CN103757014B - 富集Ac/Ds侧翼序列用特异性引物及其富集方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种富集Ac/Ds侧翼序列用特异性引物及其富集方法。该引物为:?SEQ?ID?NO:1~SEQ?ID?NO:3所示的碱基序列。利用这些Ac特异性引物结合结合特异性引物,通过Tail-PCR结合巢式PCR,可以很好从玉米基因组中富集Ac或Ds的侧翼序列。利用这个方法,对于玉米基因组中某一Ac转座子可以富集108倍,为通过高通量测序方法进行大规模的分离Ac/Ds侧翼序列奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种富集Ac/Ds侧翼序列用特异性引物及其富集方法。特别是一种用于分离玉米Ac/Ds转座突变体中Ac/Ds转座子侧翼序列过程中从基因组中富集Ac/Ds侧翼序列用特异性引物及富集方法。
背景技术
玉米是全球第一大粮食作物,是全世界主要的粮食来源。我国玉米的总产量已超过小麦,成为仅次于水稻的第二大粮食作物。而且玉米长期以来都是一种遗传模式植物。玉米B73基因组的序列测定已经完成,这将加快玉米方面的科学研究。预计在玉米中至少存在3.2万个基因,这些基因的克隆和功能分析已成为下一个重要的挑战。转座子标签法是分析基因功能的一种十分有效的方法,它的原理是利用一些在基因组中可移动、序列已知的DNA片段,即转座子的转座,插入到一个新的位点上,通过分离、测序分析它的侧翼序列,从而克隆研究这些基因的功能。目前在玉米中最主要的用于创建插入突变体的转座子是Mutator(Mu)和Activator/Dissociator(Ac/Ds)两个系统。在分离鉴定转座系和利用转座子标签法克隆基因的过程中,分离转座子的侧翼序列是一个重要的环节。但目前用于分离Ac/Ds侧翼序列的方法还主要是利用通过Southern杂交或基于PCR技术的方法,其中基于GenomeWalking技术的PCR方法,即基于限制性内切酶酶切加接头的方法,相对于基于Southern杂交的方法具有较高的效率,但其由于受到限制性内切酶酶切位点的特异性,使得实验的通量难以进一步提高。因此需要建立一种新的、通量大的标签分离的方法,随着高通量测序方法的快速发展,目前已有将二代测序技术用于分离Mu转座子侧翼序列和克隆基因的研究,相比传统的通过Southern杂交或基于PCR技术的分离Mu转座子侧翼序列的方法大大提高了效率和通量。在Ac/Ds转座子的侧翼序列的分离方法中,一个主要的限制应用二代测序技术分离Ac/Ds侧翼序列的因素是高效的从基因组中富集出Ac/Ds的侧翼序列。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种富集Ac/Ds侧翼序列用的特异性引物。
本发明的目的之二在于提供利用这些特异性引物从基因组中富集Ac/Ds侧翼序列的方法。
为达到上述目的,本发明采用如下技术方案:
一种富集Ac/Ds转座子侧翼序列用特异性引物,其特征在于该引物为SEQIDNO:1~SEQIDNO:3所示的碱基序列。
一种富集Ac/Ds转座子侧翼序列的方法,采用上述的特异性引物,其特征在于该方法的具体步骤为:
a.将玉米基因组DNA用超声波打断,打断的DNA片段主带在1.6kb~4.0kb之间;
b.将步骤a所得DNA片段回收后用Taq酶进行加A,得到加A的DNA片段;
c.将步骤b所得加A的DNA片段回收后连接接头,所述的接头由接头1和接头2退火获得;所述的接头1的序列为SEQIDNO:7所示的碱基序列;所述的接头2的序列为SEQIDNO:8所示的碱基序列;
d.将步骤c所得的DNA片段回收后,用Ac末端特异性引物和接头引物AP1进行第一轮PCR扩增,得到扩增产物;所述的特异性引物为SEQIDNO:1所示的序列;所述的接头引物AP1为SEQIDNO:4所示的序列;
e.将步骤d所得的PCR扩增产物回收后,进行第二轮PCR扩增,所用的特异性引物为SEQIDNO:2所示的序列和SEQIDNO:5所示的接头引物AP2LTm;
f.将步骤f所得的PCR扩增产物回收后,进行第三轮PCR扩增,所用的特异性引物Ac22为SEQIDNO:3所示的序列和SEQIDNO:6所示的接头引物AP2;
g.将步骤f所得的PCR扩增产物回收,即为富集了Ac/Ds侧翼序列的样品。
上述的步骤e中的PCR扩增条件为:94°C预变性5分钟,11个循环(94°C30秒,69°C20秒,72°C2.5分钟,94°C30秒,69°C20秒,72°C2.5分钟,94°C30秒,69°C20秒,72°C2.5分钟,94°C30秒,55°C20秒,72°C2.5分钟,),过度延伸72°C8分钟。
上述的步骤f中的PCR扩增条件为:94°C预变性5分钟,11个循环(94°C30秒,67°C20秒,72°C2分钟,94°C30秒,67°C20秒,72°C2分钟,94°C30秒,67°C20秒,72°C2分钟,94°C30秒,53°C20秒,72°C2.5分钟,),过度延伸72°C8分钟。
上述的步骤g中的PCR扩增条件为:94°C预变性5分钟,2个循环(94°C30秒,58°C20秒,72°C1分钟,9个循环(94°C30秒,65°C20秒,72°C1分钟),过度延伸72°C8分钟。
利用这些Ac特异性引物结合结合特异性引物,通过Tail-PCR结合巢式PCR,可以很好从玉米基因组中富集Ac或Ds的侧翼序列。利用这个方法,对于玉米基因组中某一Ac转座子可以富集108倍,为通过高通量测序方法进行大规模的分离Ac/Ds侧翼序列奠定了基础。
附图说明
图1为超声波打断的基因组DNA。DNAmarker为1kbDNAladder。
图2为第一轮PCR产物。泳道分别为PCR产物,空白对照和DNAmarker。DNAmarker为100bpDNAladder。
图3为第二轮PCR产物。泳道分别为PCR产物,空白对照和DNAmarker。DNAmarker为100bpDNAladder。
图4为第三轮PCR产物。泳道1,2分别为两个独立的PCR反应的产物,泳道3,4分别为空白对照。
图5为在20个转座系的混合样品中Ds(bz-m2(DI))的富集情况的检测。泳道1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11依次为分别以10-2ng、10-3ng、10-4ng、10-5ng、10-6ng、10-7ng、10-8ng、10-9ng、10-10ng、10-11ng、10-12ng第三轮PCR产物为模板的扩增产物,泳道12为空白对照。DNAmarker为100bpDNAladder。
图6为在20个转座系的混合样品中6个已知插入位置的Ac转座子的富集情况的检测。A、B、C、D、E、F分别对应Apt1-119,Apt1-287,Apt1-248,Apt1-265,Apt1-299,Apt1-300这6个转座系。每组中泳道1、2、3、4、5、6、7、8依次为分别以1ng、10-1ng、10-2ng、10-3ng、10-4ng、10-5ng、10-6ng、10-7ng第三轮PCR产物为模板的扩增产物。DNAmarker为100bpDNAladder。
图7为在PCR反应检测限分析。A、B、C分别对应图6中转座系Apt1-287,Apt1-248和Apt1-300扩增产物的重组到T载体中的质粒。每组中泳道泳道1、2、3、4、5、6、7、8、9、10依次为分别以1ng、10-1ng、10-2ng、10-3ng、10-4ng、10-5ng、10-6ng、10-7ng、10-8ng、10-9ng的质粒为模板的PCR产物,泳道11为空白对照。DNAmarker为100bpDNAladder。
具体实施方式
下面结合具体实施事例,进一步阐述本发明。应理解,这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实例中所涉及的引物和方法适用于任何Ac和Ds侧翼序列富集。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法,通常按照常规条件,如分子克隆(MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rded.)或植物分子生物学-实验手册(PlantMolecularBiology-ALaboratoryManual,MelodyS.Clark编,Springer-verlagBerlinHeidelberg,1997)中所述条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例一:Ac末端特异性引物和接头引物和接头序列的获得
本发明以根据Genebank中序列号为GU595147中的注释,截取出其中所包含的Ac转座子的序列,以60bp为单位在玉米B73基因组进行扫描,检测每段片段在玉米B73基因组中的拷贝数,即Ac转座子序列1-60,11-70,21-80……4501-4560,4511-4565。结果发现761-820bp一段在玉米B73基因组中只有一个拷贝;291-350bp一段在玉米基因组中只有4个拷贝,为了提高从基因组中富集Ac/Ds序列的特异性,我们分别在这两段设计了用于第一轮和第二轮PCR的Ac特异性的引物Ac806HTm(SEQIDNO:1)和Ac317HTm(SEQIDNO:2),为了尽可能从富集的Ac/Ds序列中减少Ac/Ds末端序列的长度,我们Ac转座子5’末端设计了一条引物用于第三轮PCRAc22(SEQIDNO:3)。
为了提高接头与DNA片段的连接效率,我们对Clontech公司的用于Genomewalking的平末端接头序列进行了改进,在接头1的3’端增加一个T,DNA经过3’端加A后,可以与接头进行TA连接,这样可以提高连接效率。
为了提高富集的效率,我们采用了TAIL-PCR技术进行PCR扩增,利用接头序列我们相应的设计了低退火温度的引物AP2LTm。
用于从基因组中富集Ac/Ds侧翼序列的Ac末端特异性引物,接头引物和接头序列:
序列名称 | 序列 |
Ac22r | TTTTCCCATCCTACTTTCATCC |
Ac317HTm | GAGCAGCGTTCGCTAGGTATTTCTTA |
Ac806HTm | GCAATGGTGCTGACGTGCTGTACTG |
AP1 | GTAATACGACTCACTATAGGGC |
AP2LTm | ACTCACTATAGGGCACGC |
AP2 | ACTATAGGGCACGCGTGGT |
接头1 | GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTCGACGGCCCGGGCTGGTT |
接头2 | 5’-PO4-ACCAGCCC-NH2-3’ |
其中接头2,AP1和AP2的序列引自Clontech公司的genomewalkingkit的说明书。
实施例二:从转座系的基因组中富集Ac/Ds序列
我们选取了20份转座系(Apt1-119,Apt1-287,Apt1-248,Apt1-265,Apt1-299,Apt1-300,Apt1-146,Apt1-147,Apt1-148,Apt1-149,Apt1-150,Apt1-151,Apt1-154,Apt1-158,Apt1-159,Apt1-160,Apt1-161,Apt1-162,Apt1-163和Apt1-164),其中Apt1-119,Apt1-287,Apt1-248,Apt1-265,Apt1-299,Apt1-300这6个转座系中已知Ac转座子的插入位置,其余14份转座系中没有鉴定到Ac转座子的插入位置,这些材料中均在9号染色体上的bz1基因中插入有一个已知的Ds(bz-m2(DI))。对于每一个转座系分别提取DNA,将DNA等量混合后,取15ug基因组DNA超声波打断(图1),打断的DNA用T4Polymerase补平,加A,加接头后,用PCR产物清洁试剂盒回收DNA片段,取20ng回收产物,用Ac末端特异性引物Ac806HTm和接头引物AP1进行第一轮PCR扩增,得到扩增产物(图2);将第一轮PCR扩增产物用PCR产物清洁试剂盒回收后,取20ngPCR产物,用引物Ac末端特异性引物Ac317HTm和接头引物AP2LTm,进行第二轮扩增(图3),PCR产物清洁试剂盒回收后,取20ngPCR产物用Ac末端特异性引物Ac22和接头引物AP2,进行第三轮扩增(图4),所得产物经琼脂糖凝胶回收150bp~250bp的条带后,即为富集了Ac/Ds序列的DNA样品。
第一轮PCR扩增条件为:94°C预变性5分钟,11个循环(94°C30秒,69°C20秒,72°C2.5分钟,94°C30秒,69°C20秒,72°C2.5分钟,94°C30秒,69°C20秒,72°C2.5分钟,94°C30秒,55°C20秒,72°C2.5分钟,),过度延伸72°C8分钟。
第二轮PCR扩增条件为:94°C预变性5分钟,11个循环(94°C30秒,67°C20秒,72°C2分钟,94°C30秒,67°C20秒,72°C2分钟,94°C30秒,67°C20秒,72°C2分钟,94°C30秒,53°C20秒,72°C2.5分钟,),过度延伸72°C8分钟。
第三轮PCR扩增条件为:94°C预变性5分钟,2个循环(94°C30秒,58°C20秒,72°C1分钟),9个循环(94°C30秒,65°C20秒,72°C1分钟),过度延伸72°C8分钟。
我们利用已知插入位置的Ac和Ds(bz-m2(DI))的侧翼序列设计了引物,与Ac末端特异性引物配合通过PCR反应检测样品中Ac/Ds序列的富集程度。我们将上述第三轮PCR产物经过PCR产物清洁试剂盒回收后并定量,电泳检测表明,第三轮的PCR产物集中在100-300bp之间(图4)。并进行从1ng/ul开始进行10倍浓度的连续稀释,然后分别取1ul样品用作PCR的模板,查看可以扩增到产物的最低浓度。结果表明,对于Ds(bz-m2(DI)),可以在10-7ng/ul这个级别上扩增到目的产物(图5),而对于已知插入位置6个Ac转座子,可以在10-6ng/ul这个级别上扩增到目的产物(图6),表明在第三轮PCR产物中,Ds(bz-m2(DI))与每个Ac转座子的差别在10倍这个级别上,由于我们是在起始样品中混合了20份Ac转座系材料,而这20份Ac转座系材料都带有Ds(bz-m2(DI)),所以在样品中就相当于Ds(bz-m2(DI))的量是每个Ac转座子的20倍,这与我们的检测的结果是一致的。
为了确定我们从基因组中将Ac/Ds转座子的侧翼序列富集了多少倍。我们将转座系Apt1-287,Apt1-248和Apt1-300的扩增片段构建到T载体中,并提取质粒,纯化后定量后,进行10倍的连续稀释,获得1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9ng/uL稀释液,并分别取1ul作为模板,进行扩增检测(图7)。结果均在10-6ng这个级别上可以扩增到目的产物,由于这三个T载体质粒的大小约为3kb,在10-6ng这个级别上相当于3×102个拷贝,即当反应液中某一DNA片段为102个拷贝这个级别时,可以被扩增出可见的DNA条带。上述我们在第三轮PCR产物的10-6ng这个级别可以检测到目的片段,而第三轮PCR产物的大小在100-300bp之间,按平均200bp计算,则在10-6ng中约含有4×103个拷贝的DNA片段,即在20个转座系的混合样品中,通过我们可以将某一个Ac转座系的侧翼序列富集到占PCR产物的10-1这个数量级上。将上述结果按1ng这个级别计算,200bp的DNA片段约为4×1010个拷贝,那么在20个转座系中,每个Ac转座子对应的侧翼序列的拷贝数约在109这个级别上,玉米基因组大小为2500Mb,而对于某一个Ac转座子而言,在每个基因组中只有1个拷贝,1ng的DNA片段相当含有102拷贝的基因组,所以在20个转座系的混合样品中某一个Ac转座子的拷贝数在10这个数量级上。综合上述的结果,我们这个方法可以从玉米基因组中将某一Ac转座子富集108倍。
上述用于检测Ds(bz-m2(DI))和6个已知插入位置的Ac转座子的引物为:
序列名称 | 序列 | 用途 |
Ac22r | TTTTCCCATCCTACTTTCATCC | 检测富集情况的Ac/Ds末端特异性引物 |
Ds2(D1)5’fds-2 | TTCCTTGTCCCTTCATTGC | 检测Ds(bz-m2 (DI))富集情况的Ds侧翼序列特异性引物 |
Apt1-119 | CATGGCTAAGCAGTAAGCAC | 检测Apt1-119中Ac转座子富集情况的Ac侧翼序列特异性引物 |
Apt1-287 | ACCTCAGGGGCAGCTTCTT | 检测Apt1-287中Ac转座子富集情况的Ac侧翼序列特异性引物 |
Apt1-248 | AGACAACCAAACACACTCTACCG | 检测Apt1-248中Ac转座子富集情况的Ac侧翼序列特异性引物 |
Apt1-265 | TCACGCCTAAAATTAGACGCT | 检测Apt1-265中Ac转座子富集情况的Ac侧翼序列特异性引物 |
Apt1-299 | CTCTTGCCTCTATCCTCTTGTT | 检测Apt1-299中Ac转座子富集情况的Ac侧翼序列特异性引物 |
Apt1-300 | ACTCGGTGAGGTTCTCGTAG | 检测Apt1-300中Ac转座子富集情况的Ac侧翼序列特异性引物 |
上述进行侧翼序列富集情况检测的PCR反应条件为:94°C预变性5分钟,30个循环(94°C30秒,55°C20秒,72°C1分钟),过度延伸72°C8分钟。
<110>上海大学
<120>富集Ac/Ds侧翼序列用特异性引物及其富集方法
<160>15
<210>1
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
GCAATGGTGCTGACGTGCTGTACTG25
<210>2
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
GAGCAGCGTTCGCTAGGTATTTCTTA26
<210>3
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
TTTTCCCATCCTACTTTCATCC22
<210>4
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
GTAATACGACTCACTATAGGGC22
<210>5
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
ACTCACTATAGGGCACGC18
<210>6
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
ACTATAGGGCACGCGTGGT19
<210>7
<211>49
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTCGACGGCCCGGGCTGGTT49
<210>8
<211>8
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
5’-PO4-ACCAGCCC-NH2-3’8
<210>9
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
TTCCTTGTCCCTTCATTGC19
<210>10
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
CATGGCTAAGCAGTAAGCAC20
<210>11
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>11
ACCTCAGGGGCAGCTTCTT19
<210>12
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
AGACAACCAAACACACTCTACCG23
<210>13
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>13
TCACGCCTAAAATTAGACGCT21
<210>14
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>14
CTCTTGCCTCTATCCTCTTGTT22
<210>15
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>15
ACTCGGTGAGGTTCTCGTAG20
Claims (5)
1.一组富集Ac/Ds转座子侧翼序列用特异性引物,其特征在于该引物为SEQIDNO:1~SEQIDNO:3所示的碱基序列。
2.一种富集Ac/Ds转座子侧翼序列的方法,采用根据权利要求1所述的特异性引物,其特征在于该方法的具体步骤为:
a.将玉米基因组DNA用超声波打断,打断的DNA片段主带在1.6kb~4.0kb之间;
b.将步骤a所得DNA片段回收后用Taq酶进行加A,得到加A的DNA片段;
c.将步骤b所得加A的DNA片段回收后连接接头,所述的接头由接头1和接头2退火获得;所述的接头1的序列为SEQIDNO:7所示的碱基序列;所述的接头2的序列为SEQIDNO:8所示的碱基序列;
d.将步骤c所得的DNA片段回收后,用Ac末端特异性引物和接头引物AP1进行第一轮PCR扩增,得到扩增产物;所述的特异性引物为SEQIDNO:1所示的序列;所述的接头引物AP1为SEQIDNO:4所示的序列;
e.将步骤d所得的PCR扩增产物回收后,进行第二轮PCR扩增,所用的特异性引物为SEQIDNO:2所示的序列和SEQIDNO:5所示的接头引物AP2LTm;
f.将步骤f所得的PCR扩增产物回收后,进行第三轮PCR扩增,所用的特异性引物Ac22为SEQIDNO:3所示的序列和SEQIDNO:6所示的接头引物AP2;
g.将步骤f所得的PCR扩增产物回收,即为富集了Ac/Ds侧翼序列的样品。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于上述的步骤e中的PCR扩增条件为:94°C预变性5分钟,11个循环:94°C30秒,69°C20秒,72°C2.5分钟,94°C30秒,69°C20秒,72°C2.5分钟,94°C30秒,69°C20秒,72°C2.5分钟,94°C30秒,55°C20秒,72°C2.5分钟,过度延伸72°C8分钟。
4.根据权利要求2所述的方法,其特征在于上述的步骤f中的PCR扩增条件为:94°C预变性5分钟,11个循环:94°C30秒,67°C20秒,72°C2分钟,94°C30秒,67°C20秒,72°C2分钟,94°C30秒,67°C20秒,72°C2分钟,94°C30秒,53°C20秒,72°C2.5分钟,过度延伸72°C8分钟。
5.根据权利要求2所述的方法,其特征在于上述的步骤g中的PCR扩增条件为:94°C预变性5分钟,2个循环:94°C30秒,58°C20秒,72°C1分钟,9个循环:94°C30秒,65°C20秒,72°C1分钟,过度延伸72°C8分钟。
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2014
- 2014-01-08 CN CN201410008009.7A patent/CN103757014B/zh not_active Expired - Fee Related
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