CN103757013A - 用于分离Ac/Ds侧翼序列的特异性接头序列及其分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于分离玉米Ac/Ds转座突变体中Ac/Ds转座子侧翼序列的特异性接头序列及其分离方法。该接头序列为：SEQIDNO：1～SEQIDNO：4所示的碱基序列。利用这些接头序列与经过相应的限制性内切酶酶切的Ac/Ds转座系DNA连接后，利用Ac特异性引物和接头序列特异性引物可以很好扩增获得基因组中的Ac/Ds的侧翼序列。这种检测方法操作简单，为大规模的获得Ac突变体的Ac侧翼序列和分离Ac插入突变体的基因的重要的技术手段。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于分离玉米Ac/Ds转座突变体中Ac/Ds转座子侧翼序列的特异性接头序列及其分离方法。
背景技术
玉米是全球第一大粮食作物，是全世界主要的粮食来源。而且玉米长期以来都是一种遗传模式植物。玉米B73基因组的序列测定已经完成，这将加快玉米方面的科学研究。预计在玉米中至少存在3.2万个基因，这些基因的克隆和功能分析已成为下一个重要的挑战。在众多基因克隆的方法中，插入突变研究一种非常有效的手段。主要包括T-DNA插入突变和转座子插入突变。由于转基因技术的限制，在玉米中很难应用T-DNA插入法进行插入突变分析。但是在玉米存在内源的转座子是很好的进行插入突变研究的工具。目前在玉米中最主要的用于创建插入突变体的转座子是Mutator（Mu）和Activator/Dissociator（Ac/Ds）两个系统。Mu因子具有转座频率高，正向突变率高和全基因组范围插入的特点，目前在国内外已有几个较大规模的Mu插入突变体库，并以用于玉米分离和克隆玉米基因。Ac/Ds虽然其转座频率较Mu转座子低，但其在玉米基因组拷贝数低，倾向于向连锁位点转座和倾向于插入低甲基化的基因富集区，近年来被作为与Mu互补的系统广泛的用于构建插入突变体库和进行基因的定向插入突变分析。
在分离鉴定转座系和利用转座子标签法克隆基因的过程中，分离转座子的侧翼序列是一个重要的环节。现在用于分离Ac/Ds侧翼序列的方法主要有两种，一种是以Ac或Ds的部分序列作为探针，通过Southern杂交来鉴定在每一个转座系材料中所对应的特异条带，然后回收特异条带区域的DNA并进行分子内的自连接，再通过反向PCR的方法来扩增特异条带，最后将侧翼条带测序并验证。另一种是利用genomewalking技术的原理，以能够产生平末端或3’ 突出末端的限制酶内切酶酶切DNA，然后连接特异的接头再以特异性的引物进行扩增或是直接以特异性的引物进行扩增获得转座系所特有的条带，回收并测序获得Ac/Ds的侧翼序列。其中后一种方法是相对效率较高的一种方法，但由于受到所使用的效率较高的内切酶数量的限制，仍有一部分转座系不能通过这种方法获得Ac/Ds的侧翼序列。除了上面所述的产生平末端或3’ 突出末端的限制酶内切酶，还有一种能够产生5’ 突出末端的限制性内切酶，如EcoRI，SalI，BamHI和HindIII等，如果能够开发出利用这类酶酶切DNA，然后利用genomewalking技术分离Ac/Ds的方法将会大大提高Ac/Ds突变体库中Ac/Ds侧翼序列的分离效率和利用Ac/Ds标签法克隆基因的成功率。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种用于分离Ac/Ds侧翼序列的特异性接头序列。
本发明的目的之二在于提供一种该特异性接头序列分离Ac/Ds转座子侧翼序列的方法。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种用于分离Ac/Ds侧翼序列的特异性接头序列，其特征在于该序列为：SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：4所示的碱基序列。
一种Ac/Ds侧翼序列的分离方法，利用上述的特异性接头序列，其特征在于该方法的具体步骤为：
a. 利用产生5’ 突出端限制性内切酶进行限制性内切酶玉米的DNA，得到酶切产物；
b. 将步骤a所得酶切产物，连接接头后，选择Ac末端特异性引物和接头引物进行第一轮PCR扩增，得到扩增产物；所述的接头由接头1和任一特异性接头序列退火获得，所述的接头1为SEQ ID NO：5所示的碱基序列，所述的特异性接头为SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：4所示的碱基序列中的一种；所述的Ac末端特异性引物为SEQ ID NO：6~7所示的碱基序列；所述的接头引物为SEQ ID NO：10所示的碱基序列；
c.将步骤b所得的PCR扩增产物经稀释后作为模板，再用第二轮Ac末端特异性引物和接头引物进行第二轮PCR扩增，得到Ac/Ds转座子侧翼序列；所述的第二轮PCR扩增的Ac末端特异性引物为SEQ ID NO：8~9所示的碱基序列；所述的第二轮PCR扩增的接头引物为SEQ ID NO：11所示的碱基序列。
上述的步骤b中所述的退火的方法为：将所述的接头1和所述的特异性接头序列用无菌水溶解至终浓度为200μM, 按照下面配方在0.5ml离心管中配接头溶液：
接头1（200μM） 10μl
接头2（200μM） 10μl
60mM Tris-HCl pH7.5, 150mM NaCl 10μl
将配置的溶液于94°C水浴中保温2分钟，然后在水浴中自然冷却至室温，使两条单链DNA退火形成部分双链的接头。
上述的步骤b中所述的 PCR扩增条件为：94°C预变性3分钟，13个循环（94°C 30秒，72°C 20秒 -1°C/秒，72°C 1分钟）20个循环（94°C 30秒，57°C 20秒，72°C 1分钟），过度延伸72°C 8分钟。
上述的步骤b中所述的c中PCR扩增条件为：94°C预变性3分钟，13个循环（94°C 30秒，72°C 20秒 -1°C/秒，72°C 1分钟）30个循环（94°C 30秒，57°C 20秒，72°C 1分钟），过度延伸72°C 8分钟。
上述的产生5’ 突出端限制性内切酶为：EcoRI、SalI、 BamHI、 BglII 或HindII酶切。
本发明方案中所指的Ac5’和Ac3’末端是根据Genebank中的序列号为GU595147中的Ac序列的方向指定的,与Ac转座酶的编码方向一致。
本发明与现有技术相比的具有以下突出的实质性特点和显著进步：本发明利用这类产生5’突出末端的限制性内切酶酶切转座系的基因组DNA，并利用Ac末端特异性引物和接头特异性引物可以很好扩增获得基因组中的Ac/Ds的侧翼序列。增加了在分离Ac/Ds的侧翼序列所用的限制性内切酶的种类，为大规模的获得Ac突变体的Ac侧翼序列和分离Ac插入突变体的基因的重要的技术手段。
附图说明
图1为利用以产生5’突出末端的限制性内切酶处理的DNA分离Ac/Ds转座子侧翼序列。每个转座系的两份独立的样品经BglII酶切。泳道1-20中，如泳道1和2是一个转座系的两份样品，泳道3和4是另一个转座系的两份独立的样品，依次类推。泳道21为925H报道系，泳道22为Ac供体929.20。以引物 Ac317r 和Ac169r 分别被用作是第一轮和第二轮Ac末端特异性引物。白色箭头标示候选的特异条带只出现在了某一转座系的两份独立样品中。
图2为apt1-109转座系中侧翼序列的确认. 泳道1-5：Ac5’端侧翼序列特异性引物分别和Ac末端特异性引物的扩增产物。泳道1为925H， 泳道2为929.20，泳道3和4是apt1-109转座系的两份独立样品，泳道5为空白对照。用Ac5’特异性引物与5’端侧翼序列特异性引物扩增到了一条符合预期649bp大小的条带。
图3 为分离与dek突变表型的共分离的Ac/Ds侧翼序列。以限制性内切酶SalI酶切基因组DNA，以引物 Ac317r 和Ac169r 分别被用作是第一轮和第二轮Ac末端特异性引物，结果只在野生型杂合体（+/-）中扩增到了一条彼此间大小相同的条带，呈现与dek突变表型共分离。
图4 与dek突变表型共分离的侧翼序列的验证。
具体实施方式
下面结合具体实施事例，进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实例中所涉及的接头，引物和方法适用于任何Ac和Ds侧翼序列的分离和鉴定。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，如分子克隆（Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd ed.）或植物分子生物学－实验手册（Plant Molecular Biology－A Laboratory Manual, Melody S. Clark编，Springer-verlag Berlin Heidelberg, 1997）中所述条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例一：
一、接头的获得：本发明根据Clontech公司的genomewalking kit的平末端接头的序列，设计了适用于产生5’突出末端的接头序列，其中接头1引自Clontech公司的genomewalking kit的说明书，适用于不同限制性内切酶的接头2为我们根据接头1的序列所设计的。
将由公司合成的接头1和接头2用无菌水溶解至终浓度为200μM, 按照下面配方在0.5ml离心管中配接头溶液：
接头1（200μM） 10μl
接头2（200μM） 10μl
60mM Tris-HCl pH7.5, 150mM NaCl 10μl
将配置的溶液于94°C水浴中保温2分钟，然后在水浴中自然冷却至室温，使两条单链DNA退火形成部分双链的接头。
二、利用PCR方法扩增获得Ac/Ds侧翼序列
为了能够获得可遗传的Ac/Ds的侧翼序列，对于一个转座系取两份独立的DNA样品，每份样品为10-15株植株的DNA等量混合而成。利用限制性内切酶（如EcoRI, SalI, BamHI, BglII 和HindIII等）酶切在15ul体系中500ng DNA样品，得到内梅切产物。
对于获得的具有5’突出末端的样品，取50ng 酶切产物在10ul体系中连接步骤一中的接头，得到接头产物，取该接头产物1ul 稀释10倍的用作后续PCR扩增的模板，进行次扩增，得到扩增产物。对于Ac5’末端，以Ac317r和AP1分别作第一轮扩增的Ac末端的特异性引物和接头特异性引物，对于Ac3’端，以Ac4131f和AP1分别作第一轮扩增的Ac末端的特异性引物和接头特异性引物。将第一轮PCR扩增产物稀释100倍后，取1ul用作第二轮PCR的引物。对于Ac5’末端，以Ac169r和AP2分别作第二轮扩增的Ac末端的特异性引物和接头特异性引物，对于Ac3’端，以Ac4217f和AP2分别作第二轮扩增的Ac末端的特异性引物和接头特异性引物。以3%的琼脂糖凝胶检测第二轮PCR产物。
PCR扩增条件为：
第一轮PCR反应条件：
94°C预变性3分钟，13个循环（94°C 30秒，72°C 20秒 -1°C/秒，72°C 1分钟）20个循环（94°C 30秒，57°C 20秒，72°C 1分钟），过度延伸72°C 8分钟。
第二轮PCR反应条件：
94°C预变性3分钟，13个循环（94°C 30秒，72°C 20秒 -1°C/秒，72°C 1分钟）30个循环（94°C 30秒，57°C 20秒，72°C 1分钟），过度延伸72°C 8分钟。
对于只在某一转座系的两份独立样品中出现的条带，而在Ac供体和报道系中缺失的条带被作为该转座系的特异条带，这个条带中包含了该转座系中候选的Ac/Ds的侧翼序列（图1）。通过凝胶回收和TA克隆后进行测序。利用获得的序列设计引物，并与相应的Ac末端特异性引物结合以相应的转座系和Ac供体和报道系为模板进行扩增，如果只能在转座系中能够扩增到预期大小的条带，那么可以确认获得的序列为Ac/Ds某一侧的侧翼序列（图2）。
实施例二：分离与突变表型共分离的特异条带
玉米籽粒突变体shu00067的分离群体中，选取野生型纯合植株（+/+）和野生型杂合植株（dek/+）提取DNA，用SalI酶切基因组DNA，利用实施例二中所用的方法分离Ac/Ds侧翼序列，鉴定到一条与dek突变表型呈现共分离关系的条带（图3）。通过将此PCR条带测序侧翼序列设计引物，用Ac末端特异性引物和侧翼序列特异性引物只在突变体籽粒（-/-）和野生型杂合（+/-）中扩增到了条带，而野生型对照W22和野生型纯合植株中没有扩增到相应的产物（图4），结果表明分到到的侧翼序列是真实的而且与dek突变表型是共分离的。
<110> 上海大学
<120> 用于分离Ac/Ds转座子侧翼序列的特异性接头序列及其分离方法
<160> 11
<210> 1
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
AATTACCAGCCC 12
<210> 2
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
TCGAACCAGCCC 12
<210> 3
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
GATCACCAGCCC 12
<210> 4
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
AGCTACCAGCCC 20
<210> 5
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTCGACGGCCCGGGCTGGT 48
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
CAGCGTTCGCTAGGTATTTCTTA 23
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
CCAGATGTGAGCAAGTGATTATG 23
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
TCGGGAAACTAGCTCTACCG 20
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
TAGCCAAGAGCCCAAGACTTATCAC 24
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
GTAATACGACTCACTATAGGGC 22
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ACTATAGGGCACGCGTGGT 19
Claims (6)
1.一种用于分离Ac/Ds侧翼序列的特异性接头序列，其特征在于该序列为：SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：4所示的碱基序列。
2.一种Ac/Ds侧翼序列的分离方法，利用根据权利要求1所述的特异性接头序列，其特征在于该方法的具体步骤为：
a. 利用产生5’ 突出端限制性内切酶进行限制性内切酶玉米的DNA，得到酶切产物；
b. 将步骤a所得酶切产物，连接接头后，选择Ac末端特异性引物和接头引物进行第一轮PCR扩增，得到扩增产物；所述的接头由接头1和特异性接头序列退火获得，所述的接头1为SEQ ID NO：5所示的碱基序列，所述的接头2为SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：4所示的碱基序列中的一种；所述的Ac末端特异性引物为SEQ ID NO：6~7所示的碱基序列；所述的接头引物为SEQ ID NO：10所示的碱基序列；
c.将步骤b所得的PCR扩增产物经稀释后作为模板，再用第二轮Ac末端特异性引物和接头引物进行第二轮PCR扩增，得到Ac/Ds转座子侧翼序列；所述的第二轮PCR扩增的Ac末端特异性引物为SEQ ID NO：8~9所示的碱基序列；所述的第二轮PCR扩增的接头引物为SEQ ID NO：11所示的碱基序列。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的步骤b中所述的退火的方法为：将所述的接头1和所述的特异性接头序列用无菌水溶解至终浓度为200μM, 按照下面配方在0.5ml离心管中配接头溶液：
接头1（200μM） 10μl
接头2（200μM） 10μl
60mM Tris-HCl pH7.5, 150mM NaCl 10μl
将配置的溶液于94°C水浴中保温2分钟，然后在水浴中自然冷却至室温，使两条单链DNA退火形成部分双链的接头。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的步骤b中所述的 PCR扩增条件为：94°C预变性3分钟，13个循环（94°C 30秒，72°C 20秒 -1°C/秒，72°C 1分钟）20个循环（94°C 30秒，57°C 20秒，72°C 1分钟），过度延伸72°C 8分钟。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的步骤b中所述的c中PCR扩增条件为：94°C预变性3分钟，13个循环（94°C 30秒，72°C 20秒 -1°C/秒，72°C 1分钟）30个循环（94°C 30秒，57°C 20秒，72°C 1分钟），过度延伸72°C 8分钟。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的产生5’ 突出端限制性内切酶为：EcoRI、SalI、 BamHI、 BglII 或HindII酶切。
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