CN112210620B - 一种基于NGS测序的AcDs全基因组位点高效检测引物和方法 - Google Patents

一种基于NGS测序的AcDs全基因组位点高效检测引物和方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于NGS测序的AcDs全基因组位点高效检测引物和方法，所述引物是Primer5和Primer3所示的碱基序列。使用这两条引物，通过混合建库PCR，再NGS二代深度测序的方法，可以从每个玉米材料中富集到60‑100个Ac/Ds位点，检测率接近饱和，且使用随机标签序列标记每个样本，方便从混合测序序列中分离出每个样品的序列，为Ac/Ds位点检测提供了一种高通量大规模的方案。

Description

一种基于NGS测序的AcDs全基因组位点高效检测引物和方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及用于高效检测全基因组水平AcDs转座子位点的引物和方法。
背景技术
植物和动物中的转座子是广泛存在，对物种的进化、驯化和新的品种的形成具有重要的作用，同时，人们大量利用转座子制作突变体文库，制造人工变异，创造新的作物品种。AcDs是最早于玉米中发现一种转座子，该转座子的特点的全基因组水平平均分布，长度在1kb-4kb间变化。在不同玉米品种中，Ac/Ds转座多倾向于插入在基因区，因此造成玉米丰富多变的表型，是创制新材料的很好的工具。Ac/Ds系统具有跨物种活性，因而是目前各植物中最为广泛应用的一类转座子建库系统。构建Ac/Ds突变体库都支持数千上万份的遗传稳定材料，才能获得较多的表型变异，筛选出好的科研和育种材料。然而，现有的检测手段，包括Southern、染色体步移、环形PCR、反向PCR和重测序等等,效率较低，成本过高,限制了该领域的发展，急需要一种高效、廉价、高通量的检测手段。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种全基因组水平上高通量、高效率、低成本的Ac/Ds转座子插入位点检测引物引物。本发明的目的之二针对现有技术的不足，提供一种用于检测Ac/Ds转座子插入位点的方法。为了完成上述目标，本发明采用如下技术方案。
本发明提供一种用于分离Ac/Ds转座子插入位点基因组序列的特异引物，所示特异性引物包括Primer3和Primer5，所述Primer3和Primer5为a、b、c或者d：
a.基因组序列上位于转座子两侧的保守共有序列；
b.距离转座子末端最后一个碱基的距离约为50-500bp；
c.携带区分样品的4-8bp标签序列；
d.包含用于NGS深度测序的锚定序列。
所述基因组为玉米基因组，所述Primer3为序列表中序列1所示的序列，所述Primer5为序列表中序列2所示的序列。
所述特异引物为Primer3、Primer5和adaptor primer。
所述adaptor primer为序列表中序列5所示的序列。
本发明还提供一种用于分离Ac/Ds转座子插入位点基因组序列的方法，具体步骤为：
a.取多株植株的玉米基因组DNA等量混合，用DNA打断酶打断，得到打断产物，打断的DNA片段在250bp-5kb之间；
b.对于步骤a所得打断产物，用合成的接头1和接头2和DNA连接酶连接，得到带有接头的DNA片段，
c.将步骤b所得到的产物，每20个样品打断产物混合，然后用试剂盒回收；
d.将步骤c的回收产物用权利要求1-4中任一所述Primer5和Primer3及接头PCR引物adaptor primer进行PCR扩增；
e.回收步骤d的扩增产物，定量后，用NGS测序仪测序，将后续测序结果与基因组序列比对后得到对应的位点。
其中，所述的步骤a中的打断酶为识别序列为4-6碱基粘性末端DNA酶，打断条件为37℃，1-5小时。
其中，所述的步骤a中的打断酶为SauI所述步骤b中的接头1为adaptor1，其序列为序列表中的序列3，所述接头2为adaptor2，其序列为序列表中的序列4。
其中，所述的步骤b中的连接酶为T4 DNA连接酶，连接条件为25℃，1-3小时；所述的步骤c中的试剂盒为Axygen凝胶回收试剂盒AP-GX-250；所述的步骤d的PCR扩增条件为：98℃，预变性2分钟，15个循环(98℃10秒，62℃20秒，72℃1分钟)，延度伸72℃8分钟。
以上所述的引物或所述的方法在分离Ac/Ds转座子插入位点基因组序列中的应用也应在本发明的保护范围之内。
本发明的有益效果在于：和现有的Ac/Ds转座子位点鉴定方法相比，该方法能富集到基因组上几乎全部的位点，效率极高；此外，该方法由于引物上标签序列，帮助混合测序后，从大规模数据中将单个样品的位点分离出来，适合高通量检测；并且混合PCR、测序极大程度的降低了建库和测序的成本。引物的特异设计既保证后续分析时，确定Ac/Ds的70-80bp的特异性序列，又能保证在后续二代NGS测序过程中拿到70-80bp侧翼基因组序列，是一种巧妙而高效的新型设计。
附图说明
图1为DNA酶打断的基因组DNA。DNA marker为5kb DNA ladder。其中，1为1-20号玉米的混合基因组打断条带；2为21-40号玉米的混合基因组打断条带；3为41-60号玉米的混合基因组打断条带；4为61-80号玉米的混合基因组打断条带。
图2为利用接头序列进行PCR后的产物。泳道分别为marker，1为1-20号玉米打断的混合基因组的PCR产物；2为21-40号玉米打断的混合基因组的PCR产物；3为41-60号玉米打断的混合基因组的PCR产物；4为61-80号玉米打断的混合基因组的PCR产物。DNA marker为1OO bp DNA ladder。
图3为4个NGS测序成功的4个新插入位置Ac/Ds转座子的PCR验证检测情况。
图4为图3样品的Sanger测序峰图。
图5为Ds 5’末端序列相似度比对图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。下列实例中所涉及的引物和方法适用于任何Ac和Ds侧翼序列富集。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件来实施。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例中涉及的转座子，可应用但不限于genbank seqID为JF421358.1的一种Ds。
实施例1Ac/Ds特异引物设计和检验
本发明根据NCBI中genbank seqID为JF421358.1的Ds序列为参考，在玉米B73基因组中进行扫描比对，获得73个Ac/Ds。根据这些Ac/Ds的共有序列特点，将末端保守的序列各150bp截取出来，比对结果见图5。本发明最终将利用NGS测序技术获得全基因组水平的所有Ac/Ds位点。目前NGS的读长一般在单端150bp，双端总和为150-300bp，为短读长。为保证在这个读长范围内，能够获得大于50bp的转座子序列以及大于50bp的邻近基因组序列，本发明设计Ac/Ds上5’或3’端引物距离各自方向的末端70bp左右，预估获得基因组上的序列为70-220bp不等。我们设计了Ac/Ds 5’和3’末端的特异引物Primer5和Primer3，如表1所示，其中NNNNNN表示标签序列，大写字母部分对应的序列为锚定序列。此外，还设计了对应的接头序列Adaptor1和Adaptor2，接头PCR引物adaptor primer。adaptor和primer匹配于NGS二代高通量测序时采用的锚定序列和测序引物序列,primer中gcgtcttcatcctgttaa用来和adaptor的相同序列相互退火，完成PCR扩增，获得产物，以备测序。
本发明配合Sau3AI(NEB,Cat.No R0169L)打断的基因组片段加载特异接头，设计了特异性高的接头序列adaptor1和adaptor2。将adaptor1和adaptor2高温解链后退火，程序为95℃2分钟，混合adaptor1和adaptor2后缓慢降低到室温。
用于检测全基因组Ac/Ds位点的特异引物、接头、接头引物的序列如表1所示：
表1用于检测全基因组Ac/Ds位点的特异引物、接头、接头引物序列
Figure BDA0002737631550000041
实施例2高通量的NGS测序方法从玉米基因组富集Ac/Ds位点
选取80个含有转座子的玉米样本，20个为一组，共分为4组，按如下步骤实施实验：
(1)取50ng玉米基因组DNA，用Sau3AI(NEB,R0169L)在37度打断5小时，得到打断产物，打断的DNA片段在250bp-5kb之间；
(2)在打断产物中加入Adaptor1和Adaptor2各10pM接头和1μl T4 DNA连接酶，25℃条件下反应3小时连接，得到带有接头的DNA片段；这一步骤中，接头与打断产物的比例是10pM：50ng。
(3)每20个样品混合，然后用PCR产物试剂盒回收，图1第1条泳道为样品1-20的琼脂糖凝胶电泳检测，图1第2条泳道为样品21-40的琼脂糖凝胶电泳检测，图1第3条泳道为样品41-60的琼脂糖凝胶电泳检测，图1第4条泳道为样品61-80的琼脂糖凝胶电泳检测；
(4)体系中加入10pM Primer3，10pM Primer5和10pM adaptor primer，及1ug(3)中的混合样品，进行PCR，扩增条件为98℃预变性2分钟，15个循环(98℃10秒，62℃20秒，72℃1分钟)，延度伸72℃8分钟。
(5)用Beckman的AMPure XP beads磁珠等体积回收产物；
(6)NGS novaseq测序，比对结果见图4。
(7)根据测序分析结果，其中有效序列是指包含Ac/Ds序列和边翼的基因组序列(各样品中含有有效序列的数量及其占比具体如表2所示)。以样品0828-123和1023-99为例，其有效序列所定位的Ac/Ds转座子位置如表3所示，其中，所述0828-123号Ac/Ds转座子位置是指chr1上的第7193碱基开始。在上述有效序列中选取其中4个序列进行PCR验证和Sanger测序，Sanger测序结果见图3、4。
表2各样品中含有有效序列的数量及其占比具体如表2所示
Figure BDA0002737631550000042
Figure BDA0002737631550000051
Figure BDA0002737631550000061
Figure BDA0002737631550000071
表3，表2中有效序列所定位的Ac/Ds转座子位置
Figure BDA0002737631550000072
Figure BDA0002737631550000081
Figure BDA0002737631550000091
Figure BDA0002737631550000101
(8)以样品的基因组序列为模板，分别以用5'-1-R和Primer5、5'-2-R和Primer5、3'-1-R和Primer3以及3'-2-R和Primer3为引物对进行扩增，扩增条件为95℃预变性3分钟，30个循环(95℃30秒，62℃20秒，72℃1分钟)，延度伸72℃8分。
结果如图3所示，其中图3中的第一泳道为引物对5'-1-R和Primer5的扩增产物，对应位点1；其中图3中的第二泳道为引物对5'-2-R和Primer5的扩增产物，对应位点2；其中图3中的第三泳道为引物对3'-1-R和Primer3的扩增产物，对应位点3；其中图3中的第四泳道为引物对3'-2-R和Primer3的扩增产物，对应位点4。
表4用于验证NGS测序所获得Ac/Ds位点的特异引物序列：
序列名称 序列
5'-1-R GGTTCGGGGGCCTGAATTAA
5'-2-R GACCCACCTGAACGAACCAA
3'-1-R GCACTACAGCCCCCATATCC
3'-2-R CCAGTTCACGTTGTGGAGGA
(9)用Sanger测序法检测步骤(8)中获得产物，测序峰图解读序列，如图4所示，序列如图中标注，位点1位置在玉米chr3的193916663碱基处；位点2位置在玉米chr4的2021118716碱基处；位点3位置在玉米chr1的17473484碱基处；位点4位置在玉米chr7的126929602碱基处(相对B73的参考基因组)。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 中国农业科学院作物科学研究所
中国农业科学院生物技术研究所
<120> 一种基于NGS测序的AcDs全基因组位点高效检测引物和方法
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacn nnnnntccgt ccgcaagtta aatatgaaaa 60
tgaaaa 66
<210> 2
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacn nnnnnaaatc gatcgggata aaactaacaa 60
aa 62
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gatcatgaag acgcaataga a 21
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttctattgcg tcttcatcct gttaatacac 30
<210> 5
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
caagcagaag acggcatacg agatgcgtct tcatcctgtt aa 42

Claims (7)

1.一种用于分离Ac/Ds转座子插入位点基因组序列的特异引物，其特征在于，所示特异性引物包括Primer3和Primer5，所述Primer3为序列表中序列1所示的序列，所述Primer5为序列表中序列2所示的序列。
2.根据权利要求1所述的特异引物，其特征在于，所述特异引物为Primer3、Primer5和adaptor primer；所述adaptor primer为序列表中序列5所示的序列。
3.一种用于分离Ac/Ds转座子插入位点基因组序列的方法，其特征在于，该方法的具体步骤为：
a.取多株植株的玉米基因组DNA等量混合，用DNA打断酶打断，得到打断产物，打断的DNA片段在250 bp-5 kb之间；b.对于步骤a所得打断产物，用合成的接头1和接头2和DNA连接酶连接，得到带有接头的DNA片段，
c.将步骤b所得到的产物，每20个样品打断产物混合，然后用试剂盒回收；
d.将步骤c的回收产物用权利要求2中的所述Primer5和Primer3及接头PCR引物adaptor primer进行PCR扩增；
e.回收步骤d的扩增产物，定量后，用NGS测序仪测序，与基因组序列比对，得到对应的位点。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的步骤a中的打断酶为SauI或其他识别序列为4-6碱基粘性末端DNA酶，打断条件为37℃，1-5小时。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的步骤a中的打断酶为SauI，所述步骤b中的接头1为adaptor1，其序列为序列表中的序列3，所述接头2为adaptor2，其序列为序列表中的序列4。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的步骤b中的连接酶为T4 DNA连接酶，连接条件为25 ℃，1-3小时；所述的步骤c中的试剂盒为Axygen凝胶回收试剂盒AP-GX-250；所述的步骤d的PCR扩增条件为：98℃，预变性2分钟，15个循环：98℃10秒，62℃ 20秒，72 ℃1分钟；延伸 72℃8分钟。
7.权利要求1-2任一所述的引物或权利要求3-6任一所述的方法在分离Ac/Ds转座子插入位点基因组序列中的应用。
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