CN102154446B - 一种鉴别转基因水稻中外源转基因和受体内源基因的方法 - Google Patents

一种鉴别转基因水稻中外源转基因和受体内源基因的方法 Download PDF

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CN102154446B CN 201010563586 CN201010563586A CN102154446B CN 102154446 B CN102154446 B CN 102154446B CN 201010563586 CN201010563586 CN 201010563586 CN 201010563586 A CN201010563586 A CN 201010563586A CN 102154446 B CN102154446 B CN 102154446B
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王海洋
万向元
周君莉
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Abstract

本发明提供了水稻转化受体来源的外源转基因的检测方法。属于生物技术领域。具体为在来源于转化受体的野生型基因中引入若干SNP位点，但不改变氨基酸序列，将修饰后的基因克隆于表达载体并转化水稻，从而获得转基因水稻。而后可利用SNP位点来区别转基因植株中相同等位基因的外源性与内源性。本方法可以应用于转基因水稻回交转育材料中外源基因的检测，也可应用于与标记基因分离后转基因植株中外源基因的检测。该发明不仅可以区分转基因水稻中外源与相应的内源基因，而且可以判断该位点的纯合或杂合状态。

Description

一种鉴别转基因水稻中外源转基因和受体内源基因的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域。具体为在来源于植物的野生型基因中引入若干SNP位点，将修饰后的该基因克隆于表达载体并转化水稻，从而获得转基因植物。而后可利用SNP位点来区别转基因植物中相同等位基因的外源性与内源性。
背景技术
转基因技术已成为目前发展最迅猛的现代技术之一。从1996年的170万公顷到2009年的1.34亿公顷，转基因作物在13年间耕种面积增长了80倍（Clive James, 2009）。转基因技术广泛发展和利用的同时，各国及国际社会也在不断加强其生物安全评价研究与实施，例如在1992 年召开的联合国环境与发展大会签署了两个纲领性文件——《21 世纪议程》和《生物多样性公约》，并于2000 年经多国签署了《卡塔赫纳生物安全议定书》。
转基因植物生物安全评价的内容之一是对目标转基因进行分子生物学检测及跟踪。所以针对目标基因序列进行PCR扩增、测序或Southern blot可以有效地检测外源基因。随着对安全性要求的提高，为了有效降低转基因对环境及食品带来的风险，并提高消费者的接受程度，越来越多的研究及发明开始利用植物来源的甚至受体植物自身来源的外源基因来改良作物以增加产量、改良品质，提高非生物及生物胁迫能力。但是，由于转基因来源于受体，即受体本身含有该基因，因此利用常规方法难于鉴别内源和外源基因。 
另一方面，出于食品安全性的考虑，无标记基因转化系统发展迅速。常用基因如糖类分解代谢酶基因(Pawan K J, 2002)、β-葡萄糖苷酸酶基因(Pawan K J, 2002)、绿/黄/红色荧光蛋白基因(Pawan K J, 2002)、叶绿素合成酶基因(Cough K C, 2001)、化合物解毒酶基因（Daniel H, 2001; Scott P B, 2003）及天门冬氨酸激酶基因(Pawan K J, 2002)等。剔除标记基因的机制主要为同源重组或在分离世代选择无标记的个体。农杆菌介导的双T-DNA转化方法是将目标基因与筛选标记基因分别克隆在两个T-DNA上用来转化外殖体，基因枪共转化法是用两个以上质粒/DNA片段同时轰击转化外植体，两者目的均是在转基因植株后代有性繁殖过程中经遗传重组及人工选择将携带标记基因的植株剔除，从而筛选出无选择标记基因的转基因植株后代。但当外源基因是供体来源的基因时，剔除标记基因后的转基因植株中的目标基因将难以进行分子检测及跟踪。
此外，将野生型等位基因转化植物突变体后，在转化植株及其自交后代中可利用引起功能变化的序列差异鉴定外源基因，如PCR检测。但是，当将转化事件通过有性杂交转育至其它野生型遗传背景中后，由于野生型遗传背景含有该转基因对应的内源基因，因此无法区分植物基因组本身的内源基因与导入的外源基因。
迅猛发展的第三代分子标记单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism, SNP）标记技记术是一种高通量、低成本、可机械操作的分型方法，为解决上述多种问题提供了技术依据。高通量快速检测平台的建立使其应用更加广泛。与SSR分子标记相比，以Taqman? real-time PCR为基础的SNP检测平台可使用384孔板一次检测1百万个样品，真正达到高通量、低成本 (Gupta et al. 2008)。如果在转化植物之前向目标基因内部引入SNP标记，利用Taqman? real-time PCR技术对转基因植株及其后代进行检测，不仅能区分转化植株中内、外源基因，还可区分目标基因的纯合及杂合状态。　
发明内容
本发明解决了植物转化受体来源的外源转基因的检测问题，属于生物技术领域。具体为在来源于转化受体的野生型基因中引入若干SNP位点，但不改变所编码氨基酸序列，然后将修饰后的该基因克隆于表达载体并转化植物，从而获得转基因植物。而后可利用SNP位点来区别转基因植株中相同等位基因的外源性与内源性。本方法可以应用于回交转育材料中外源基因的检测，也可应用于与标记基因分离后转基因植株中外源基因的检测。
本发明依次通过下列步骤实现：
1.         设计并合成含有目标位点突变的引物，对目标基因进行PCR扩增，在不改变氨基酸序列的同时向目标基因引入SNP位点。
2.         将含有SNP突变位点的目标基因构建至表达载体。
3.         用上述转化载体转化受体植物。
4.         利用Real-Time PCR方法（TaqMan探针）检测转基因植物中目标基因中的SNP位点。
5.         将上述转基因植株中转化事件通过有性杂交转育至其它背景中，利用Real-Time PCR仪器结合TaqMan探针法检测新育成品系/种中目标基因中的SNP位点，并判断该位点的纯合或杂合状态。
本发明方法所涉及的引物合成技术、植物叶片总DNA提取技术、PCR技术、载体构建技术、Southern blot技术、植物遗传转化技术以及利用Real-Time PCR仪器进行的SNP检测技术（TaqMan探针）均为公知技术。筛选/标记基因即红色荧光蛋白基因的编码序列可在NCBI数据库中查阅。　
本发明的优点是：
1.         与SSR等第二代分子标记相比，本发明利用的SNP标记是一种高通量、低成本、可机械操作的分型方法。使用针对核酸中不同多态性序列的荧光Taqman探针，它们在PCR扩增中被水解释放荧光信号，只有与靶序列完全匹配的探针才能被相应的切割。利用多通道real-time PCR仪检测结果，可以便捷地判断核酸多态性。以Taqman? real-time PCR为基础的SNP检测平台可使用384孔板一次检测1百万个样品。在转化植物之前向目标基因内部引入SNP标记，可以便捷地检测、区分转化植株中内、外源基因。
2.         当外源基因是供体来源的基因时，可使用本发明检测并跟踪剔除标记基因后的转基因植株中的外源目标基因。
3.         转化受体来源的野生型基因转化植物后，可用本发明检测外源基因的存在与否。将转基因通过有性杂交转育至野生型遗传背景中后，可以使用本发明检测外源基因是否存在并加以跟踪。
附图说明
图1A显示了实施例1中的ms26不育系水稻植株花器官形态学观察示意图。
图1B显示了实施例1中的ms26不育系水稻植株上不能形成正常花粉。
图2显示了实施例1中ms26缺失片段及引物位置示意图。
图3显示了实施例4中经农杆菌转化后获得的荧光愈伤组织。
图4显示了实施例4中经农杆菌转化后获得的再生植株。          
图5显示了实施例5中部分转基因植株的Southern blot鉴定（N：阴性对照，Marker:分子量标准；P：以转化质粒作为阳性对照）。
图6显示了实施例6中转基因苗SNP检测结果。图中圆点表示FAM荧光检测（含SNP位点，纯合）；三角型表示VIC荧光检测（不含SNP位点）；正方型表示FAM和VIC同时检测（含SNP位点，杂合）；差号表示不能判断。　
具体实施方式
下文结合实施例和附图具体描述本发明的技术方案，但不限于此。
实施例1：遗传转化材料的创制
利用化学诱变的方法处理野生型水稻品种武运粳7号，创制水稻突变体库，从中筛选水稻核隐性雄性不育突变体ms26，该突变体在突变位点处于纯合状态。突变的水稻植株不能形成花粉。附图1A显示了水稻核隐性不育突变体ms26植株稻穗及花器官形态学表现。附图1B显示了水稻ms26突变体植株上不能形成花粉。
与野生型等位基因MS26相比，突变等位基因ms26缺失了3102个碱基。利用引起二者功能差异的核苷酸序列差异设计PCR引物对二者扩增，可判断该位点的基因型。具体方法如下。在ms26基因缺失序列设计一条反向引物Cyp-test-3，引物序列为5′-AAGGTGTAGAAGCGGAAGAGGATGG-3′；在缺失片段两侧设计一对引物，正向引物名称为Cyp-test-5，其序列为：5′- GAGAACGAATTGGTCAATGGCCGA -3′；反向引物名称为Cyp-WT，其序列为：5′-GAAAATAGTGCTCTTATGGATTGACCT-3′。在突变体中由引物Cyp-test-5和Cyp-test-3扩增出262bp片段，在其对应的野生型水稻中由引物Cyp-test-5和 Cyp-WT扩增出567bp片段，在杂合体中两片段均能扩增出。附图2为ms26缺失片段及引物位置示意图。
实施例2：向野生型OsCYP704B2等位基因（含自身内源启动子及终止子）中引入3个SNP
利用软件Primer 5设计引物，在不改变目标基因OsCYP704B2所编码的氨基酸的同时引入3个单核苷酸突变，分别由第1468、1470和1473位碱基的G转换为C。设计并合成含有目标位点突变的引物，对目标基因进行PCR扩增，从而将SNP位点引入目标基因。所述引物序列为：5’-aggcgcgccgtttaacaggtggaagacaaggtggtgagg3’(含一个限制性内切酶AscI识别位点)和5’-catgcgacggtcacggtgcggtccttcgacaagtactc-3’(内含3个SNP位点)。修饰后的OsCYP704B2核苷酸序列见SEQ ID NO:1，其中 SNP由方框标出。修饰前后的OsCYP704B2基因所编码的氨基酸序列100%匹配，修饰后OsCYP704B2基因编码的氨基酸序列见SEQ ID NO:2。
实施例3：将含有SNP突变位点的目标基因构建至表达载体。
将修饰后的OsCYP704B2基因克隆于植物表达载体中，与报告/筛选标记基因即红色荧光蛋白基因相串连，该基因表达的红色荧光蛋白用于筛选转化愈伤组织及水稻转基因植株。
实施例4：获得转基因水稻植株
将实施例3中转化载体用电击法导入农杆菌菌株AGLO中，而后转化由实施例1中的水稻不育系诱导的愈伤组织。利用红色荧光蛋白对转化愈伤组织进行筛选，附图3为含有外源基因的愈伤组织，然后将其分化再生出表达外源基因的转化植株（附图4）。
实施例5：转基因植株的Southern Blot检测
对T0代转基因水稻基因组DNA进行Southern Blot检测，以鉴定外源基因在水稻转化受体中的整合情况。取实施例4中T0代转基因水稻植株叶片，抽取总DNA。以红色荥光蛋白基因序列中的526bp核苷酸片段为探针，选用NEB公司的XbaⅠ限制性内切酶进行消化反应。酶切反应体系为200ul，其中含基因组DNA15ug、NE Buffer 20ul、BSA 2ul、XbaⅠ4ul（20 U/ul），用无离子水将体系补足至200 ul后，37℃ 温育6h。附图5为部分转基因植株Southern Blot检测结果。结果表明外源基因已整合至受体水稻基因组中。
实施例6：检测转基因水稻中OsCYP704B2基因中的SNP
取实施例4中T0代转基因水稻植株叶片，抽取总DNA，在Real-Time PCR仪上利用TaqMan探针法对OsCYP704B2基因中的SNP位点进行检测。探针及引物序列如下：
1.         正向引物：Wang-3SNP_F   GACTGGCTTGTCGAGTACTTGT，
2.         反向引物：Wang-3SNP_R  TGTAGGAGGTGAAAGGCATGTC     ，
3.         探针1：CCGTCCTGTCCTTCG　NFQ　（用于检测不含SNP位点的样品），
4.         探针2：CACGGTGCGGTCCT  NFQ　（用于检测含有SNP位点的样品）。
SNP检测结果显示，在转基因水稻受体中存在3个目标SNP（附图6）。 
序列表 （SEQUENCE LISTING）
<110>  北京未名凯拓作物设计中心有限公司 
          北京凯拓迪恩生物技术研发中心有限责任公司
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<213>  水稻（Oryza sativa）
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<210>  2
<211>  544
<212>  PRT
<213>  水稻（Oryza sativa）
<400>  2
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1               5                   10                  15      
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            20                  25                  30          
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Lys Gly Glu Val Tyr Arg Ser Tyr Met Asp Val Leu Leu Gly Asp Gly 
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        275                 280                 285             
Ile Leu Ser Arg Phe Ile Glu Leu Gly Glu Ala Gly Gly Asp Glu Gly 
    290                 295                 300                 
Gly Gly Ser Phe Gly Asp Asp Lys Ser Leu Arg Asp Val Val Leu Asn 
305                 310                 315                 320 
Phe Val Ile Ala Gly Arg Asp Thr Thr Ala Thr Thr Leu Ser Trp Phe 
                325                 330                 335     
Thr Tyr Met Ala Met Thr His Pro Ala Val Ala Asp Lys Leu Arg Arg 
            340                 345                 350         
Glu Leu Ala Ala Phe Glu Asp Glu Arg Ala Arg Glu Glu Gly Val Ala 
        355                 360                 365             
Leu Ala Asp Ala Ala Gly Glu Ala Ser Phe Ala Ala Arg Val Ala Gln 
    370                 375                 380                 
Phe Ala Ser Leu Leu Ser Tyr Asp Ala Val Gly Lys Leu Val Tyr Leu 
385                 390                 395                 400 
His Ala Cys Val Thr Glu Thr Leu Arg Leu Tyr Pro Ala Val Pro Gln 
                405                 410                 415     
Asp Pro Lys Gly Ile Val Glu Asp Asp Val Leu Pro Asp Gly Thr Lys 
            420                 425                 430         
Val Arg Ala Gly Gly Met Val Thr Tyr Val Pro Tyr Ser Met Gly Arg 
        435                 440                 445             
Met Glu Tyr Asn Trp Gly Pro Asp Ala Ala Ser Phe Arg Pro Glu Arg 
    450                 455                 460                 
Trp Leu Ser Gly Asp Gly Gly Ala Phe Arg Asn Ala Ser Pro Phe Lys 
465                 470                 475                 480 
Phe Thr Ala Phe Gln Ala Gly Pro Arg Ile Cys Leu Gly Lys Asp Ser 
                485                 490                 495     
Ala Tyr Leu Gln Met Lys Met Ala Leu Ala Ile Leu Phe Arg Phe Tyr 
            500                 505                 510         
Thr Phe Asp Leu Val Glu Asp His Pro Val Lys Tyr Arg Met Met Thr 
        515                 520                 525             
Ile Leu Ser Met Ala His Gly Leu Lys Val Arg Val Ser Thr Ser Val 
    530                 535                 540                 
序列表 （SEQUENCE LISTING）
 
<110>  北京未名凯拓作物设计中心有限公司
       北京凯拓迪恩生物技术研发中心有限责任公司
 <120>  一种鉴别转基因水稻中外源转基因和受体内源基因的方法
<160>  2    
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  3808
<212>  DNA
<213>  水稻（Oryza sativa）
 
<400>  1
aggtggaaga caaggtggtg aggattggga gggctaccta tggcagggta gtgaagaggc     60
 
aggcaatgag agctctcttc agacttacat tggatgctga cagtaacaaa agcctgtagg    120
 
ttttgatact cttgattgat tgtttattta gttacctagt atcttcagta acagatgaga    180
 
gatttattca gcaaatgctc cggtttgctc gaaggttgta ataagagtgt gggcaagaat    240
 
caaggtcaat ccataagagc actattttca tgctcttctg atcttggttt cagacttgtt    300
 
tcagtgttga cattggttat ttctcaattc attcgagtat ttgttgttac atcacaaagg    360
 
ataagttcta tagaaaaaat cttccttttc aagtgatgtt ctttaatttt ctgtagaatt    420
 
gtgccctgca atttctcaaa tctttgatag atggcttatt tgtattgact ggaaaagaaa    480
 
ttagttgtca ataactagaa gctttagaga tgcaaagtat tggatatatc ttggcaatag    540
 
tattttatat tgcttgttta tgtgagaatg ttttaactag atggcaactg atttctggga    600
 
caaaatcgct tctacaatag cattttatgg aactcgtact cgtcgatagc atttcttgga    660
 
tttgggtgtt tgtaaatggc atttcttgga ttttctcttc attaaaatag cctattcaga    720
 
tgaagtagaa ttcaggtgaa gtagaaacca actactttgg gttcacaatt tatatttctt    780
 
ttgaggatac cccatttcat tttagttgtc atcaaagact agacaatatc gacagaaaat    840
 
ggtaagcctg gtttcagttg gtgacaattt aacagaattc agatggatat ggttctgata    900
 
ttagaaggtg gcataccttt agtcgctgca aacgcttcag ttatctgaac aaaacaacga    960
 
acttggctga gcaggggaaa aaaatactgt agcattcatt ttgtgtttac atgagtaacg   1020
 
attcttttct aggtggacag atcacaaaaa gaaaactaaa gctaagatcc aactcctaag   1080
 
ggtgttaggt tagggacacc atatgaatga gacaatctta attcttggtc acacaaagat   1140
 
tgtctcaagg ttggtagcat cagtgcccaa tatatcacct aactatgcca tccaaaatgc   1200
 
tacatagcat ctcttgtaga ctgaaccctt catgaagagc cccatggagg aagctcatgc   1260
 
aatgccagtg acatcattct tcccagtagc aggaatccac aagctcatag ctatcttcct   1320
 
tgttgtcctc tatggatctt ggtccacaag tggagcctga ggaaccagaa agggccaaga   1380
 
tcatggccaa tcatcggcgc gacagtggag caactgaaga actaccacag gatgcatgac   1440
 
tggcttgtcg agtacttgtc gaaggaccgc accgtgaccg tcgacatgcc tttcacctcc   1500
 
tacacctaca ttgccgaccc ggtgaacgtc gagcatgtcc tgaagaccaa cttcaccaat   1560
 
taccccaagg taaaagaacc ataggatctt cagtgtactg taaaatgtgc cttgcacagt   1620
 
actaacactg acacaaaaaa tgtctgaaaa tatgcagggt gaagtgtaca ggtcttacat   1680
 
ggatgtgctg ctcggtgatg gcatattcaa tgccgacggc gagatgtgga ggaagcaaag   1740
 
gaagacggcg agcttcgagt ttgcctccaa gaacttgaga gacttcagca ctgtggtgtt   1800
 
cagggagtac tccctgaagc tatcaagcat tctgagccaa gcatgcaagg ccggcagagt   1860
 
tgtagacatg caggtaacca actgaattcc ttgcctaata cctaaacatt tcttgagaaa   1920
 
ccaaattgtt cagaattctg atgcaagaac taaccaaaat tcaggaattg ttcatgagga   1980
 
tgacactgga ctcgatctgc aaggtcgggt ttggggttga gatcgggacg ctgtcacctg   2040
 
atctcccgga gaacagcttt gcccaggcat tcgacgctgc caacatcatc gtcacgctgc   2100
 
ggttcatcga tcctctgtgg cgtctgaaga agttcttgca cgtcggatca gaggctctcc   2160
 
tcgagcagag catgaagctg gttgatgact tcacctacag cgtgatccgc cgccgcaagg   2220
 
ctgagatctt gcaggctcga gccagcggca agcaagagaa ggtgatcctt cctctcttgc   2280
 
tcaaagaatc agtagaactg aactgacatg gtaatggtga tgatcagatc ggaaaaggtt   2340
 
ttgtttcttg atatcgttga tttgtaatgg cgagcagatc aagcacgaca tactgtcgcg   2400
 
gttcatcgag ctcggggagg ccggcggcga cgaggggggc ggcagcttcg gggacgacaa   2460
 
gagcctccgc gacgtggtgc tcaacttcgt gatcgccggg cgtgacacga cggcgacgac   2520
 
gctgtcgtgg ttcacgtaca tggcgatgac gcacccggcc gtcgccgaca agctccggcg   2580
 
cgagctggcc gcgttcgagg atgagcgcgc gcgcgaggag ggcgtcgcgc tcgccgacgc   2640
 
cgccggcgag gcgtcgttcg cggcgcgcgt ggcgcagttc gcgtcgctgc tgagctacga   2700
 
cgcggtgggg aagctggtgt acctgcacgc gtgcgtgacg gagacgctcc gcctctaccc   2760
 
ggcggtgccg caggacccca aggggatcgt ggaggacgac gtgctccccg acggcaccaa   2820
 
ggtgcgcgcc ggcgggatgg tgacgtacgt gccctactcc atggggagga tggagtacaa   2880
 
ctggggcccc gacgcggcga gcttccggcc ggagcggtgg ctcagcggcg acggcggcgc   2940
 
gttccggaac gcgtcgccgt tcaagttcac cgcgttccag gccgggccgc ggatctgcct   3000
 
cggcaaggac tccgcctacc tccagatgaa gatggcgctc gccatcctct tccgcttcta   3060
 
caccttcgac ctcgtcgagg accaccccgt caagtaccgg atgatgacca tcctctccat   3120
 
ggctcacggc ctcaaggtcc gcgtctccac ctccgtctga cccccgccgc cgctcgccgg   3180
 
cagccgcgcc gccgccgccc gtatcgctta ccggagtagt aaataagcct atgtaatctg   3240
 
gtttgaattt gaaatttgaa tgtaccatgt ttgattctag gatttgttgg tcctagaccc   3300
 
tgcttgaaac ggtgcgaatt tcatctaaat ggttgagaaa ttttatcgaa agctgttcca   3360
 
ttctacgcta caaatggtgg gactggattt aaacattggc gacgtggaca aggccgtatc   3420
 
accatgtttg cacattttta aacctgtaat ctggtttgaa tttgaatgta ccatgacacc   3480
 
atgtttgcaa aactttacat gaatgtttga gaaaaaatat ggagaactgt tcaattagta   3540
 
tgcgtttaaa atgggactgg atttaaacat tggcgacgtg gacaaggcta gtggactgag   3600
 
actctgagat gttgcggaag tcggggacgc agcggcggca gccgccggcg tggcggcggt   3660
 
gccggagcct gcgacacatc aagcagatgc acgcggtgat ggcgctccgg ggcttcctct   3720
 
ccgatccctc cgagctccgc gagctccttt tcgcctccgc cgtcgcggtc cgcggcgcca   3780
 
tcgcgcacgc ctacctcgtg ttcgacca                                      3808
 
<210>  2
<211>  544
<212>  PRT
<213>  水稻（Oryza sativa）
 
<400>  2
 
Met Lys Ser Pro Met Glu Glu Ala His Ala Met Pro Val Thr Ser Phe
1               5                   10                  15     
Phe Pro Val Ala Gly Ile His Lys Leu Ile Ala Ile Phe Leu Val Val
            20                  25                  30         
Leu Ser Trp Ile Leu Val His Lys Trp Ser Leu Arg Asn Gln Lys Gly
        35                  40                  45             
Pro Arg Ser Trp Pro Ile Ile Gly Ala Thr Val Glu Gln Leu Lys Asn
    50                  55                  60                 
Tyr His Arg Met His Asp Trp Leu Val Glu Tyr Leu Ser Lys Asp Arg
65                  70                  75                  80 
Thr Val Thr Val Asp Met Pro Phe Thr Ser Tyr Thr Tyr Ile Ala Asp
                85                  90                  95     
Pro Val Asn Val Glu His Val Leu Lys Thr Asn Phe Thr Asn Tyr Pro
            100                 105                 110        
Lys Gly Glu Val Tyr Arg Ser Tyr Met Asp Val Leu Leu Gly Asp Gly
        115                 120                 125            
Ile Phe Asn Ala Asp Gly Glu Met Trp Arg Lys Gln Arg Lys Thr Ala
    130                 135                 140                
Ser Phe Glu Phe Ala Ser Lys Asn Leu Arg Asp Phe Ser Thr Val Val
145                 150                 155                 160
Phe Arg Glu Tyr Ser Leu Lys Leu Ser Ser Ile Leu Ser Gln Ala Cys
                165                 170                 175    
Lys Ala Gly Arg Val Val Asp Met Gln Glu Leu Phe Met Arg Met Thr
            180                 185                 190        
Leu Asp Ser Ile Cys Lys Val Gly Phe Gly Val Glu Ile Gly Thr Leu
        195                 200                 205            
Ser Pro Asp Leu Pro Glu Asn Ser Phe Ala Gln Ala Phe Asp Ala Ala
    210                 215                 220                
Asn Ile Ile Val Thr Leu Arg Phe Ile Asp Pro Leu Trp Arg Leu Lys
225                 230                 235                 240
Lys Phe Leu His Val Gly Ser Glu Ala Leu Leu Glu Gln Ser Met Lys
                245                 250                 255    
Leu Val Asp Asp Phe Thr Tyr Ser Val Ile Arg Arg Arg Lys Ala Glu
            260                 265                 270        
Ile Leu Gln Ala Arg Ala Ser Gly Lys Gln Glu Lys Ile Lys His Asp
        275                 280                 285            
Ile Leu Ser Arg Phe Ile Glu Leu Gly Glu Ala Gly Gly Asp Glu Gly
    290                 295                 300                
Gly Gly Ser Phe Gly Asp Asp Lys Ser Leu Arg Asp Val Val Leu Asn
305                 310                 315                 320
Phe Val Ile Ala Gly Arg Asp Thr Thr Ala Thr Thr Leu Ser Trp Phe
                325                 330                 335    
Thr Tyr Met Ala Met Thr His Pro Ala Val Ala Asp Lys Leu Arg Arg
            340                 345                 350        
Glu Leu Ala Ala Phe Glu Asp Glu Arg Ala Arg Glu Glu Gly Val Ala
        355                 360                 365            
Leu Ala Asp Ala Ala Gly Glu Ala Ser Phe Ala Ala Arg Val Ala Gln
    370                 375                 380                
Phe Ala Ser Leu Leu Ser Tyr Asp Ala Val Gly Lys Leu Val Tyr Leu
385                 390                 395                 400
His Ala Cys Val Thr Glu Thr Leu Arg Leu Tyr Pro Ala Val Pro Gln
                405                 410                 415    
Asp Pro Lys Gly Ile Val Glu Asp Asp Val Leu Pro Asp Gly Thr Lys
            420                 425                 430        
Val Arg Ala Gly Gly Met Val Thr Tyr Val Pro Tyr Ser Met Gly Arg
        435                 440                 445            
Met Glu Tyr Asn Trp Gly Pro Asp Ala Ala Ser Phe Arg Pro Glu Arg
    450                 455                 460                
Trp Leu Ser Gly Asp Gly Gly Ala Phe Arg Asn Ala Ser Pro Phe Lys
465                 470                 475                 480
Phe Thr Ala Phe Gln Ala Gly Pro Arg Ile Cys Leu Gly Lys Asp Ser
                485                 490                 495    
Ala Tyr Leu Gln Met Lys Met Ala Leu Ala Ile Leu Phe Arg Phe Tyr
            500                 505                 510        
Thr Phe Asp Leu Val Glu Asp His Pro Val Lys Tyr Arg Met Met Thr
        515                 520                 525            
Ile Leu Ser Met Ala His Gly Leu Lys Val Arg Val Ser Thr Ser Val
    530                 535                 540                 

Claims (2)

1.一种有效的辨别转基因水稻中内源MS26基因和相对应外源MS26基因的方法，该方法包括以下步骤：
a）构建水稻ms26核隐性雄性不育突变体;
b) 设计外源转基因的SNP位点;
c) 检测并跟踪由含有b）所述SNP的转基因水稻与其它水稻品种/系杂交后代中的SNP;　
其特征在于，所述SNP为将目标基因OsCYP704B2的第1468、1470和1473位的碱基G转换为C。
2.权利要求1中所述的方法，该方法是在Real Time PCR仪上利用Taqman?法进行的，具体为：根据转化受体自身的野生型内源基因与外源转基因在SNP位点的差异设计特异性探针及引物，在Real Time PCR仪上进行检测，从而区分内源及外源基因。
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Cytochrome P450 Family Member CYP704B2 Catalyzes the v-Hydroxylation of Fatty Acids and Is Required for Anther Cutin Biosynthesis and Pollen Exine Formation in Rice;Hui Li et al.;《The Plant Cell》;20100131;第22卷;第173-190页 *
Hui Li et al..Cytochrome P450 Family Member CYP704B2 Catalyzes the v-Hydroxylation of Fatty Acids and Is Required for Anther Cutin Biosynthesis and Pollen Exine Formation in Rice.《The Plant Cell》.2010,第22卷

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