CN1386860A - 一种建立植物基因标签系统的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种建立植物基因标签系统的方法,包括:构建一种DNA片段,使其包含一种由诱导系统或愈伤组织特异性表达启动子控制的编码转座酶的基因、一种依赖于转座酶的非自主性插入元件和一种植物筛选标记基因;用所构建的DNA片段或含有上述片段DNA的质粒转化植物细胞;筛选出被转化的植物细胞;诱导转座酶表达;使被转化的植物细胞再生出完整植株。该方法大大简化了传统方法所需的大量田间纯化和杂交程序,缩短了所需要的时间。

Description

一种建立植物基因标签系统的方法

本发明涉及一种建立植物基因标签系统的方法。

遗传学是对自然群体或诱变群体变异规律进行研究的一门科学。通过对作图群体中变异规律的遗传分析从而对引起变异的遗传因子(基因)及其在在染色体上的相关位置加以确认。这种变异可以是分离的，如大多数点突变；也可以是连续的，如一些复杂性状(特别是一些重要的农艺性状，如：产量和植株高度)，这些性状大多是由多基因控制的。

近年来，植物基因组研究进展迅速，拟南芥基因组序列已在2000年底全部被测定，水稻的基因组序列测定也即将于今年完成。随着植物基因组测序计划的迅速推进，Genebank中积累了大量功能未知的植物DNA序列，如何阐明其生物学意义即鉴定出基因组全部基因的功能已成为植物基因组研究的重点和热点。突变体途径是目前对植物基因组中基因进行功能分析的最广泛的应用手段，并在植物遗传学和分子生物学基础研究中取得了很大成功。经典的化学(EMS)或物理(等离子、γ射线)诱变法允许我们在相对容易的情况下以极高的频率获得整个基因组基因饱和突变，即每一基因均发生一次突变，然后用图位克隆程序对突变基因进行克隆。在模式植物如拟南芥中由于高密基因图谱和一系列重叠基因组DNA的酵母人工染色体(YAC)或细菌人工染色体(BAC)的存在，这一程序可相对较快进行。而且，随着基因组序列的完成，图位克隆策略也将大大加速。但是，对分子标记饱和度低的大多数植物来说，图位克隆无疑将是一个极为漫长的过程。

可以随机插入植物染色体的DNA元件如转座子或农杆菌T-DNA也可用作诱变剂诱导植物功能缺失突变体的发生。随着植物基因组序列的逐渐被破译，T-DNA和转座子插入突变等方法在基因功能研究中应用越来越广泛。由于插入元件的序列是已知的，通过Inverse PCR或Tail PCR法可在很短的时间内获得插入片段的侧翼(Souer et al.，1995；Liu et al.，1995)，并进行测序，因此被插入的基因序列可以再通过PCR的方法很容易的克隆出来，并可建立T-DNA或Ds侧翼序列数据库。因此，插入突变法的运用为我们提供了一种迅速有效的克隆突变基因的方法。

农杆菌T-DNA标签技术即通过农杆菌转化技术将T-DNA随机插入到植物基因组中。农杆菌介导的植物转基因技术的改进和完善，使利用T-DNA标签对植物全基因组进行突变进而研究基因组所有基因的功能成为可能。T-DNA一旦插入就几乎不再移动，因此，所再生的突变体相当稳定，较易保存。但是，T-DNA标签仅适用于可以用农杆菌介导转化的植物。而且，要建立在基因组中每一个基因至少含一个突变标签的饱和突变体库，需得到的转化突变体数量极大。

1951年Mclintock发现在玉米基因组中存在一段可移动的DNA序列，它可以通过切割、重新整合等一系列过程从基因组的一个位置“跳跃”到另一个位置，后来命名为转座元件或转座子(transposon)。后来，除玉米以外，人们在金鱼草，矮牵牛，水稻等植物中也发现有转座子存在。

转座子大体可以分为两大类：以DNA-DNA方式转座的转座子和反转录转座子(retrotransposon)。第一类转座子可以通过DNA复制或直接切除两种方式获得可移片段，重新插入基因组DNA中。根据转座的自主性，这类元件又可以分为自主转座元件和非自主转座元件，前者本身能够编码转座酶而进行转座，后者则需在自主元件存在时方可转座，如在玉米的Ac/Ds系统中，Ac(Activator)属于自主元件，Ds(Dissociation)则是非自主元件，必需在Ac元件存在下才能转座(Girel and Saedler，1992)。第二类转座子又称为返座元(retroposon)(Hirochika，1997)，是近年新发现的由RNA介导转座的转座元件，在结构和复制上与反转录病毒(retrovims)类似，只是没有病毒感染必须的env基因，它通过转录合成mRNA，再逆转录合成新的元件整合到基因组中完成转座，每转座1次拷贝数就会增加1份，因此它是目前所知高等植物中数量最大的一类可活动遗传成分。目前共发现了3种类型反转录转座子：Tyl-copia类，Ty3-gypsy类和LINE(long interspersed nuclear elements)类转座子，前两类是具有长末端重复的转座子，LINE类转座子没有长末端重复。高等植物中的反转录转座子主要属于Tyl-copia类，分布十分广泛，几乎覆盖了所有高等植物种类(Hirochika et al.，1996)。目前在基因库中登陆的植物转座子约156种，最常用的是来源于玉米的Ac/Ds系统。

转座子的发现不仅解释了生物遗传进化上分子作用引起的一些现象，也为基因工程和分子生物学研究提供了强有力的工具，使人们可以在不了解基因产物的生化性质和表达模式的情况下，分离克隆植物基因，即转座子标签(transposon tagging)。其原理是利用转座子的插入造成基因突变，以转座子序列为基础，从突变株的基因文库中筛选出带有此转座子的克隆，它必定含有与转座子序列相邻的突变基因的部分序列，再利用这部分序列从野生型基因文库中获得完整的基因(Girel and Saedler，1992)。

1984年，用转座子标签法首先在玉米中分离了bronze基因，该基因编码了玉米花色素合成途径的关键酶——UDP-葡萄糖类黄3-O-葡萄糖基转移酶(Fedoroff et al.，1984)。Baker等人首先证明了玉米的Ac/Ds转座元件在转基因烟草中有作用，此后又发现Ac/Ds在其他许多物种中如拟南芥、蕃茄、矮牵牛、亚麻、马铃薯、黄豆和水稻中都有活性(Baker et al.，1986；Hirochika et al.，1996；Hirochika，1997)。1993年用Ac元件从矮牵牛中成功地克隆了一个花色素苷合成基因，开创了用外源转座子在异源宿主中克隆基因的先河(Chuck et al.，1993)。此后利用转座子标签技术分离了许多植物基因。

目前植物基因工程常用的转座元件体系分为天然和人工改造两大类，前者包括自主元件单因子体系和反转录转座元件体系，后者主要是人工改造的双因子体系。

自主转座元件单因子体系利用了转座活性较高的自主转座子如玉米的Mu转座子、Ac转座子和矮牵牛的dTpH1转座子，已经克隆了拟南芥白化病基因(albino)、雄性育性基因、蕃茄的抗病基因Cf-9等基因(Knappet al.，1994a)。这一转座体系具有两大优点：一是在植物中插入拷贝数高，如Mu元件每个基因组平均拷贝数可达100以上，因此可以在大田自然培养条件下获得大量突变个体；二是只需筛选相对较少量的植株就能标记所有基因。然而，这一体系也存在一些问题：自主转座元件高频率的转座有可能切除转座酶而留下一些序列导致永久突变；自主转座在体细胞内可能造成基因功能自动恢复；自主元件切除留下一些片段使转座元件不能与突变表型共分离，这些都增加了筛选克隆的困难，阻碍了转座子标签的推广(Lucas et al.，1995)。

虽然反转录转座子作为一个整体，在整个植物基因组中拷贝数很多甚至是最多的一类成分，但它包括了许多亚群，有的亚群仅由一个或几个拷贝组成，这些以单拷贝或低拷贝方式存在的成分比较容易识别，同时实验证明反转录转座子的转座活动在组织培养中能被激活，因此它们是一类很有潜力的转座子标签体系。1996年Hirchick等人就利用水稻反转录转座子Tos17建立了水稻基因敲除体系(gene knock-out system)，Tos17可以在组织培养过程中被激活，插入水稻基因组中，使基因失效(Hirochika，1997)。1999年Sato等利用这一体系分离了6个水稻kn1-型同源异型框基因，发现了引起水稻植株矮化的突变基因OSH15(Sato et al.，1999)。

最近Lucas等将烟草中的有活性的Ty1-copia类反转录转座子导入拟南芥(Lucas et al.，1995)，发现它在后者中可进行转座，从而将新的拷贝插入到其它基因的可读框中。之后又相继将它导入蕃茄和水稻中，在新的宿主中进行了表达，而且宿主的内源反转录转座子不影响新导入转座子的转座，说明反转录转座子并不受植物种类差异的影响。双子叶植物中的反转录转座子不仅可在异源双子叶植物中转座，也可以在单子叶植物中表达，这为反转录转座子用于转座子标签提供了更广阔的前景。

双因子转座子体系是一经人工改造过的转座子标签系统。它由一个非自主转座元件和一个改造过后自身不能转座的自主转座元件组成，后者编码转座酶引起前者的转座。分别构建含两个元件的植物表达载体(图1)，分别转化植物培育分别含有非自主性转座子和转座酶的株系，后代纯化，再通过转基因植株杂交，在F2代就能获得大量由转座子引起的突变体。通过异源转座子(主要是玉米转座子如Ac/Ds，En/Spm，或Mu)，人们已经在拟南芥、矮牵牛、金鱼草、西红柿、玉米等几种植物(Knappet al.，1994b；Lucas et al.，1995；Sato et al.，1999；Izawa et al.，1997)中，获得各种突变植株群体，Shimamoto等利用双元载体系统，分别培育含Ds转座元件和含Ac转座元件转座酶(AcTPase)基因的水稻株系，通过杂交筛选得到了大量矮化、花期改变的突变体(Izawa et al.，1997)。

双因子转座子系统Ac/Ds的转座子标签系统虽然只需要几百个起始独立Ds转化体，通过与表达Ac转座酶的转基因植株杂交即可获得新突变体群体。大大减少了转化工作量。但后期田间所需的纯化、杂交工作量很大。而转基因植物在田间必须经几代筛选才可获得纯系。杂交后代又需经过几代扩繁使Ac转座酶和Ds插入元件分离，才能使突变体得以稳定，工作量极大。

T-DNA标签技术虽可取得较好的单位点整合效果，并具有插入稳定，容易保持等优点，但其需要相当大转化群体。要建立饱和突变体库，即基因组的每一基因至少有一个插入标签，即便是基因组最小的植物拟南芥要获得95％饱和度的插入约需12.5万个独立转基因植株，水稻则高达45万以上。前期转化工作量极大。因此，传统的方法在大多数植物突变体库的建立中均难以进行。

本发明的目的是提供一种建立植物基因标签系统的方法。

我们利用可诱导系统控制Ac/Ds转座系统的转座酶基因，并与Ds一起转入植株。在未诱导情况下，Ac转座酶基因处于沉默状态，不具激活Ds转座能力。通过瞬间的诱导Ac转座酶表达，激活Ds转座并随机插入植物基因组中从而获得突变体。由于Ds的转座是用诱导物诱导Ac转座酶而发生，不需要通过与含Ac转座酶的植株杂交来实现，从而省却了繁重的田间杂交工作。且任何一个插入突变体均可作为一个突变源来产生新的突变体。这样，就可从有限的起始材料，通过控制瞬间诱导次数，在短时间内获得植物饱和突变群体。另一方面，在未诱导情况下由于无Ac转座酶存在，突变体可保持稳定并遗传，从而省却了传统方法中通过田间多次扩繁来分离转座酶和Ds插入元件，以使插入突变体稳定的步骤和程序，节省了大量时间、人力、物力和财力。

由于通过重复诱导，插入元件Ds可重新转座，因此可以利用有限的起始材料通过反复诱导的方法使插入快速达到饱和状态。在拟南芥中仅需要100-300株左右起始材料。在水稻中也仅需要500-1000左右的起始转基因材料。这是传统方法工作量的五千到一万分之一。大大缩短了获得饱和突变体群体所需要的时间，节省了财力、物力。尤为重要的是这一方法的建立使那些难以转化或转化系统不完善的植物突变体库的建立成为可能。

本发明提供了一种建立植物基因标签系统的方法，包括以下步骤：(a)构建一种第一DNA片段，使其包含一种由诱导系统或愈伤组织特异性表达启动子控制的编码转座酶的基因和一种植物筛选标记基因，和一种第二DNA片段，使其包含一种依赖于转座酶的非自主性插入元件和一种植物筛选标记基因；或者，构建一种第三DNA片段，使其包含一种由诱导系统或愈伤组织特异性表达启动子控制的编码转座酶的基因、一种依赖于转座酶的非自主性插入元件和一种植物筛选标记基因；(b)用所构建的第一DNA片段和第二DNA片段或者含有这些DNA片段的质粒，或者用所构建的第三DNA片段或者含有该DNA片段的质粒转化植物细胞；(c)筛选出被转化的植物细胞；(d)诱导转座酶表达；(e)使被转化的植物细胞再生出完整植株。

在本发明的方法中，所述的DNA片段指含有由诱导系统(或愈伤组织特异性表达启动子)控制的转座酶的DNA分子；可以是人工合成的DNA片段，也可在包括在用于根瘤农杆菌或发根农杆菌转化植物的双元载体质粒如pBin 19，pCambia，pBI 101等和可在原核生物中繁殖的其他质粒如pUC，pBluescript，PCR载体质粒中。这些质粒以及使用这些质粒的构建方法可通过现有技术中已知的方法进行。

所述的转座酶可以是来源于不同生物(包括植物或非植物)，在植物中具有自主或非自主性转座能力的转座系统，如玉米来源的Ac/Ds，En/Spm，Mu，金鱼草中的Tam，矮牵牛中的dTph1，水稻中的Tos17等。

所述的转座酶基因是编码自主性转座酶和非自主性转座酶基因，如玉米来源的Ac转座酶基因或其他植物来源的转座酶基因。

所述的依赖于转座酶的非自主性转座插入元件，如Ds元件等。非自主性转座插入元件其末端反向重复序列(TIR)之间可根据建立突变体库的目的

(1)不含有其他DNA片段；或

(2)含有选择标记基因；或

(3)包含无启动子或仅具核心启动子(minimal promoter)-报告基因片段，以用于增强子和启动子诱捕或基因诱捕；或

(4)含有启动子用于基因激活等。

所述的植物筛选标记基因可以是抗生素筛选标记基因，如抗卡那霉素筛选标记基因新霉素磷酸转移酶(NPTII)，抗潮霉素筛选标记基因潮霉素磷酸转移酶(hpt)；或非抗生素筛选标记基因如木糖异构酶等(Haldrup etal.，1998)。

所述的控制转座酶的诱导系统可以是酒精可诱导系统(alc)，糖甾醇可诱导系统，四环素可诱导系统(tet)，乳糖可诱导系统(lac)，铜离子可诱导系统，及植物内源诱导系统如热激(heat shock)，除草剂(safener)，损伤诱导系统等及愈伤组织特异性表达启动子。

本发明的方法中，所述的植物细胞指来源于如拟南芥、烟草、马铃薯、水稻、小麦、玉米、油菜、棉花、大豆等所有植物的细胞、组织或植株。细胞或植物的转化指通过原生质体-化学介导法(Ca²⁺，PEG)，基因枪介导法，农杆菌介导法，电激法，花粉管导入，微注射等任何一种方法或几种方法的组合。

本发明的方法中，所述的转化细胞(或植物愈伤组织，植株)的筛选指利用抗生素或其他筛选标记基因，如含新霉素磷酸转移酶(NPTII)基因的细胞或愈伤组织可由卡那霉素或其替衍生代物如G 418等进行筛选；含潮霉素磷酸转移酶基因的细胞或愈伤组织可由潮霉素进行筛选等。在获得抗性愈伤组织细胞后可采用Southern或PCR法，点杂交等分子检测手段对其进行检测，以确定其含有Ac转座酶基因。

本发明的方法中，转座酶的诱导表达可通过物理方法如热激诱导，损伤诱导或针对不同诱导系统的化学诱导，如酒精诱导系统用酒精，四环素诱导系统用四环素，糖甾醇诱导系统用的地塞米松，lac诱导系统用葡萄糖等实现，也可由其相应的替代物或衍生物实现。诱导表达可在植物的任何时期如愈伤组织阶段，植物营养生长阶段，生殖生长阶段，种子发生及种子萌发阶段等，但以愈伤组织阶段为最好。转座酶还可由愈伤组织特异性表达启动子控制其在植物愈伤组织阶段特异性表达用以代替可诱导系统。用Northern或Western筛选在诱导时具有Ac转座酶高表达而在未诱导时不表达的转基因植株。

本发明的方法中，使被转化的植物细胞再生出完整植株主要指通过离体由包含有上述DNA元件的转化细胞再生的植株，也包括非离体的其他营养繁殖方法再生的植株。

附图简要说明

图1含有Ds元件和Ac转座酶的双因子转座体系质粒图。

A.编码转座酶的转座因子。Ac元件的转座酶由花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子控制。载体上同时含有抗生素筛选标记基因新霉素磷酸转移酶(NPTII)，由胭脂碱合成酶基因(NOS)启动子控制。

B.缺失Ac元件的部分片段获得非自主性转座子Ds元件，载体上同时含有抗生素筛选标记基因潮霉素磷酸转移酶基因(HPT)，由CaMV 35S启动子控制。Tocs，章鱼碱合成酶基因(OCS)终止子。Tcamv，花椰菜花叶病毒终止子。

图2可诱导启动子-Ac转座酶质粒和Ds质粒的构建。

pCC-Ac01，诱导启动子控制下的Ac转座酶质粒。卡那霉素抗性基因由Ubiquitin启动子调控，Ubiquitin启动子包含有其第一内含子，以增强抗性基因表达。酒精可诱导系统的转录调节因子alcR由水稻actin 1启动子控制，Ac转座酶基因由酒精可诱导系统alcA控制，在无诱导剂存在的情况下，转座酶基因不表达。当加入诱导剂酒精后酒精与转录调节因子alcR结合改变其构象，然后与alcA结合，Ac转座酶基因得以转录，从而产生转座酶。

pCC-Ds02，依赖转座酶的非自主性Ds元件质粒。质粒含有花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子调控的潮霉素抗性基因和依赖转座酶的非自主性转座Ds元件，包括有两个末端重复序列(TIR)用于转座的识别序列。在两个末端重复序列(TIR)之间加有含不完全内含子的大肠杆菌葡萄糖苷酸酶报告基因(GUS)以用于启动子诱捕。LB，农杆菌T-DNA左边界；RB，农杆菌T-DNA右边界。

图3 alc：gus转基因水稻植株的鉴定。M.DNA分子量标准；1.阳性对照；2.阴性对照植株；3-15，为独立拟转基因植株。

图4 alc：gus转基因水稻诱导活性的鉴定。

用100mL 1％的酒精以根部浇灌的方式诱导alc：gus转基因水稻，初次诱导48h后重复诱导一次，120h后进行GUS活性检测。1为非转基因水稻对照，2-9分别为转基因株系ta56、8a15、8a31、ta3、ta4、ta80、8a1、8a2。

图5以不同酒精浓度浇灌水稻对alc系统诱导活性的影响。

用100mL不同浓度(v/v)的酒精以根部浇灌方式诱导转基因水稻，初次诱导48h时重复诱导一次，120h时检测GUS活性。CK，非转基因水稻。A，转基因株系8a2；B，转基因株系ta4。

图6酒精剂量对alc系统诱导活性的影响。

用100mL不同浓度(v/v)的酒精通过溶液培养的方式诱导转基因水稻ta4，持续诱导96h后收集叶片检测GUS活性。CK，非转基因水稻。

图7酒精诱导时间对alc系统的作用。

用100mL的酒精以根部浇灌的方式诱导alc转基因水稻，初次诱导48h后重复诱导一次(两次诱导如图中箭头所示)，初次诱导后每隔24h采集一次叶片，用于GUS活性测定。CK为非转基因水稻。A，转基因株系ta4；B，转基因株系ta56。

图8酒精诱导时间对alc系统的作用。

用100mL的酒精以溶液培养的方式诱导alc转基因株系ta4，诱导后每隔24h采集一次叶片，用于GUS活性测定。CK为非转基因水稻。

图9 alc系统在不同器官诱导活性的比较。

用100mL 2％的酒精以根部浇灌的方式诱导转基因株系ta4，48h时重复诱导一次，96h后采集根、茎、叶，检测其GUS活性。

图10 GUS在转基因水稻叶片中的组织化学定位.用100mL 2％的酒精以根部浇灌的方式诱导转基因株系ta4，48h时重复诱导一次，96h后叶片经徒手切片，用X-Gluc检测其活性。A.诱导前，B.诱导96小时后。

实施例

诱导转座子标签系统由一个非自主转座元件和一个改造过后自身不能转座的自主转座元件组成，后者编码转座酶引起前者的转座，该方法利用酒精可诱导系统(Jepson，et al 1998)控制Ac转座酶基因表达，在未诱导情况下，Ac转座酶基因处于沉默状态，不具激活Ds转座能力。诱导后Ac转座酶得以表达并激活Ds转座，随机插入植物基因组中从而获得突变体。因此，该方法可从有限的起始材料开始通过控制瞬间诱导次数，在短时间内获得植物饱和突变群体。另一方面，在未诱导情况下由于无Ac转座酶存在，突变体可保持稳定并遗传。

实施例1可诱导启动子-Ac转座酶质粒和Ds质粒的构建

我们采用的诱导转座子标签系统分为两个部分：诱导启动子控制下的Ac转座酶质粒(pCC-Ac01)和含有依赖转座酶的非自主性Ds元件质粒。两个质粒均在可用于农杆菌转化的双元载体质粒中。pCC-Ac01质粒含有以下成分：卡那霉素抗性基因由Ubiquitin启动子调控，Ubiquitin启动子包含其第一内含子，以增强抗性基因表达(Cornejo et al.，1993)。酒精可诱导系统的转录调节因子alcR由水稻actin 1启动子控制，Ac转座酶基因由酒精可诱导系统alcA控制，在无诱导剂存在的情况下，Ac转座酶基因不表达。当加入诱导剂酒精后酒精与转录调节因子alcR结合改变其构象，然后与alcA结合，Ac转座酶基因得以转录，从而产生转座酶。

pCC-Ds02质粒含有花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子调控的潮霉素抗性基因和依赖转座酶的非自主性转座Ds元件，包括有两个末端重复序列(TIR)用于转座的识别序列。在两个末端重复序列(TIR)之间加有含不含5’端的不完全内含子的大肠杆菌葡萄糖苷酸酶报告基因(GUS)以用于启动子诱捕(见图2)。

实施例2水稻的转化

将成熟的种子去掉颖壳，用70％的酒精灭菌1-2分钟，0.1％的升汞浸泡10-15分钟，用无菌水冲洗两次，再用10-15％的次氯酸钠浸泡30-45分钟，用无菌水冲洗3-4次，接种在诱导培养基上。暗培养7-10天后，剥离种子胚，接到继代培养基上培养至长出愈伤组织。

按照Hiei等(1994)的方法通过农杆菌介导的方法将双元载体pBin19alc：gus导入到水稻中。挑取农杆菌单菌落接种于20ml YEB液体培养基(含卡那霉素50mg/mL)中，28℃(150rpm)2-3天。于4℃下5000rpm离心3分钟，去上清，重悬于AAM培养基(含0.1mmol/L乙酰丁香酮)中，28℃避光摇动1-2小时，至OD₆₀₀＝0.6-0.9。选生长状态良好、颗粒状愈伤组织浸入农杆菌培养液中摇动20分钟后，静置30分钟，取出用无菌滤纸吸干多余菌液，将愈伤组织接种于共培养基上培养。2-3天后，待农杆菌生长至可见愈伤下的菌斑但未长满愈伤时，将愈伤组织放入广口瓶中，用无菌水冲洗3-5次，每次摇动数次，直到水中不见丝状菌体；然后在含500mg/L羧苄青霉素的无菌水中浸泡30-60分钟，最后再冲洗一遍，置于无菌滤纸上凉干，转入筛选培养基(含150mg/L G418和500mg/L羧苄青霉素)筛选。

实施例3拟转化植株的再生

农杆菌侵染后，水稻愈伤在共培养培养基上培养3-5天后，转入含G418(庆大霉素衍生物，毒理机制与卡那霉素相同)100mg/L的NB培养基上筛选3周，再在含150mg/L G418的NB培养基上筛选4周，随后抗性愈伤组织转入预分化培养基(G418 150mg/L)光照培养3周，然后在分化培养基(G418 150mg/L)上进行分化，再生植株在含G418 150mg/L的壮苗培养基上生根后移栽至土壤中，进行进一步鉴定。

实施例4分子鉴定

按照Dellaporta等(1983)的方法提取拟转化植株的基因组DNA，以gus基因编码区特异的引物进行PCR扩增，从而筛选出转基因植株。按照Sambrook等(1989)的方法对转基因水稻进行Southern分析。用GUS基因编码区特异性探针进行Southern杂交，而阴性非转基因对照植株中没有任何带(图3)，说明外源基因整合到这些拟转基因植物基因组中。实施例5酒精诱导系统在转基因水稻中的优化1.酒精诱导系统在转基因植株诱导活性的初步鉴定

为了了解酒精可诱导系统在水稻中的诱导情况，我们构建了酒精诱导系统：大肠杆菌葡萄糖苷酸酶(GUS)报告基因载体，并按上述转化方法转入水稻。通过分子检测获得22个阳性植株。我们选取8个植株，以1％的酒精采用根部浇灌的方式诱导转基因植株的gus基因的表达，初次诱导48h后重复诱导一次，120小时后收集叶片，进行GUS荧光活性分析。结果显示，植物诱导前的GUS活性与非转基因对照植株的本底活性接近，诱导后转基因水稻中的GUS活性可提高25到126倍(图4)。这说明非诱导状态下alc系统可以严谨控制外源基因的表达，而适当浓度的酒精可以诱导外源基因的高度表达。株系8a2、ta4、ta56用于进一步的实验。2.诱导条件的优化A.酒精浓度对alc系统诱导活性的影响

以0.1％、0.5％、1％、2％和5％的酒精分别采用根部浇灌和溶液培养的方式诱导转基因植株。

当采用根部浇灌的方式时，初次诱导48h后重复诱导一次，120h后采集叶片，测定其GUS活性。结果显示，转基因株系8a2在取样时间内，0.1％的酒精即可诱导其GUS基因的表达；GUS活性在0.5％和1％的酒精诱导情况下可提高14至21倍；2％的酒精诱导效率最高，GUS活性可提高大约40倍；而5％的酒精诱导效率有所降低(图5)。

用不同浓度酒精以溶液培养方式诱导株系ta4。持续诱导96h后，采集叶片进行GUS荧光活性测定。结果发现0.1％的酒精即可诱导GUS活性提高16倍，1％的酒精可使alc：gus的表达活性提高160倍。而5％的酒精仅使GUS活性增加20倍左右(图6)。

因而采用根部浇灌或溶液培养的诱导方式，在一定的酒精浓度范围内，alc系统的诱导活性依赖于酒精的浓度。根部浇灌方式诱导alc系统时，2％的酒精诱导效果最佳；而采用溶液培养方式诱导时，1％的酒精最有效。可能由于较高浓度的酒精会对水稻产生胁迫，影响基因的转录翻译，因而较高浓度的酒精诱导效率反而降低(如根部浇灌方式中的5％的酒精及溶液培养方式中2％和5％浓度的酒精)。因此在进一步实验中根部浇灌方式诱导时采用2％的酒精作为诱导物，而溶液培养方式则以1％的酒精作为诱导物。B.酒精诱导时间对alc系统的作用

我们采用根部浇灌和溶液培养两种方式诱导转基因水稻，研究了酒精诱导时间对alc系统的作用。

采用根部浇灌的方式时，以2％的酒精诱导两个转基因株系ta4、ta56，诱导方式如前所述。初次诱导后每隔24h采集一次叶片，直到诱导120h后，检测GUS活性。结果显示株系ta4在初次诱导48h时，GUS活性提高18倍；72h后GUS活性升高至66倍；96h时GUS活性最强，约是增加144倍；之后GUS活性开始降低，120h时约是诱导前的118倍(图7)  。

以溶液培养方式诱导转基因株系ta4时，用1％的酒精溶液持续诱导96h，每隔24h采集一次叶片，检测GUS活性。结果显示，GUS活性持续增加，初次诱导48h后GUS活性提高7倍左右，96h后GUS活性可增加160倍(图8)。

此结果说明酒精可以快速诱导alc系统。由于蛋白质的翻译要落后于mRNA的转录，可以推测实际上alc系统对酒精的响应要更快一些。C.alc系统在不同器官诱导活性的比较

为研究alc系统在转基因水稻不同器官中的诱导能力，我们用2％的酒精通过根部浇灌的方式诱导株系ta4，诱导方式如前所述。初次诱导后96h，分别采集其根、茎、叶，进行GUS荧光活性测定。结果显示，在叶中GUS活性最强，约是诱导前的160倍，而茎根中GUS活性相对较弱约是诱导前的7到12倍(图9)。对诱导前后叶片做徒手切片，然后进行组织化学染色。结果显示，诱导前，叶片中GUS在所有细胞中均无表达，但诱导96小时后GUS在包括叶肉细胞、维管组织中均有很强的表达活性(图10)。

实施例6含有Ac转座酶转基因植物的获得

利用如前所述农杆菌水稻转化，筛选方法将pCC-Ac01质粒转入水稻，通过卡那霉素筛选获得抗性植株。以Ac转座酶基因片段为探针进行分子检测。并利用成熟的诱导程序对阳性植株进行诱导。通过Northern检测诱导前后Ac转座酶mRNA的表达量，选取诱导前无表达，而诱导后高表达Ac转座酶的植株。

实施例7以上述转基因植株为背景材料用农杆菌介导法转入Ds质粒

以上述诱导前无表达，而诱导后高表达Ac转座酶的转基因植株为原始材料通过农杆菌介导法转入含依赖Ac转座酶的非自主性转座子Ds质粒。用Southern法(或PCR方法)筛选含Ds插入片段转基因阳性愈伤组织细胞。

实施例8诱导Ac转座酶瞬时表达

利用已建立的酒精诱导体系对既含Ac转座酶又含依赖Ac转座酶的非自主性转座插入元件Ds的转基因阳性愈伤组织细胞进行诱导。

实施例9通过组织培养使上述愈伤组织细胞再生植株

通过组织培养使上述愈伤组织细胞再生植株。Southern法检测后代单株中Ds的遗传行为。每一含有Ds的植株均可看作一独立突变体。

参考文献

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Claims (14)

1.一种建立植物基因标签系统的方法，包括以下步骤：(a)构建一种第一DNA片段，使其包含一种由诱导系统或愈伤组织特异性表达启动子控制的编码转座酶的基因和一种植物筛选标记基因，和一种第二DNA片段，使其包含一种依赖于转座酶的非自主性插入元件和一种植物筛选标记基因；或者，构建一种第三DNA片段，使其包含一种由诱导系统或愈伤组织特异性表达启动子控制的编码转座酶的基因、一种依赖于转座酶的非自主性插入元件和一种植物筛选标记基因；(b)用所构建的第一DNA片段和第二DNA片段或者含有这些DNA片段的质粒，或者用所构建的第三DNA片段或者含有该DNA片段的质粒转化植物细胞；(c)筛选出被转化的植物细胞；(d)诱导转座酶表达；(e)使被转化的植物细胞再生出完整植株。

2.按照权利要求1所述的方法，其中，所述的含有这些DNA片段的质粒是用于根瘤农杆菌或发根农杆菌转化植物的双元载体质粒。

3.按照权利要求2所述的方法，其中，所述的质粒是pBin 19，pCambia，或pBI 101。

4.按照权利要求1所述的方法，其中，所述的含有这些DNA片段的质粒是可在原核生物中繁殖的质粒。

5.按照权利要求4所述的方法，其中，所述的质粒是pUC，pBluescript，或者PCR载体质粒。

6.按照权利要求1所述的方法，其中，所述的转座酶是植物中具有自主或非自主性转座能力的转座系统。

7.按照权利要求6所述的方法，其中，所述的转座酶是玉米来源的Ac/Ds，En/Spm，Mu，金鱼草中的Tam，矮牵牛中的dTph1，或者水稻中的Tos17。

8.按照权利要求1所述的方法，其中，所述的依赖于转座酶的非自主性转座插入元件是Ds元件。

9.按照权利要求1所述的方法，其中，所述的植物筛选标记基因是抗卡那霉素筛选标记基因新霉素磷酸转移酶(MPTII)，抗潮霉素筛选标记基因潮霉素磷酸转移酶(hpt)；或木糖异构酶。

10.按照权利要求1所述的方法，其中，所述的控制转座酶的诱导系统是酒精可诱导系统(alc)，糖甾醇可诱导系统，四环素可诱导系统(tet)，乳糖可诱导系统(lac)，铜离子可诱导系统，或者热激，除草剂，损伤诱导系统。

11.按照权利要求1所述的方法，其中，所述的植物细胞指来源于拟南芥、烟草、马铃薯、水稻、小麦、玉米、油菜、棉花、大豆的细胞。

12.按照权利要求1所述的方法，其中，转化植物细胞指通过原生质体-化学介导法(Ca²⁺，PEG)，基因枪介导法，农杆菌介导法，电激法，花粉管导入，微注射或这些方法的组合来进行的。

13.按照权利要求1所述的方法，其中，诱导转座酶表达是在植物的愈伤组织阶段，植物营养生长阶段，生殖生长阶段，种子发生或种子萌发阶段进行的。

14.按照权利要求1所述的方法，其中，转座酶表达是由愈伤组织特异性表达启动子控制下进行的。

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