaagctt ctcgagattc cggtgttgtt attatgaatg gcttagcttt ggttgacatg 900
ttcatggatt ccaacaaatg gttggagcta tttcccacca ttgtgtcaat tgccaaaaca 960
atcgaagtga tttcacctgg gatgttgggt acacatagtg gttctttgca attgatgtat 1020
gaagaactac aggtcttgtc tccattagta ccaacacgtg aattttatac acttcgatat 1080
tgtcaacaaa ttgaacaagg gttatgggct attgtcaatg tttcatatga tttgccacaa 1140
tttgcttctc aatgtcgatc tcatagactc ccttctggtt gtttgattca agacatgcct 1200
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catcgattgt atcgagacct tgttcatagt ggttcagcat ttggagccga acggtggctc 1320
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caaaggatgg taaacaattt ctgcacgagc gtcggcacgt cgaatagtca tcggtcgaca 1500
acactttccg gttcgaatga aattggtgtt cgggtcaccg ttcataagag ttctgatccc 1560
ggacaaccca acggtatagt tcttagtgca gctactacat tttggctccc tgttagtcca 1620
caaaatgtct tcaatttctt caaagatgaa agaactagac cacagtggga tgttctatcc 1680
aacggcaacg cagtccaaga agttgctcat atcgcaaacg gatcacatcc cggcaactgt 1740
atatccgttt tacgagcctt taatacaagt cacaacaaca tgttaatact acaagagagt 1800
tgcattgaca gttctggttc actggtggta tactgtccag ttgatttacc agctattaat 1860
gtagcaatga gcggcgaaga tccatcttac attccgttac ttccgtcagg ttttacgata 1920
acacccgacg gtcatctcga gcaaggtgac ggagcatcga cgagttctag tactgggcac 1980
ggaagatcgt ccggtggttc attgattacg gtagcgtttc aaatactagt gagcagcttg 2040
ccatcggcaa aattaaactt ggattcggtc acaattgtta ataaccttat tgctaatact 2100
gtacaacaaa ttaaggctgc tttgaattgt cctagttctt ga 2142
Claims (14)
1.一种载体，其包含在棉的种子表面和/或棉纤维中特异性表达的至少1个以上的启动子；或者，一种载体，其包含在棉的种子表面和/或棉纤维中特异性表达的至少1个以上的启动子、以及与启动子功能性地连接的激活由该启动子起始的转录的至少1个反式激活因子基因。
2.如权利要求1所述的载体，其中，所述在棉的种子表面和/或棉纤维中特异性表达的启动子包含下述启动子中的任一种：
(1)GhRDL1和/或GhEXPA启动子；
(2)在严格条件下与GhRDL1或GhEXPA启动子杂交并在棉的种子表面和/或棉纤维中特异性表达的启动子；
(3)与GhRDL1或GhEXPA启动子具有70％以上的同源性并在棉的种子表面和/或棉纤维中特异性表达的启动子。
3.如权利要求1或2所述的载体，其中，所述反式激活因子基因为下述中的任一种：
(1)编码GhHOX3蛋白的DNA；
(2)编码与GhHOX3蛋白具有60％以上的氨基酸一致性并具有与GhHOX3蛋白同等的转录激活功能的蛋白的DNA；
(3)与(1)的DNA具有70％以上的同源性并编码具有与GhHOX3蛋白同等的转录激活功能的蛋白的DNA；
(4)在严格条件下与(1)的DNA杂交并编码具有与GhHOX3蛋白同等的转录激活功能的蛋白的DNA。
4.如权利要求1～3中任一项所述的载体，其中，进一步包含至少1个功能性地连接的、促进色素生物合成基因群的表达的转录因子基因和/或色素生物合成基因。
5.如权利要求4所述的载体，其中，所述促进色素生物合成系基因群的表达的转录因子基因为下述中的任一种：
(1)编码Atpap1蛋白的DNA；
(2)编码与Atpap1蛋白具有60％以上的氨基酸一致性并具有与Atpap1蛋白同等的转录激活功能的蛋白的DNA；
(3)与(1)的DNA具有70％以上的同源性并编码具有与Atpap1蛋白同等的转录激活功能的蛋白的DNA；
(4)在严格条件下与(1)的DNA杂交并编码具有与Atpap1蛋白同等的转录激活功能的蛋白的DNA。
6.一种载体，其具有序列号1～3中的任一种序列。
7.如权利要求1～6中任一项所述的载体，其中，包含T-DNA的边界区域。
8.一种农杆菌，其转化有权利要求7所述的载体。
9.一种细胞、组织、愈伤组织、转化植物和/或其种子，其使用权利要求8所述的农杆菌进行了转化。
10.一种克隆植物、后代植物和/或它们的种子，其来自权利要求9所述的转化植物或其种子。
11.如权利要求9或10所述的细胞、组织、愈伤组织、转化植物和/或其种子、以及克隆植物、后代植物和它们的种子，其中，所述进行了转化的细胞、组织、愈伤组织、转化植物和/或其种子、以及克隆植物、后代植物和它们的种子来自棉。
12.一种生产权利要求4、6或7所述的载体、和/或使用权利要求7所述的农杆菌进行了转化的棉细胞、组织、愈伤组织、转化植物和/或其种子、以及克隆植物、后代植物和它们的种子的方法。
13.一种棉纤维、布料或衣服，其由权利要求11或12所述的所述转化植物体获得。
14.一种棉纤维、布料或衣服，其包含外源花色相关基因。
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