CN1430673A - 夜香树黄叶卷曲病毒启动子 - Google Patents

夜香树黄叶卷曲病毒启动子 Download PDF

Info

Publication number
CN1430673A
CN1430673A CN01809118A CN01809118A CN1430673A CN 1430673 A CN1430673 A CN 1430673A CN 01809118 A CN01809118 A CN 01809118A CN 01809118 A CN01809118 A CN 01809118A CN 1430673 A CN1430673 A CN 1430673A
Authority
CN
China
Prior art keywords
dna
perfluoro
sequence
seq
trifluoro
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN01809118A
Other languages
English (en)
Other versions
CN100457913C (zh
Inventor
T·霍恩
L·斯塔沃隆
P·T·德哈恩
H·T·利宫
M·科诺诺瓦
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Syngenta Participations AG
Original Assignee
Syngenta Participations AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GB0007427A external-priority patent/GB0007427D0/en
Priority claimed from GB0010486A external-priority patent/GB0010486D0/en
Application filed by Syngenta Participations AG filed Critical Syngenta Participations AG
Publication of CN1430673A publication Critical patent/CN1430673A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN100457913C publication Critical patent/CN100457913C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8209—Selection, visualisation of transformants, reporter constructs, e.g. antibiotic resistance markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/00021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/00022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/12011—Geminiviridae
    • C12N2750/12022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/60—Vector systems having a special element relevant for transcription from viruses

Abstract

本发明描述了作为相连核苷酸序列的转录启动子而发挥功能的新DNA序列。更具体的说，本发明描述了赋予相连核苷酸序列以组成性表达的DNA序列。本发明还描述了包含这些启动子序列的重组序列。所述重组DNA序列可用于构建转基因植物，尤其是在大多数组织和器官中一直表达目的核苷酸序列的植物。

Description

夜香树黄叶卷曲病毒启动子
本发明涉及在植物中作为相连核苷酸序列的转录启动子而发挥功能的新DNA序列。更具体的说，本发明涉及赋予相连目的核苷酸序列以组成性表达的新启动子。
在农业领域中，一直希望根据需要来修饰植物。实现这一需要的一种方法是使用现代遗传工程技术。例如，通过将目的基因导入植物，能够特异修饰植物而使其表达期望的表型性状。为此目的，最通常的做法是用包含启动子区、编码区、和终止区的异源基因转化植物。在通过遗传工程来实现异源基因在植物中的表达时，启动子的选择是决定性的因素。虽然可能希望只在应答特定刺激时表达某些基因或者将表达限制于特定细胞或组织，但是更希望组成性表达其它基因，即一直在整个植物的大多数组织和器官中进行表达。过去，来自花椰菜花叶病毒的35S启动子(CaMV 35S启动子)已经广泛用于在植物中组成性表达异源基因。然而，偶尔希望使用其它启动子。因此，本发明的主要目的是提供用于在植物中表达目的核苷酸序列的候选启动子。本发明还涉及包含本发明启动子的重组DNA分子、表达载体、和转基因植物。
本发明因而提供了能够驱动相连核苷酸序列表达的DNA序列，其中所述DNA序列可得自夜香树花叶卷曲病毒(Cestrum yellow leafcurling Virus，CmYLCV)的基因组。优选可得自CmYLCV全长转录本启动子且包含SEQ ID NO：1所述核苷酸序列的DNA序列。
具体而言，提供了如下DNA序列，其中：
●  所述DNA序列包含SEQ ID NO：2所述DNA序列
●  所述DNA序列包含SEQ ID NO：3所述DNA序列
●  所述DNA序列包含SEQ ID NO：4所述DNA序列
●  所述DNA序列包含SEQ ID NO：5所述DNA序列
●  所述DNA序列包含SEQ ID NO：6所述DNA序列
●  所述DNA序列在严谨条件下与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、或SEQ ID NO：6之任一发生杂交，特别是上述DNA序列包含SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20所述核苷酸序列。
本发明还提供了包含SEQ ID NO：1的至少50nt、优选大约400碱基-大约650碱基、更优选大约200碱基-大约400碱基、最优选大约350碱基的连续片段的DNA序列，其中所述DNA序列能够驱动相连核苷酸序列的表达。
在本发明的一个具体实施方案中，所述至少50nt、优选大约400碱基-大约650碱基、更优选大约200碱基-大约400碱基、最优选大约350碱基的连续片段与SEQ ID NO：1的至少50nt、优选大约400碱基-大约650碱基、更优选大约200碱基-大约400碱基、最优选大约350碱基的连续片段具有至少75％、优选80％、更优选90％、最优选95％的序列同一性。
本发明还提供了包含由夜香树黄叶卷曲病毒分离的全长转录本启动子区的重组DNA分子。另外，本发明提供了包含依照本发明的DNA序列且其可操作连接目的核苷酸序列的重组DNA分子和DNA表达盒。本发明还提供了分别包含所述重组DNA分子和表达盒的DNA表达载体。
具体而言，提供了如下重组DNA分子和DNA表达盒，其中目的核苷酸序列包含编码区。具体而言，其中：
●  编码序列编码期望的表型性状
●  编码序列编码可选择的或可筛选的标记基因
●  编码序列编码赋予抗生素抗性、病毒抗性、昆虫抗性、疾病抗性、或对其它害虫的抗性、除草剂耐受性、改进的营养价值、工业加工中改进的性能、或改变的生殖能力的蛋白质
●  编码序列编码赋予经所述编码序列转化的细胞以阳性选择优势的蛋白质
●  编码序列编码赋予经所述编码序列转化的细胞以代谢优势(包括能够代谢化合物)的蛋白质，其中所述化合物是甘露糖或木糖或其衍生物或前体，或是蛋白质的底物，或者能够由经所述编码序列转化的细胞代谢成这种底物
●  编码序列编码选自下组的酶：木糖异构酶、磷酸甘露糖异构酶、甘露糖-6-磷酸异构酶、甘露糖-1-磷酸异构酶、磷酸甘露糖变位酶、甘露糖差向异构酶、甘露糖或木糖磷酸酶、甘露糖-6-磷酸酶、甘露糖-1-磷酸酶、和甘露糖或木糖通透酶
●  编码序列编码磷酸甘露糖异构酶
●  编码区是不能翻译的
●  不能翻译的编码区来自病毒基因，特别是来自TSWV，更特别的是来自TSWV NP基因
●  编码序列编码具有商业价值的酶或者植物中的代射物
●  编码序列处于反义取向
本发明还提供了包含上述DNA序列或重组DNA分子的DNA表达载体。在本发明的一个具体实施方案中，所述DNA表达载体是pNOV2819或pNOV2820。本发明还提供了包含依照本发明的第一DNA序列且其可操作连接目的核苷酸序列和依照本发明的第二DNA序列且其可操作连接目的核苷酸序列的DNA表达载体。在本发明的一个具体实施方案中，上述DNA表达载体能够改变病毒基因组的表达。
在一个甚至更具体的实施方案中，上述DNA表达载体包含能够在细胞中表达所述病毒基因组或其部分的有义RNA片段的第一DNA序列和能够在细胞中表达所述病毒基因组或其部分的反义RNA片段的第二DNA序列，其中所述有义RNA片段与所述反义RNA片段能够形成双链RNA。
本发明提供了上述表达载体，其中：
●  所述病毒选自下组：tospoviruses、马铃薯Y病毒组、马铃薯X病毒组、烟草花叶病毒组、黄矮病毒组、南瓜花叶病毒组、雀麦花叶病毒组、线形病毒组(closteorvirus)、番茄丛矮病毒组、和真菌传棒状病毒组
●  所述DNA序列包含衍生自病毒外壳蛋白基因、病毒核壳蛋白基因、病毒复制酶基因、或病毒移动蛋白基因或其部分的核苷酸序列
●  所述DNA序列衍生自番茄斑萎病毒(tomato spotted wiltvirus，TSWV)
●  所述DNA衍生自核壳蛋白基因
本发明还提供了经依照本发明的DNA序列、重组DNA分子、或DNA表达载体稳定转化的宿主细胞，具体而言，其中：
●  宿主细胞是细菌
●  宿主细胞是植物细胞
●  宿主细胞是选自下组的植物细胞：水稻、玉米、小麦、大麦、黑麦、甘薯、甜玉米、菜豆、豌豆、菊苣、莴苣、甘蓝、花椰菜、嫩茎花椰菜、芜菁、萝卜、菠菜、芦笋、洋葱、大蒜、胡椒、芹菜、南瓜、西葫芦、大麻、夏南瓜、苹果、梨、温柏(quince)、甜瓜、李、樱桃、桃、油桃、杏、草莓、葡萄、悬钩子、黑莓、凤梨、鳄梨、番木瓜、芒果、香蕉、大豆、番茄、高粱、甘蔗、甜菜、向日葵、油菜籽、三叶草、烟草、胡萝卜、棉花、苜蓿、马铃薯、茄子、黄瓜、拟南芥、和木本植物诸如针叶树和落叶树，特别是水稻、玉米、小麦、大麦、甘蓝、花椰菜、胡椒、南瓜、甜瓜、大豆、番茄、甜菜、向日葵、或棉花，尤其是水稻、玉米、小麦、高粱、果园草、甜菜、和大豆细胞
●  宿主细胞是来自双子叶植物的植物细胞
●  宿主细胞是来自选自下组的双子叶植物的植物细胞：大豆、棉花、烟草、甜菜、和油菜籽
●  宿主细胞是来自单子叶植物的植物细胞
●  宿主细胞是来自选自下组的单子叶植物的植物细胞：玉米、小麦、高粱、黑麦、燕麦、草坪草、水稻、和大麦
另外，本发明还提供了经依照本发明的DNA序列、重组DNA分子、或DNA表达载体稳定转化的植物或其后代，包括种子。具体而言，其中：
●  植物选自下组：水稻、玉米、小麦、大麦、黑麦、甘薯、甜玉米、菜豆、豌豆、菊苣、莴苣、甘蓝、花椰菜、嫩茎花椰菜、芜菁、萝卜、菠菜、芦笋、洋葱、大蒜、胡椒、芹菜、南瓜、西葫芦、大麻、夏南瓜、苹果、梨、温柏(quince)、甜瓜、李、樱桃、桃、油桃、杏、草莓、葡萄、悬钩子、黑莓、凤梨、鳄梨、番木瓜、芒果、香蕉、大豆、番茄、高粱、甘蔗、甜菜、向日葵、油菜籽、三叶草、烟草、胡萝卜、棉花、苜蓿、马铃薯、茄子、黄瓜、拟南芥、和木本植物诸如针叶树和落叶树，特别是水稻、玉米、小麦、大麦、甘蓝、花椰菜、胡椒、南瓜、甜瓜、大豆、番茄、甜菜、向日葵、或棉花，尤其是水稻、玉米、小麦、高粱、果园草、甜菜、和大豆
本发明还公开了：
●  依照本发明的DNA序列用于表达目的核苷酸序列的用途
●  生成依照本发明的DNA序列的方法，其中通过聚合酶链式反应生成该DNA，其中至少一种所用寡核苷酸包含展现SEQ ID NO：1的15、18、20、22、24、或更多碱基对的连续片段的核苷酸序列。
为了确保清楚且一致的理解说明书和权利要求书，提供下列定义：
CmYLCV：夜香树黄叶卷曲病毒。
DNA改组：DNA改组是快速、容易、且有效的将重排导入DNA分子(优选随机)或在两种或多种DNA分子之间产生DNA序列交换(优选随机)的方法。由DNA改组产生的DNA分子即改组后DNA分子是由至少一种模板DNA分子衍生的非天然存在DNA分子。
表达：指内源基因或转基因在植物中的转录和/或翻译。例如，在反义构建物的情况中，表达可以只指反义DNA的转录。
功能等同序列：指具有与CmYLCV全长转录本启动子或其部分基本相似的启动子活性且在严谨杂交条件下与所述启动子序列发生杂交的DNA序列。
基因：指编码序列和相连调控序列，其中编码序列转录成RNA，诸如mRNA、rRNA、tRNA、snRNA、有义RNA、或反义RNA。调控序列的范例是启动子序列、5’和3’非翻译序列、和终止序列。可能存在的其它元件是例如内含子。
目的基因：指在转移至植物后赋予植物以期望特征的任何基因，诸如抗生素抗性、病毒抗性、昆虫抗性、疾病抗性、或对其它害虫的抗性、除草剂耐受性、改进的营养价值、工业加工中改进的性能、或改变的生殖能力。“目的基因”还可以是为了在植物中生成具有商业价值的酶或代谢物而转移至植物的基因。
异源：在用于本文时，指具有不同的天然或合成来源。例如，若用未转化宿主细胞中不存在的核酸序列转化宿主细胞，则说核酸序列对于宿主细胞而言是异源的。转化所用核酸可以包含异源启动子、异源编码序列、或异源终止序列。或者，转化所用核酸可以是完全异源的，或者可以包含异源与内源核酸序列的任意可能组合。
前导区：基因中转录起始位点与翻译起始位点之间的区域。
标记基因：指编码可选择的或可筛选的性状的基因。
可操作连接/相连：若两种序列的定位使得调控DNA序列影响编码DNA序列的表达，则说调控DNA序列与编码RNA或蛋白质的DNA序列“可操作连接”或“相连”。
植物：指任何植物，特别是种子植物。
植物细胞：植物的结构和生理单位，包括原生质体和细胞壁。植物细胞可以是分离的单细胞或培养细胞的形式，或者是更高组织单位诸如植物组织或植物器官的一部分。
植物材料：指叶、茎/干、根、花或其部分、果实、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、卵细胞、接合子、胚、种子、插条、细胞或组织培养物、或植物的任何其它部分或产物。
启动子：指起始相连DNA序列转录的DNA序列。启动子区还可包含作为基因表达的调节基因而发挥作用的元件，包括激活子、增强子、和/或遏制子，而且可以包含5’非翻译前导序列的整个或部分。
重组DNA分子：使用重组DNA技术连接起来的DNA序列组合。
重组DNA技术：用于将DNA序列连接起来的流程，例如描述于Sambrook等人，1989，冷泉港，纽约，冷泉港实验室出版社。
可筛选的标记基因：指其表达不赋予经转化细胞以选择优势但使得经转化细胞在表型上与未转化细胞截然不同的基因。
可选择的标记基因：指其在植物细胞中的表达给予细胞以选择优势的基因。经可选择的标记基因转化的细胞所具有的选择优势可能归功于它们在存在负选择剂诸如抗生素或除草剂时相对于未转化细胞的生长能力。经转化细胞相对于未转化细胞所具有的选择优势还可能归功于它们具有新的或增强的利用所添加化合物如营养物、生长因子、能源的能力。可选择的标记基因还指其在植物细胞中的表达在存在选择剂时相对于缺乏选择剂时对经转化植物细胞具有积极影响而对未转化植物细胞具有消极影响(例如在生长方面)从而给予经转化植物细胞以正选择优势的基因或基因组合。
序列同一性：序列同一性百分比是使用基于动力学编程算法的计算机程序测定的。本发明这一方面优选的计算机程序包括设计用于探索所有可获得的序列数据库(无论检索的是蛋白质或DNA)的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool即基本局部比对搜索工具)搜索程序。已经可以在因特网(目前的网址是http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)上公开获得这种搜索工具的BLAST 2.0版(Gapped BLAST即缺口BLAST)。它使用试探式算法，寻找局部而非整体比对，因而能够检测只共享分离区域的序列之间的关联。BLAST搜索中给出的得分具有明确定义的统计学解释。优选将任选参数设成缺省值来运行所述程序。
转化：指将核酸导入细胞。具体而言，指DNA分子稳定整合到目的生物体的基因组中。
TSWV：番茄斑矮病毒。
本发明涉及可以由夜香树黄叶卷曲病毒(CmYLCV)基因组获得的DNA序列。优选可以由能够驱动相连目的核苷酸序列表达的CmYLCV全长转录本启动子获得的DNA序列。本发明还涵盖包含其功能和/或结构等同物的DNA序列。本发明因而涉及可作为相连核苷酸序列的转录启动子而发挥功能的DNA序列。启动子区还可包含可作为基因表达的调节基因而发挥作用的元件，诸如激活子、增强子、和/或遏制子，而且可以包含转录所得mRNA的5’非翻译前导序列。
在本发明的一个优选实施方案中，所述DNA序列赋予相连核苷酸序列的组成性表达。组成性表达指目的核苷酸序列一直在大多数组织和器官中进行表达。在瞬时表达实验中与GUS或CAT报告基因一起测试时，依照本发明的DNA序列赋予GUS或CAT报告基因的高水平表达。因而，依照本发明的DNA序列可用于高水平表达相连目的核苷酸序列，优选编码序列。熟练技术人员知道能够以有义或反义取向表达相连目的编码序列。另外，目的编码序列可以与待转化的植物具有异源或同源来源。在同源编码序列的情况中，依照本发明的DNA序列可用于所述序列的异位表达。在本发明的一个具体实施方案中，目的编码序列处于依照本发明的DNA序列控制下的表达通过所谓的共遏制过程遏制其自身表达及该基因原始拷贝的表达。
可以由夜香树黄叶卷曲病毒(CmYLCV)基因组DNA获得本发明的启动子，例如可以由受感染的夜香树Cestrum parqui植株分离所述DNA。受CmYLCV感染的Cestrum parqui植株是通过它们的花叶和皱叶畸形来鉴定的。然后将该DNA测序并分析。与数据库中序列的序列比较显示，CmYLCV的基因组组织与花椰菜花叶病毒科的其它成员有关。CmYLCV包含8个开放读码框。CmYLCV基因产物的序列比较显示，基因I产物参与胞内运动；基因A编码未知功能的小蛋白；基因B编码蚜虫传播因子；基因C编码病毒体相关蛋白；基因IV编码主要衣壳蛋白；基因V编码逆转录酶；基因VI反式激活全长转录本上病毒基因的翻译。特别感兴趣的是所谓的CmYLCV全长转录本启动子。
熟练技术人员知道可以依照本发明使用CmYLCV全长转录本启动子的各个区域。本发明的一个具体实施方案是SEQ ID NO：1所示的CmYLCV全长转录本启动子区，称为CmpD启动子。该序列包含350bp CmYLCV全长转录本启动子和320bp CmYLCV全长转录本5’非翻译前导序列。可以通过将CmYLCV基因组DNA测序来获得该序列。分别通过与数据库中序列进行比较来鉴定启动子和前导序列。SEQ ID NO：19显示了SEQ ID NO：1的一种变体，称为CmpE，其中CmYLCV全长转录本5’非翻译前导序列的长度是318bp而非320bp。
本发明的一个优选实施方案是SEQ ID NO：2所述DNA序列，称为CmpC启动子。CmpC启动子是SEQ ID NO：1所示序列的片段，包含346bp的CmYLCV全长转录本启动子，对应于SEQ ID NO：1的第5-350位碱基。可以使用正向引物Cmp1(SEQ ID NO：13)和反向引物CmpC2(SEQ IDNO：14)通过PCR由来自夜香树黄叶卷曲病毒或受其感染的Cestrumparqui植株的基因组DNA获得该DNA序列。CmpC启动子的推定TATA盒位于SEQ ID NO：2的第308-315位碱基。CmpC启动子包含至少3个推定增强子区。具有核苷酸序列CAAT的增强子区1位于SEQ ID NO：2的第232-235位碱基；同样具有核苷酸序列CAAT的增强子区2位于SEQ ID NO：2的第243-246位碱基；具有核苷酸序列TGACGTAA的增强子区3位于SEQID NO：2的第246-253位碱基。
本发明的另一个优选实施方案是SEQ ID NO：3所示DNA，称为CmpS启动子。CmpS启动子也是SEQ ID NO：1所示序列的片段，包含SEQ ID NO：2的346bp和来自CmYLCV全长转录本启动子前导区的54bp。前导区是位于编码区之前、转录但不翻译成蛋白质的核苷酸序列。熟练技术人员知道前导区可能包含在基因表达中具有重要功能的调控元件。可以使用正向引物Cmp1(SEQ ID NO：13)和反向引物CmpS2(SEQ ID NO：15)通过PCR由来自夜香树黄叶卷曲病毒或受其感染的Cestrum parqui植株的基因组DNA获得CmpS启动子。CmpS启动子在前导区中包含至少2个推定增强子区。增强子区4(GAGAGA)位于SEQ ID NO：3的第354-359位碱基，增强子区5(GAGAGAGA)位于SEQ ID NO：3的第368-375位碱基。
本发明的还有一个优选实施方案是SEQ ID NO：4所述序列，称为CmpL启动子。正如上述启动子，CmpL启动子是SEQ ID NO：1所示序列的片段，包含SEQ ID NO：2的346bp和CmYLCV全长转录本5’非翻译前导序列的288bp。可以使用正向引物Cmp1(SEQ ID NO：13)和反向引物CmpL2(SEQ ID NO：16)通过PCR由来自夜香树黄叶卷曲病毒或受其感染的Cestrum parqui植株的基因组DNA获得CmpL启动子。SEQ ID NO：20显示了SEQ ID NO：4的一种变体，称为CmpF，其中CmYLCV全长转录本5’非翻译前导序列是286bp而非288bp。
熟练技术人员知道可以用同源或异源核苷酸序列在其5’和3’末端延伸SEQ ID NO：1、2、3、4、19、和20所示核苷酸序列。例如，可以将SEQ ID NO：1、2、3、4、19、和20的5’末端延伸SEQ ID NO：6所示核苷酸的全部或部分。发现SEQ ID NO：6天然的位于SEQ ID NO：2、3、4、和20的上游，而且包含CmYLCV ORF VI的一部分(SEQ ID NO：6的第1-100位碱基)以及CmYLCV全长转录本启动子的一部分(SEQ ID NO：6的第101-104位碱基)。同样的，可以将SEQ ID NO：2、3、4、和20的3’末端延伸SEQ ID NO：5所示核苷酸的全部或部分。发现该核苷酸序列天然的位于SEQ ID NO：4和20的3’末端，而且包含CmYLCV全长转录本前导序列的一部分。
如上所述，例如，可以通过PCR由来自夜香树黄叶卷曲病毒或受其感染的Cestrum parqui植株的基因组DNA获得本发明的DNA序列。或者，可以使用序列特异引物由包含本发明DNA序列同系物的花椰菜花叶病毒科的任何其它病毒获得本发明的DNA序列。熟练技术人员知道，可以根据SEQ ID NO：1-6、19、和20所示核苷酸序列选择任何目的引物组合来PCR扩增可依照本发明使用的各种长度的DNA片段。本发明因而包括由依照本发明发挥功能(即能够赋予相连核苷酸序列的表达)的CmYLCV全长转录本启动子衍生的片段。
可以如下进行测试：生成这种启动子片段，将它们融合可选择的或可筛选的标记基因，并对融合构建物测定启动子活性的保持。这种测定法属于本领域技术人员的常规技术范围之内。本发明的优选DNA片段的长度是至少大约50碱基、优选大约400碱基-大约650碱基、更优选大约200碱基-大约400碱基、最优选大约350碱基。
熟练技术人员还知道可以使用本领域已知方法将一个或多个核苷酸的突变、插入、删除、和/或替代导入SEQ ID NO：1、2、3、4、5、和6的DNA序列或由其序列信息衍生的更长或更短片段。另外，可以通过本发明序列的改组使未修饰或经修饰的本发明核苷酸序列多样化。为了测试依照本发明的DNA序列变体的功能，将目的序列可操作连接可选择的或可筛选的标记基因，并在使用原生质体的瞬时表达实验或稳定转化的植株中测试标记基因的表达。熟练技术人员知道能够驱动相连核苷酸序列表达的DNA序列是以模块化方式构造的。因此，来自较短DNA片段的表达水平可能与来自最长片段的表达水平不同，而且可能彼此不同。例如，删除下调的上游元件将导致相连核苷酸序列表达水平的升高，而删除上调元件将降低相连核苷酸序列的表达水平。熟练技术人员还知道删除发育特异的或组织特异的元件将导致相连核苷酸序列表达模式的时间或空间变化。
本发明还涵盖本发明启动子的功能等同物，即在严谨条件下与SEQID NO：1、2、3、4、5、或6之任一发生杂交的核苷酸序列，诸如SEQ IDNO：19和20所示序列。于65℃、优选60℃、最优选55℃在包含0.1％SDS的二倍强度(2×)柠檬酸盐缓冲液(SSC)中进行严谨杂交，随后于相同温度用SSC浓度降低的缓冲液漂洗支持物。这种浓度降低的缓冲液通常是包含0.1％SDS的十分之一强度SSC(0.1×SSC)、优选包含0.1％SDS的0.2×SSC、最优选包含0.1％SDS的半数强度SSC(0.5×SSC)。事实上，可以通过将SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、19、或20之任一与由目的生物体(特别是其它花椰菜花叶病毒)分离的基因组DNA进行杂交来寻找来自其它生物体的整个或部分CmYLCV全长转录本启动子的功能等同物。熟练技术人员知道如何找到这些序列，本领域知道许多方法来鉴定其它生物体中的同源序列。然后可以将这些新鉴定的DNA分子测序，将序列与SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、19、或20之任一进行比较，并测试启动子活性。本发明的范围涵盖与SEQ ID NO：1、2、3、4、或6之任一核苷酸序列在至少50个核苷酸的长度上具有至少75％、优选80％、更优选90％、最优选95％的序列同一性的DNA分子。序列同一性百分比是使用基于动力学编程算法的计算机程序测定的。本发明这一方面优选的计算机程序包括设计用于探索所有可获得的序列数据库(无论检索的是蛋白质还是DNA)的BLAST(Basic LocalAlignment Search Tool即基本局部比对搜索工具)搜索程序。已经可以在因特网(目前的网址是http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)上公开获得这种搜索工具的BLAST 2.0版(Gapped BLAST即缺口BLAST)。它使用试探式算法，寻找局部而非整体比对，因而能够检测只共享分离区域的序列之间的关联。BLAST搜索中给出的得分具有明确定义的统计学解释。优选将任选参数设成缺省值来运行所述程序。
本发明的另一个目标是提供包含依照本发明的DNA序列且其可操作连接目的核苷酸序列的重组DNA分子。目的核苷酸序列可以编码例如核糖体RNA、反义RNA、或不翻译成蛋白质的任何其它类型的RNA。在本发明的另一个优选实施方案中，目的核苷酸序列翻译成蛋白质产物。与启动子序列相连的核苷酸序列可以与待转化的植物具有同源或异源来源。序列还可以是完全或部分合成的。无论来源是什么，相连DNA序列将在经转化植物中以符合相连启动子的表达特性的方式进行表达。在与启动子相连的是同源核苷酸序列的情况中，依照本发明的启动子可用于所述同源序列的异位表达。异位表达指与启动子序列相连的核苷酸序列在受其自身启动子的控制下不表达的组织和器官和/或时间进行表达。在本发明的一个具体实施方案中，与启动子序列相连的核苷酸的表达通过所谓的共遏制过程遏制其自身表达以及该基因原始拷贝的表达。
在本发明的一个优选实施方案中，相连核苷酸序列可能编码希望一直在整个植物的大多数组织和器官中进行表达的蛋白质。这些核苷酸序列优选编码赋予经其转化的植物以期望的表型性状的蛋白质。范例是所编码的蛋白质赋予抗生素抗性、病毒抗性、昆虫抗性、疾病抗性、或对其它害虫的抗性、除草剂耐性、改进的营养价值、工业加工中改进的性能、或改变的生殖能力的核苷酸序列。相连核苷酸序列还可以是为了在植物中生成具有商业价值的酶或代谢物而转移至植物的核苷酸序列。本发明还涵盖可选择的或可筛选的标记基因，即包含本发明DNA序列且其可操作连接编码区的基因，其中编码区编码可选择的或可筛选的性状。
下文描述了可选择或可筛选标记基因的范例。对于某些目的物种，可能优选不同的抗生素或除草剂选择标记。在转化中常规使用的选择标记包括赋予卡那霉素、巴龙霉素、遗传霉素、和相关抗生素抗性的nptII基因(Vieira和Messing，1982，Gene，19：259-268；Bevan等人，1983，Nature，304：184-187)、编码氨基糖苷3’-腺苷酰转移酶并赋予链霉素或壮观霉素抗性的细菌aadA基因(Goldschmidt-Clermont，1991，Nucl.Acids Res.，19：4083-4089)、赋予潮霉素抗性的hph基因(Blochlinger和Diggelmann，1984，Mol.Cell.Biol.，4：2929-2931)、和赋予氨甲蝶呤抗性的dbfr基因(Bourouis和Jarry，1983，EMBO J.，2：1099-1104)。可以使用的其它标记包括赋予除草剂膦丝菌素抗性的膦丝菌素乙酰基转移酶基因(White等人，1990，Nucl.Acids Res.，18：1062；Spencer等人，1990，Theor.Appl.Genet.，79：625-631)、编码草甘膦抗性的突变型EPSP合酶基因(Hinchee等人，1988，Bio/Technology，6：915-922)、赋予咪唑啉酮或磺酰脲抗性的突变型乙酰乳酸合酶(ALS)基因(Lee等人，1988，EMBO J.，7：1241-1248)、赋予莠去净抗性的突变型psbA基因(Smeda等人，1993，Plant Physiol.，103：911-917)、或突变型原卟啉原氧化酶基因(EP 0 769 059)。还可以通过可筛选标记基因的表达来实现经转化细胞的鉴定，诸如编码氯霉素乙酰基转移酶(CAT)、β-葡糖醛酸酶(GUS)、萤光素酶(LUC)、绿色荧光蛋白(GFP)、或赋予经转化细胞以截然不同的表型性状的任何其它蛋白质的基因。
还可以使用导致正选择的选择标记，诸如磷酸甘露糖异构酶基因(专利申请WO 93/05163)。WO 94/20627描述了可用于正选择的其它基因，它们编码木糖异构酶和磷酸甘露糖异构酶，诸如甘露糖-6-磷酸异构酶和甘露糖-1-磷酸异构酶；磷酸甘露糖变位酶；甘露糖差向异构酶，诸如将碳水化合物转变成甘露糖或将甘露糖转变成碳水化合物诸如葡萄糖或半乳糖的酶；磷酸酶，诸如甘露糖或木糖磷酸酶、甘露糖-6-磷酸酶、和甘露糖-1-磷酸酶；和参与将甘露糖或其衍生物或前体转运至细胞内的通透酶。降低化合物对细胞的毒性的试剂通常是葡萄糖衍生物，诸如甲基-3-O-葡萄糖或根皮苷。可以鉴定群体中的经转化细胞而不损伤或杀死未转化细胞且不共导入抗生素或除草剂抗性基因。正如WO 93/05163所述，除了需要消除抗生素或除草剂抗性基因的事实，还显示正选择方法常常远比传统的负选择更有效。
因此，本发明的启动子优选可操作连接编码包含如下区域的蛋白质的核苷酸序列：(1)编码参与化合物代谢的蛋白质和/或(2)调控蛋白质编码基因的活性，其中化合物是甘露糖或木糖或其衍生物或前体、或是该蛋白质的底物，或者能够由经转化细胞代谢成这种底物。所述核苷酸序列可以编码甘露糖-6-磷酸异构酶，化合物可以是甘露糖。或者，核苷酸序列可以编码磷酸糖异构酶、磷酸糖变位酶诸如磷酸甘露糖变位酶、磷酸酶诸如甘露糖-6-磷酸酶、糖差向异构酶、糖通透酶、磷酸糖通透酶、或木糖异构酶，化合物可以是甘露糖、甘露糖-6-磷酸、D-甘露糖胺、或木糖。
在本发明的一个优选实施方案中，本发明的启动子可操作连接编码磷酸甘露糖异构酶(PMI)的大肠杆菌manA基因(Joersbo和Okkels，1996，Plant Cell Reports，16：219-221；Negrotto等人，2000，Plant Cell Reports，19：798-803)的编码区和由根癌农杆菌T-DNA获得的Nos(胭脂碱合酶)终止子(Depicker等人，1982，J.Mol.Appl.Genet.，1(6)：561-573)。熟练技术人员知道可以用能够在植物中发挥功能的任何其它终止子替代Nos终止子。本发明的启动子可以是SEQ ID NO：1-6、19、和20所述CmpD、CmpC、CmpS、CmpL、CmpB、CmpA、CmpE、或CmpF启动子或由其衍生的任何启动子。在本发明的一个甚至更优选的实施方案中，启动子是SEQ ID NO：3所述CmpS启动子。
本发明的启动子还可用于提供对病毒的抗性或耐受，即通过将本发明的启动子可操作连接来自待控制病毒的基因的编码区。
对于负链病毒诸如番茄斑矮病毒(TSWV)的病毒控制，可以使用病毒核壳蛋白(NP)和移动蛋白(MP)基因序列。对于属于α样病毒亚组的病毒诸如TMV和CMV，可以使用依赖RNA的RNA聚合酶(RdRp)和移动蛋白(MP)基因序列。对于属于小RNA病毒样亚组的病毒，包括马铃薯Y病毒组，可以将任何病毒序列连接本发明的启动子。最后，对于其它病毒，包括DNA病毒，可以使用依赖RNA的RNA聚合酶(RdRp)或复制酶相关基因序列。可以如WO 00/68374的实施例8和实施例9所示构建用于病毒控制的这些构建物。用本发明的启动子取代WO 00/68374中所公开的启动子属于本领域技术人员的常规技术范围之内。遵循WO00/68374的传授，熟练技术人员还知道如何制备包含本发明启动子且其可操作连接上述病毒序列的构建物以赋予对所述病毒的抗性或耐受。
除了在转基因植物中表达双链病毒RNA(正如WO 00/68374所公开的)，还可以作为不能翻译的RNA和有义病毒RNA分子来表达病毒RNA(正如US 558302或本发明实施例12和13所述)。
本发明的另一个目标是提供包含本发明的DNA序列且其与相连目的核苷酸序列融合的重组表达载体。在这些载体中，可以将外源DNA插入多接头区，使得这些外源序列可以在合适的宿主细胞中进行表达，其中所述宿主细胞可以是例如细菌或植物来源。例如，衍生自根癌农杆菌二元载体pBIN19的质粒pBI101能够克隆并使用β-葡糖醛酸酶(GUS)表达信号来测试启动子(Jefferson等人，1987，EMBO J.，6：3901-3907)。该载体的大小是12.2kb。它具有低拷贝的RK2复制起点，并赋予细菌和植物二者以卡那霉素抗性。本领域熟练技术人员知道许多其它表达载体可以依照本发明进行使用。
本发明的另一个目标是提供包含本发明重组DNA序列的转基因植物。本发明因而涉及通过下文所述转化方法之任一获得的植物细胞、由这些细胞衍生的植株、植物材料、由这些植株衍生的后代和种子、和具有改进特性的农业产品。依照本发明转化的植物可以是单子叶植物或双子叶植物，包括但不限于水稻、玉米、小麦、大麦、黑麦、甘薯、甜玉米、菜豆、豌豆、菊苣、莴苣、甘蓝、花椰菜、嫩茎花椰菜、芜菁、萝卜、菠菜、芦笋、洋葱、大蒜、胡椒、芹菜、南瓜、西葫芦、大麻、夏南瓜、苹果、梨、温柏(quince)、甜瓜、李、樱桃、桃、油桃、杏、草莓、葡萄、悬钩子、黑莓、凤梨、鳄梨、番木瓜、芒果、香蕉、大豆、番茄、高粱、甘蔗、甜菜、向日葵、油菜籽、三叶草、烟草、胡萝卜、棉花、苜蓿、马铃薯、茄子、黄瓜、拟南芥、和木本植物诸如针叶树和落叶树。优选用于转化的植物是水稻、玉米、小麦、大麦、甘蓝、花椰菜、胡椒、南瓜、甜瓜、大豆、番茄、甜菜、向日葵、或棉花，尤其是水稻、玉米、小麦、高粱、果园草、甜菜、和大豆。可以通过许多众所周知的方法将本发明的重组DNA序列导入植物细胞。本领域技术人员知道这些方法的选择可能取决于用于转化的植物类型，即单子叶植物或双子叶植物。适用于转化植物细胞的方法包括显微注射(Crossway等人，1986，Bio Techniques，4：320-334)、电穿孔(Riggs和Bates，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83：5602-5606)、由农杆菌介导的转化(Hinchee等人，1988，Bio/Technology，6：915-922；EP 0 853 675)、直接基因转移(Paszkowski等人，1984，EMBO J.，3：2717-2722)、和使用购自Agracetus公司(麦迪逊，威斯康星州)和Dupont公司(Wilmington，特拉华州)的设备的弹果颗粒加速(美国专利号4,945,050；McCabe等人，1988，Bio/Technology，6：923-926)。用于转化的细胞可以是已分化的叶细胞、胚细胞、或任何其它类型的细胞。
在原生质体的直接转化中，可以通过使用化学剂或电场来增强原生质体对外源遗传物质的摄取。然后外源物质可以整合到细胞核基因组中。先前的工作是在双子叶植物烟草中进行的，导致外源DNA掺入并转移至后代植株(Paszkowski等人，1984，EMBO J.，3：2717-2722；Potrykus等人，1985，Mol.Gen.Genet.，199：169-177)。单子叶植物，例如小麦(Triticum monococcum)、多花黑麦草(Loliummultiflorum)(意大利黑麦草)、玉米、和黑墨西哥甜玉米的原生质体可以通过这种流程而转化。另一个优选实施方案是EP 0 292 435和EP 0 846 771中公开的用于玉米的原生质体转化方法。关于玉米转化还可参阅Koziel等人，1993，Bio/Technology，11：194-200。可以通过利用原生质体的直接基因转移技术或颗粒轰击来进行水稻转化。由原生质体介导的转化据说被用于日本型和印度型(Zhang等人，1988，Plant Cell Rep.，7：379-384；Shimamoto等人，1989，Nature，338：274-276；Datta等人，1990，Bio/Technology，8：736-740)。上述两种类型也可常规的使用微粒轰击进行转化(Christou等人，1991，Bio/Technology，9：957-962)。专利申请号EP 0 332 581描述了用于Pooideae原生质体的生成、转化、和再生的技术。这些技术能够转化所有的Pooideae植物，包括鸭茅属(Dactylis)和小麦。另外，小麦转化描述于专利申请号EP 0 674 715；和Weeds等人，1993，Plant Physiol.，102：1077-1084。
例如，可以依照常规植物转化方法将由此构建的植物表达载体导入水稻愈伤组织，由其诱导根和叶的分化，然后转移至花盆用于栽培，以获得经转化水稻。
经本发明DNA序列或载体的转化而生成的植物将在整个植物的大多数组织和器官中表达目的核苷酸序列。
改造到上文所述转基因植物中的遗传特性通过有性生殖或营养生长进行传递，从而在后代植株中实现维持和繁殖。一般而言，所述维持和繁殖利用了开发用于特定目的的已知农业方法，诸如耕地、播种、或收获。还可以应用专业方法诸如水培或温室技术。还可以在以开发具有改进特性(诸如对害虫、除草剂、或压力的耐受，改进的营养价值，提高的产量，或改进的结构)且引起较少倒伏或脱粒损失的植物为目的的植物育种中，使用依照本发明的转基因植物的有利遗传特性。多种育种步骤表征为详细定义的人为干涉，诸如选择待杂交的系，指引亲本系的授粉，或选择适当的后代植株。根据期望的特性，采用不同的育种措施。相关技术在本领域是众所周知的，包括但不限于杂交、自交、回交、多系育种、品种融合、种间杂交、非整倍体技术、等。杂交技术还包括通过机械、化学、或生化手段使植物不育以生成雄性或雌性不育植株。雄性不育植株与不同系的花粉的交叉授粉确保雄性不育植株而雌性可育植株的基因组将一致获得两种亲本系的特性。因而，依照本发明的转基因植物可用于改进植物系的育种，例如增加常规方法诸如除草剂或杀虫剂处理的效力，或者能够由于它们的经修饰遗传特性而免除所述方法。或者，可以获得具有改进的压力耐受的新作物，由于它们优化的遗传“装备”，所生成的收获产物的品质好于不能耐受可比的不利发育条件的作物的产物。
本发明的另一个目标是提供可用于在期望生物体中表达目的核苷酸序列的DNA序列。所述生物体可以是细菌、植物、或任何其它目的生物体。
另外，SEQ ID NO：1-6的公开使得本领域技术人员能够设计用于聚合酶链式反应的寡核苷酸，试图由模板扩增DNA片段，所述模板包含表征为SEQ ID NO：1、2、3、4、5、或6中15、优选20-30或更多碱基对的任何连续序列的核苷酸序列。所述核苷酸包含代表SEQ ID NO：1、2、3、4、5、或6中15、优选20-30或更多碱基对的核苷酸序列。使用至少这样一种核苷酸进行的聚合酶链式反应及其扩增产物构成本发明的另一个实施方案。
       序列表中序列的简述
 SEQ ID NO：1  CmpD
 SEQ ID NO：2  CmpC
 SEQ ID NO：3  CmpS
 SEQ ID NO：4  CmpL
 SEQ ID NO：5  CmpB
 SEQ ID NO：6  CmpA
 SEQ ID NO：7  S1正向引物
 SEQ ID NO：8  S2反向引物
SEQ ID NO：9  GUS正向引物
SEQ ID NO：10  GUS反向引物
SEQ ID NO：11  CAT正向引物
SEQ ID NO：12  CAT反向引物
SEQ ID NO：13  Cmp1正向引物
SEQ ID NO：14  CmpC2反向引物
SEQ ID NO：15  CmpS2反向引物
SEQ ID NO：16  CmpL2反向引物
SEQ ID NO：17  PA正向引物
SEQ ID NO：18  PA反向引物
SEQ ID NO：19  CmpE
SEQ ID NO：20  CmpF
SEQ ID NO：21  NOS终止子正向引物
SEQ ID NO：22  NOS终止子反向引物
SEQ ID NO：23  TSWV NP基因正向引物
SEQ ID NO：24  TSWV NP基因反向引物
SEQ ID NO：25  CmYLCV启动子正向引物
SEQ ID NO：26  CmYLCV启动子反向引物
SEQ ID NO：27  AGLINK多克隆位点
SEQ ID NO：28  BIGLINK多克隆位点
SEQ ID NO：29  Cmpf-B引物
SEQ ID NO：30  CmpS-B引物
SEQ ID NO：31  pNOV2804；二元载体，包含无启动子的PMI-nos终止子表达盒
SEQ ID NO：32  pNOV3604；用于biolistics转化的载体，包含无启动子的PMI-Hos终止子表达盒
SEQ ID NO：33  CmpMr反向引物
SEQ ID NO：34  CmpMf正向引物
SEQ ID NO：35  CmpMrs反向引物
SEQ ID NO：36  CmpMfs正向引物
SEQ ID NO：37  synGFPI；包含内含子的植物优化GFP基因
SEQ ID NO：38  GIG；包含内含子的GUS基因
SEQ ID NO：39  Cmp-C反向引物
SEQ ID NO：40  CmpS-synGFPI-nos表达盒
SEQ ID NO：41  CmpS-GIG-nos表达盒
SEQ ID NO：42  CmpC-synGFPI-nos表达盒
SEQ ID NO：43  CmpC-GIG-nos表达盒
SEQ ID NO：44  pNOV2117载体
SEQ ID NO：45  pNOV4200载体
SEQ ID NO：46  ZmUbi-GFP-35S终止子表达盒
SEQ ID NO：47  ZmUbi-GIG-nos表达盒
SEQ ID NO：48  Ubq3(At)-synGFPI-nos表达盒
SEQ ID NO：49  Ubq3(At)-GIG-nos表达盒
                         实施例
本文所用标准重组DNA和分子克隆技术在本领域是众所周知的，且描述于例如Sambrook等人，1989，《Molecular Cloning》即分子克隆，冷泉港，冷泉港实验室出版社，纽约和Ausubel等人，1994，《Currentprotocols in molecular biology》即分子生物学通用方案，JohnWiley & Sons，纽约。
实施例1：病毒克隆1.DNA提取
由受夜香树黄叶卷曲病毒感染的Cestrum parqui植株提取病毒基因组DNA。使用配备PT10探针的Brinkman Polytron匀浆器将5g受感染叶片在30ml研磨缓冲液(0.2M Tris pH7.0、0.02M EDTA、2M尿素)中以最高速度匀浆60秒钟，并于4℃与屈立通X-100(2％终浓度)一起温和摇动过夜。将粗制匀浆低速离心(10,000rpm，20min，SorvallSS-34转头)，然后将获得的上清液高速离心(27,000rpm，2hr，BeckmanSW-28转头)通过蔗糖垫(3ml 15％蔗糖)，由此纯化病毒。然后将包含病毒的沉淀重悬于0.1M Tris pH7.4、2.5mM MgCl2。加入DNA酶I(Sigma)和RNA酶A(Sigma)皆至终浓度10mg/ml。于37℃保温30分钟后，加入EDTA至10mM终止反应。通过存在1％SDS时的蛋白酶K处理(E.Merck，0.5mg/ml终浓度)即于65℃保温15分钟，由CmYLCV颗粒分离病毒DNA。然后通过酚抽提和乙醇沉淀来纯化病毒DNA。将最终乙醇沉淀所包含的病毒DNA溶于水。2.DNA的扩增和克隆
将数百纳克获得的DNA作为模板用于PCR扩增，50μl反应体系包含10μM每种引物、25mM每种dNTP、5μl pfu反应缓冲液(Stratagene)、和2.5U pfu turbo DNA聚合酶(Stratagene)。将S1正向引物(gaccacaaacatcagaag，SEQ ID NO：7)和S2反向引物(caaacttattgggtaatc，SEQ ID NO：8)用于PCR反应。用于PCR的循环参数是：1x(94℃ 1min)；30x(94℃ 1min，50℃ 1min，72℃ 1min)；1x(72℃ 10min)。依照制造商的指示将每种DNA片段克隆到pPCR-ScriptTMAmp SK(+)质粒(Stratagene)中。
实施例2：DNA测序
依照制造商的指示，使用自动化ABI PRISM 377型DNA测序仪(Perkin Elmer)和ABI PRISM d罗丹明终止物循环测序试剂盒(PerkinElmer)进行DNA病毒克隆的测序。将所述S1引物和S2引物(实施例1)以及通用M13-20引物和反向引物用于测序反应。实施例3：用于瞬时表达的质粒的构建
正如实施例1所述，使用Pfu聚合酶(Stratagene)进行所有PCR反应。1.报告基因的扩增
扩增β-葡糖醛酸酶(GUS)和氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因。对于GUS基因的扩增，在退火温度60℃使用GUS正向寡核苷酸(cagggtaccactaaaatcacc，SEQ ID NO：9)和GUS反向寡核苷酸(aggggatccccaattcccc，SEQ ID NO：10)。于62℃使CAT正向寡核苷酸(aggggtaccatcgatatggag，SEQ ID NO：11)和CAT反向寡核苷酸(ttaggatccgccctgccac，SEQ ID NO：12)退火。正向引物设计包含KpnI识别位点，反向引物设计包含BamHI识别位点。2.CmYLCV启动子的扩增
选择了三种不同的启动子片段，CmpC(SEQ ID NO：2)、CmpS(SEQID NO：3)、和CmpL(SEQ ID NO：4)。于退火温度52℃将Cmp1正向引物(cttctagacaaagtggcagac，SEQ ID NO：13)用于所有三种扩增。它是通过修饰(以下划线显示)原始序列以包含XbaI识别位点而得到的。将CmpC2反向引物(ttggtaccttaacaatgaggg，SEQ ID NO：14)用于CmpC片段的扩增，将CmpS2反向引物(ctacttctaggtaccttgctc，SEQ ID NO：15)用于CmpS片段的扩增。二者经修饰包含KpnI识别位点。将CmpL2反向引物(ttggtaccttaacaatgaggg，SEQ ID NO：16)用于CmpL片段的扩增，而且它经修饰包含ClaI限制性位点。3.多腺苷酸化信号的扩增
由花椰菜花叶病毒(CaMV)传染性克隆扩增多腺苷酸化信号片段(Franck等人，Cell，21(1)：285-294，1980)。将PA(多腺苷酸化信号扩增)正向寡核苷酸(ggggatccccagtctctctc，SEQ ID NO：17)和PA反向寡核苷酸(gtgaattcgagctcggta，SEQ ID NO：18)用于PCR，并于60℃退火。正向引物设计包含BamHI识别位点，反向引物设计包含EcoRI识别位点。
4.生成的构建物
●  pCmpCG(CmpC启动子片段+GUS基因+polyA)
●  pCmpSG(CmpS启动子片段+GUS基因+polyA)
●  pCmpCC(CmpC启动子片段+CAT基因+polyA)
●  pCmpSC(CmpS启动子片段+CAT基因+polyA)
●  pCmpLC(CmpL启动子片段+CAT基因+polyA)
将包含启动子片段、报告基因、和多腺苷酸化信号的盒插入经XbaI和EcoRI限制性消化的pUC19载体(Stratagene)。
5.用于比较的构建物
●  pCapG(Cap启动子片段+GUS基因+polyA)
●  pCapSG(CapS启动子片段+GUS基因+polyA)
●  pCapC(Cap启动子片段+CAT基因+polyA)
这些构建物所含启动子片段得自CaMV(Franck等人，Cell，21(1)：285-294，1980；参阅GenBank编号V00141)。GUS、CAT、和polyA片段与用于CmYLCV构建物的相同。Cap对应于自TATA盒第-227-+33位碱基(CaMV基因组的第7175-7438位碱基，参阅GenBank编号V00141)的片段，CapS对应于自TATA盒第-227-+82位碱基(CaMV基因组的第7175-7486位碱基，参阅GenBank编号V00141)的片段。这些位置大致对应于CmYLCV片段的位置。
实施例4：瞬时表达实验
1.悬浮培养物和原生质体的制备
诸葛菜(Orychophragmus violaceus)。在40ml含100mg/ml肌醇、2％蔗糖、和0.1mg/ml 2，4D的MS培养基(Murashige和Skoog，Physiol Plant，15：474-497，1962)中进行悬浮培养。由4-5日龄的培养物分离原生质体。在0.1％果胶裂解酶(pectolyase)Y23(Seishin Pharmaceutical公司，日本)、1％纤维素酶Onozuka R10(Yakult Honsha公司，日本)、0.4M D-甘露醇、和0.1％MES pH5.5中于26℃消化细胞壁1小时。将原生质体滤过50μm筛子，并用电穿孔(EP)溶液(10mM HEPES、150mM NaCl、5mM CaCl2、0.2M甘露醇pH7.1)清洗两次。
烟草(Nicotiana plumbaginifolia)。在添加7g/L细菌用琼脂的RPM2培养基(Blonstein等人，Mol Gen Genet，211：252-259，1988)pH5.6上无污染维持植物。为了制备原生质体，将叶片切碎，并在含0.5％driselase(Fluka)、0.25mM PVP 10(聚乙烯吡咯烷酮MW10000)、3.85mM CaCl2、6mg/L NAA、2mg/L BAP、和0.5M蔗糖pH5.7的溶液中于26℃保温过夜。将原生质体滤过100μm筛子。向原生质体悬浮液中加入蔗糖溶液(0.6M蔗糖、0.1％MES、和15mM CaCl2pH5.7)进行第一步纯化，并将悬浮液覆盖上W5溶液(150mM NaCl、125mM CaCl2、5mM KCl、6mM葡萄糖；Menczel等人，Theor Appl Genet，59：191-195，1981)上。然后将原生质体用W5溶液清洗一次，最后用EP溶液清洗一次。
水稻(Oryza sativa)。由自O.sativa cv.Nipponbare建立的形态发生水稻悬浮培养物制备原生质体(Datta等人，1990，Bio/Technology，8：736-740)。
2.瞬时表达实验
在0.66ml EP缓冲液中通过电穿孔转染2×106个诸葛菜原生质体，即用960μF电容对距离4mm的原生质体悬浮液放电。对电容器施加450伏。在存在5-10μg质粒DNA时进行电穿孔，然后将原生质体于25℃培养16-24小时。在存在0.3ml PEG(40％聚乙二醇6000)和5-10μg质粒DNA时，在0.3ml悬浮液中转染2×106个烟草(Nicotianaplumbaginifolia)原生质体。将原生质体在0.4ml K3培养基(Godall等人，Methods Enzymol，181：148-161，1990)中于25℃培养16-24小时，并在收获前添加10ml W5缓冲液。
通过至少三轮冻融来制备蛋白质提取物，并通过离心来实现澄清。
实施例5：CAT和GUS测定法
为了检测CAT基因表达，依照制造商的指示，使用CAT ELISA试剂盒(Boehringer)进行双重抗体三明治(DAS)-ELISA。使用Dynex MRXII装置测量CAT活性。在GUS缓冲液(0.05M NaPO4 pH7、0.01M EDTA、0.1％屈立通X-100、0.1％Sarkosyl)中稀释用于GUS测定法的样品。在存在等量的GUS反应缓冲液(100ml/L 10xGUS缓冲液、200mg/L BSA、705mg/L葡糖苷酸4-甲基伞形酯)时于37℃进行反应，并用2M Ammediol终止反应。在Titertek F1uoreskan II中测量活性。
将CAT和GUS测定结果都对标准克隆值进行标准化。由10次不同实验获得的结果显示各种CmYLCV启动子片段均作为高度活泼的启动子发挥功能。
          N.plumbaginifolia原生质体的瞬时表达
    GUS报告基因     CAT报告基因
CmpCG  100 CmpCC  100
CmpSG  86.0±20％ CmpSC  78±20％
CapG  9±20％ CapSC  89.5±15％
CapSG  38.9±15％ CmpLC  9±20％
             诸葛菜原生质体的瞬时表达
    GUS报告基因     CAT报告基因
CmpCG  100 CmpCC  100
CmpSG  84.6±15％ CmpSC  255±20％
CapG  9.6±15％ CapSC  546±15％
CapSG  40.7±15％ CmpLC  10±20％
    水稻原生质体的瞬时表达
        GUS报告基因
CmpCG  100
CmpSG  84.6±15％
CapG  9.6±15％
CapSG  40.7±15％
实施例6：用于植物再生和转化的溶液和培养基的配制
培养基GM、CIM、和SIM是由Valvekens等人(1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：5536-5540)描述的培养基。
培养基GM包含Murashige和Skoog(l962，Physiol.Plant，15：473-497)的矿物盐、1.0mg/L硫胺素(储液1mg/ml)、0.5mg/L盐酸吡哆醇(储液1mg/ml)、0.5mg/L尼克酸(储液1mg/ml)、0.5g/L2-(N-吗啉代)乙烷磺酸(MES)、10g/L蔗糖、8g/L琼脂，用1N KOH将pH调至5.8。CIM包含B5培养基(Gamborg等人，1968，Exp.Cell Res.，50：151-158)的矿物盐和维生素、0.5g/L 2-(N-吗啉代)乙烷磺酸(MES)、20g/L葡萄糖、0.5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)(储液10mg/ml溶于DMSO)、0.05mg/L激动素(储液5mg/ml溶于DMSO)pH5.8。固体CIM培养基包含8g/L琼脂。SIM包含B5培养基(Gamborg等人，1968，见上文)的矿物盐和维生素、0.5g/L 2-(N-吗啉代)乙烷磺酸(MES)、20g/L葡萄糖、5mg/L N6-(2-异戊烯基)腺嘌呤(2iP)(储液20mg/ml溶于DMSO)、0.15mg/L吲哚-3-乙酸(IAA)(储液1.5mg/ml溶于DMSO)、8g/L琼脂pH5.8。SIM V750 K100是SIM培养基添加750mg/L万古霉素和100mg/L卡那霉素。SIM V500 K100是SIM培养基添加500mg/L万古霉素和100mg/L卡那霉素。GM K50是GM培养基添加50mg/L卡那霉素。
将培养基高压灭菌(121℃20min)。将维生素溶于水，并在高压灭菌前加到培养基中。将激素溶于二甲亚砜(DMSO)。将抗生素溶于水，并过滤除菌(0.22μm)。将培养基高压灭菌，并在冷却至65℃后加入激素和抗生素。在所有情况中，使用9cm培养皿(Falcon，3003)，只是通常将GM和GM K50倒到15cm培养皿(Falcon，3025)中。
使用前将装有固体培养基的平板在层流中干燥以除去冷凝水。实施例7：拟南芥品系和生长条件
拟南芥种子生态型哥伦比亚(Col-0)野生型购自美国Lehle种子公司(1102 South Industrial大街，Suite D，Round Rock TX 78681，美国)。在装有4份沙、4份园土、和1份agrilit混合物的盆中栽培植物，22℃，光照/黑暗循环16/8小时。实施例8：农杆菌菌株和培养物
依照Walkerpeach和Velten(“Agrobacterium-mediated genetransfer to plant cell：Cointegrate and binary vector systems”即由农杆菌介导基因转移至植物细胞：共整合和二元载体系统，《PlantMolecular Biology Manual》即植物分子生物学手册，B1：1-19，1994，S.B.Gelvin、R.A.Schilperoort编，Kluvers学术出版社)描述的方案，通过三亲交配将载体质粒导入受体根癌农杆菌菌株LBA4404(Clontech)。所用转移菌株是包含接合质粒pRK2013(Ditta等人，1980，Broad host range DNA cloning system from Gram-negativebacteria.Construction of gene bank of Rhizobium meliloti.即来自革兰氏阴性细菌的宿主范围广泛的DNA克隆系统。苜蓿根瘤菌基因库的构建，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：7347-7351)的大肠杆菌HB101。在未添加抗生素的LB培养基(Sambrook等人，1989，《Molecular Cloning》即分子克隆，冷泉港，冷泉港实验室出版社，纽约)中于28℃以200rpm培养用于根转化的农杆菌。
实施例9：种子灭菌
在2ml Eppendorf管中，将种子在70％EtOH、0.05％吐温20中浸泡1分钟。用移液枪吸去70％EtOH、0.05％吐温20，并再次在5％NaOCl、0.05％吐温20中浸泡15分钟。经常摇动种子。在无菌条件下除去溶液，并将种子用无菌的蒸馏水清洗3次，每次10分钟。最后一次清洗后，将种子置于0.5-1ml水中。可以立即使用种子，或者保存于4℃，可长达2-3周。用镊子将无菌种子(20-30粒)转移到15cm培养皿中的GM培养基上。在栽培室(22℃，光照/黑暗循环16/8小时)中，幼苗在垂直放置的平板中生长。实施例10：拟南芥根外植体的转化
将3周龄幼苗的根用于转化流程。根不应是绿色或褐色的。用解剖刀和镊子除去幼苗的绿色部分。收集剩余的根，并在每个装有固体CIM培养基的平板上放置大约5个完整根系统。将根轻轻的压入平板表面，以确保与培养基的完全接触，但是它们不应浸入琼脂。将根在栽培室(22℃，光照/黑暗循环16/8小时)中培养3天。然后将根转移至装有用液体CIM培养基润湿的滤纸的无菌培养皿，并用解剖刀切成0.5-1cm小段。然后将根外植体转移至装有10ml液体CIM培养基的50ml无菌Falcon管。向该管中加入0.5ml农杆菌过夜培养物(OD 0.6-1)，并保温1-2分钟，同时轻轻摇动。用镊子固定无菌金属筛(50目，Sigma，S-0895)，并通过它倒掉管中的液体。根通常停留在管口附近的管壁上。然后将根外植体转移至装有滤纸的无菌培养皿，并稍微印干以除去过量液体。将根外植体置于装有固体CIM培养基的平板上，并在栽培室中在小光灯(1.5-2klux)下培养2天。在共培养阶段之后应当能够看到农杆菌过度生长的轻微痕迹。然后将根外植体转移至装有20ml液体CIM培养基(添加1000mg/L万古霉素)的50ml Falcon管。将Falcon管轻微漩涡震动以除去农杆菌。如上所述倒掉管中的液体，并将外植体在滤纸上稍微印干。然后将外植体转移至装有SIM V750 K100培养基的平板。根应当紧密接触培养基。将外植体在栽培室中在正常条件下培养1周，然后转移至SIM V500 K100培养基，并继续培养1周。然后将万古霉素的量降至250mg/L。在SIM培养基上培养的第三周结束时应当出现初苗。长到0.3-0.5cm长时切下苗，除去任何残余愈伤组织，并将苗转移至装有GM K50培养基的15cm平板。每个平板最多放置3根苗。为了得到更多的苗，可以将剩余根外植体转移至新鲜SIM平板(添加125mg/L万古霉素和100mg/L卡那霉素)，继续培养2周。可以将生根的苗转移至土壤使其结子。将未生根的苗转移至装有GM培养基的Magenta罐(每罐一根)以体外生成种子。
在栽培室中，将来自各个转基因植株的种子在GM K50培养基上发芽2周。选择表型正常即形成绿色真叶和分支根系统的卡那霉素抗性幼苗用于进一步分析。实施例11：β-葡糖醛酸酶(GUS)的组织化学测定法
将体外培养的幼苗或土壤中生长的植株用于GUS测定法。将整个幼苗或解离的器官浸入GUS染色液。GUS染色液包含1mM 5-溴-4-氯-3-吲哚葡糖苷酸(X-Gluc，Duchefa，储液20mM溶于DMSO)、100mM磷酸钠缓冲液pH7.0、10mM EDTA pH8.0、和0.1％屈立通X-100。将组织样品于37℃保温1-16小时。如果需要，可以清理样品，即用70％EtOH清洗几次以除去叶绿素。实施例12：烟草转化载体pZU627的构建
依照制造商的指示，使用铂金Pfx DNA聚合酶(LifeTechnologies)进行所有PCR反应。1.NOS终止子的扩增和克隆
使用NOS终止子正向引物(SEQ ID NO：21)和NOS终止子反向引物(SEQ ID NO：22)由pBIN19(Bevan等人，1984)扩增NOS终止子。正向引物经修饰包含PstI位点，反向引物经修饰包含HindIII位点。将NOS终止子扩增产物作为PstI/HindIII片段克隆到pBluescript(Stratagene)的相同位点中，生成质粒pZU400A。2.番茄斑矮病毒核壳蛋白(TSWV NP)基因的扩增和克隆
为了获得不能翻译的TSWV NP基因，将经修饰的TSWV NP基因引物用于扩增TSWV NP基因。TSWV NP基因正向引物导入BamHI、SphI、起始密码子、和终止密码子(SEQ ID NO：23)。反向引物经修饰导入PstI位点(SEQ ID NO：24)。将扩增产物作为BamHI/PstI片段克隆到pZU400A的BamHI/PstI位点中，位于NOS终止子上游，方向与其相同。在生成的克隆pZU400b中，依照制造商的指示，通过T4 DNA聚合酶处理(LifeTechnologies)除去TSWV NP基因与NOS终止子之间的PstI位点。由生成的克隆pZU400C，将TSWV NP基因和NOS终止子作为SphI/HindIII片段克隆到穿梭载体pZO1560的SphI/HindIII位点中，生成质粒pZU400。pZO1560是pBluescript的衍生物，其中原始多克隆位点被AGLINK多克隆位点(SEQ ID NO：27)取代。3.CmYLCV启动子的扩增和克隆
使用CmYLCV启动子正向引物(SEQ ID NO：25)和CmYLCV启动子反向引物(SEQ ID NO：26)扩增CmYLCV病毒启动子。正向引物经修饰包含SstI位点，反向引物经修饰包含PstI位点。将扩增的CmYLCV病毒启动子作为SstI/PstI片段克隆到pZU400的SstI/PstI位点中，位于TSWV-N基因上游，方向与TSWV-N基因相同。生成的克隆pZU625所包含的病毒基因盒能够生成不能翻译的TSWV NP RNA。4.将病毒基因盒克隆至pVictorHiNK
将病毒基因盒作为AscI/PacI片段由pZU625克隆到pVictorHiNK载体pZU494的AscI/PacI位点中，生成植物转化载体pZU627。pVictorHiNK是包含衍生自铜绿假单胞菌质粒pVS1的复制起点(ORI)(已知它在根癌农杆菌中高度稳定)的二元载体(Itoh等人，1984，Plasmid，11：206-220；Itoh和Haas，1985，Gene，36：27-36)。pVS1 ORI只在农杆菌中有功能，而且能够通过三亲交配流程被辅助质粒pRK2013由大肠杆菌转移至根癌农杆菌(Ditta等人，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：7347-7351)。
该二元载体还包含ColE1复制起点，它在大肠杆菌中有功能且衍生自pUC19(Yannisch-Perron等人，1985，Gene，33：103-119)。
为了在大肠杆菌和根癌农杆菌中得到维持，该载体包含由来自转座子Tn7(Fling等人，1985，Nucl.Acid Res.，13：7095)的0.93kb基因编码的、针对壮观霉素和链霉素的细菌抗性基因，它作为选择标记而发挥功能，用于在大肠杆菌和根癌农杆菌中维持载体。为了有效的细菌表达，将该基因融合tac启动子(Amman等人，1983，Gene，25：167-178)。
长度分别为1.9kb和0.9kb、包含24bp边界重复序列的T-DNA右边界和左边界片段衍生自胭脂碱型根癌农杆菌菌株pTi137的Ti质粒(Yadev等人，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79：6322-6326)。随后修饰边界之间的T-DNA区域，即删除由M13衍生的序列，并且为了改进它的克隆通用性而导入BIGLINK多克隆位点(SEQ ID NO：28)，生成pVictorHiNK。
pVictorHiNK包含用于在植物转化过程中选择转化体的NPTII基因盒。该基因盒包含由根癌农杆菌获得的NOS启动子、NPTII基因、和NOS终止子。实施例13：植物转化和抗性筛选1.用二元载体转化植物材料
将二元载体转移至植物材料的方法已经建立且对于本领域技术人员而言是知道的。由于例如所用农杆菌菌株的不同、外植体材料的来源不同、依赖所用栽培种以及植物物种的再生系统的不同，流程中存在变化。依照如下流程，将二元载体pZU627用于植物转化实验。通过三亲交配用pZU627转染至受体根癌农杆菌菌株中，随后对接合后体进行Southern印迹分析以确认构建物正确转移至受体菌株，将拒受性外植体材料接种重组根癌农杆菌菌株并与其共培养，使用适当的抗生素选择性杀死根癌农杆菌菌株，通过在含卡那霉素的选择培养基上的生长来选择经转化细胞，将小植株转移至土壤，通过对植株的分离染色体DNA进行Southern印迹分析来测定整合的T-DNA的完整性。2.植物对TSWV感染的抗性
在温室中在标准隔离条件下培养经转化植株以防止任何病原体感染。在四叶期，通过机械接种用TSWV感染植株。将来自全身感染TSWV植株的组织在5倍体积的冰冷接种缓冲液(10mM磷酸盐缓冲液，添加1％Na2SO3)中研磨，并在存在金刚砂粉末时摩擦前两片完全伸展的新叶。在接种后3周内对接种后的植株监测症状发展。包含pZU627序列的植株不显示TSWV症状，而未转化对照植株在接种后7天内显示严重的全身性TSWV症状。将抗性植株自花授粉，并收获种子。对后代植株分析整合基因的分离，随后如上所述再次筛选对TSWV感染的抗性。实施例14：用于植物转化的CmpS-磷酸甘露糖异构酶-nos构建物的构建
使用具有侧翼BamHI位点的Cmpf-B引物(cgc gga tcc tgg cag acaaag tgg cag a；SEQ ID NO：29)和CmpS-B引物(cgc gga tcc tac ttctag gct act tg；SEQ ID NO：30)PCR扩增CmpS启动子。将生成的PCR片段克隆到pBluescript KS(+)的BamHI位点中，形成pNOV4211。
为了构建用于根癌农杆菌转化的二元载体，使用BamHI由pNOV4211切下CmpS启动子，并在PMI基因上游插入经BamHI消化的pNOV2804(SEQID NO：31)，生成载体pNOV2819。pNOV2804(SEQ ID NO：31)是具有VS1复制起点的二元载体，主链中具有一个拷贝的农杆菌virG基因，且在T-DNA的左边界与右边界之间具有无启动子的PMI-nos终止子表达盒。PMI(磷酸甘露糖异构酶)是大肠杆菌manA基因(Joersbo和Okkels，1996，Plant Cell Reports，16：219-221；Negrotto等人，2000，Plant Cell Reports，19：798-803)的编码区。nos(胭脂碱合酶)终止子得自根癌农杆菌T-DNA(Depicker等人，1982，J.Mol.Appl.Genet.，1(6)：561-573)。磷酸甘露糖异构酶编码区和nos终止子分别位于pNOV2804(SEQ ID NO：31)的第290-1465nt和第1516-1789nt。
为了构建用于biolistic转化的载体，使用BamHI由pNOV4211切下CmpS启动子，并插入经BamHI消化的pNOV3604(SEQ ID NO：32)，形成pNOV2820，由此构建成由CmpS启动子驱动的PMI表达盒。pNOV3604是用于制备biolistic片段的载体，而且是以pUC19为基础的，具有ColE1复制起点和赋予氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因。与pNOV2804一样，pNOV3604也包含无启动子的PMI-nos终止子表达盒(见下文)。磷酸甘露糖异构酶编码区和nos终止子分别位于pNOV3604(SEQID NO：32)的第42-1217nt和第1268-1541nt。
将二元载体pNOV2819用于根癌农杆菌转化，将载体pNOV2820用于biolistic转化。实施例15：用于在植物中稳定表达的CmpC-GUS质粒的构建1.二元载体的构建
选择并修饰载体pCambia 1302(Cambia，堪培拉，澳大利亚；Roberts，C.S.、Rajagopal，S.、Smith，L.、Nguyen，T.、Yang，W.、Nugroho，S.、Ravi，K.S.、Cao，M.L.、Vijayachandra，K.等人，“Acomprehensive set of modular vectors for advanced manipulationand efficient transformation of plants”即用于植物的高级操作和有效转化的一组全面的模块化载体，洛克菲勒基金会水稻生物技术国际计划会议，马六甲，马来西亚，1997年9月15-19日)用于实验：通过HindIII内切核酸酶对第9788位的消化和NcoI内切核酸酶对第1位的消化除去GFP基因前面的CaMV 35S启动子，并将载体的两个相容末端再次连接。通过XhoI内切核酸酶对第7613位的消化和BstXI对第9494位的消化切除潮霉素基因及其前面的CaMV 35S启动子。由载体切除35S启动子序列以排除由同源性介导的基因沉默的任何风险。
将由1’启动子(Mengiste等人，Plant J.，12(4)：945-948，1997)驱动的bar基因导入第9737位EcoRI位点作为选择标记。将获得的载体命名为pCamBar。2.生成的构建物
分别将实施例3所述盒CmpCG和CapG插入pCamBar载体的第9764位XbaI位点与第9737位EcoRI位点之间，获得pCamBarCmpCG和pCamBarCapG质粒。将两种构建物用于转化根癌农杆菌细胞。实施例16：拟南芥中的稳定表达1.植物的生成和转染
将拟南芥(哥伦比亚0)野生型种子播种，于4℃在黑暗中冷处理3天以实现同步发芽，并转移至栽培室(22℃，24小时光照)。当它们生成最大数目的未展开芽苞时，浸润发芽植株。浸润是依照clough和Bent，Plant J.，16：735-743，1987所述方案进行的。2.转基因植株的选择
通过每5天喷洒BASTA即草铵膦除草剂(Plüss-Staufer AG/SA)(150mg/L)，进行3次来选择由T1代种子获得的幼苗。选择后收集了20株pCamBarCmpCG抗性植株和9株pCamBarCapG抗性植株。在所述条件下栽培它们以获得T2代种子。这些种子经历与上文所述用于野生型的相同流程，通过草铵膦喷洒选择T2幼苗，并对抗性突变体分析GUS基因表达。3.稳定转化的拟南芥植株中的组织化学GUS表达
如实施例11所述进行GUS组织化学染色。在15ml培养管中进行分析，将转化后的幼苗浸泡在X-gluc溶液中，以130mBar施压10分钟，并于37℃保温过夜。由经pCamBarCmpCG转化的拟南芥植株获得的结果指示，GUS报告基因在所有营养器官中具有由CmpC启动子驱动的组成性表达。4.稳定转化的拟南芥植株中的定量酶学GUS测定法
A.样品制备
每种转基因系选4株植株、每株植株选1片叶子用于测试。将4片叶子收集到相同eppendorf管中，用液氮冷冻，并用一次性研磨器磨成细粉。将其在150μl GUS缓冲液(0.05M NaPO4 pH7、0.01M EDTA、0.1％屈立通X-100、0.1％Sarkosyl)中稀释，于37℃保温5分钟，并在微量离心机中以最大速度离心5分钟。将上清液转移至新的eppendorf管，并将这些样品用于酶学测试。
依照Bradford法(Bradford，M.M.，Anal.Biochem.，72：248-254，1976)评估这些植物提取物中的蛋白质，以BSA作为标准。使用提取的样品作为模板，通过PCR分析确认了突变系中启动子和GUS基因的存在。
B.荧光GUS测定法
如实施例5所述进行GUS荧光测定法。为了检测GUS基因表达，在GUS缓冲液中稀释表达样品。在存在等量的GUS反应缓冲液时于37℃进行反应，并用2M Ammediol终止反应。在Titertek Fluoroskan II中测量活性。
在选择的经pCamBarCmpCG转化的20个系中有15个、在经pCamBarCapG转化的9个系中有8个在叶片中显示有GUS酶活性。几个CmpCG转化系中的活性水平与CapG可比。但是，由于基因型的差异(基因座的数目和每个基因座的转基因插入片段数目)，不同转基因系的结果是不同的。实施例17：CmpC启动子变体的构建
正如实施例1所述，使用Pfu聚合酶(Stratagene)进行所有PCR反应。1.DNA的扩增和克隆
生成pCmpCG质粒(实施例3)的两种变体，pCmpMG和pCmpMsG。前者删除了CmpC启动子中的序列“GTGGTCCC”，后者将其突变成序列“GTGCTCGC”。
为了获得pCmpMG，扩增了3个PCR片段：CmpM1：使用Cmp1正向引物(见实施例3，SEQ ID NO：13)和CmpMr反向引物(CCATCGTGGTATTTGGTATTG，SEQ ID NO：33)，以pCmpCG质粒作为模板。CmpM2：使用CmpMf正向引物(CAATACCAAATACCACGATGG，SEQ ID NO：34)和CmpC2反向引物(见实施例3，SEQ ID NO：14)，以pCmpCG质粒作为模板。CmpM：使用Cmp1正向引物和CmpC2反向引物，以等摩尔混和的CmpM1和CmpM2 PCR产物作为模板。
为了获得pCmpMsG，扩增了3个PCR片段：CmpMs1：使用Cmp1正向引物和CmpMrs反向引物(CGTGGTAGCGAGCACTTTGGT，SEQ ID NO：35)，以pCmpCG质粒作为模板。CmpMs2：使用CmpMfs正向引物(AAGTGCTCGCTACCACGATGG，SEQ ID NO：36)和Cmp2反向引物，以pCmpCG质粒作为模板。CmpsM：使用Cmp1正向引物和Cmp2反向引物，以等摩尔混和的CmpMs1和CmpMs2 PCR产物作为模板。
为了获得pCmpMG和pCmpMsG质粒，用XbaI和BamHI内切核酸酶限制性消化原始pCmpCG质粒以切除CmpC片段，并在该处插入CmpM和CmpMsPCR产物。实施例18：使用pCmpM和pCmpMs构建物的瞬时表达实验1.悬浮培养物和原生质体的制备
如实施例4所述生成悬浮培养物和原生质体。2.GUS测定法
如实施例4所述进行转染和蛋白质提取物的制备，如实施例5所述进行GUS测定法。
由10次不同实验的平均值获得GUS测定法的结果，并对标准克隆值进行标准化。CmpCG构建物中“GTGGTCCC”序列的删除将所有原生质体种类中GUS报告基因的表达降至来自CmpC的GUS报告基因表达的大约50％(见下文)。由“GTGCTCGC”突变诱导的效果依赖植物物种。在诸葛菜和水稻的原生质体中，GUS基因表达水平分别降至65.2％和73.6％。在N.plumbaginifolia的原生质体中，CmpMs启动子活性与CmpM启动子相似。
     N.plumbaginifolia
 CmpCG  100
 CmpMG  52±12％
 CmpMsG  53.7±16％
 CapG  28.3±14％
        诸葛菜
 CmpCG  100
 CmpMG  55.2±12％
 CmpMsG  73.6±10％
 CapG  5±1％
          水稻
 CmpCG  100
 CmpMG  59.6±21％
 CmpMsG  65.2±20％
 CapG  42.5±16％
实施例19：包含5’启动子片段且其可操作连接GFP或GUS报告基因的植物转化载体的构建1.启动子的扩增和克隆
构建嵌合基因，它包含来自CmYLCV全长转录本启动子(SEQ ID NO：1)的DNA序列且其融合包含内含子的植物优化GFP(synGFPI，SEQ ID NO：37)或包含内含子的GUS报告基因(GIG，SEQ ID NO：38)序列。GIG基因在SEQ ID NO：38的第385-576nt包含来自马铃薯(Solanumtuberosum)的ST-LS1内含子(由Purdue大学的Standon Gelvin博士处获得，且描述于Narasimhulu等人，1996，Plant Cell，8：873-886)。synGFPI是在SEQ ID NO：37的第278-465nt导入了ST-LS1内含子的植物优化GFP基因。关于启动子，将CmYLCV基因组DNA作为模板用于聚合酶链式反应(PCR)。设计基因特异引物来扩增DNA序列。使用Cmpf-B正向引物(SEQ ID NO：29)，联合5’向3’引物(CGCGGATTGCTCCCTTAACAATGAGG，SEQ ID NO：39)作为反向引物，分离对应于CmpC(SEQ ID NO：2)的基因片段。使用Cmpf-B正向引物(SEQ ID NO：29)，联合CmpS-B反向引物(SEQ ID NO：30)，分离对应于CmpS(SEQ ID NO：3)的基因片段。所有3种引物都在它们的5’端包含BamHI限制酶识别位点CGCGGA。依照制造商的指示，使用Pfu聚合酶(Stratagene)进行所有PCR反应。使用热循环仪(DNA Engine，MJResearch公司，Waltham，MA，美国)和如下PCR条件来扩增启动子片段：94℃ 10sec；20个循环的94℃ 10sec、56℃ 30sec、72℃ 60sec；72℃ 90sec。BamHI限制性消化后，将启动子片段连接到包含GIG基因或synGFPI基因的基于pUC的载体中，以构建启动子-报告基因融合体且其可操作连接nos终止子。2.生成的启动子-报告基因盒●  CmpS启动子片段+synGFPI基因+nos(SEQ ID NO：40)●  CmpS启动子片段+GIG基因+nos(SEQ ID NO：41)●  CmpC启动子片段+synGFPI基因+nos(SEQ ID NO：42)●  CmpC启动子片段+GIG基因+nos(SEQ ID NO：43)
SEQ ID NO 启动子 基因(synGFPI或GIG) 终止子
40 第1-402nt 第411-1331nt 第1343-1618nt
41 第1-405nt 第425-2425nt 第2479-2751nt
42 第1-354nt 第380-1292nt 第1304-1577nt
43 第1-354nt 第399-2399nt 第2453-2725nt
3.亚克隆到农杆菌二元载体中
将包含启动子片段、报告基因、和nos终止子的启动子-报告基因盒(SEQ ID NO：40-43)插入用于玉米转化的二元载体pNOV2117和用于番茄转化的二元载体pNOV4200。pNOV2117(SEQ ID NO：44)是具有VS1复制起点的二元载体，主链中具有一个拷贝的农杆菌virG基因，且在T-DNA的左边界与右边界之间具有玉米遍在蛋白启动子-PMI基因-nos终止子表达盒。PMI(磷酸甘露糖异构酶)是大肠杆菌manA基因(Joersbo和Okkels，1996，Plant Cell Reports，16：219-221；Negrotto等人，2000，Plant Cell Reports，19：798-803)的编码区。nos(胭脂碱合酶)终止子得自根癌农杆菌T-DNA(Depicker等人，1982，J.Mol.Appl.Genet.，1(6)：561-573)。玉米遍在蛋白启动子、磷酸甘露糖异构酶编码区、和nos终止子分别位于pNOV2117(SEQ ID NO：44)的第31-2012nt、第2109-3212nt、和第3273-3521nt。紧挨右边界插入报告基因-启动子盒。二元载体中的选择标记表达盒紧挨着左边界。
为了番茄转化，将pNOV4200(SEQ ID NO：45)用作二元载体，它包含VS1复制起点，位于主链中的一个拷贝的农杆菌virG基因，且在左边界与右边界之间包含潮霉素选择标记盒。潮霉素选择标记盒包含拟南芥遍在蛋白3启动子(Ubq3(At)，Callis等人，J.Biol.Chem.，265：12486-12493，1990)且其可操作连接编码潮霉素抗性的基因(本文称为“HYG”，来自大肠杆菌的合成潮霉素B磷酸转移酶基因，专利：JP 1986085192-A1，1986年4月30日)和nos终止子(Depicker等人，J.Mol.Appl.Genet.，1(6)：561-573，1982)。拟南芥遍在蛋白启动子、HYG基因、和nos终止子分别位于pNOV4200(SEQ ID NO：45)的第162-11494nt、第1897-2939nt、和第2939-3236nt。紧挨右边界插入报告基因-启动子盒(SEQ ID NO：40-43)。二元载体中的选择标记表达盒紧挨着左边界。
下文显示了二元载体构建物中选择标记和启动子-报告基因盒的取向。4.二元载体构建物●  NOV4215(右边界CmpS启动子片段+synGFPI基因+nos-ZmUbi+PMI基因+nos左边界)●  NOV4216(右边界nos+synGFPI基因+CmpS启动子片段-ZmUbi+PMI基因+nos左边界)●  NOV4217(右边界CmpS启动子片段+synGFPI基因+nos-Ubq3(At)+HYG基因+nos左边界)●  NOV4220(右边界CmpS启动子片段+GIG基因+nos-Ubq3(At)+HYG基因+nos左边界)●  NOV4224(右边界CmpC启动子片段+GIG基因+nos-ZmUbi+HYG基因+nos左边界)●  NOV4226(右边界CmpC启动子片段+synGFPI基因+nos-ZmUbi+PMI基因+nos左边界)
使用已知启动子构建了其它盒用于比较。为此目的，构建了包含玉米遍在蛋白启动子(Christensen等人，Plant Mol.Biol.，12：619-632，1989)且其可操作连接synGFP和35S终止子(35S term)的启动子盒ZmUbi-GFP-35S终止子(SEQ ID NO：46)，还构建了包含玉米遍在蛋白启动子且其可操作连接GIG基因和nos终止子的启动子盒(NOV 3612，SEQ ID NO：47)。ZmUbi启动子、GFP基因、和35S终止子分别位于SEQ ID NO：46的第1-2019nt、第2020-2751nt、和第2876-2949nt。ZmUbi启动子、GIG、和nos终止子分别位于SEQ ID NO：47的第1-1982nt、第2015-4015nt、和第4069-4341nt。将ZmUbi-GIG-nos盒(SEQ ID NO：47)克隆到基于pUC的载体中。如上所述，将ZmUbi-GFP-nos盒(SEQ ID NO：46)克隆到pNOV2117二元载体中，用于玉米转化。构建了包含拟南芥遍在蛋白3启动子(Ubq3(At))且其可操作连接synGFPI和nos终止子的启动子盒(SEQ ID NO：48)和包含拟南芥遍在蛋白3启动子且其可操作连接GIG基因和nos终止子的启动子盒(SEQ ID NO：49)。遍在蛋白3启动子、synGFPI基因、和nos终止子分别位于SEQ ID NO：48的第1-1332nt、第1738-2658nt、和第2670-2943nt。遍在蛋白3启动子、GIG基因、和nos终止子分别位于SEQID NO：49的第1-1335nt、第1746-3746位、和第3800-4072nt。如上所述，将启动子盒克隆到包含潮霉素选择标记盒的pNOV4200二元载体中，用于番茄转化。下文显示了二元载体构建物中选择标记和启动子-报告基因盒的取向。5.二元载体构建物●  NOV2110(右边界ZmUbi启动子+synGFPI基因+35S终止子-ZmUbi+PMI基因+nos左边界)●  NOV4209(右边界Ubq3(At)启动子+synGFPI基因+nos-Ubq3(At)+HYG基因+nos左边界)●  NOV4208(右边界Ubq3(At)启动子+GUS-内含子-GUS基因+nos-Ubq3(At)+HYG基因+nos左边界)实施例20：由农杆菌介导的玉米转化
基本上如Negrotto等人，2000，Plant Cell Reports，19：798-803所述进行未成熟玉米胚的转化。关于这个实施例，所有培养基的成分描述于Negrotto等人，见上文。但是，可以替代该文献中描述的各种培养基成分。1.转化质粒和选择标记
如实施例19所述，将用于转化的基因克隆到适用于玉米转化的载体中。所用载体包含磷酸甘露糖异构酶(PMI)基因(Negrotto等人，2000，Plant Cell Reports，19：798-803)。2.根癌农杆菌的制备
将包含植物转化质粒的农杆菌菌株LBA4404(pSB1)在YEP(酵母提取物5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 5g/L、琼脂15g/L pH6.8)固体培养基上于28℃培养2-4天。将大约0.8×109个农杆菌悬于添加100μM乙酰丁香酮(As)的LS-inf培养基(Negrotto等人，2000，Plant CellReports，19：798-803)。将细菌在该培养基中预诱导30-60分钟。3.接种
由A188或其它合适玉米基因型的8-12日龄穗切下未成熟胚并转移至添加100μM As的液体LS-inf。将胚用新鲜的感染培养基漂洗一次。然后加入农杆菌溶液，并将胚漩涡震动30秒钟，使其与细菌作用5分钟。然后将胚转移至LSAs培养基，盾片侧朝上，并在黑暗中培养2-3天。随后，将每个培养皿20-25个胚转移至添加250mg/L头孢噻肟和1.6mg/L硝酸银的LSDc培养基，并在黑暗中于28℃培养10天。4.经转化细胞的选择和经转化植株的再生
将未成熟胚生成的胚性愈伤组织转移至LSD1M0.5S培养基。在该培养基上对培养物选择6周，第3周进行继代培养步骤。将存活愈伤组织转移至LSD1M0.5S培养基扩大培养或转移至Reg1培养基。在光照下培养(16小时光照/8小时黑暗方案)之后，将绿色组织转移至不含调节剂的Reg2培养基，并培养1-2周。将小植株转移至装有Reg3培养基的Magenta GA-7盒(Magenta公司，Chicago III)，并在光照下培养。将启动子-报告基因盒呈PCR阳性的植株转移至土壤，并在温室中栽培。实施例21：番茄的稳定转化
基本上如Meissner等人，The Plant Journal，12：1465-1472，1997所述进行番茄转化。1.转化质粒和选择标记
如实施例19所述，将用于转化的基因克隆到适用于番茄转化的载体中。载体包含用于选择的潮霉素抗性基因。2.根癌农杆菌的制备
将包含植物转化质粒的农杆菌菌株GV3101在LB(酵母提取物5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 5g/L、琼脂15g/L pH6.8)液体培养基上于22℃培养2天。将大约0.8×109个农杆菌悬于添加100μM乙酰丁香酮的KCMS接种培养基(MS盐4.3g/L、Myo-Inositol、硫胺素1.3μg/ml、2，4-D 0.2μg/ml、激动素0.1μg/ml、和蔗糖3％，pH5.5)。将细菌在该培养基中预诱导60分钟。3.种子的灭菌和发芽
将番茄Micro-Tom栽培种(Meissner等人，The Plant Journal，12：1465-1472，1997)和ZTV-840栽培种的种子在含吐温的20％漂白液中浸泡20分钟。然后将种子用无菌水清洗3次，并置于Magenta盒(Magenta公司，Chicago III)中的TSG培养基(1/2 MS盐、1％蔗糖、1％植物用琼脂pH5.8)上进行发芽。在发芽后7-10天切下子叶，并将子叶叶柄切成5mm区段。4.接种
在接种农杆菌之前，将7-10日龄子叶和子叶叶柄区段在烟草BY-2饲养细胞平板(MS盐、Myo-inisitol 0.1mg/ml、酪蛋白水解物0.2mg/ml、盐酸硫胺系1.3μg/ml、3％蔗糖pH5.5)上保温24小时。
将子叶在液体KCMS农杆菌悬浮液中浸泡5分钟。然后将20-25片子叶转移至相同饲养细胞平板，远轴侧朝上，并在黑暗中培养2-3天。5.经转化子叶和叶柄的选择和经转化植株的再生
在光照下接种农杆菌后2-3天，将子叶和叶柄区段转移至选择培养基TSM-1(4.3g/L MS盐、1xB5维生素、2％蔗糖、1％葡萄糖、1μg/ml玉米素、0.05μg/ml IAA、5μg/ml潮霉素、和250μg/ml羧苄青霉素pH5.8)。将子叶和叶柄区段生成的胚性愈伤组织转移至TSM-2培养基(MS盐4.3g/L、1xMS维生素、2％蔗糖、1μg/ml玉米素、5μg/ml潮霉素、和250μg/ml羧苄青霉素pH5.8)。将存活愈伤组织形成的小植株转移至装有TRM培养基(4.3g/L MS盐、1xMS维生素、2％蔗糖pH5.8)的Magenta GA-7盒(Magenta公司，Chicago III)，并在光照下培养。生根后，将原代转化体转移至土壤。实施例22：绿色荧光蛋白(GFP)的荧光测定法
为了检测synGFP基因表达而进行荧光测定法。
将稳定转化的玉米和番茄的叶片在干冰上冷冻。将冷冻组织彻底磨碎，并与300μl GFP提取缓冲液(10mM Tris-HCl pH7.5、100mM NaCl、1mM MgCl2、10mM DTT、和0.1％Sarcosyl)混和。通过离心将提取物与叶片碎屑分开，随后转移至具有透明底部的黑色96孔板(Costar3615)。通过Spectra Fluor Plus Plate Reader在465nm激发和512nm发射处测量相对荧光单位(RFU)。将GFP活性对使用BCA测定法(依照Pierce)测量的总蛋白进行标准化。实施例23：稳定转化的玉米和番茄植株的表达分析1.玉米转基因To植株
GFP在CmpS启动子(NOV4215、NOV4216)控制下的表达水平比在ZmUbi启动子(NOV2110)控制下高10-20倍。这些结果是由42株独立To系的叶片样品获得的，代表了总共93株To植株。2.GFP ELISA测定法
为了检测绿色荧光蛋白(GFP)而进行定量三明治免疫测定法。使用两种商品化的多克隆抗体。山羊抗GFP IAP(Rockland，#600-1-1-215)是免疫亲和纯化的，兔抗GFP抗体(Torrey PinesBiolabs，#TP401)是蛋白A纯化的。通过兔抗体将植物提取物中的GFP蛋白质捕获到固相微量滴定板上。然后在固相兔抗体、GFP蛋白质、与孔中的第二种山羊抗体之间形成“三明治”。通过清洗步骤除去未结合的二抗之后，使用碱性磷酸酶标记的抗体检测结合的抗体。加入酶的底物，并通过读取每个孔的吸光值来测量显色。然后将读数拟合标准曲线，绘制GFP浓度对吸光值的曲线。
                    synGFP报告基因
    二元载体盒 GFP活性(平均值)RFU/mg蛋白质 ELISA(平均值)ng GFP/mg蛋白质
 NOV4215(CmpS) 4722.3  657.1
 NOV4216(CmpS) 2795.8  246.1
 NOV2110(ZmUbi) 272.0  41.4
2.番茄(Lycopersicon esculentum)TO植株
CmYLcV启动子的CmpS片段(NOV4217)导致synGFP的表达水平显著高于拟南芥Ubq3启动子(NOV4209)的表达水平。
synGFP报告基因
这些结果是通过使用显微镜对5株独立的经NOV4217盒稳定转化的愈伤组织系和2株独立的经NOV4209盒稳定转化的愈伤组织系评估愈伤组织和初生苗中的synGFP荧光强度而获得的。
二元载体盒(启动子) 愈伤组织编号 GFP荧光强度
NOV4217(CmpS) NOV4217-1 +++++
NOV4217(CmpS) NOV4217-2 ++++
NOV4217(CmpS) NOV4217-3 ++++
NOV4217(CmpS) NOV4217-4 +++
NOV4217(CmpS) NOV4217-5 +++
NOV4209(Ubq3(At)) NOV4209-1 +
NOV4209(Ubq3(At)) NOV4209-2 +
GUS-内含子-GUS报告基因
这些结果是通过对11株独立的包含CmpS启动子-报告基因盒的稳定转化的愈伤组织系(系NOV4220-1至NOV4220-11)评估GUS染色强度而获得的。还评估了2株包含CmYLCV启动子的CmpC启动子片段的稳定转化的愈伤组织系(NOV4224-1、NOV4224-2)。为了比较，还评估了2株包含拟南芥遍在蛋白3(Ubq3)启动子的稳定转化的愈伤组织系(NOV4208-1、NOV4208-2)。
二元载体盒(启动子) 愈伤组织编号 GUS染色
NOV4220(CmpS) NOV4220-1 ++++
NOV4220(CmpS) NOV4220-2 +++
NOV4220(CmpS) NOV4220-3 ++++
NOV4220(CmpS) NOV4220-4 +++++
NOV4220(CmpS) NOV4220-5 +++++
NOV4220(CmpS) NOV4220-6 +++
NOV4220(CmpS) NOV4220-7 ++++
NOV4220(CmpS) NOV4220-8 +++++
NOV4220(CmpS) NOV4220-9 ++++
NOV4220(CmpS) NOV4220-10 +++
NOV4220(CmpS) NOV4220-11 ++++
NOV4224(CmpC) NOV4224-1 ++++
NOV4224(CmpC) NOV4224-2 +++
NOV4208(Ubq3(At)) NOV4208-1 +
NOV4208(Ubq3(At)) NOV4208-2 ++
实施例24：玉米中的瞬时表达实验1.胚的制备
由A188或其它合适玉米基因型的8-12日龄穗切下未成熟胚并转移至液体2DG4+0.5d(Duncan氏D培养基经修改包含20mg/L葡萄糖并添加10g/L甘露糖)，并培养1-2天。2.质壁分离
在轰击前，将未成熟胚在12％蔗糖溶液中保温3-4小时。将胚在平板上排列成8-10mm圈。3.轰击
如Wright等人(2001，Plant cell Reports，印刷中)所述，通过在存在5μg质粒DNA时于650psi对玉米胚进行微粒轰击来进行转染。
倘若“印刷中”的参考文献不起作用，下面是由该论文提取的细节：如DuPont Biolistics手册所述将片段DNA沉淀在金微载体(＜1μm)上。使用PDS-1000He Biolistics装置将基因投递至靶组织细胞。装置的设置如下：破裂盘与巨载体相距8mm，巨载体与终止屏相距10mm，终止屏与靶相距7cm。使用650psi破裂盘用DNA包被的微粒射击平板两次。为了降低氦爆冲击波对组织的损伤，将不锈钢筛网(在水平和垂直方向上每英寸线性距离有200个孔；McMaster-Carr，New Brunswick，NJ)置于终止屏与靶组织之间。将胚在平板上在黑暗中于25℃培养48小时。通过在GUS裂解缓冲液中裂解细胞来制备蛋白质提取物，并通过离心来实现澄清。
实施例25：GUS测定法
为了检测GUS基因表达而进行组织化学和化学发光测定法。1.β-葡糖醛酸酶(GUS)的组织化学测定法
将玉米胚和番茄体外愈伤组织用于GUS测定法。将整个胚或小块愈伤组织浸入GUS染色液。GUS染色液包含1mM 5-溴-4-氯-3-吲哚葡萄糖苷酸(X-Gluc，Duchefa，储液20mM溶于DMSO)、100mM磷酸钠缓冲液pH7.0、10mM EDTA pH8.0、和0.1％屈立通X-100。将组织样品于37℃保温1-16小时。如果需要，可以清理样品，即用70％EtOH清洗几次以除去叶绿素。2.β-葡糖醛酸酶(GUS)的化学发光测定法
为了定量分析GUS表达，依照制造商的指示使用GUS-光试剂盒(Tropix公司)来进行GUS化学发光测定法。在光度计中测量活性。
将构建物pCmpS和pCmpMG(实施例17)的GUS结果对比较克隆值(pNOV3612，实施例19)进行标准化。由2次不同实验获得的结果显示，与pCmpS相比，CmYLCV启动子中的8bp删除(pCmpMG，实施例17)不显著影响GUS报告基因的表达水平。玉米胚中的瞬时表达
      感染后48小时和72小时时的GUS活性
构建物编号     GUS活性(RFU/mg蛋白质)
 48小时  72小时
pCmpS  103.7  51.7
pCmpMG  81.4  70.8
ZmUbi(pNOV3612)  52.6  70.2
                         序列表<110>Syngenta Participations AG<120>夜香树黄叶卷曲病毒启动子<130>S-31359A<140><141><150>GB 0007427.8<151>2000-03-27<150>GB 0010486.9<151>2000-04-28<150>EP 01101802.5<151>2001-01-26<150>US<151>2001-02-28<160>49<170>PatentIn Ver.2.2<210>1<211>670<212>DNA<213>夜香树黄叶卷曲病毒<400>1attactggca gacaaagtgg cagacatact gtcccacaaa tgaagatgga atctgtaaaa 60gaaaacgcgt gaaataatgc gtctgacaaa ggttaggtcg gctgccttta atcaatacca 120aagtggtccc taccacgatg gaaaaactgt gcagtcggtt tggctttttc tgacgaacaa 180ataagattcg tggccgacag gtgggggtcc accatgtgaa ggcatcttca gactccaata 240atggagcaat gacgtaaggg cttacgaaat aagtaagggt agtttgggaa atgtccactc 300acccgtcagt ctataaatac ttagcccctc cctcattgtt aagggagcaa aatctcagag 360agatagtcct agagagagaa agagagcaag tagcctagaa gtagtcaagg cggcgaagta 420ttcaggcagg gtggccagga agaagaaaag ccaagacgac gaaaacaggt aagagctaag 480ctttctcatc tcaaagatga ttcttgatga tttttgtctc cacggtccgt ataggatcca 540ctgaattgat aaatatcata tggtttgtat aaaacccgat atttaaatct gtatcattct 600gtttgaataa aacttgatac tttgttggag tcgtttgtaa aaacataaac aattataatc 660tgttaaaaac                                                        670<210>2<211>346<212>DNA<213>夜香树黄叶卷曲病毒<400>2ctggcagaca aagtggcaga catactgtcc cacaaatgaa gatggaatct gtaaaagaaa 60acgcgtgaaa taatgcgtct gacaaaggtt aggtcggctg cctttaatca ataccaaagt 120ggtccctacc acgatggaaa aactgtgcag tcggtttggc tttttctgac gaacaaataa 180gattcgtggc cgacaggtgg gggtccacca tgtgaaggca tcttcagact ccaataatgg 240agcaatgacg taagggctta cgaaataagt aagggtagtt tgggaaatgt ccactcaccc 300gtcagtctat aaatacttag cccctccctc attgttaagg gagcaa                346<210>3<211>400<212>DNA<213>夜香树黄叶卷曲病毒<400>3ctggcagaca aagtggcaga catactgtcc cacaaatgaa gatggaatct gtaaaagaaa 60acgcgtgaaa taatgcgtct gacaaaggtt aggtcggctg cctttaatca ataccaaagt 120ggtccctacc acgatggaaa aactgtgcag tcggtttggc tttttctgac gaacaaataa 180gattcgtggc cgacaggtgg gggtccacca tgtgaaggca tcttcagact ccaataatgg 240agcaatgacg taagggctta cgaaataagt aagggtagtt tgggaaatgt ccactcaccc 300gtcagtctat aaatacttag cccctccctc attgttaagg gagcaaaatc tcagagagat 360agtcctagag agagaaagag agcaagtagc ctagaagtag                       400<210>4<211>634<212>DNA<213>夜香树黄叶卷曲病毒<400>4ctggcagaca aagtggcaga catactgtcc cacaaatgaa gatggaatct gtaaaagaaa 60acgcgtgaaa taatgcgtct gacaaaggtt aggtcggctg cctttaatca ataccaaagt 120ggtccctacc acgatggaaa aactgtgcag tcggtttggc tttttctgac gaacaaataa 180gattcgtggc cgacaggtgg gggtccacca tgtgaaggca tcttcagact ccaataatgg 240agcaatgacg taagggctta cgaaataagt aagggtagtt tgggaaatgt ccactcaccc 300gtcagtctat aaatacttag cccctccctc attgttaagg gagcaaaatc tcagagagat 360agtcctagag agagaaagag agcaagtagc ctagaagtag tcaaggcggc gaagtattca 420ggcagggtgg ccaggaagaa gaaaagccaa gacgacgaaa acaggtaaga gctaagcttt 480ctcatctcaa agatgattct tgatgatttt tgtctccacg gtccgtatag gatccactga 540attgataaat atcatatggt ttgtataaaa cccgatattt aaatctgtat cattctgttt 600gaataaaact tgatactttg ttggagtcgt ttgt                             634<210>5<211>32<212>DNA<213>夜香树黄叶卷曲病毒<400>5aaaaacataa acaattataa tctgttaaaa ac                               32<210>6<211>104<212>DNA<213>夜香树黄叶卷曲病毒<400>6ggcacagctg tcagttgtgc aaatccgagt catctggacc acaaacatca gaagagggtc 60tacaagagtc agaagacgaa gacttttcgg tgctagttta atta                  104<210>7<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸<400>7gaccacaaac atcagaag                                               18<210>8<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸<400>8caaacttatt gggtaatc                                               18<210>9<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸<400>9cagggtacca ctaaaatcac c                                           21<210>10<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸<400>10aggggatccc caattcccc                                              19<210>11<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸<400>11aggggtacca tcgatatgga g                                           21<210>12<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸<400>12ttaggatccg ccctgccac                                              19<210>13<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸<400>13cttctagaca aagtggcaga c                                           21<210>14<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸<400>14ttggtacctt aacaatgagg g                                           21<210>15<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸<400>15ctacttctag gtaccttgct c                                           21<210>16<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸<400>16ttggtacctt aacaatgagg g                                           21<210>17<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸<400>17ggggatcccc agtctctctc                                             20<210>18<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸<400>18gtgaattcga gctcggta                                               18<210>19<211>668<212>DNA<213>夜香树黄叶卷曲病毒<400>19attactggca gacaaagtgg cagacatact gtcccacaaa tgaagatgga atctgtaaaa 60gaaaacgcgt gaaataatgc gtctgacaaa ggttaggtcg gctgccttta atcaatacca 120aagtggtccc taccacgatg gaaaaactgt gcagtcggtt tggctttttc tgacgaacaa 180ataagattcg tggccgacag gtgggggtcc accatgtgaa ggcatcttca gactccaata 240atggagcaat gacgtaaggg cttacgaaat aagtaagggt agtttgggaa atgtccactc 300acccgtcagt ctataaatac ttagcccctc cctcattgtt aagggagcaa aatctcagag 360agatagtcct agagagagaa agagagcaag tagcctagaa gtagtcaagg cggcgaagta 420ttcaggcagg tggccaggaa gaagaaaagc caagacgacg aaaacaggta agagctaagc 480tttctcatct caaagatgat tcttgatgat ttttgtctcc acggtccgta taggatcact 540gaattgataa atatcatatg gtttgtataa aacccgatat ttaaatctgt atcattctgt 600ttgaataaaa cttgatactt tgttggagtc gtttgtaaaa acataaacaa ttataatctg 660ttaaaaac                                                          668<210>20<211>632<212>DNA<213>夜香树黄叶卷曲病毒<400>20ctggcagaca aagtggcaga catactgtcc cacaaatgaa gatggaatct gtaaaagaaa 60acgcgtgaaa taatgcgtct gacaaaggtt aggtcggctg cctttaatca ataccaaagt 120ggtccctacc acgatggaaa aactgtgcag tcggtttggc tttttctgac gaacaaataa 180gattcgtggc cgacaggtgg gggtccacca tgtgaaggca tcttcagact ccaataatgg 240agcaatgacg taagggctta cgaaataagt aagggtagtt tgggaaatgt ccactcaccc 300gtcagtctat aaatacttag cccctccctc attgttaagg gagcaaaatc tcagagagat 360agtcctagag agagaaagag agcaagtagc ctagaagtag tcaaggcggc gaagtattca 420ggcaggtggc caggaagaag aaaagccaag acgacgaaaa caggtaagag ctaagctttc 480tcatctcaaa gatgattctt gatgattttt gtctccacgg tccgtatagg atcactgaat 540tgataaatat catatggttt gtataaaacc cgatatttaa atctgtatca ttctgtttga 600ataaaacttg atactttgtt ggagtcgttt gt                               632<210>21<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸<400>21cccgctgcag atcgttcaaa catttggc                                    28<210>22<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸<400>22cccgaagctt tctagagatc tagtaac                                     27<210>23<211>41<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸<400>23gggcggatcc gcatgcatgt cttaaggtaa gctcactaag g                     41<210>24<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸<400>24ccgcgctgca ggctgctttc aagcaagttc tgcg                             34<210>25<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸<400>25ttgagagctc gtttaattac tggcagacaa agtgg                            35<210>26<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸<400>26ttgactgcag gtttatgttt ttacaaacga ctcc                             34<210>27<211>137<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：AGLINK多克隆位点<400>27gcggccgctc cggattcgaa ttaattaacg tacgaagctt gcatgcctgc agtgatcacc 60atggtcgact ctagaggatc cccgggtacc gagctcgaat tcggcgcgcc caattgattt 120aaatggccgc tgcggcc                                                137<210>28<211>216<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：BIGLINK多克隆位点<400>28ggccgcagcg gccatttaaa tcaattgggc gcgccgaatt cgagctcggt acccggggat 60cctctagagt cgaccatggt gatcactgca ggcatgcaag cttcgtacgt taattaattc 120gaatccggag cggccgcacg cgtgggcccg tttaaacctc gagagatctg ctagccctgc 180aggaaattta ccggtgcccg ggcggccagc atggcc                           216<210>29<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸<400>29cgcggatcct ggcagacaaa gtggcaga                                    28<210>30<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸<400>30cgcggatcct acttctaggc tacttg                                      26<210>31<211>7195<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：载体pNOV2804<400>31gtttacccgc caatatatcc tgtcaaacac tgatagttta aactgaaggc gggaaacgac 60aatctgatca tgagcggaga attaagggag tcacgttatg acccccgccg atgacgcggg 120acaagccgtt ttacgtttgg aactgacaga accgcaacgc tgcaggaatt ggccgcagcg 180gccatttaaa tcaattgggc gcgtacgtag cactagtgcg cgatcgctta attaagcggc 240gcgcctaaag cttgcatgcc tgcaggtcga ctctagagga tccccgatca tgcaaaaact 300cattaactca gtgcaaaact atgcctgggg cagcaaaacg gcgttgactg aactttatgg 360tatggaaaat ccgtccagcc agccgatggc cgagctgtgg atgggcgcac atccgaaaag 420cagttcacga gtgcagaatg ccgccggaga tatcgtttca ctgcgtgatg tgattgagag 480tgataaatcg actctgctcg gagaggccgt tgccaaacgc tttggcgaac tgcctttcct 540gttcaaagta ttatgcgcag cacagccact ctccattcag gttcatccaa acaaacacaa 600ttctgaaatc ggttttgcca aagaaaatgc cgcaggtatc ccgatggatg ccgccgagcg 660taactataaa gatcctaacc acaagccgga gctggttttt gcgctgacgc ctttccttgc 720gatgaacgcg tttcgtgaat tttccgagat tgtctcccta ctccagccgg tcgcaggtgc 780acatccggcg attgctcact ttttacaaca gcctgatgcc gaacgtttaa gcgaactgtt 840cgccagcctg ttgaatatgc agggtgaaga aaaatcccgc gcgctggcga ttttaaaatc 900ggccctcgat agccagcagg gtgaaccgtg gcaaacgatt cgtttaattt ctgaatttta 960cccggaagac agcggtctgt tctccccgct attgctgaat gtggtgaaat tgaaccctgg 1020cgaagcgatg ttcctgttcg ctgaaacacc gcacgcttac ctgcaaggcg tggcgctgga 1080agtgatggca aactccgata acgtgctgcg tgcgggtctg acgcctaaat acattgatat 1140tccggaactg gttgccaatg tgaaattcga agccaaaccg gctaaccagt tgttgaccca 1200gccggtgaaa caaggtgcag aactggactt cccgattcca gtggatgatt ttgccttctc 1260gctgcatgac cttagtgata aagaaaccac cattagccag cagagtgccg ccattttgtt 1320ctgcgtcgaa ggcgatgcaa cgttgtggaa aggttctcag cagttacagc ttaaaccggg 1380tgaatcagcg tttattgccg ccaacgaatc accggtgact gtcaaaggcc acggccgttt 1440agcgcgtgtt tacaacaagc tgtaagagct tactgaaaaa attaacatct cttgctaagc 1500tgggagctct agatccccga atttccccga tcgttcaaac atttggcaat aaagtttctt 1560aagattgaat cctgttgccg gtcttgcgat gattatcata taatttctgt tgaattacgt 1620taagcatgta ataattaaca tgtaatgcat gacgttattt atgagatggg tttttatgat 1680tagagtcccg caattataca tttaatacgc gatagaaaac aaaatatagc gcgcaaacta 1740ggataaatta tcgcgcgcgg tgtcatctat gttactagat cgggaattgg gtaccatgcc 1800cgggcggcca gcatggccgt atccgcaatg tgttattaag ttgtctaagc gtcaatttgt 1860ttacaccaca atatatcctg ccaccagcca gccaacagct ccccgaccgg cagctcggca 1920caaaatcacc actcgataca ggcagcccat cagaattaat tctcatgttt gacagcttat 1980catcgactgc acggtgcacc aatgcttctg gcgtcaggca gccatcggaa gctgtggtat 2040ggctgtgcag gtcgtaaatc actgcataat tcgtgtcgct caaggcgcac tcccgttctg 2100gataatgttt tttgcgccga catcataacg gttctggcaa atattctgaa atgagctgtt 2160gacaattaat catccggctc gtataatgtg tggaattgtg agcggataac aatttcacac 2220aggaaacaga ccatgaggga agcgttgatc gccgaagtat cgactcaact atcagaggta 2280gttggcgtca tcgagcgcca tctcgaaccg acgttgctgg ccgtacattt gtacggctcc 2340gcagtggatg gcggcctgaa gccacacagt gatattgatt tgctggttac ggtgaccgta 2400aggcttgatg aaacaacgcg gcgagctttg atcaacgacc ttttggaaac ttcggcttcc 2460cctggagaga gcgagattct ccgcgctgta gaagtcacca ttgttgtgca cgacgacatc 2520attccgtggc gttatccagc taagcgcgaa ctgcaatttg gagaatggca gcgcaatgac 2580attcttgcag gtatcttcga gccagccacg atcgacattg atctggctat cttgctgaca 2640aaagcaagag aacatagcgt tgccttggta ggtccagcgg cggaggaact ctttgatccg 2700gttcctgaac aggatctatt tgaggcgcta aatgaaacct taacgctatg gaactcgccg 2760cccgactggg ctggcgatga gcgaaatgta gtgcttacgt tgtcccgcat ttggtacagc 2820gcagtaaccg gcaaaatcgc gccgaaggat gtcgctgccg actgggcaat ggagcgcctg 2880ccggcccagt atcagcccgt catacttgaa gctaggcagg cttatcttgg acaagaagat 2940cgcttggcct cgcgcgcaga tcagttggaa gaatttgttc actacgtgaa aggcgagatc 3000accaaagtag tcggcaaata aagctctagt ggatctccgt acccccgggg gatctggctc 3060gcggcggacg cacgacgccg gggcgagacc ataggcgatc tcctaaatca atagtagctg 3120taacctcgaa gcgtttcact tgtaacaacg attgagaatt tttgtcataa aattgaaata 3180cttggttcgc atttttgtca tccgcggtca gccgcaattc tgacgaactg cccatttagc 3240tggagatgat tgtacatcct tcacgtgaaa atttctcaag cgctgtgaac aagggttcag 3300attttagatt gaaaggtgag ccgttgaaac acgttcttct tgtcgatgac gacgtcgcta 3360tgcggcatct tattattgaa taccttacga tccacgcctt caaagtgacc gcggtagccg 3420acagcaccca gttcacaaga gtactctctt ccgcgacggt cgatgtcgtg gttgttgatc 3480taaatttagg tcgtgaagat gggctcgaga tcgttcgtaa tctggcggca aagtctgata 3540ttccaatcat aattatcagt ggcgaccgcc ttgaggagac ggataaagtt gttgcactcg 3600agctaggagc aagtgatttt atcgctaagc cgttcagtat cagagagttt ctagcacgca 3660ttcgggttgc cttgcgcgtg cgccccaacg ttgtccgctc caaagaccga cggtcttttt 3720gttttactga ctggacactt aatctcaggc aacgtcgctt gatgtccgaa gctggcggtg 3780aggtgaaact tacggcaggt gagttcaatc ttctcctcgc gtttttagag aaaccccgcg 3840acgttctatc gcgcgagcaa cttctcattg ccagtcgagt acgcgacgag gaggtttatg 3900acaggagtat agatgttctc attttgaggc tgcgccgcaa acttgaggca gatccgtcaa 3960gccctcaact gataaaaaca gcaagaggtg ccggttattt ctttgacgcg gacgtgcagg 4020tttcgcacgg ggggacgatg gcagcctgag ccaattccca gatccccgag gaatcggcgt 4080gagcggtcgc aaaccatccg gcccggtaca aatcggcgcg gcgctgggtg atgacctggt 4140ggagaagttg aaggccgcgc aggccgccca gcggcaacgc atcgaggcag aagcacgccc 4200cggtgaatcg tggcaagcgg ccgctgatcg aatccgcaaa gaatcccggc aaccgccggc 4260agccggtgcg ccgtcgatta ggaagccgcc caagggcgac gagcaaccag attttttcgt 4320tccgatgctc tatgacgtgg gcacccgcga tagtcgcagc atcatggacg tggccgtttt 4380ccgtctgtcg aagcgtgacc gacgagctgg cgaggtgatc cgctacgagc ttccagacgg 4440gcacgtagag gtttccgcag ggccggccgg catggccagt gtgtgggatt acgacctggt 4500actgatggcg gtttcccatc taaccgaatc catgaaccga taccgggaag ggaagggaga 4560caagcccggc cgcgtgttcc gtccacacgt tgcggacgta ctcaagttct gccggcgagc 4620cgatggcgga aagcagaaag acgacctggt agaaacctgc attcggttaa acaccacgca 4680cgttgccatg cagcgtacga agaaggccaa gaacggccgc ctggtgacgg tatccgaggg 4740tgaagccttg attagccgct acaagatcgt aaagagcgaa accgggcggc cggagtacat 4800cgagatcgag ctagctgatt ggatgtaccg cgagatcaca gaaggcaaga acccggacgt 4860gctgacggtt caccccgatt actttttgat cgatcccggc atcggccgtt ttctctaccg 4920cctggcacgc cgcgccgcag gcaaggcaga agccagatgg ttgttcaaga cgatctacga 4980acgcagtggc agcgccggag agttcaagaa gttctgtttc accgtgcgca agctgatcgg 5040gtcaaatgac ctgccggagt acgatttgaa ggaggaggcg gggcaggctg gcccgatcct 5100agtcatgcgc taccgcaacc tgatcgaggg cgaagcatcc gccggttcct aatgtacgga 5160gcagatgcta gggcaaattg ccctagcagg ggaaaaaggt cgaaaaggtc tctttcctgt 5220ggatagcacg tacattggga acccaaagcc gtacattggg aaccggaacc cgtacattgg 5280gaacccaaag ccgtacattg ggaaccggtc acacatgtaa gtgactgata taaaagagaa 5340aaaaggcgat ttttccgcct aaaactcttt aaaacttatt aaaactctta aaacccgcct 5400ggcctgtgca taactgtctg gccagcgcac agccgaagag ctgcaaaaag cgcctaccct 5460tcggtcgctg cgctccctac gccccgccgc ttcgcgtcgg cctatcgcgg ccgctggccg 5520ctcaaaaatg gctggcctac ggccaggcaa tctaccaggg cgcggacaag ccgcgccgtc 5580gccactcgac cgccggcgct gaggtctgcc tcgtgaagaa ggtgttgctg actcatacca 5640ggcctgaatc gccccatcat ccagccagaa agtgagggag ccacggttga tgagagcttt 5700gttgtaggtg gaccagttgg tgattttgaa cttttgcttt gccacggaac ggtctgcgtt 5760gtcgggaaga tgcgtgatct gatccttcaa ctcagcaaaa gttcgattta ttcaacaaag 5820ccgccgtccc gtcaagtcag cgtaatgctc tgccagtgtt acaaccaatt aaccaattct 5880gattagaaaa actcatcgag catcaaatga aactgcaatt tattcatatc aggattatca 5940ataccatatt tttgaaaaag ccgtttctgt aatgaaggag aaaactcacc gaggcagttc 6000cataggatgg caagatcctg gtatcggtct gcgattccga ctcgtccaac atcaatacaa 6060cctattaatt tcccctcgtc aaaaataagg ttatcaagtg agaaatcacc atgagtgacg 6120actgaatccg gtgagaatgg caaaagctct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag 6180aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt 6240cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga 6300atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg 6360taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa 6420aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt 6480tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct 6540gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct 6600cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc 6660cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt 6720atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc 6780tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat 6840ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa 6900acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa 6960aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga 7020aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct 7080tttgatccgg aattaattcc tgtggttggc atgcacatac aaatggacga acggataaac 7140cttttcacgc ccttttaaat atccgattat tctaataaac gctcttttct cttag      7195<210>32<211>4224<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：载体pNOV3604<400>32agcttgcatg cctgcaggtc gactctagag gatccccgat catgcaaaaa ctcattaact 60cagtgcaaaa ctatgcctgg ggcagcaaaa cggcgttgac tgaactttat ggtatggaaa 120atccgtccag ccagccgatg gccgagctgt ggatgggcgc acatccgaaa agcagttcac 180gagtgcagaa tgccgccgga gatatcgttt cactgcgtga tgtgattgag agtgataaat 240cgactctgct cggagaggcc gttgccaaac gctttggcga actgcctttc ctgttcaaag 300tattatgcgc agcacagcca ctctccattc aggttcatcc aaacaaacac aattctgaaa 360tcggttttgc caaagaaaat gccgcaggta tcccgatgga tgccgccgag cgtaactata 420aagatcctaa ccacaagccg gagctggttt ttgcgctgac gcctttcctt gcgatgaacg 480cgtttcgtga attttccgag attgtctccc tactccagcc ggtcgcaggt gcacatccgg 540cgattgctca ctttttacaa cagcctgatg ccgaacgttt aagcgaactg ttcgccagcc 600tgttgaatat gcagggtgaa gaaaaatccc gcgcgctggc gattttaaaa tcggccctcg 660atagccagca gggtgaaccg tggcaaacga ttcgtttaat ttctgaattt tacccggaag 720acagcggtct gttctccccg ctattgctga atgtggtgaa attgaaccct ggcgaagcga 780tgttcctgtt cgctgaaaca ccgcacgctt acctgcaagg cgtggcgctg gaagtgatgg 840caaactccga taacgtgctg cgtgcgggtc tgacgcctaa atacattgat attccggaac 900tggttgccaa tgtgaaattc gaagccaaac cggctaacca gttgttgacc cagccggtga 960aacaaggtgc agaactggac ttcccgattc cagtggatga ttttgccttc tcgctgcatg 1020accttagtga taaagaaacc accattagcc agcagagtgc cgccattttg ttctgcgtcg 1080aaggcgatgc aacgttgtgg aaaggttctc agcagttaca gcttaaaccg ggtgaatcag 1140cgtttattgc cgccaacgaa tcaccggtga ctgtcaaagg ccacggccgt ttagcgcgtg 1200tttacaacaa gctgtaagag cttactgaaa aaattaacat ctcttgctaa gctgggagct 1260ctagatcccc gaatttcccc gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc ttaagattga 1320atcctgttgc cggtcttgcg atgattatca tataatttct gttgaattac gttaagcatg 1380taataattaa catgtaatgc atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc 1440cgcaattata catttaatac gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat 1500tatcgcgcgc ggtgtcatct atgttactag atcgggaatt gggtaccgaa ttcactggcc 1560gtcgttttac aacgtcgtga ctgggaaaac cctggcgtta cccaacttaa tcgccttgca 1620gcacatcccc ctttcgccag ctggcgtaat agcgaagagg cccgcaccga tcgcccttcc 1680caacagttgc gcagcctgaa tggcgaatgg cgcctgatgc ggtattttct ccttacgcat 1740ctgtgcggta tttcacaccg catatggtgc actctcagta caatctgctc tgatgccgca 1800tagttaagcc agccccgaca cccgccaaca cccgctgacg cgccctgacg ggcttgtctg 1860ctcccggcat ccgcttacag acaagctgtg accgtctccg ggagctgcat gtgtcagagg 1920ttttcaccgt catcaccgaa acgcgcgaga cgaaagggcc tcgtgatacg cctattttta 1980taggttaatg tcatgataat aatggtttct tagacgtcag gtggcacttt tcggggaaat 2040gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg 2100agacaataac cctgataaat gcttcaatgg cgcgccgcgg ccgcttaaga atattgaaaa 2160aggaagagta tgagtattca acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt 2220tgccttcctg tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag 2280ttgggtgcac gagtgggtta catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt 2340tttcgccccg aagaacgttt tccaatgatg agcactttta aagttctgct atgtggcgcg 2400gtattatccc gtattgacgc cgggcaagag caactcggtc gccgcataca ctattctcag 2460aatgacttgg ttgagtactc accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta 2520agagaattat gcagtgctgc cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg 2580acaacgatcg gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta 2640actcgccttg atcgttggga accggagctg aatgaagcca taccaaacga cgagcgtgac 2700accacgatgc ctgtagcaat ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt 2760actctagctt cccggcaaca attaatagac tggatggagg cggataaagt tgcaggacca 2820cttctgcgct cggcccttcc ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg agccggtgag 2880cgtgggtctc gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc ccgtatcgta 2940gttatctaca cgacggggag tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca gatcgctgag 3000ataggtgcct cactgattaa gcattggtaa ctgtcagacc aagtttactc atatatactt 3060tagattgatt taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat 3120aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta 3180gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa 3240acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt 3300tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgtcct tctagtgtag 3360ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta 3420atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca 3480agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag 3540cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa 3600agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga 3660acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc 3720gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc 3780ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt 3840gctcacatgt tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat taccgccttt 3900gagtgagctg ataccgctcg ccgcagccga acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag 3960gaagcggaag agcttaagcg gccgcggcgc gccgcccaat acgcaaaccg cctctccccg 4020cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca 4080gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc tcactcatta ggcaccccag gctttacact 4140ttatgcttcc ggctcgtatg ttgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa 4200acagctatga ccatgattac gcca                                        4224<210>33<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸<400>33ccatcgtggt  atttggtatt g                                          21<210>34<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸<400>34caataccaaa taccacgatg g                                           21<210>35<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸<400>35cgtggtagcg agcactttgg t                                           21<210>36<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：寡核苷酸<400>36aagtgctcgc taccacgatg g                                           21<210>37<211>912<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：包含内含子的合成GFP基因<400>37atgagcaagg gcgaggagct gttcaccggc gtggtgccaa tcctggtgga gctggacggc  60gacgtgaacg gccacaagtt cagcgtgagc ggcgagggcg agggcgacgc gacctacggc 120aagctgaccc tgaagttcat ctgtaccacc ggcaagctcc cggtcccgtg gccgaccctg 180gtgaccacct tcacctacgg cgtgcagtgt ttcagccgct acccggacca catgaagcgc 240cacgacttct tcaagagcgc catgccggag ggctacgtaa gtttctgctt ctacctttga 300tatatatata ataattatca ttaattagta gtaatataat atttcaaata tttttttcaa 360aataaaagaa tgtagtatat agcaattgct tttctgtagt ttataagtgt gtatatttta 420atttataact tttctaatat atgaccaaaa tttgttgatg tgcaggtgca ggagcgcacc 480atcagcttca aggacgacgg caactacaag acccgcgccg aggtgaagtt cgagggcgac 540acactagtga accgcatcga gctgaagggc atcgacttca aggaggacgg caacatcctg 600ggccacaagc tggagtacaa ctacaacagc cacaacgtgt acatcaccgc ggacaagcag 660aagaacggca tcaaggcgaa cttcaagatc cgccacaaca tcgaggacgg cagcgtgcag 720ctggccgacc actaccagca gaacaccccg atcggcgacg gtcctgtgct gctgccggac 780aaccactacc tgagcaccca gagcgccctg agcaaggacc cgaacgagaa gcgcgaccac 840atggtgctgc tggagttcgt gaccgccgcc ggcatcaccc acggcatgga cgagctgtac 900aaggttaact ag                                                     912<210>38<211>2001<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：包含内含子的GUS基因<400>38atggtccgtc ctgtagaaac cccaacccgt gaaatcaaaa aactcgacgg cctgtgggca   60ttcagtctgg atcgcgaaaa ctgtggaatt gatcagcgtt ggtgggaaag cgcgttacaa  120gaaagccggg caattgctgt gccaggcagt tttaacgatc agttcgccga tgcagatatt  180cgtaattatg cgggcaacgt ctggtatcag cgcgaagtct ttataccgaa aggttgggca  240ggccagcgta tcgtgctgcg tttcgatgcg gtcactcatt acggcaaagt gtgggtcaat  300aatcaggaag tgatggagca tcagggcggc tatacgccat ttgaagccga tgtcacgccg  360tatgttattg ccgggaaaag tgtacgtaag tttctgcttc tacctttgat atatatataa  420taattatcat taattagtag taatataata tttcaaatat ttttttcaaa ataaaagaat  480gtagtatata gcaattgctt ttctgtagtt tataagtgtg tatattttaa tttataactt  540ttctaatata tgaccaaaat ttgttgatgt gcaggtatca ccgtttgtgt gaacaacgaa  600ctgaactggc agactatccc gccgggaatg gtgattaccg acgaaaacgg caagaaaaag  660cagtcttact tccatgattt ctttaactat gccggaatcc atcgcagcgt aatgctctac  720accacgccga acacctgggt ggacgatatc accgtggtga cgcatgtcgc gcaagactgt  780aaccacgcgt ctgttgactg gcaggtggtg gccaatggtg atgtcagcgt tgaactgcgt  840gatgcggatc aacaggtggt tgcaactgga caaggcacta gcgggacttt gcaagtggtg  900aatccgcacc tctggcaacc gggtgaaggt tatctctatg aactgtgcgt cacagccaaa  960agccagacag agtgtgatat ctacccgctt cgcgtcggca tccggtcagt ggcagtgaag 1020ggcgaacagt tcctgattaa ccacaaaccg ttctacttta ctggctttgg tcgtcatgaa 1080gatgcggact tgcgtggcaa aggattcgat aacgtgctga tggtgcacga ccacgcatta 1140atggactgga ttggggccaa ctcctaccgt acctcgcatt acccttacgc tgaagagatg 1200ctcgactggg cagatgaaca tggcatcgtg gtgattgatg aaactgctgc tgtcggcttt 1260aacctctctt taggcattgg tttcgaagcg ggcaacaagc cgaaagaact gtacagcgaa 1320gaggcagtca acggggaaac tcagcaagcg cacttacagg cgattaaaga gctgatagcg 1380cgtgacaaaa accacccaag cgtggtgatg tggagtattg ccaacgaacc ggatacccgt 1440ccgcaaggtg cacgggaata tttcgcgcca ctggcggaag caacgcgtaa actcgacccg 1500acgcgtccga tcacctgcgt caatgtaatg ttctgcgacg ctcacaccga taccatcagc 1560gatctctttg atgtgctgtg cctgaaccgt tattacggat ggtatgtcca aagcggcgat 1620ttggaaacgg cagagaaggt actggaaaaa gaacttctgg cctggcagga gaaactgcat 1680cagccgatta tcatcaccga atacggcgtg gatacgttag ccgggctgca ctcaatgtac 1740accgacatgt ggagtgaaga gtatcagtgt gcatggctgg atatgtatca ccgcgtcttt 1800gatcgcgtca gcgccgtcgt cggtgaacag gtatggaatt tcgccgattt tgcgacctcg 1860caaggcatat tgcgcgttgg cggtaacaag aaagggatct tcactcgcga ccgcaaaccg 1920aagtcggcgg cttttctgct gcaaaaacgc tggactggca tgaacttcgg tgaaaaaccg 1980cagcagggag gcaaacaatg a                                           2001<210>39<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：PCR引物<400>39cgcggattgc tcccttaaca atgagg                                      26<210>40<211>1618<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：CmpS-synGFPI-nos表达盒<400>40tcctggcaga caaagtggca gacatactgt cccacaaatg aagatggaat ctgtaaaaga  60aaacgcgtga aataatgcgt ctgacaaagg ttaggtcggc tgcctttaat caataccaaa 120gtggtcccta ccacgatgga aaaactgtgc agtcggtttg gctttttctg acgaacaaat  180aagattcgtg gccgacaggt gggggtccac catgtgaagg catcttcaga ctccaataat  240ggagcaatga cgtaagggct tacgaaataa gtaagggtag tttgggaaat gtccactcac  300ccgtcagtct ataaatactt agcccctccc tcattgttaa gggagcaaaa tctcagagag  360atagtcctag agagagaaag agagcaagta gcctagaagt aggatccacc atgctgcaga  420tgagcaaggg cgaggagctg ttcaccggcg tggtgccaat cctggtggag ctggacggcg  480acgtgaacgg ccacaagttc agcgtgagcg gcgagggcga gggcgacgcg acctacggca  540agctgaccct gaagttcatc tgtaccaccg gcaagctccc ggtcccgtgg ccgaccctgg  600tgaccacctt cacctacggc gtgcagtgtt tcagccgcta cccggaccac atgaagcgcc  660acgacttctt caagagcgcc atgccggagg gctacgtaag tttctgcttc tacctttgat  720atatatataa taattatcat taattagtag taatataata tttcaaatat ttttttcaaa  780ataaaagaat gtagtatata gcaattgctt ttctgtagtt tataagtgtg tatattttaa  840tttataactt ttctaatata tgaccaaaat ttgttgatgt gcaggtgcag gagcgcacca  900tcagcttcaa ggacgacggc aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca  960cactagtgaa ccgcatcgag ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc aacatcctgg 1020gccacaagct ggagtacaac tacaacagcc acaacgtgta catcaccgcg gacaagcaga 1080agaacggcat caaggcgaac ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc agcgtgcagc 1140tggccgacca ctaccagcag aacaccccga tcggcgacgg tcctgtgctg ctgccggaca 1200accactacct gagcacccag agcgccctga gcaaggaccc gaacgagaag cgcgaccaca 1260tggtgctgct ggagttcgtg accgccgccg gcatcaccca cggcatggac gagctgtaca 1320aggttaacta gagctcaaga tcccccgaat ttccccgatc gttcaaacat ttggcaataa 1380agtttcttaa gattgaatcc tgttgccggt cttgcgatga ttatcatcta atttctgttg 1440aattacgtta agcatgtaat aattaacatg taatgcatga cgttatttat gagatgggtt 1500tttatgatta gagtcccgca attatacatt taatacgcga tagaaaacaa aatatagcgc 1560gcaaactagg ataaattatc gcgcgcggtg tcatctatgt tactagatcc gggaattg   1618<210>41<211>2730<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：Cmps-GIG-nos表达盒<400>41aggatcctgg cagacaaagt ggcagacata ctgtcccaca aatgaagatg gaatctgtaa    60aagaaaacgc gtgaaataat gcgtctgaca aaggttaggt cggctgcctt taatcaatac   120caaagtggtc cctaccacga tggaaaaact gtgcagtcgg tttggctttt tctgacgaac   180aaataagatt cgtggccgac aggtgggggt ccaccatgtg aaggcatctt cagactccaa   240taatggagca atgacgtaag ggcttacgaa ataagtaagg gtagtttggg aaatgtccac   300tcacccgtca gtctataaat acttagcccc tccctcattg ttaagggagc aaaatctcag   360agagatagtc ctagagagag aaagagagca agtagcctag aagtaggatc ccctcgaggt   420cgaccatggt ccgtcctgta gaaaccccaa cccgtgaaat caaaaaactc gacggcctgt   480gggcattcag tctggatcgc gaaaactgtg gaattgatca gcgttggtgg gaaagcgcgt   540tacaagaaag ccgggcaatt gctgtgccag gcagttttaa cgatcagttc gccgatgcag   600atattcgtaa ttatgcgggc aacgtctggt atcagcgcga agtctttata ccgaaaggtt   660gggcaggcca gcgtatcgtg ctgcgtttcg atgcggtcac tcattacggc aaagtgtggg   720tcaataatca ggaagtgatg gagcatcagg gcggctatac gccatttgaa gccgatgtca   780cgccgtatgt tattgccggg aaaagtgtac gtaagtttct gcttctacct ttgatatata   840tataataatt atcattaatt agtagtaata taatatttca aatatttttt tcaaaataaa   900agaatgtagt atatagcaat tgcttttctg tagtttataa gtgtgtatat tttaatttat   960aacttttcta atatatgacc aaaatttgtt gatgtgcagg tatcaccgtt tgtgtgaaca  1020acgaactgaa ctggcagact atcccgccgg gaatggtgat taccgacgaa aacggcaaga  1080aaaagcagtc ttacttccat gatttcttta actatgccgg aatccatcgc agcgtaatgc  1140tctacaccac gccgaacacc tgggtggacg atatcaccgt ggtgacgcat gtcgcgcaag  1200actgtaacca cgcgtctgtt gactggcagg tggtggccaa tggtgatgtc agcgttgaac  1260tgcgtgatgc ggatcaacag gtggttgcaa ctggacaagg cactagcggg actttgcaag  1320tggtgaatcc gcacctctgg caaccgggtg aaggttatct ctatgaactg tgcgtcacag    1380ccaaaagcca gacagagtgt gatatctacc cgcttcgcgt cggcatccgg tcagtggcag    1440tgaagggcga acagttcctg attaaccaca aaccgttcta ctttactggc tttggtcgtc    1500atgaagatgc ggacttgcgt ggcaaaggat tcgataacgt gctgatggtg cacgaccacg    1560cattaatgga ctggattggg gccaactcct accgtacctc gcattaccct tacgctgaag    1620agatgctcga ctgggcagat gaacatggca tcgtggtgat tgatgaaact gctgctgtcg    1680gctttaacct ctctttaggc attggtttcg aagcgggcaa caagccgaaa gaactgtaca    1740gcgaagaggc agtcaacggg gaaactcagc aagcgcactt acaggcgatt aaagagctga    1800tagcgcgtga caaaaaccac ccaagcgtgg tgatgtggag tattgccaac gaaccggata    1860cccgtccgca aggtgcacgg gaatatttcg cgccactggc ggaagcaacg cgtaaactcg    1920acccgacgcg tccgatcacc tgcgtcaatg taatgttctg cgacgctcac accgatacca    1980tcagcgatct ctttgatgtg ctgtgcctga accgttatta cggatggtat gtccaaagcg    2040gcgatttgga aacggcagag aaggtactgg aaaaagaact tctggcctgg caggagaaac    2100tgcatcagcc gattatcatc accgaatacg gcgtggatac gttagccggg ctgcactcaa    2160tgtacaccga catgtggagt gaagagtatc agtgtgcatg gctggatatg tatcaccgcg    2220tctttgatcg cgtcagcgcc gtcgtcggtg aacaggtatg gaatttcgcc gattttgcga    2280cctcgcaagg catattgcgc gttggcggta acaagaaagg gatcttcact cgcgaccgca    2340aaccgaagtc ggcggctttt ctgctgcaaa aacgctggac tggcatgaac ttcggtgaaa    2400aaccgcagca gggaggcaaa caatgaatca acaactctcc tggcgcacca tcgtcggcta    2460cagcctcggg aattagatcc ccgaatttcc ccgatcgttc aaacatttgg caataaagtt    2520tcttaagatt gaatcctgtt gccggtcttg cgatgattat catataattt ctgttgaatt    2580acgttaagca tgtaataatt aacatgtaat gcatgacgtt atttatgaga tgggttttta    2640tgattagagt cccgcaatta tacatttaat acgcgataga aaacaaaata tagcgcgcaa    2700actaggataa attatcgcgc gcggtgtcat                                     2730<210>42<211>1577<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：CmpC-synGFPI-nos表达盒<400>42tggcagacaa agtggcagac atactgtccc acaaatgaag atggaatctg taaaagaaaa    60cgcgtgaaat aatgcgtctg acaaaggtta ggtcggctgc ctttaatcaa taccaaagtg   120gtccctacca cgatggaaaa actgtgcagt cggtttggct ttttctgacg aacaaataag   180attcgtggcc gacaggtggg ggtccaccat gtgaaggcat cttcagactc caataatgga   240gcaatgacgt aagggcttac gaaataagta agggtagttt gggaaatgtc cactcacccg   300tcagtctata aatacttagc ccctccctca ttgttaaggg agcaacgatc cgcgaagggc   360gaattcgttt aaacctgcag atgagcaagg gcgaggagct gttcaccggc gtggtgccaa   420tcctggtgga gctggacggc gacgtgaacg gccacaagtt cagcgtgagc ggcgagggcg   480agggcgacgc gacctacggc aagctgaccc tgaagttcat ctgtaccacc ggcaagctcc   540cggtcccgtg gccgaccctg gtgaccacct tcacctacgg cgtgcagtgt ttcagccgct   600acccggacca catgaagcgc cacgacttct tcaagagcgc catgccggag ggctacgtaa   660gtttctgctt ctacctttga tatatatata ataattatca ttaattagta gtaatataat   720atttcaaata tttttttcaa aataaaagaa tgtagtatat agcaattgct tttctgtagt   780ttataagtgt gtatatttta atttataact tttctaatat atgaccaaaa tttgttgatg   840tgcaggtgca ggagcgcacc atcagcttca aggacgacgg caactacaag acccgcgccg   900aggtgaagtt cgagggcgac acactagtga accgcatcga gctgaagggc atcgacttca   960aggaggacgg caacatcctg ggccacaagc tggagtacaa ctacaacagc cacaatgtgt  1020acatcaccgc ggacaagcag aagaacggca tcaaggcgaa cttcaagatc cgccacaata  1080tcgaggacgg cagcgtgcag ctggccgacc actaccagca gaacaccccg atcggcgacg  1140gtcctgtgct gctgccggac aaccactacc tgagcaccca gagcgccctg agcaaggacc  1200cgaacgagaa gcgcgaccac atggtgctgc tggagttcgt gaccgccgcc ggcatcaccc  1260acggcatgga cgagctgtac aaggttaact agagctctag atccccgaat ttccccgatc  1320gttcaaacat ttggcaataa agtttcttaa gattgaatcc tgttgccggt cttgcgatga  1380ttatcatata atttctgttg aattacgtta agcatgtaat aattaacatg taatgcatga    1440cgttatttat gagatgggtt tttatgatta gagtcccgca attatacatt taatacgcga    1500tagaaaacaa aatatagcgc gcaaactagg ataaattatc gcgcgcggtg tcatctatgt    1560tactagatcg ggaattg                                                   1577<210>43<211>2725<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：CmpC-GIG-nos表达盒<400>43tggcagacaa agtggcagac atactgtccc acaaatgaag atggaatctg taaaagaaaa     60cgcgtgaaat aatgcgtctg acaaaggtta ggtcggctgc ctttaatcaa taccaaagtg    120gtccctacca cgatggaaaa actgtgcagt cggtttggct ttttctgacg aacaaataag    180attcgtggcc gacaggtggg ggtccaccat gtgaaggcat cttcagactc caataatgga    240gcaatgacgt aagggcttac gaaataagta agggtagttt gggaaatgtc cactcacccg    300tcagtctata aatacttagc ccctccctca ttgttaaggg agcaacgatc cgcgaagggc    360gaattcctgc agcccggggg atcccctcga ggtcgaccat ggtccgtcct gtagaaaccc    420caacccgtga aatcaaaaaa ctcgacggcc tgtgggcatt cagtctggat cgcgaaaact    480gtggaattga tcagcgttgg tgggaaagcg cgttacaaga aagccgggca attgctgtgc    540caggcagttt taacgatcag ttcgccgatg cagatattcg taattatgcg ggcaacgtct    600ggtatcagcg cgaagtcttt ataccgaaag gttgggcagg ccagcgtatc gtgctgcgtt    660tcgatgcggt cactcattac ggcaaagtgt gggtcaataa tcaggaagtg atggagcatc    720agggcggcta tacgccattt gaagccgatg tcacgccgta tgttattgcc gggaaaagtg    780tacgtaagtt tctgcttcta cctttgatat atatataata attatcatta attagtagta    840atataatatt tcaaatattt ttttcaaaat aaaagaatgt agtatatagc aattgctttt    900ctgtagttta taagtgtgta tattttaatt tataactttt ctaatatatg accaaaattt     960gttgatgtgc aggtatcacc gtttgtgtga acaacgaact gaactggcag actatcccgc    1020cgggaatggt gattaccgac gaaaacggca agaaaaagca gtcttacttc catgatttct    1080ttaactatgc cggaatccat cgcagcgtaa tgctctacac cacgccgaac acctgggtgg    1140acgatatcac cgtggtgacg catgtcgcgc aagactgtaa ccacgcgtct gttgactggc    1200aggtggtggc caatggtgat gtcagcgttg aactgcgtga tgcggatcaa caggtggttg    1260caactggaca aggcactagc gggactttgc aagtggtgaa tccgcacctc tggcaaccgg    1320gtgaaggtta tctctatgaa ctgtgcgtca cagccaaaag ccagacagag tgtgatatct    1380acccgcttcg cgtcggcatc cggtcagtgg cagtgaaggg cgaacagttc ctgattaacc    1440acaaaccgtt ctactttact ggctttggtc gtcatgaaga tgcggacttg cgtggcaaag    1500gattcgataa cgtgctgatg gtgcacgacc acgcattaat ggactggatt ggggccaact    1560cctaccgtac ctcgcattac ccttacgctg aagagatgct cgactgggca gatgaacatg    1620gcatcgtggt gattgatgaa actgctgctg tcggctttaa cctctcttta ggcattggtt    1680tcgaagcggg caacaagccg aaagaactgt acagcgaaga ggcagtcaac ggggaaactc    1740agcaagcgca cttacaggcg attaaagagc tgatagcgcg tgacaaaaac cacccaagcg    1800tggtgatgtg gagtattgcc aacgaaccgg atacccgtcc gcaaggtgca cgggaatatt    1860tcgcgccact ggcggaagca acgcgtaaac tcgacccgac gcgtccgatc acctgcgtca    1920atgtaatgtt ctgcgacgct cacaccgata ccatcagcga tctctttgat gtgctgtgcc    1980tgaaccgtta ttacggatgg tatgtccaaa gcggcgattt ggaaacggca gagaaggtac    2040tggaaaaaga acttctggcc tggcaggaga aactgcatca gccgattatc atcaccgaat    2100acggcgtgga tacgttagcc gggctgcact caatgtacac cgacatgtgg agtgaagagt    2160atcagtgtgc atggctggat atgtatcacc gcgtctttga tcgcgtcagc gccgtcgtcg    2220gtgaacaggt atggaatttc gccgattttg cgacctcgca aggcatattg cgcgttggcg    2280gtaacaagaa agggatcttc actcgcgacc gcaaaccgaa gtcggcggct tttctgctgc    2340aaaaacgctg gactggcatg aacttcggtg aaaaaccgca gcagggaggc aaacaatgaa    2400tcaacaactc tcctggcgca ccatcgtcgg ctacagcctc gggaattaga tccccgaatt    2460tccccgatcg ttcaaacatt tggcaataaa gtttcttaag attgaatcct gttgccggtc    2520ttgcgatgat tatcatataa tttctgttga attacgttaa gcatgtaata attaacatgt    2580aatgcatgac gttatttatg agatgggttt ttatgattag agtcccgcaa ttatacattt    2640aatacgcgat agaaaacaaa atatagcgcg caaactagga taaattatcg cgcgcggtgt    2700catctatgtt actagatcgg gaatt                                          2725<210>44<211>9172<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：载体pNOV2117<400>44aagcttggcg cgccggtacc agcttgcatg cctgcagtgc agcgtgaccc ggtcgtgccc     60ctctctagag ataatgagca ttgcatgtct aagttataaa aaattaccac atattttttt    120tgtcacactt gtttgaagtg cagtttatct atctttatac atatatttaa actttactct    180acgaataata taatctatag tactacaata atatcagtgt tttagagaat catataaatg    240aacagttaga catggtctaa aggacaattg agtattttga caacaggact ctacagtttt    300atctttttag tgtgcatgtg ttctcctttt tttttgcaaa tagcttcacc tatataatac    360ttcatccatt ttattagtac atccatttag ggtttagggt taatggtttt tatagactaa    420tttttttagt acatctattt tattctattt tagcctctaa attaagaaaa ctaaaactct    480attttagttt ttttatttaa taatttagat ataaaataga ataaaataaa gtgactaaaa    540attaaacaaa taccctttaa gaaattaaaa aaactaagga aacatttttc ttgtttcgag    600tagataatgc cagcctgtta aacgccgtcg acgagtctaa cggacaccaa ccagcgaacc    660agcagcgtcg cgtcgggcca agcgaagcag acggcacggc atctctgtcg ctgcctctgg    720acccctctcg agagttccgc tccaccgttg gacttgctcc gctgtcggca tccagaaatt    780gcgtggcgga gcggcagacg tgagccggca cggcaggcgg cctcctcctc ctctcacggc    840accggcagct acgggggatt cctttcccac cgctccttcg ctttcccttc ctcgcccgcc    900gtaataaata gacaccccct ccacaccctc tttccccaac ctcgtgttgt tcggagcgca    960cacacacaca accagatctc ccccaaatcc acccgtcggc acctccgctt caaggtacgc    1020cgctcgtcct cccccccccc ccctctctac cttctctaga tcggcgttcc ggtccatggt    1080tagggcccgg tagttctact tctgttcatg tttgtgttag atccgtgttt gtgttagatc    1140cgtgctgcta gcgttcgtac acggatgcga cctgtacgtc agacacgttc tgattgctaa    1200cttgccagtg tttctctttg gggaatcctg ggatggctct agccgttccg cagacgggat    1260cgatttcatg attttttttg tttcgttgca tagggtttgg tttgcccttt tcctttattt    1320caatatatgc cgtgcacttg tttgtcgggt catcttttca tgcttttttt tgtcttggtt    1380gtgatgatgt ggtctggttg ggcggtcgtt ctagatcgga gtagaattct gtttcaaact    1440acctggtgga tttattaatt ttggatctgt atgtgtgtgc catacatatt catagttacg    1500aattgaagat gatggatgga aatatcgatc taggataggt atacatgttg atgcgggttt    1560tactgatgca tatacagaga tgctttttgt tcgcttggtt gtgatgatgt ggtgtggttg    1620ggcggtcgtt cattcgttct agatcggagt agaatactgt ttcaaactac ctggtgtatt    1680tattaatttt ggaactgtat gtgtgtgtca tacatcttca tagttacgag tttaagatgg    1740atggaaatat cgatctagga taggtataca tgttgatgtg ggttttactg atgcatatac    1800atgatggcat atgcagcatc tattcatatg ctctaacctt gagtacctat ctattataat    1860aaacaagtat gttttataat tattttgatc ttgatatact tggatgatgg catatgcagc    1920agctatatgt ggattttttt agccctgcct tcatacgcta tttatttgct tggtactgtt    1980tcttttgtcg atgctcaccc tgttgtttgg tgttacttct gcagggatcc ccgatcatgc    2040aaaaactcat taactcagtg caaaactatg cctggggcag caaaacggcg ttgactgaac    2100tttatggtat ggaaaatccg tccagccagc cgatggccga gctgtggatg ggcgcacatc    2160cgaaaagcag ttcacgagtg cagaatgccg ccggagatat cgtttcactg cgtgatgtga    2220ttgagagtga taaatcgact ctgctcggag aggccgttgc caaacgcttt ggcgaactgc    2280ctttcctgtt caaagtatta tgcgcagcac agccactctc cattcaggtt catccaaaca    2340aacacaattc tgaaatcggt tttgccaaag aaaatgccgc aggtatcccg atggatgccg    2400ccgagcgtaa ctataaagat cctaaccaca agccggagct ggtttttgcg ctgacgcctt    2460tccttgcgat gaacgcgttt cgtgaatttt ccgagattgt ctccctactc cagccggtcg    2520caggtgcaca tccggcgatt gctcactttt tacaacagcc tgatgccgaa cgtttaagcg    2580aactgttcgc cagcctgttg aatatgcagg gtgaagaaaa atcccgcgcg ctggcgattt    2640taaaatcggc cctcgatagc cagcagggtg aaccgtggca aacgattcgt ttaatttctg    2700aattttaccc ggaagacagc ggtctgttct ccccgctatt gctgaatgtg gtgaaattga    2760accctggcga agcgatgttc ctgttcgctg aaacaccgca cgcttacctg caaggcgtgg    2820cgctggaagt gatggcaaac tccgataacg tgctgcgtgc gggtctgacg cctaaataca    2880ttgatattcc ggaactggtt gccaatgtga aattcgaagc caaaccggct aaccagttgt    2940tgacccagcc ggtgaaacaa ggtgcagaac tggacttccc gattccagtg gatgattttg    3000ccttctcgct gcatgacctt agtgataaag aaaccaccat tagccagcag agtgccgcca    3060ttttgttctg cgtcgaaggc gatgcaacgt tgtggaaagg ttctcagcag ttacagctta    3120aaccgggtga atcagcgttt attgccgcca acgaatcacc ggtgactgtc aaaggccacg    3180gccgtttagc gcgtgtttac aacaagctgt aagagcttac tgaaaaaatt aacatctctt    3240gctaagctgg gagctcgatc cgtcgacctg cagatcgttc aaacatttgg caataaagtt    3300tcttaagatt gaatcctgtt gccggtcttg cgatgattat catataattt ctgttgaatt    3360acgttaagca tgtaataatt aacatgtaat gcatgacgtt atttatgaga tgggttttta    3420tgattagagt cccgcaatta tacatttaat acgcgataga aaacaaaata tagcgcgcaa    3480actaggataa attatcgcgc gcggtgtcat ctatgttact agatctgcta gccctgcagg    3540aaatttaccg gtgcccgggc ggccagcatg gccgtatccg caatgtgtta ttaagttgtc    3600taagcgtcaa tttgtttaca ccacaatata tcctgccacc agccagccaa cagctccccg    3660accggcagct cggcacaaaa tcaccactcg atacaggcag cccatcagaa ttaattctca    3720tgtttgacag cttatcatcg actgcacggt gcaccaatgc ttctggcgtc aggcagccat    3780cggaagctgt ggtatggctg tgcaggtcgt aaatcactgc ataattcgtg tcgctcaagg    3840cgcactcccg ttctggataa tgttttttgc gccgacatca taacggttct ggcaaatatt    3900ctgaaatgag ctgttgacaa ttaatcatcc ggctcgtata atgtgtggaa ttgtgagcgg    3960ataacaattt cacacaggaa acagaccatg agggaagcgt tgatcgccga agtatcgact    4020caactatcag aggtagttgg cgtcatcgag cgccatctcg aaccgacgtt gctggccgta    4080catttgtacg gctccgcagt ggatggcggc ctgaagccac acagtgatat tgatttgctg    4140gttacggtga ccgtaaggct tgatgaaaca acgcggcgag ctttgatcaa cgaccttttg    4200gaaacttcgg cttcccctgg agagagcgag attctccgcg ctgtagaagt caccattgtt    4260gtgcacgacg acatcattcc gtggcgttat ccagctaagc gcgaactgca atttggagaa    4320tggcagcgca atgacattct tgcaggtatc ttcgagccag ccacgatcga cattgatctg    4380gctatcttgc tgacaaaagc aagagaacat agcgttgcct tggtaggtcc agcggcggag    4440gaactctttg atccggttcc tgaacaggat ctatttgagg cgctaaatga aaccttaacg    4500ctatggaact cgccgcccga ctgggctggc gatgagcgaa atgtagtgct tacgttgtcc    4560cgcatttggt acagcgcagt aaccggcaaa atcgcgccga aggatgtcgc tgccgactgg    4620gcaatggagc gcctgccggc ccagtatcag cccgtcatac ttgaagctag gcaggcttat    4680cttggacaag aagatcgctt ggcctcgcgc gcagatcagt tggaagaatt tgttcactac    4740gtgaaaggcg agatcaccaa agtagtcggc aaataaagct ctagtggatc tccgtacccc    4800cgggggatct ggctcgcggc ggacgcacga cgccggggcg agaccatagg cgatctccta    4860aatcaatagt agctgtaacc tcgaagcgtt tcacttgtaa caacgattga gaatttttgt    4920cataaaattg aaatacttgg ttcgcatttt tgtcatccgc ggtcagccgc aattctgacg    4980aactgcccat ttagctggag atgattgtac atccttcacg tgaaaatttc tcaagcgctg    5040tgaacaaggg ttcagatttt agattgaaag gtgagccgtt gaaacacgtt cttcttgtcg    5100atgacgacgt cgctatgcgg catcttatta ttgaatacct tacgatccac gccttcaaag    5160tgaccgcggt agccgacagc acccagttca caagagtact ctcttccgcg acggtcgatg    5220tcgtggttgt tgatctaaat ttaggtcgtg aagatgggct cgagatcgtt cgtaatctgg    5280cggcaaagtc tgatattcca atcataatta tcagtggcga ccgccttgag gagacggata    5340aagttgttgc actcgagcta ggagcaagtg attttatcgc taagccgttc agtatcagag    5400agtttctagc acgcattcgg gttgccttgc gcgtgcgccc caacgttgtc cgctccaaag    5460accgacggtc tttttgtttt actgactgga cacttaatct caggcaacgt cgcttgatgt    5520ccgaagctgg cggtgaggtg aaacttacgg caggtgagtt caatcttctc ctcgcgtttt    5580tagagaaacc ccgcgacgtt ctatcgcgcg agcaacttct cattgccagt cgagtacgcg    5640acgaggaggt ttatgacagg agtatagatg ttctcatttt gaggctgcgc cgcaaacttg    5700aggcagatcc gtcaagccct caactgataa aaacagcaag aggtgccggt tatttctttg    5760acgcggacgt gcaggtttcg cacgggggga cgatggcagc ctgagccaat tcccagatcc    5820ccgaggaatc ggcgtgagcg gtcgcaaacc atccggcccg gtacaaatcg gcgcggcgct    5880gggtgatgac ctggtggaga agttgaaggc cgcgcaggcc gcccagcggc aacgcatcga    5940ggcagaagca cgccccggtg aatcgtggca agcggccgct gatcgaatcc gcaaagaatc    6000ccggcaaccg ccggcagccg gtgcgccgtc gattaggaag ccgcccaagg gcgacgagca    6060accagatttt ttcgttccga tgctctatga cgtgggcacc cgcgatagtc gcagcatcat    6120ggacgtggcc gttttccgtc tgtcgaagcg tgaccgacga gctggcgagg tgatccgcta    6180cgagcttcca gacgggcacg tagaggtttc cgcagggccg gccggcatgg ccagtgtgtg    6240ggattacgac ctggtactga tggcggtttc ccatctaacc gaatccatga accgataccg    6300ggaagggaag ggagacaagc ccggccgcgt gttccgtcca cacgttgcgg acgtactcaa    6360gttctgccgg cgagccgatg gcggaaagca gaaagacgac ctggtagaaa cctgcattcg    6420gttaaacacc acgcacgttg ccatgcagcg tacgaagaag gccaagaacg gccgcctggt    6480gacggtatcc gagggtgaag ccttgattag ccgctacaag atcgtaaaga gcgaaaccgg    6540gcggccggag tacatcgaga tcgagctagc tgattggatg taccgcgaga tcacagaagg    6600caagaacccg gacgtgctga cggttcaccc cgattacttt ttgatcgatc ccggcatcgg    6660ccgttttctc taccgcctgg cacgccgcgc cgcaggcaag gcagaagcca gatggttgtt    6720caagacgatc tacgaacgca gtggcagcgc cggagagttc aagaagttct gtttcaccgt    6780gcgcaagctg atcgggtcaa atgacctgcc ggagtacgat ttgaaggagg aggcggggca    6840ggctggcccg atcctagtca tgcgctaccg caacctgatc gagggcgaag catccgccgg    6900ttcctaatgt acggagcaga tgctagggca aattgcccta gcaggggaaa aaggtcgaaa    6960aggtctcttt cctgtggata gcacgtacat tgggaaccca aagccgtaca ttgggaaccg    7020gaacccgtac attgggaacc caaagccgta cattgggaac cggtcacaca tgtaagtgac    7080tgatataaaa gagaaaaaag gcgatttttc cgcctaaaac tctttaaaac ttattaaaac    7140tcttaaaacc cgcctggcct gtgcataact gtctggccag cgcacagccg aagagctgca    7200aaaagcgcct acccttcggt cgctgcgctc cctacgcccc gccgcttcgc gtcggcctat    7260cgcggccgct ggccgctcaa aaatggctgg cctacggcca ggcaatctac cagggcgcgg    7320acaagccgcg ccgtcgccac tcgaccgccg gcgctgaggt ctgcctcgtg aagaaggtgt    7380tgctgactca taccaggcct gaatcgcccc atcatccagc cagaaagtga gggagccacg    7440gttgatgaga gctttgttgt aggtggacca gttggtgatt ttgaactttt gctttgccac    7500ggaacggtct gcgttgtcgg gaagatgcgt gatctgatcc ttcaactcag caaaagttcg    7560atttattcaa caaagccgcc gtcccgtcaa gtcagcgtaa tgctctgcca gtgttacaac    7620caattaacca attctgatta gaaaaactca tcgagcatca aatgaaactg caatttattc    7680atatcaggat tatcaatacc atatttttga aaaagccgtt tctgtaatga aggagaaaac    7740tcaccgaggc agttccatag gatggcaaga tcctggtatc ggtctgcgat tccgactcgt    7800ccaacatcaa tacaacctat taatttcccc tcgtcaaaaa taaggttatc aagtgagaaa    7860tcaccatgag tgacgactga atccggtgag aatggcaaaa gctctgcatt aatgaatcgg    7920ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga    7980ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat    8040acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca    8100aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc    8160tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata    8220aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc    8280gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc    8340acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga    8400accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc    8460ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag    8520gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag    8580aacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag    8640ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca    8700gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga    8760cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat    8820cttcacctag atccttttga tccggaatta attcctgtgg ttggcatgca catacaaatg    8880gacgaacgga taaacctttt cacgcccttt taaatatccg attattctaa taaacgctct    8940tttctcttag gtttacccgc caatatatcc tgtcaaacac tgatagttta aactgaaggc    9000gggaaacgac aatctgatca tgagcggaga attaagggag tcacgttatg acccccgccg    9060atgacgcggg acaagccgtt ttacgtttgg aactgacaga accgcaacgc tgcaggaatt    9120ggccgcagcg gccatttaaa tcaattgggc gcgccgaatt cgagctcggt ac            9172<210>45<211>8849<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：载体pNOV4200<400>45ggtacccccg ggggatcctc tagagtcgac catggtgatc actgcaggca tgcaagcttc    60gtacgttaat taattcgaat ccggagcggc cgcacgcgtg ggcccgttta aacctcgaga   120gatctgctag ccctgcagga aatttaccgg tgcccgtacc ggatttggag ccaagtctca   180taaacgccat tgtggaagaa agtcttgagt tggtggtaat gtaacagagt agtaagaaca   240gagaagagag agagtgtgag atacatgaat tgtcgggcaa caaaaatcct gaacatctta   300ttttagcaaa gagaaagagt tccgagtctg tagcagaaga gtgaggagaa atttaagctc   360ttggacttgt gaattgttcc gcctcttgaa tacttcttca atcctcatat attcttcttc   420tatgttacct gaaaaccggc atttaatctc gcgggtttat tccggttcaa catttttttt   480gttttgagtt attatctggg cttaataacg caggcctgaa ataaattcaa ggcccaactg   540tttttttttt taagaagttg ctgttaaaaa aaaaaaaagg gaattaacaa caacaacaaa   600aaaagataaa gaaaataata acaattactt taattgtaga ctaaaaaaac atagatttta   660tcatgaaaaa aagagaaaag aaataaaaac ttggatcaaa aaaaaacata cagatcttct   720aattattaac ttttcttaaa aattaggtcc tttttcccaa caattaggtt tagagttttg   780gaattaaacc aaaaagattg ttctaaaaaa tactcaaatt tggtagataa gtttccttat   840tttaattagt caatggtaga tacttttttt tcttttcttt attagagtag attagaatct   900tttatgccaa gtattgataa attaaatcaa gaagataaac tatcataatc aacatgaaat   960taaaagaaaa atctcatata tagtattagt attctctata tatattatga ttgcttattc  1020ttaatgggtt gggttaacca agacatagtc ttaatggaaa gaatcttttt tgaacttttt  1080ccttattgat taaattcttc tatagaaaag aaagaaatta tttgaggaaa agtatataca  1140aaaagaaaaa tagaaaaatg tcagtgaagc agatgtaatg gatgacctaa tccaaccacc  1200accataggat gtttctactt gagtcggtct tttaaaaacg cacggtggaa aatatgacac    1260gtatcatatg attccttcct ttagtttcgt gataataatc ctcaactgat atcttccttt    1320ttttgttttg gctaaagata ttttattctc attaatagaa aagacggttt tgggcttttg    1380gtttgcgata taaagaagac cttcgtgtgg aagataataa ttcatccttt cgtctttttc    1440tgactcttca atctctccca aagcctaaag cgatctctgc aaatctctcg cgactctctc    1500tttcaaggta tattttctga ttctttttgt ttttgattcg tatctgatct ccaatttttg    1560ttatgtggat tattgaatct tttgtataaa ttgcttttga caatattgtt cgtttcgtca    1620atccagcttc taaattttgt cctgattact aagatatcga ttcgtagtgt ttacatctgt    1680gtaatttctt gcttgattgt gaaattagga ttttcaagga cgatctattc aatttttgtg    1740ttttctttgt tcgattctct ctgttttagg tttcttatgt ttagatccgt ttctctttgg    1800tgttgttttg atttctctta cggcttttga tttggtatat gttcgctgat tggtttctac    1860ttgttctatt gttttatttc aggtggatct cgactctagg ggggcaataa gatatgaaaa    1920agcctgaact caccgcgacg tctgtcgaga agtttctgat cgaaaagttc gacagcgtct    1980ccgacctgat gcagctctcg gagggcgaag aatctcgtgc tttcagcttc gatgtaggag    2040ggcgtggata tgtcctgcgg gtaaatagct gcgccgatgg tttctacaaa gatcgttatg    2100tttatcggca ctttgcatcg gccgcgctcc cgattccgga agtgcttgac attggggcat    2160tcagcgagag cctgacctat tgcatctccc gccgtgcaca gggtgtcacg ttgcaagacc    2220tgcctgaaac cgaactgccc gctgttctgc agccggtcgc ggaggccatg gatgcgatcg    2280ctgcggccga tcttagccag acgagcgggt tcggcccatt cggaccgcaa ggaatcggtc    2340aatacactac atggcgtgat ttcatatgcg cgattgctga tccccatgtg tatcactggc    2400aaactgtgat ggacgacacc gtcagtgcgt ccgtcgcgca ggctctcgat gagctgatgc    2460tttgggccga ggactgcccc gaagtccggc acctcgtgca cgcggatttc ggctccaaca    2520atgtcctgac ggacaatggc cgcataacag cggtcattga ctggagcgag gcgatgttcg    2580gggattccca atacgaggtc gccaacatct tcttctggag gccgtggttg gcttgtatgg    2640agcagcagac gcgctacttc gagcggaggc atccggagct tgcaggatcg ccgcggctcc    2700gggcgtatat gctccgcatt ggtcttgacc aactctatca gagcttggtt gacggcaatt    2760tcgatgatgc agcttgggcg cagggtcgat gcgacgcaat cgtccgatcc ggagccggga    2820ctgtcgggcg tacacaaatc gcccgcagaa gcgcggccgt ctggaccgat ggctgtgtag    2880aagtactcgc cgatagtgga aaccgacgcc ccagcactcg tccgagggca aaggaataga    2940gtagatgccg accgggatcc ccgaatttcc ccgatcgttc aaacatttgg caataaagtt    3000tcttaagatt gaatcctgtt gccgcgtctt cgatgattat catataattt ctgttgaatt    3060acgttaagca tgtaataatt aacatgtaat gcatgacgtt atttatgaga tgggttttta    3120tgattagagt cccgcaatta tacatttaat acgcgataga aaacaaaata tagcgcgcaa    3180actaggataa attatcgcgc gcggtgtcat ctatgttact agatcgggaa ttgggtacgg    3240gcggccagca tggccgtatc cgcaatgtgt tattaagttg tctaagcgtc aatttgttta    3300caccacaata tatcctgcca ccagccagcc aacagctccc cgaccggcag ctcggcacaa    3360aatcaccact cgatacaggc agcccatcag aattaattct catgtttgac agcttatcat    3420cgactgcacg gtgcaccaat gcttctggcg tcaggcagcc atcggaagct gtggtatggc    3480tgtgcaggtc gtaaatcact gcataattcg tgtcgctcaa ggcgcactcc cgttctggat    3540aatgtttttt gcgccgacat cataacggtt ctggcaaata ttctgaaatg agctgttgac    3600aattaatcat ccggctcgta taatgtgtgg aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg    3660aaacagacca tgagggaagc gttgatcgcc gaagtatcga ctcaactatc agaggtagtt    3720ggcgtcatcg agcgccatct cgaaccgacg ttgctggccg tacatttgta cggctccgca    3780gtggatggcg gcctgaagcc acacagtgat attgatttgc tggttacggt gaccgtaagg    3840cttgatgaaa caacgcggcg agctttgatc aacgaccttt tggaaacttc ggcttcccct    3900ggagagagcg agattctccg cgctgtagaa gtcaccattg ttgtgcacga cgacatcatt    3960ccgtggcgtt atccagctaa gcgcgaactg caatttggag aatggcagcg caatgacatt    4020cttgcaggta tcttcgagcc agccacgatc gacattgatc tggctatctt gctgacaaaa    4080gcaagagaac atagcgttgc cttggtaggt ccagcggcgg aggaactctt tgatccggtt    4140cctgaacagg atctatttga ggcgctaaat gaaaccttaa cgctatggaa ctcgccgccc    4200gactgggctg gcgatgagcg aaatgtagtg cttacgttgt cccgcatttg gtacagcgca    4260gtaaccggca aaatcgcgcc gaaggatgtc gctgccgact gggcaatgga gcgcctgccg    4320gcccagtatc agcccgtcat acttgaagct aggcaggctt atcttggaca agaagatcgc    4380ttggcctcgc gcgcagatca gttggaagaa tttgttcact acgtgaaagg cgagatcacc    4440aaagtagtcg gcaaataaag ctctagtgga tctccgtacc cccgggggat ctggctcgcg    4500gcggacgcac gacgccgggg cgagaccata ggcgatctcc taaatcaata gtagctgtaa    4560cctcgaagcg tttcacttgt aacaacgatt gagaattttt gtcataaaat tgaaatactt    4620ggttcgcatt tttgtcatcc gcggtcagcc gcaattctga cgaactgccc atttagctgg    4680agatgattgt acatccttca cgtgaaaatt tctcaagcgc tgtgaacaag ggttcagatt    4740ttagattgaa aggtgagccg ttgaaacacg ttcttcttgt cgatgacgac gtcgctatgc    4800ggcatcttat tattgaatac cttacgatcc acgccttcaa agtgaccgcg gtagccgaca    4860gcacccagtt cacaagagta ctctcttccg cgacggtcga tgtcgtggtt gttgatctag    4920atttaggtcg tgaagatggg ctcgagatcg ttcgtaatct ggcggcaaag tctgatattc    4980caatcataat tatcagtggc gaccgccttg aggagacgga taaagttgtt gcactcgagc    5040taggagcaag tgattttatc gctaagccgt tcagtatcag agagtttcta gcacgcattc    5100gggttgcctt gcgcgtgcgc cccaacgttg tccgctccaa agaccgacgg tctttttgtt    5160ttactgactg gacacttaat ctcaggcaac gtcgcttgat gtccgaagct ggcggtgagg    5220tgaaacttac ggcaggtgag ttcaatcttc tcctcgcgtt tttagagaaa ccccgcgacg    5280ttctatcgcg cgagcaactt ctcattgcca gtcgagtacg cgacgaggag gtttatgaca    5340ggagtataga tgttctcatt ttgaggctgc gccgcaaact tgaggcagat ccgtcaagcc    5400ctcaactgat aaaaacagca agaggtgccg gttatttctt tgacgcggac gtgcaggttt    5460cgcacggggg gacgatggca gcctgagcca attcccagat ccccgaggaa tcggcgtgag    5520cggtcgcaaa ccatccggcc cggtacaaat cggcgcggcg ctgggtgatg acctggtgga    5580gaagttgaag gccgcgcagg ccgcccagcg gcaacgcatc gaggcagaag cacgccccgg    5640tgaatcgtgg caagcggccg ctgatcgaat ccgcaaagaa tcccggcaac cgccggcagc    5700cggtgcgccg tcgattagga agccgcccaa gggcgacgag caaccagatt ttttcgttcc    5760gatgctctat gacgtgggca cccgcgatag tcgcagcatc atggacgtgg ccgttttccg    5820tctgtcgaag cgtgaccgac gagctggcga ggtgatccgc tacgagcttc cagacgggca    5880cgtagaggtt tccgcagggc cggccggcat ggccagtgtg tgggattacg acctggtact    5940gatggcggtt tcccatctaa ccgaatccat gaaccgatac cgggaaggga agggagacaa    6000gcccggccgc gtgttccgtc cacacgttgc ggacgtactc aagttctgcc ggcgagccga    6060tggcggaaag cagaaagacg acctggtaga aacctgcatt cggttaaaca ccacgcacgt    6120tgccatgcag cgtacgaaga aggccaagaa cggccgcctg gtgacggtat ccgagggtga    6180agccttgatt agccgctaca agatcgtaaa gagcgaaacc gggcggccgg agtacatcga    6240gatcgagcta gctgattgga tgtaccgcga gatcacagaa ggcaagaacc cggacgtgct    6300gacggttcac cccgattact ttttgatcga tcccggcatc ggccgttttc tctaccgcct    6360ggcacgccgc gccgcaggca aggcagaagc cagatggttg ttcaagacga tctacgaacg    6420cagtggcagc gccggagagt tcaagaagtt ctgtttcacc gtgcgcaagc tgatcgggtc    6480aaatgacctg ccggagtacg atttgaagga ggaggcgggg caggctggcc cgatcctagt    6540catgcgctac cgcaacctga tcgagggcga agcatccgcc ggttcctaat gtacggagca    6600gatgctaggg caaattgccc tagcagggga aaaaggtcga aaaggtctct ttcctgtgga    6660tagcacgtac attgggaacc caaagccgta cattgggaac cggaacccgt acattgggaa    6720cccaaagccg tacattggga accggtcaca catgtaagtg actgatataa aagagaaaaa    6780aggcgatttt tccgcctaaa actctttaaa acttattaaa actcttaaaa cccgcctggc    6840ctgtgcataa ctgtctggcc agcgcacagc cgaagagctg caaaaagcgc ctacccttcg    6900gtcgctgcgc tccctacgcc ccgccgcttc gcgtcggcct atcgcggccg ctggccgctc    6960aaaaatggct ggcctacggc caggcaatct accagggcgc ggacaagccg cgccgtcgcc    7020actcgaccgc cggcgctgag gcctgcctcg tgaagaaggt gttgctgact cataccaggc    7080ctgaatcgcc ccatcatcca gccagaaagt gagggagcca cggttgatga gagctttgtt    7140gtaggtggac cagttggtga ttttgaactt ttgctttgcc acggaacggt ctgcgttgtc    7200gggaagatgc gtgatctgat ccttcaactc agcaaaagtt cgatttattc aacaaagccg    7260ccgtcccgtc aagtcagcgt aatgctctgc cagtgttaca accaattaac caattctgat    7320tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat tcatatcagg attatcaata    7380ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa actcaccgag gcagttccat    7440aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc gtccaacatc aatacaacct    7500attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga aatcaccatg agtgacgact    7560gaatccggtg agaatggcaa aagctctgca ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg    7620cggtttgcgt attgggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt    7680tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc    7740aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa    7800aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa    7860tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc    7920ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc    7980cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag    8040ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga    8100ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc    8160gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac    8220agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga agaacagtat ttggtatctg    8280cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca    8340aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa    8400aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa    8460ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt    8520gatccggaat taattcctgt ggttggcatg cacatacaaa tggacgaacg gataaacctt    8580ttcacgccct tttaaatatc cgattattct aataaacgct cttttctctt aggtttaccc    8640gccaatatat cctgtcaaac actgatagtt taaactgaag gcgggaaacg acaatctgat    8700catgagcgga gaattaaggg agtcacgtta tgacccccgc cgatgacgcg ggacaagccg    8760ttttacgttt ggaactgaca gaaccgcaac gctgcaggaa ttggccgcag cggccattta    8820aatcaattgg gcgcgccgaa ttcgagctc                                      8849<210>46<211>2949<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：ZmUbi-GFP-35S终止子表达盒<400>46gcatgcctgc agtgcagcgt gacccggtcg tgcccctctc tagagataat gagcattgca     60tgtctaagtt ataaaaaatt accacatatt ttttttgtca cacttgtttg aagtgcagtt    120tatctatctt tatacatata tttaaacttt actctacgaa taatataatc tatagtacta     180caataatatc agtgttttag agaatcatat aaatgaacag ttagacatgg tctaaaggac     240aattgagtat tttgacaaca ggactctaca gttttatctt tttagtgtgc atgtgttctc     300cttttttttt gcaaatagct tcacctatat aatacttcat ccattttatt agtacatcca     360tttagggttt agggttaatg gtttttatag actaattttt ttagtacatc tattttattc     420tattttagcc tctaaattaa gaaaactaaa actctatttt agttttttta tttaataatt     480tagatataaa atagaataaa ataaagtgac taaaaattaa acaaataccc tttaagaaat     540taaaaaaact aaggaaacat ttttcttgtt tcgagtagat aatgccagcc tgttaaacgc     600cgtcgacgag tctaacggac accaaccagc gaaccagcag cgtcgcgtcg ggccaagcga     660agcagacggc acggcatctc tgtcgctgcc tctggacccc tctcgagagt tccgctccac     720cgttggactt gctccgctgt cggcatccag aaattgcgtg gcggagcggc agacgtgagc     780cggcacggca ggcggcctcc tcctcctctc acggcacggc agctacgggg gattcctttc     840ccaccgctcc ttcgctttcc cttcctcgcc cgccgtaata aatagacacc ccctccacac     900cctctttccc caacctcgtg ttgttcggag cgcacacaca cacaaccaga tctcccccaa     960atccacccgt cggcacctcc gcttcaaggt acgccgctcg tcctcccccc ccccccctct    1020ctaccttctc tagatcggcg ttccggtcca tggttagggc ccggtagttc tacttctgtt    1080catgtttgtg ttagatccgt gtttgtgtta gatccgtgct gctagcgttc gtacacggat    1140gcgacctgta cgtcagacac gttctgattg ctaacttgcc agtgtttctc tttggggaat    1200cctgggatgg ctctagccgt tccgcagacg ggatcgattt catgattttt tttgtttcgt    1260tgcatagggt ttggtttgcc cttttccttt atttcaatat atgccgtgca cttgtttgtc    1320gggtcatctt ttcatgcttt tttttgtctt ggttgtgatg atgtggtctg gttgggcggt    1380cgttctagat cggagtagaa ttctgtttca aactacctgg tggatttatt aattttggat    1440ctgtatgtgt gtgccataca tattcatagt tacgaattga agatgatgga tggaaatatc    1500gatctaggat aggtatacat gttgatgcgg gttttactga tgcatataca gagatgcttt    1560ttgttcgctt ggttgtgatg atgtggtgtg gttgggcggt cgttcattcg ttctagatcg    1620gagtagaata ctgtttcaaa ctacctggtg tatttattaa ttttggaact gtatgtgtgt    1680gtcatacatc ttcatagtta cgagtttaag atggatggaa atatcgatct aggataggta    1740tacatgttga tgtgggtttt actgatgcat atacatgatg gcatatgcag catctattca    1800tatgctctaa ccttgagtac ctatctatta taataaacaa gtatgtttta taattatttt    1860gatcttgata tacttggatg atggcatatg cagcagctat atgtggattt ttttagccct    1920gccttcatac gctatttatt tgcttggtac tgtttctttt gtcgatgctc accctgttgt    1980ttggtgttac ttctgcaggt cgactctaga ggatccacca tgctgcagat gagcaagggc    2040gaggagctgt tcaccggcgt ggtgccaatc ctggtggagc tggacggcga cgtgaacggc    2100cacaagttca gcgtgagcgg cgagggcgag ggcgacgcga cctacggcaa gctgaccctg    2160aagttcatct gtaccaccgg caagctcccg gtcccgtggc cgaccctggt gaccaccttc    2220acctacggcg tgcagtgttt cagccgctac ccggaccaca tgaagcgcca cgacttcttc    2280aagagcgcca tgccggaggg ctacgtgcag gagcgcacca tcagcttcaa ggacgacggc    2340aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca cactagtgaa ccgcatcgag    2400ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc aacatcctgg gccacaagct ggagtacaac    2460tacaacagcc acaacgtgta catcaccgcg gacaagcaga agaacggcat caaggcgaac    2520ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc agcgtgcagc tggccgacca ctaccagcag    2580aacaccccga tcggcgacgg tcctgtgctg ctgccggaca accactacct gagcacccag    2640agcgccctga gcaaggaccc gaacgagaag cgcgaccaca tggtgctgct ggagttcgtg    2700accgccgccg gcatcaccca cggcatggac gagctgtaca aggttaacta gagctcaaga    2760tctgttctgc acaaagtgga gtagtcagtc atcgatcagg aaccagacac cagactttta    2820ttcatacagt gaagtgaagt gaagtgcagt gcagtgagtt gctggttttt gtacaactta    2880gtatgtattt gtatttgtaa aatacttcta tcaataaaat ttctaattcc taaaaccaaa    2940atccagtgg                                                            2949<210>47<211>4341<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：ZmUbi-GIG-nos表达盒<400>47cctgcagtgc agcgtgaccc ggtcgtgccc ctctctagag ataatgagca ttgcatgtct      60aagttataaa aaattaccac atattttttt tgtcacactt gtttgaagtg cagtttatct     120atctttatac atatatttaa actttactct acgaataata taatctatag tactacaata     180atatcagtgt tttagagaat catataaatg aacagttaga catggtctaa aggacaattg     240agtattttga caacaggact ctacagtttt atctttttag tgtgcatgtg ttctcctttt     300tttttgcaaa tagcttcacc tatataatac ttcatccatt ttattagtac atccatttag     360ggtttagggt taatggtttt tatagactaa tttttttagt acatctattt tattctattt     420tagcctctaa attaagaaaa ctaaaactct attttagttt ttttatttaa taatttagat     480ataaaataga ataaaataaa gtgactaaaa attaaacaaa taccctttaa gaaattaaaa     540aaactaagga aacatttttc ttgtttcgag tagataatgc cagcctgtta aacgccgtcg     600acgagtctaa cggacaccaa ccagcgaacc agcagcgtcg cgtcgggcca agcgaagcag     660acggcacggc atctctgtcg ctgcctctgg acccctctcg agagttccgc tccaccgttg     720gacttgctcc gctgtcggca tccagaaatt gcgtggcgga gcggcagacg tgagccggca     780cggcaggcgg cctcctcctc ctctcacggc accggcagct acgggggatt cctttcccac     840cgctccttcg ctttcccttc ctcgcccgcc gtaataaata gacaccccct ccacaccctc     900tttccccaac ctcgtgttgt tcggagcgca cacacacaca accagatctc ccccaaatcc     960acccgtcggc acctccgctt caaggtacgc cgctcgtcct cccccccccc ccctctctac    1020cttctctaga tcggcgttcc ggtccatggt tagggcccgg tagttctact tctgttcatg    1080tttgtgttag atccgtgttt gtgttagatc cgtgctgcta gcgttcgtac acggatgcga    1140cctgtacgtc agacacgttc tgattgctaa cttgccagtg tttctctttg gggaatcctg    1200ggatggctct agccgttccg cagacgggat cgatttcatg attttttttg tttcgttgca    1260tagggtttgg tttgcccttt tcctttattt caatatatgc cgtgcacttg tttgtcgggt    1320catcttttca tgcttttttt tgtcttggtt gtgatgatgt ggtctggttg ggcggtcgtt    1380ctagatcgga gtagaattct gtttcaaact acctggtgga tttattaatt ttggatctgt    1440atgtgtgtgc catacatatt catagttacg aattgaagat gatggatgga aatatcgatc    1500taggataggt atacatgttg atgcgggttt tactgatgca tatacagaga tgctttttgt    1560tcgcttggtt gtgatgatgt ggtgtggttg ggcggtcgtt cattcgttct agatcggagt    1620agaatactgt ttcaaactac ctggtgtatt tattaatttt ggaactgtat gtgtgtgtca    1680tacatcttca tagttacgag tttaagatgg atggaaatat cgatctagga taggtataca    1740tgttgatgtg ggttttactg atgcatatac atgatggcat atgcagcatc tattcatatg    1800ctctaacctt gagtacctat ctattataat aaacaagtat gttttataat tattttgatc    1860ttgatatact tggatgatgg catatgcagc agctatatgt ggattttttt agccctgcct    1920tcatacgcta tttatttgct tggtactgtt tcttttgtcg atgctcaccc tgttgtttgg    1980tgttacttct gcagggatcc cctcgaggtc gaccatggtc cgtcctgtag aaaccccaac    2040ccgtgaaatc aaaaaactcg acggcctgtg ggcattcagt ctggatcgcg aaaactgtgg    2100aattgatcag cgttggtggg aaagcgcgtt acaagaaagc cgggcaattg ctgtgccagg    2160cagttttaac gatcagttcg ccgatgcaga tattcgtaat tatgcgggca acgtctggta    2220tcagcgcgaa gtctttatac cgaaaggttg ggcaggccag cgtatcgtgc tgcgtttcga    2280tgcggtcact cattacggca aagtgtgggt caataatcag gaagtgatgg agcatcaggg    2340cggctatacg ccatttgaag ccgatgtcac gccgtatgtt attgccggga aaagtgtacg    2400taagtttctg cttctacctt tgatatatat ataataatta tcattaatta gtagtaatat    2460aatatttcaa atattttttt caaaataaaa gaatgtagta tatagcaatt gcttttctgt    2520agtttataag tgtgtatatt ttaatttata acttttctaa tatatgacca aaatttgttg    2580atgtgcaggt atcaccgttt gtgtgaacaa cgaactgaac tggcagacta tcccgccggg    2640aatggtgatt accgacgaaa acggcaagaa aaagcagtct tacttccatg atttctttaa    2700ctatgccgga atccatcgca gcgtaatgct ctacaccacg ccgaacacct gggtggacga    2760tatcaccgtg gtgacgcatg tcgcgcaaga ctgtaaccac gcgtctgttg actggcaggt    2820ggtggccaat ggtgatgtca gcgttgaact gcgtgatgcg gatcaacagg tggttgcaac    2880tggacaaggc actagcggga ctttgcaagt ggtgaatccg cacctctggc aaccgggtga    2940aggttatctc tatgaactgt gcgtcacagc caaaagccag acagagtgtg atatctaccc    3000gcttcgcgtc ggcatccggt cagtggcagt gaagggcgaa cagttcctga ttaaccacaa    3060accgttctac tttactggct ttggtcgtca tgaagatgcg gacttgcgtg gcaaaggatt    3120cgataacgtg ctgatggtgc acgaccacgc attaatggac tggattgggg ccaactccta    3180ccgtacctcg cattaccctt acgctgaaga gatgctcgac tgggcagatg aacatggcat    3240cgtggtgatt gatgaaactg ctgctgtcgg ctttaacctc tctttaggca ttggtttcga    3300agcgggcaac aagccgaaag aactgtacag cgaagaggca gtcaacgggg aaactcagca    3360agcgcactta caggcgatta aagagctgat agcgcgtgac aaaaaccacc caagcgtggt    3420gatgtggagt attgccaacg aaccggatac ccgtccgcaa ggtgcacggg aatatttcgc    3480gccactggcg gaagcaacgc gtaaactcga cccgacgcgt ccgatcacct gcgtcaatgt    3540aatgttctgc gacgctcaca ccgataccat cagcgatctc tttgatgtgc tgtgcctgaa    3600ccgttattac ggatggtatg tccaaagcgg cgatttggaa acggcagaga aggtactgga    3660aaaagaactt ctggcctggc aggagaaact gcatcagccg attatcatca ccgaatacgg    3720cgtggatacg ttagccgggc tgcactcaat gtacaccgac atgtggagtg aagagtatca    3780gtgtgcatgg ctggatatgt atcaccgcgt ctttgatcgc gtcagcgccg tcgtcggtga    3840acaggtatgg aatttcgccg attttgcgac ctcgcaaggc atattgcgcg ttggcggtaa    3900caagaaaggg atcttcactc gcgaccgcaa accgaagtcg gcggcttttc tgctgcaaaa    3960acgctggact ggcatgaact tcggtgaaaa accgcagcag ggaggcaaac aatgaatcaa    4020caactctcct ggcgcaccat cgtcggctac agcctcggga attagatccc cgaatttccc    4080cgatcgttca aacatttggc aataaagttt cttaagattg aatcctgttg ccggtcttgc    4140gatgattatc atataatttc tgttgaatta cgttaagcat gtaataatta acatgtaatg    4200catgacgtta tttatgagat gggtttttat gattagagtc ccgcaattat acatttaata    4260cgcgatagaa aacaaaatat agcgcgcaaa ctaggataaa ttatcgcgcg cggtgtcatc    4320tatgttacta gatcgggaat t                                              4341<210>48<211>2943<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：Ubq3(At)-synGFPI-nos表达盒<400>48accggatttg gagccaagtc tcataaacgc cattgtggaa gaaagtcttg agttggtggt      60aatgtaacag agtagtaaga acagagaaga gagagagtgt gagatacatg aattgtcggg     120caacaaaaat cctgaacatc ttattttagc aaagagaaag agttccgagt ctgtagcaga     180agagtgagga gaaatttaag ctcttggact tgtgaattgt tccgcctctt gaatacttct     240tcaatcctca tatattcttc ttctatgtta cctgaaaacc ggcatttaat ctcgcgggtt     300tattccggtt caacattttt tttgttttga gttattatct gggcttaata acgcaggcct     360gaaataaatt caaggcccaa ctgttttttt ttttaagaag ttgctgttaa aaaaaaaaaa     420agggaattaa caacaacaac aaaaaaagat aaagaaaata ataacaatta ctttaattgt     480agactaaaaa aacatagatt ttatcatgaa aaaaagagaa aagaaataaa aacttggatc     540aaaaaaaaaa catacagatc ttctaattat taacttttct taaaaattag gtcctttttc     600ccaacaatta ggtttagagt tttggaatta aaccaaaaag attgttctaa aaaatactca     660aatttggtag ataagtttcc ttattttaat tagtcaatgg tagatacttt tttttctttt     720ctttattaga gtagattaga atcttttatg ccaagtattg ataaattaaa tcaagaagat     780aaactatcat aatcaacatg aaattaaaag aaaaatctca tatatagtat tagtattctc     840tatatatatt atgattgctt attcttaatg ggttgggtta accaagacat agtcttaatg     900gaaagaatct tttttgaact ttttccttat tgattaaatt cttctataga aaagaaagaa     960attatttgag gaaaagtata tacaaaaaga aaaatagaaa aatgtcagtg aagcagatgt    1020aatggatgac ctaatccaac caccaccata ggatgtttct acttgagtcg gtcttttaaa    1080aacgcacggt ggaaaatatg acacgtatca tatgattcct tcctttagtt tcgtgataat    1140aatcctcaac tgatatcttc ctttttttgt tttggctaaa gatattttat tctcattaat    1200agaaaagacg gttttgggct tttggtttgc gatataaaga agaccttcgt gtggaagata    1260ataattcatc ctttcgtctt tttctgactc ttcaatctct cccaaagcct aaagcgatct    1320ctgcaaatct ctcgcgactc tctctttcaa ggtatatttt ctgattcttt ttgtttttga    1380ttcgtatctg atctccaatt tttgttatgt ggattattga atcttttgta taaattgctt    1440ttgacaatat tgttcgtttc gtcaatccag cttctaaatt ttgtcctgat tactaagata    1500tcgattcgta gtgtttacat ctgtgtaatt tcttgcttga ttgtgaaatt aggattttca    1560aggacgatct attcaatttt tgtgttttct ttgttcgatt ctctctgttt taggtttctt    1620atgtttagat ccgtttctct ttggtgttgt tttgatttct cttacggctt ttgatttggt    1680atatgttcgc tgattggttt ctacttgttc tattgtttta tttcaggtgg atccaccatg    1740ctgcagatga gcaagggcga ggagctgttc accggcgtgg tgccaatcct ggtggagctg    1800gacggcgacg tgaacggcca caagttcagc gtgagcggcg agggcgaggg cgacgcgacc    1860tacggcaagc tgaccctgaa gttcatctgt accaccggca agctcccggt cccgtggccg    1920accctggtga ccaccttcac ctacggcgtg cagtgtttca gccgctaccc ggaccacatg    1980aagcgccacg acttcttcaa gagcgccatg ccggagggct acgtaagttt ctgcttctac    2040ctttgatata tatataataa ttatcattaa ttagtagtaa tataatattt caaatatttt    2100tttcaaaata aaagaatgta gtatatagca attgcttttc tgtagtttat aagtgtgtat    2160attttaattt ataacttttc taatatatga ccaaaatttg ttgatgtgca ggtgcaggag    2220cgcaccatca gcttcaagga cgacggcaac tacaagaccc gcgccgaggt gaagttcgag    2280ggcgacacac tagtgaaccg catcgagctg aagggcatcg acttcaagga ggacggcaac    2340atcctgggcc acaagctgga gtacaactac aacagccaca atgtgtacat caccgcggac    2400aagcagaaga acggcatcaa ggcgaacttc aagatccgcc acaatatcga ggacggcagc    2460gtgcagctgg ccgaccacta ccagcagaac accccgatcg gcgacggtcc tgtgctgctg    2520ccggacaacc actacctgag cacccagagc gccctgagca aggacccgaa cgagaagcgc    2580gaccacatgg tgctgctgga gttcgtgacc gccgccggca tcacccacgg catggacgag    2640ctgtacaagg ttaactagag ctctagatcc ccgaatttcc ccgatcgttc aaacatttgg    2700caataaagtt tcttaagatt gaatcctgtt gccggtcttg cgatgattat catataattt    2760ctgttgaatt acgttaagca tgtaataatt aacatgtaat gcatgacgtt atttatgaga    2820tgggttttta tgattagagt cccgcaatta tacatttaat acgcgataga aaacaaaata    2880tagcgcgcaa actaggataa attatcgcgc gcggtgtcat ctatgttact agatcgggaa    2940ttg                                                                  2943<210>49<211>4072<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：Ubq3(At)-GIG-nos表达盒<400>49cggatttgga gccaagtctc ataaacgcca ttgtggaaga aagtcttgag ttggtggtaa      60tgtaacagag tagtaagaac agagaagaga gagagtgtga gatacatgaa ttgtcgggca     120acaaaaatcc tgaacatctt attttagcaa agagaaagag ttccgagtct gtagcagaag     180agtgaggaga aatttaagct cttggacttg tgaattgttc cgcctcttga atacttcttc     240aatcctcata tattcttctt ctatgttacc tgaaaaccgg catttaatct cgcgggttta     300ttccggttca acattttttt tgttttgagt tattatctgg gcttaataac gcaggcctga     360aataaattca aggcccaact gttttttttt ttaagaagtt gctgttaaaa aaaaaaaaag     420ggaattaaca acaacaacaa aaaaagataa agaaaataat aacaattact ttaattgtag     480actaaaaaaa catagatttt atcatgaaaa aaagagaaaa gaaataaaaa cttggatcaa     540aaaaaaacat acagatcttc taattattaa cttttcttaa aaattaggtc ctttttccca     600acaattaggt ttagagtttt ggaattaaac caaaaagatt gttctaaaaa atactcaaat     660ttggtagata agtttcctta ttttaattag tcaatggtag atactttttt ttcttttctt     720tattagagta gattagaatc ttttatgcca agtattgata aattaaatca agaagataaa     780ctatcataat caacatgaaa ttaaaagaaa aatctcatat atagtattag tattctctat     840atatattatg attgcttatt cttaatgggt tgggttaacc aagacatagt cttaatggaa     900agaatctttt ttgaactttt tccttattga ttaaattctt ctatagaaaa gaaagaaatt     960atttgaggaa aagtatatac aaaaagaaaa atagaaaaat gtcagtgaag cagatgtaat    1020ggatgaccta atccaaccac caccatagga tgtttctact tgagtcggtc ttttaaaaac    1080gcacggtgga aaatatgaca cgtatcatat gattccttcc tttagtttcg tgataataat    1140cctcaactga tatcttcctt tttttgtttt ggctaaagat attttattct cattaataga    1200aaagacggtt ttgggctttt ggtttgcgat ataaagaaga ccttcgtgtg gaagataata    1260attcatcctt tcgtcttttt ctgactcttc aatctctccc aaagcctaaa gcgatctctg    1320caaatctctc gcgactctct ctttcaaggt atattttctg attctttttg tttttgattc    1380gtatctgatc tccaattttt gttatgtgga ttattgaatc ttttgtataa attgcttttg    1440acaatattgt tcgtttcgtc aatccagctt ctaaattttg tcctgattac taagatatcg    1500attcgtagtg tttacatctg tgtaatttct tgcttgattg tgaaattagg attttcaagg    1560acgatctatt caatttttgt gttttctttg ttcgattctc tctgttttag gtttcttatg    1620tttagatccg tttctctttg gtgttgtttt gatttctctt acggcttttg atttggtata    1680tgttcgctga ttggtttcta cttgttctat tgttttattt caggtggatc ccctcgaggt    1740cgaccatggt ccgtcctgta gaaaccccaa cccgtgaaat caaaaaactc gacggcctgt    1800gggcattcag tctggatcgc gaaaactgtg gaattgatca gcgttggtgg gaaagcgcgt    1860tacaagaaag ccgggcaatt gctgtgccag gcagttttaa cgatcagttc gccgatgcag    1920atattcgtaa ttatgcgggc aacgtctggt atcagcgcga agtctttata ccgaaaggtt    1980gggcaggcca gcgtatcgtg ctgcgtttcg atgcggtcac tcattacggc aaagtgtggg    2040tcaataatca ggaagtgatg gagcatcagg gcggctatac gccatttgaa gccgatgtca    2100cgccgtatgt tattgccggg aaaagtgtac gtaagtttct gcttctacct ttgatatata    2160tataataatt atcattaatt agtagtaata taatatttca aatatttttt tcaaaataaa    2220agaatgtagt atatagcaat tgcttttctg tagtttataa gtgtgtatat tttaatttat    2280aacttttcta atatatgacc aaaatttgtt gatgtgcagg tatcaccgtt tgtgtgaaca    2340acgaactgaa ctggcagact atcccgccgg gaatggtgat taccgacgaa aacggcaaga    2400aaaagcagtc ttacttccat gatttcttta actatgccgg aatccatcgc agcgtaatgc    2460tctacaccac gccgaacacc tgggtggacg atatcaccgt ggtgacgcat gtcgcgcaag    2520actgtaacca cgcgtctgtt gactggcagg tggtggccaa tggtgatgtc agcgttgaac    2580tgcgtgatgc ggatcaacag gtggttgcaa ctggacaagg cactagcggg actttgcaag    2640tggtgaatcc gcacctctgg caaccgggtg aaggttatct ctatgaactg tgcgtcacag    2700ccaaaagcca gacagagtgt gatatctacc cgcttcgcgt cggcatccgg tcagtggcag    2760tgaagggcga acagttcctg attaaccaca aaccgttcta ctttactggc tttggtcgtc    2820atgaagatgc ggacttgcgt ggcaaaggat tcgataacgt gctgatggtg cacgaccacg    2880cattaatgga ctggattggg gccaactcct accgtacctc gcattaccct tacgctgaag    2940agatgctcga ctgggcagat gaacatggca tcgtggtgat tgatgaaact gctgctgtcg    3000gctttaacct ctctttaggc attggtttcg aagcgggcaa caagccgaaa gaactgtaca    3060gcgaagaggc agtcaacggg gaaactcagc aagcgcactt acaggcgatt aaagagctga    3120tagcgcgtga caaaaaccac ccaagcgtgg tgatgtggag tattgccaac gaaccggata    3180cccgtccgca aggtgcacgg gaatatttcg cgccactggc ggaagcaacg cgtaaactcg    3240acccgacgcg tccgatcacc tgcgtcaatg taatgttctg cgacgctcac accgatacca    3300tcagcgatct ctttgatgtg ctgtgcctga accgttatta cggatggtat gtccaaagcg    3360gcgatttgga aacggcagag aaggtactgg aaaaagaact tctggcctgg caggagaaac    3420tgcatcagcc gattatcatc accgaatacg gcgtggatac gttagccggg ctgcactcaa    3480tgtacaccga catgtggagt gaagagtatc agtgtgcatg gctggatatg tatcaccgcg    3540tctttgatcg cgtcagcgcc gtcgtcggtg aacaggtatg gaatttcgcc gattttgcga    3600cctcgcaagg catattgcgc gttggcggta acaagaaagg gatcttcact cgcgaccgca    3660aaccgaagtc ggcggctttt ctgctgcaaa aacgctggac tggcatgaac ttcggtgaaa    3720aaccgcagca gggaggcaaa caatgaatca acaactctcc tggcgcacca tcgtcggcta    3780cagcctcggg aattagatcc ccgaatttcc ccgatcgttc aaacatttgg caataaagtt    3840tcttaagatt gaatcctgtt gccggtcttg cgatgattat catataattt ctgttgaatt    3900acgttaagca tgtaataatt aacatgtaat gcatgacgtt atttatgaga tgggttttta    3960tgattagagt cccgcaatta tacatttaat acgcgataga aaacaaaata tagcgcgcaa    4020actaggataa attatcgcgc gcggtgtcat ctatgttact agatcgggaa tt            4072

Claims (39)

1.能够驱动相连核苷酸序列表达的DNA序列，其中所述DNA序列包含SEQ ID NO：1所述核苷酸序列。
2.依照权利要求1的DNA序列，其中所述DNA序列包含SEQ ID NO：2所述核苷酸序列。
3.依照权利要求1的DNA序列，其中所述DNA序列包含SEQ ID NO：3所述核苷酸序列。
4.依照权利要求1的DNA序列，其中所述DNA序列包含SEQ ID NO：4所述核苷酸序列。
5.依照权利要求1的DNA序列，其中所述DNA序列包含SEQ ID NO：5所述核苷酸序列。
6.依照权利要求1的DNA序列，其中所述DNA序列包含SEQ ID NO：6所述核苷酸序列。
7.在严谨条件下与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、或SEQ ID NO：6之任一发生杂交的DNA序列。
8.依照权利要求7的DNA序列，其中所述DNA序列包含SEQ ID NO：19所述核苷酸序列。
9.依照权利要求7的DNA序列，其中所述DNA序列包含SEQ ID NO：20所述核苷酸序列。
10.包含SEQ ID NO：1的至少50nt的连续片段的DNA序列，其中所述DNA序列能够驱动相连核苷酸序列的表达。
11.依照权利要求10的DNA序列，其中所述至少50nt的连续片段与SEQ ID NO：1的至少50nt的连续片段具有至少70％的序列同一性。
12.包含由夜香树黄叶卷曲病毒分离的全长转录本启动子区的重组DNA分子。
13.包含依照权利要求1-11之任一的DNA序列且其可操作连接目的核苷酸序列的重组DNA分子。
14.权利要求13的重组DNA分子，其中目的核苷酸序列包含编码序列。
15.权利要求14的重组DNA分子，其中编码序列编码期望的表型性状。
16.权利要求15的重组DNA分子，其中编码序列编码赋予经所述编码序列转化的细胞以正选择优势的蛋白质。
17.权利要求15或16的重组DNA分子，其中编码序列编码赋予经所述编码序列转化的细胞以代谢优势的蛋白质，该代谢优势包括能够代谢化合物，其中所述化合物是甘露糖或木糖或其衍生物或前体，或是该蛋白质的底物，或者能够由经所述编码序列转化的细胞代谢成这种底物。
18.权利要求17的重组DNA分子，其中所述编码序列编码选自下组的酶：木糖异构酶、磷酸甘露糖异构酶、甘露糖-6-磷酸异构酶、甘露糖-1-磷酸异构酶、磷酸甘露糖变位酶、甘露糖差向异构酶、甘露糖或木糖磷酸酶、甘露糖-6-磷酸酶、甘露糖-1-磷酸酶、和甘露糖或木糖通透酶。
19.权利要求18的重组DNA分子，其中编码序列编码磷酸甘露糖异构酶。
20.依照权利要求14的重组DNA，其中编码区是不能翻译的。
21.依照权利要求20的重组DNA，其中不能翻译的编码区来自病毒基因。
22.依照权利要求21的重组DNA，其中病毒基因衍生自TSWV，特别是来自TSWV NP基因。
23.权利要求14的重组DNA分子，其中编码序列处于反义取向。
24.包含依照权利要求1-11之任一的DNA序列或依照权利要求12-23之任一的重组DNA分子的DNA表达载体。
25.权利要求24的DNA表达载体，其中所述DNA表达载体是pNOV2819。
26.权利要求24的DNA表达载体，其中所述DNA表达载体是pNOV2820。
27.包含依照权利要求1-11之任一的第一DNA序列及与之可操作连接的目的核苷酸序列以及依照权利要求1-11之任一的第二DNA序列及与之可操作连接的目的核苷酸序列的DNA表达载体。
28.依照权利要求27的DNA表达载体，其能够改变病毒基因组的表达。
29.依照权利要求28的DNA表达载体，其中包含能够在细胞中表达所述病毒基因组或其部分的有义RNA片段的第一DNA序列和能够在细胞中表达所述病毒基因组或其部分的反义RNA片段的第二DNA序列，所述有义RNA片段与所述反义RNA片段能够形成双链RNA。
30.依照权利要求29的DNA表达载体，其中所述病毒选自下组：tospoviruses、马铃薯Y病毒组、马铃薯X病毒组、烟草花叶病毒组、黄矮病毒组、南瓜花叶病毒组、雀麦花叶病毒组、线形病毒组、番茄丛矮病毒组、和真菌传棒状病毒组。
31.权利要求30的DNA表达载体，其中所述DNA序列包含衍生自病毒外壳蛋白基因、病毒核壳蛋白基因、病毒复制酶基因、或病毒移动蛋白基因或者其部分的核苷酸序列。
32.权利要求31的DNA表达载体，其中所述DNA序列衍生自番茄斑萎病毒(TSWV)。
33.权利要求32的DNA表达载体，其中所述DNA衍生自核壳蛋白基因。
34.经依照权利要求1-11之任一的DNA序列或依照权利要求12-23之任一的重组DNA分子或依照权利要求24-33之任一的DNA表达载体稳定转化的宿主细胞。
35.权利要求34的宿主细胞，其中所述宿主细胞是植物细胞。
36.经依照权利要求1-11之任一的DNA序列或依照权利要求12-23之任一的重组DNA分子或依照权利要求24-33之任一的DNA表达载体稳定转化的植物和其后代。
37.权利要求36的植物，其中所述植物选自下组：玉米、小麦、高粱、黑麦、燕麦、草坪草、水稻、大麦、大豆、棉花、烟草、甜菜、和油籽油菜。
38.权利要求1-11之任一的DNA序列用于表达目的核苷酸序列的用途。
39.生成依照权利要求1的DNA序列的方法，其中通过聚合酶链式反应生成该DNA，其中至少一种所用寡核苷酸包含代表SEQ ID NO：1的15或更多碱基对的连续片段的核苷酸序列。
CNB018091180A 2000-03-27 2001-03-26 夜香树黄叶卷曲病毒启动子 Expired - Lifetime CN100457913C (zh)

Applications Claiming Priority (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB0007427.8 2000-03-27
GB0007427A GB0007427D0 (en) 2000-03-27 2000-03-27 Organic compounds
GB0010486A GB0010486D0 (en) 2000-04-28 2000-04-28 Organic compounds
GB0010486.9 2000-04-28
EP01101802.5 2001-01-26
EP01101802 2001-01-26
US27207601P 2001-02-28 2001-02-28
US60/272,076 2001-02-28

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1430673A true CN1430673A (zh) 2003-07-16
CN100457913C CN100457913C (zh) 2009-02-04

Family

ID=27224121

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB018091180A Expired - Lifetime CN100457913C (zh) 2000-03-27 2001-03-26 夜香树黄叶卷曲病毒启动子

Country Status (16)

Country Link
EP (1) EP1268826B1 (zh)
JP (1) JP4739634B2 (zh)
KR (1) KR100766290B1 (zh)
CN (1) CN100457913C (zh)
AR (1) AR044724A1 (zh)
AT (1) ATE393829T1 (zh)
AU (2) AU2001242516B2 (zh)
BR (1) BR0109530B1 (zh)
CA (1) CA2406191C (zh)
DE (1) DE60133807T2 (zh)
EA (1) EA006761B1 (zh)
ES (1) ES2304127T3 (zh)
HU (1) HU225788B1 (zh)
NZ (1) NZ521412A (zh)
PL (1) PL204327B1 (zh)
WO (1) WO2001073087A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102348802A (zh) * 2009-01-22 2012-02-08 先正达参股股份有限公司 突变体羟基苯丙酮酸双加氧酶多肽及其使用方法
CN112210560A (zh) * 2020-11-05 2021-01-12 四川农业大学 一种玉米叶黄化基因oy2以及与其连锁的InDel分子标记和应用

Families Citing this family (66)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AR035799A1 (es) 2001-03-30 2004-07-14 Syngenta Participations Ag Toxinas insecticidas aisladas de bacillus thuringiensis y sus usos.
CN101001951B (zh) * 2004-08-02 2011-06-15 巴斯福植物科学有限公司 分离转录终止序列的方法
US8124842B2 (en) 2005-10-05 2012-02-28 Bayer Cropscience Ag Plants having an increased content of amino sugars
EP1772052A1 (de) 2005-10-05 2007-04-11 Bayer CropScience GmbH Verbesserte Verfahren und Mittel zur Herstellung von Hyaluronan
AR064558A1 (es) 2006-12-29 2009-04-08 Bayer Cropscience Sa Proceso para la modificacion de las propiedades termicas y de digestion de almidones de maiz y harinas de maiz
EP2036983A1 (de) 2007-09-12 2009-03-18 Bayer CropScience AG Pflanzen, die erhöhte Mengen an Glucosaminglycanen synthetisieren
KR100987352B1 (ko) * 2008-04-15 2010-10-12 주식회사 인트론바이오테크놀로지 비특이 증폭을 감소시킬 수 있는 ｐｃｒ용 프라이머 및이를 이용한 ｐｃｒ 방법
EP2143797A1 (de) 2008-07-10 2010-01-13 Bayer CropScience AG Weizenstärke sowie Weizenmehle und Lebensmittel enthaltend diese Weizenstärke/Weizenmehle
CN101768213B (zh) 2008-12-30 2012-05-30 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种与植物分蘖数目相关的蛋白及其编码基因与应用
CN101817879A (zh) 2009-02-26 2010-09-01 中国科学院遗传与发育生物学研究所 金属硫蛋白及其编码基因与应用
EP2726493B1 (en) 2011-07-01 2020-10-14 Monsanto Technology LLC Methods and compositions for selective regulation of protein expression
WO2013015993A1 (en) 2011-07-28 2013-01-31 Syngenta Participations Ag Methods and compositions for controlling nematode pests
US10023876B2 (en) 2012-02-16 2018-07-17 Syngenta Participations Ag Engineered pesticidal proteins
RU2015101749A (ru) 2012-06-22 2016-08-10 Зингента Партисипейшнс Аг Биологический контроль жесткокрылых вредителей
CN107109414A (zh) 2014-12-23 2017-08-29 先正达参股股份有限公司 鞘翅目有害生物的生物控制
JP6937699B2 (ja) 2015-04-10 2021-09-22 シンジェンタ パーティシペーションズ アーゲー 動物飼料組成物および使用方法
PL3324732T3 (pl) 2015-07-22 2023-03-13 Monsanto Technology Llc Sposoby i kompozycje do selektywnego regulowania ekspresji białka
WO2017059902A1 (en) * 2015-10-07 2017-04-13 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh 3' utr sequences for stabilization of rna
WO2018076335A1 (en) 2016-10-31 2018-05-03 Institute Of Genetics And Developmental Biology, Chinese Academy Of Sciences Compositions and methods for enhancing abiotic stress tolerance
AR113761A1 (es) 2017-10-18 2020-06-10 Syngenta Participations Ag Control de plagas de hemípteros utilizando moléculas de arn
WO2021004611A1 (en) 2019-07-05 2021-01-14 Bejo Zaden B.V. Tomato spotted wilt virus resistance in cichorium
WO2021092130A1 (en) 2019-11-05 2021-05-14 Pairwise Plants Services, Inc. Compositions and methods for rna-encoded dna-replacement of alleles
CN115380111A (zh) 2020-01-30 2022-11-22 成对植物服务股份有限公司 用于碱基多样化的组合物、系统和方法
MX2022009333A (es) 2020-01-31 2022-10-07 Pairwise Plants Services Inc Supresion de la respuesta de evasion de la sombra en las plantas.
US20230063560A1 (en) 2020-02-04 2023-03-02 Pairwise Plans Services, Inc. Thornless and/or prickleless rubus plants
EP4107274A1 (en) 2020-02-21 2022-12-28 Pairwise Plants Services, Inc. Improved resistance to soybean cyst nematode through gene editing
US20210292754A1 (en) 2020-03-16 2021-09-23 Pairwise Plants Services, Inc. Natural guide architectures and methods of making and using the same
US20210301282A1 (en) 2020-03-26 2021-09-30 Pairwise Plants Services, Inc. Methods for controlling meristem size for crop improvement
US11882808B2 (en) 2020-03-27 2024-01-30 Pairwise Plants Services, Inc. Methods for improving resistance to soybean rust
EP4135512A1 (en) 2020-04-16 2023-02-22 Pairwise Plants Services, Inc. Methods for controlling meristem size for crop improvement
CN116096230A (zh) 2020-06-02 2023-05-09 成对植物服务股份有限公司 控制分生组织大小以改良作物的方法
BR112022025598A2 (pt) 2020-06-17 2023-01-03 Pairwise Plants Services Inc Métodos para controlar o tamanho do meristema para melhoria da safra
AU2021300169A1 (en) 2020-06-30 2023-02-02 Pairwise Plants Services, Inc. Compositions, systems, and methods for base diversification
CN116745415A (zh) 2020-08-28 2023-09-12 成对植物服务股份有限公司 工程化crispr-cas蛋白质及其使用方法
EP4240844A2 (en) 2020-11-06 2023-09-13 Pairwise Plants Services, Inc. Compositions and methods for rna-encoded dna-replacement of alleles
CN117441015A (zh) 2021-02-11 2024-01-23 成对植物服务股份有限公司 用于修饰植物中细胞分裂素氧化酶水平的方法和组合物
CN117203227A (zh) 2021-02-25 2023-12-08 成对植物服务股份有限公司 用于修饰植物中根结构的方法和组合物
US20220403475A1 (en) 2021-06-14 2022-12-22 Pairwise Plants Services, Inc. Reporter constructs, compositions comprising the same, and methods of use thereof
CN117897050A (zh) 2021-06-17 2024-04-16 成对植物服务股份有限公司 大豆中生长调节因子家族转录因子的修饰
UY39827A (es) 2021-06-24 2023-01-31 Pairwise Plants Services Inc Modificación de genes de ubiquitina ligasa e3 hect para mejorar los rasgos de rendimiento
CA3224982A1 (en) 2021-07-01 2023-01-05 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for enhancing root system development
WO2023019188A1 (en) 2021-08-12 2023-02-16 Pairwise Plants Services, Inc. Modification of brassinosteroid receptor genes to improve yield traits
US20230063927A1 (en) 2021-08-17 2023-03-02 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for modifying cytokinin receptor histidine kinase genes in plants
US20230074699A1 (en) 2021-08-30 2023-03-09 Pairwise Plants Services, Inc. Modification of ubiquitin binding peptidase genes in plants for yield trait improvement
AR126938A1 (es) 2021-09-02 2023-11-29 Pairwise Plants Services Inc Métodos y composiciones para mejorar la arquitectura de las plantas y los rasgos de rendimiento
WO2023049720A1 (en) 2021-09-21 2023-03-30 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for reducing pod shatter in canola
WO2023049728A1 (en) 2021-09-21 2023-03-30 Pairwise Plants Services, Inc. Color-based and/or visual methods for identifying the presence of a transgene and compositions and constructs relating to the same
WO2023060028A1 (en) 2021-10-04 2023-04-13 Pairwise Plants Services, Inc. Methods for improving floret fertility and seed yield
AR127300A1 (es) 2021-10-07 2024-01-10 Pairwise Plants Services Inc Métodos para mejorar la fertilidad de la flor y el rendimiento de semillas
AR127904A1 (es) 2021-12-09 2024-03-06 Pairwise Plants Services Inc Métodos para mejorar la fertilidad de floretes y el rendimiento de semillas
US20230295646A1 (en) 2021-12-13 2023-09-21 Pairwise Plants Services, Inc. Model editing systems and methods relating to the same
WO2023133440A1 (en) 2022-01-06 2023-07-13 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for trichome removal
WO2023147526A1 (en) 2022-01-31 2023-08-03 Pairwise Plants Services, Inc. Suppression of shade avoidance response in plants
WO2023164722A1 (en) 2022-02-28 2023-08-31 Pairwise Plants Services, Inc. Engineered crispr-cas effector proteins and methods of use thereof
WO2023168217A1 (en) 2022-03-02 2023-09-07 Pairwise Plants Services, Inc. Modification of brassinosteroid receptor genes to improve yield traits
WO2023192838A1 (en) 2022-03-31 2023-10-05 Pairwise Plants Services, Inc. Early flowering rosaceae plants with improved characteristics
WO2023196886A1 (en) 2022-04-07 2023-10-12 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for improving resistance to fusarium head blight
US20230383305A1 (en) 2022-04-21 2023-11-30 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for improving yield traits
WO2023215704A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for enhancing yield and disease resistance
WO2023215809A1 (en) 2022-05-05 2023-11-09 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for modifying root architecture and/or improving plant yield traits
US20230416771A1 (en) 2022-06-27 2023-12-28 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for modifying shade avoidance in plants
US20240000031A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for controlling meristem size for crop improvement
US20240002873A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for controlling meristem size for crop improvement
US20240043857A1 (en) 2022-08-04 2024-02-08 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for improving yield traits
US20240060081A1 (en) 2022-08-11 2024-02-22 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for controlling meristem size for crop improvement
WO2024054880A1 (en) 2022-09-08 2024-03-14 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for improving yield characteristics in plants

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0131623B2 (en) * 1983-01-17 1999-07-28 Monsanto Company Chimeric genes suitable for expression in plant cells
DK0426641T3 (da) * 1989-10-31 2000-10-23 Monsanto Co Promotor til transgene planter
US5824857A (en) * 1991-11-08 1998-10-20 Washington University Plant promoter

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102348802A (zh) * 2009-01-22 2012-02-08 先正达参股股份有限公司 突变体羟基苯丙酮酸双加氧酶多肽及其使用方法
CN102348802B (zh) * 2009-01-22 2014-09-24 先正达参股股份有限公司 突变体羟基苯丙酮酸双加氧酶多肽及其使用方法
CN112210560A (zh) * 2020-11-05 2021-01-12 四川农业大学 一种玉米叶黄化基因oy2以及与其连锁的InDel分子标记和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN100457913C (zh) 2009-02-04
KR20020086724A (ko) 2002-11-18
EA200200960A1 (ru) 2003-06-26
CA2406191C (en) 2012-05-29
HU225788B1 (en) 2007-09-28
BR0109530B1 (pt) 2014-09-16
EP1268826B1 (en) 2008-04-30
CA2406191A1 (en) 2001-10-04
NZ521412A (en) 2003-11-28
ATE393829T1 (de) 2008-05-15
JP4739634B2 (ja) 2011-08-03
WO2001073087A8 (en) 2003-01-03
EP1268826A1 (en) 2003-01-02
AU4251601A (en) 2001-10-08
PL204327B1 (pl) 2010-01-29
WO2001073087A1 (en) 2001-10-04
DE60133807T2 (de) 2009-06-25
BR0109530A (pt) 2002-12-10
HUP0300570A2 (hu) 2003-08-28
ES2304127T3 (es) 2008-09-16
PL358790A1 (en) 2004-08-23
EA006761B1 (ru) 2006-04-28
JP2003529353A (ja) 2003-10-07
HUP0300570A3 (en) 2004-11-29
AU2001242516B2 (en) 2005-07-14
KR100766290B1 (ko) 2007-10-11
DE60133807D1 (en) 2008-06-12
AR044724A1 (es) 2005-10-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1430673A (zh) 夜香树黄叶卷曲病毒启动子
US20040086847A1 (en) Cestrum yellow leaf curling virus promoters
AU2020264325A1 (en) Plant genome modification using guide rna/cas endonuclease systems and methods of use
CA2730126C (en) Plant regulatory sequence
AU2016350610A1 (en) Methods and compositions of improved plant transformation
CN101939423A (zh) 用于捕获和修饰基因组dna大片段和用合成叶绿体构建生物体的系统
CN110724685A (zh) 转基因耐盐耐除草剂玉米sr801外源插入旁侧序列及其应用
CN108026150A (zh) 小麦秆锈病抗性基因及使用方法
CN109880846A (zh) 一种用于植物基因组编辑载体、及其构建方法和应用
AU2005252598B8 (en) Transformation vectors
WO2022121127A1 (zh) 一种根结线虫病相关miRNA及其调控基因、蛋白和应用
CN107058317B (zh) 一种花粉特异性启动子及其应用
CN111560373B (zh) 植物组成型启动子OsUbipro及其应用
CN115011600B (zh) 一种响应缺铁胁迫的诱导型启动子GmbHLH47启动子及其应用
CN110423775B (zh) 一种水稻基因组中稻瘟病抗性位点dna的编辑修饰方法、编辑载体
CN109355308B (zh) 一种培育具有马铃薯y病毒属广谱病毒抗性的转基因大豆的方法
CN101979560B (zh) 一种受化学物质烯丙异噻唑诱导的启动子及其应用
CN106459973B (zh) 高等植物中的rna生成
CN109182372B (zh) 烟草NtPED基因在调控烟草叶柄夹角中的应用
Rong et al. Transgenic rape with hrf2 gene encoding harpinxooc resistant to Sclerotinia sclerotinorium
CN1386860A (zh) 一种建立植物基因标签系统的方法
Rani et al. A forward genetics approach identifies pathogenicity genes in Fusarium oxysporum f. sp. carthami, a fungus causing vascular wilt disease of safflower
CN115109128A (zh) 花生青枯菌效应蛋白RipXV及其编码基因和应用
AU2015224510B2 (en) Activation tagging platform for maize, and resultant tagged population and plants
WO2000006753A1 (en) Engineering nematode resistance in solanacae

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CX01 Expiry of patent term

Granted publication date: 20090204

CX01 Expiry of patent term