CN109652457A - 一种基因敲除选育alpk2基因缺失型斑马鱼的方法 - Google Patents

一种基因敲除选育alpk2基因缺失型斑马鱼的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因敲除技术领域，特别是公开了一种基因敲除选育ALPK2基因缺失型斑马鱼的方法，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，在斑马鱼的ALPK2基因上设计合适的打靶位点，在体外合成的特异性gRNA和Cas9‑蛋白，显微共注射进入斑马鱼一细胞内，+胚胎培养48h后，通过选取胚胎进行基因型分析，从而证实了所选位点的有效性。本发明能更高效且更精确地在生物体基因组中沉默特定基因，且制作简单、成本低，且可同时对靶基因上多个位点进行剪切，沉默任意数目的单个基因。且干扰掉ALPK2基因斑马鱼胚胎出现明显的发育畸形。

Description

一种基因敲除选育ALPK2基因缺失型斑马鱼的方法
技术领域
本发明涉及基因敲除领域，特别是公开了一种基因敲除选育ALPK2基因缺失型斑马鱼的方法。
背景技术
ALPK2（alpha-kinase 2）基因位于斑马鱼第11号染色体上，包含10个外显子和9个内含子，cDNA全长5234bp，编码1037个氨基酸。
斑马鱼与人类心脏发育过程中的基因、信号通路有高度同源性，且ALPK2基因进化上较为保守，研究发现ALPK2在斑马鱼胚胎早期表达量特别高。而且，与其他动物模型相比，斑马鱼具有个体小、易于饲养、发育快、繁殖能力强、体外受精、胚胎体外发育且透明等优点。
通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，在斑马鱼的ALPK2基因上设计合适的打靶位点，在体外合成的特异性gRNA（终浓度20 ng/μL）和Cas9蛋白（终浓度5 μg/μL），显微共注射进入斑马鱼一细胞内，胚胎培养48h后，通过选取胚胎进行基因型分析，鉴定所设打靶位点的有效性。
基因打靶技术起源于20世纪80年代末，是一种通过对基因组进行定点修饰来研究基因功能的重要方法手段，也可用于治疗人类的各种遗传性疾病。该技术主要是利用缺失突变、基因灭活、染色体大片段删除以及外源基因导入等方式来改变生物的遗传信息，并且在生殖系中稳定遗传后表达突变性状，从而研究生物体内特定基因在生长发育过程中的作用，所以这类技术手段已成为现代分子生物学研究热点。传统的基因打靶技术是建立在胚胎干细胞(ESC) 和同源重组技术的基础之上，故打靶技术效率极低。2013年初，一种全新的人工核酸内切酶clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)9，能更高效且更精确地在生物体基因组中沉默特定基因，且制作简单、成本低，且可同时对靶基因上多个位点进行剪切，沉默任意数目的单个基因，但同时该技术存在一定的缺陷，其脱靶率相对较高。
发明内容
本发明为了克服上述技术问题的不足，提供了一种基因敲除选育ALPK2基因缺失型斑马鱼的方法，找到了合适的打靶位点，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，选育出ALPK2基因缺失型斑马鱼。
解决上述技术问题的技术方案如下：
1）设计CRISPR/Cas9基因敲除靶位点和检测引物
在National Center for Biotechnology Information（NCBI）上查询斑马鱼ALPK2基因的基因组DNA序列，在网站SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)上分析其功能结构域，根据CRISPR/Cas敲除原理，在网站The ZiFiT Targeter (http://zifit.partners.org/ZiFiT/) 上设计ALPK2基因的靶位点。靶点的选择必须遵循此标准：5’-GG-(N)18-NGG-3’。其中5’端的 GG 二核苷酸是T7启动子的一部分，设计靶位点时可以不受此限制，但是必须保证靶位点的3’端是NGG。靶点的选择位置必须在基因的结构域内，以确保靶位点碱基的插入或者缺失可以影响ALPK2基因的整个结构域，从而来改变基因的表达。
两对特异性靶位点PCR 引物如下：
两对特异性靶位点PCR 引物如下：
F1（靶位点3正向引物）：
tgtaatacgactcactata ggtgactagtcctctttcca gttttagagctagaaatagc
R（共用的反向引物）：aagcaccgactcggtgccact
F2（靶位点4正向引物）
tgtaatacgactcactata ggtttggctctccattgttg gttttagagctagaaatagc
R（共用的反向引物）：aagcaccgactcggtgccact
PCR检测引物上下游引物分别位于2号内含子以及3号内含子上：
F (5’ - gaggactgggagctaacat -3’)
R (5’- cagacttccgtgtagtttggc -3’）
2）构建gRNA表达载体以及gRNA体外合成
a，首先将gRNA骨架克隆到p42250载体上，取1-2μL质粒进行琼脂糖凝胶电泳检测
b，特异性gRNA体外合成
用BsaI限制性内切酶线性化此质粒。一般来说，酶切反应总体积为20μL，体系如下：
p42250载体 6μL
10× Buffer 2μL
BsaI限制性内切酶 1μL
ddH2O 11μL
总体积 20μL
混匀后于37 ℃水浴，酶切2.5h以上
c，以线性化的p42250载体为模板，通过下面特异性引物进行PCR，扩增出用于特异性gRNA合成的双链DNA
正向特异性靶位点引物F1或F2：T7启动子+20pb靶序列+20bp sgRNA上游骨架；
反向引物R：20bp sgRNA下游骨架
PCR反应体系（50μL）如下：
模板（p42250载体） 0.5 μL
Primer F1（或F2，10 uM） 2 μL
Primer R（10 uM） 2 μL
2× Buffer（含20mM Mg2+） 25 μL
dNTP mix（10 mM） 1 μL
Ex-Taq DNA聚合酶 1 μL
ddH2O 18.5 μL
总体积 50 μL
震荡混匀之后，4 ℃离心，于PCR仪上进行扩增反应。反应条件为：预变性95℃5min，（变性95℃30 s，退火56℃30s，延伸72 ℃30s) 30个循环，再72℃8 min。待反应结束后，离心PCR产物，取1 μL样品点样于1.6%琼脂糖凝胶上进行电泳，凝胶成像系统拍摄结果。
d，检测确定条带正确之后，进行琼脂糖凝胶DNA回收，纯化回收PCR产物
e,测定纯化的DNA浓度（尽量达到1 μg），再以此DNA为模板，用20 μL体系进行体外转录，合成特异性gRNA。转录实验中所用Tip头，EP管均为DEPC处理过的RNase-Free产品，具体操作如下：
体外转录反应体系（20 μL）：
模板DNA 12 μL
10×Buffer 2μL
rNTP mix（10 mM） 4 μL
T7 RNA聚合酶 2 μL
Nuclease-Free Water 0 μL
总体积 20 μL
将反应物都加入0.2 mL RNase-Free 的EP管中，混匀之后，于37 ℃水浴2 .5h；
水浴结束后，向转录体系中加入1 μL DNA酶，放置于37 ℃水浴锅中反应30 min，以消化DNA模板，然后取1 μL样品，用配制好的1.6%的琼脂糖凝胶进行电泳，以检测转录结果，若转录产物大小与预期的相符，则说明转录成功；
f，特异性gRNA的纯化
用RNeasy Mini kit试剂盒纯化转录成功的gRNA，保存于-20 ℃。吸取纯化后的gRNA溶液1 μL进行琼脂糖凝胶电泳，以检验纯化产物，并测定纯化之后的gRNA浓度
3）斑马鱼胚胎的显微注射
在受精后30 min 之内，用吸管吸取胚胎转移至用琼脂糖制作的显微注射专用培养皿中。
在进行显微注射之前，将Cas9 蛋白和gRNA配成混合液，充分混匀，使Cas9 蛋白的终浓度为5 μg/μL，gRNA 的终浓度为20 ng/μL。注射约3μL Cas9 蛋白和gRNA混合液于一细胞期的受精卵内。注射过的受精卵放置于E3水（5 mmol/L NaCl， 0.33mmol/L CaCl2，0.33mmol/L MgSO4，0.17 mmol/L KCl，）中，28 ℃孵化。在体式显微镜下观察胚胎表型，筛选正常发育的胚胎用于靶位点突变分析
显微注射体系如下：
Cas9 蛋白 5 μg/μL
gRNA 20 ng/μL
Nuclease free H2O
Total 3μL
4）Sanger测序检测靶位点的有效性
对斑马鱼胚胎进行显微注射之后，挑选部分发育正常的早期胚胎，检测其ALPK2基因是否存在突变，可以提前确认此次选择的靶位点是否有效果，显微注射操作是否规范
a、提取斑马鱼基因组
斑马鱼胚胎受精48小时后（48 hpf），分别收集野生型（做对照）和注射后胚胎于1.5mLEp管中（每管10颗胚胎），按照下述方法提取基因组DNA，具体步骤如下：
向装有胚胎的Ep管中加入200 μL细胞裂解液，2 μL蛋白酶K，放置于55 ℃恒温箱中裂解过夜
裂解完成后，放在振荡器上充分震荡，加入等体积（200μL）异丙醇（预先冷却）于Ep管中，充分颠倒混匀，于4 ℃条件下，12000rpm离心10 min，倒掉上清液；
加入70 %乙醇500 μL，于4 ℃条件下，12000rpm离心5 min，弃上清液，室温风干5-10min；
加入20 μL去离子水，充分吹打混匀，琼脂糖凝胶电泳检测提取效率
b、PCR扩增目的序列
提取基因组DNA之后，根据CRISPR靶位点上下游约50-100bp的基因组区域，利用Primer3.0软件设计引物序列以扩增出目的DNA片段
PCR反应体系（20 μL）如下：
2×Es Taq MasterMix 10 μL
Primer F (10 μM) 1 μL
Primer R (10 μM) 1 μL
模板(基因组DNA) 1 μL
ddH2O 7 μL
总体积 20 μL
震荡混匀之后，4 ℃离心，于PCR仪上进行扩增反应。反应条件为：预变性95℃5 min，（变性95℃ 30 s，退火56℃ 30 s，延伸72 ℃30 s) 30个循环，再72℃8 min。待反应结束后，离心PCR产物，取2μL样品点样于1.6 %琼脂糖凝胶上进行电泳，检测PCR产物大小是否正确
c、若PCR产物正确，则用1.6 %琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，送部分PCR产物进行Sanger测序，由测序的峰图来初步获得插入或缺失的信息
4)注射两个月之后，进行剪尾鉴定，同上鉴定步骤
5）PCR产物的Sanger测序
将跑胶结果有两条带的PCR产物送往测序，将测序之后给出的峰图和序列，在NCBI上与标准目的序列进行对比；
6）获得可遗传的斑马鱼突变体的F1代
通过前面一系列筛选确定了斑马鱼突变体F0代，紧接着将F0代突变体分别与野生型斑马鱼杂交得到F1代胚胎，置于28 ℃培养，在初期观察F1代的存活率。受精两天后，每个突变体F1代分别取10个胚胎进行突变遗传性鉴定。将每管胚胎提取基因组，然后PCR扩增出497bp的靶位点附近区域，观察PCR扩增是否会出现小带，PCR会出现一条500bp左右的小带，如果此突变可以遗传到F1代，则PCR扩增会出现小于497bp的小带
如果从F1代胚胎中检测到存在突变，则将斑马鱼突变体的F1代养大至2-3个月。再分别对每条F1代斑马鱼成鱼进行剪尾，筛选F1代突变体（具体方法如前面所述）。
本发明的有益效果是：
通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，在斑马鱼的ALPK2基因上设计合适的打靶位点，在体外合成的特异性gRNA（终浓度20 ng/μL）和Cas9蛋白（终浓度5 μg/μL），显微共注射进入斑马鱼一细胞内，胚胎培养48h后，通过选取胚胎进行基因型分析，鉴定所设打靶位点的有效性。本发明能更高效且更精确地在生物体基因组中沉默特定基因，且制作简单、成本低，且可同时对靶基因上多个位点进行剪切，沉默任意数目的单个基因，脱靶率很低，且干扰掉ALPK2基因斑马鱼胚胎出现明显的发育畸形。
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
附图说明
图1为CRISPR/Cas9 打靶系统的原理图；
图2为ALPK2基因上靶位点的结构图；
图3为斑马鱼F1代电泳结果图；
图4为缺失型和WT型基因序列正向对比；
图5为靶位点附近缺失对比。
具体实施方式
实施例1：
1）设计CRISPR/Cas9基因敲除靶位点和检测引物
在National Center for Biotechnology Information（NCBI）上查询斑马鱼ALPK2基因的基因组DNA序列，在网站SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)上分析其功能结构域，根据CRISPR/Cas敲除原理，在网站The ZiFiT Targeter (http://zifit.partners.org/ZiFiT/) 上设计ALPK2基因的靶位点。靶点的选择必须遵循此标准：5’-GG-(N)18-NGG-3’。其中5’端的 GG 二核苷酸是T7启动子的一部分，设计靶位点时可以不受此限制，但是必须保证靶位点的3’端是NGG。靶点的选择位置必须在基因的结构域内，以确保靶位点碱基的插入或者缺失可以影响ALPK2基因的整个结构域，从而来改变基因的表达
特异性靶位点PCR 引物如下：
F1（靶位点3正向引物）：
tgtaatacgactcactata ggagatcagtgttggtgatg gttttagagctagaaatagc
R（共用的反向引物）：aagcaccgactcggtgccact
F2（靶位点4正向引物）
tgtaatacgactcactata ggaagatcaaagcctgcagc gttttagagctagaaatagc
R（共用的反向引物）：aagcaccgactcggtgccact
PCR检测引物上下游引物位于5′末端侧翼序列上：
F (5’ - gaggactgggagctaacat -3’)
R (5’- cagacttccgtgtagtttggc -3’）
3）构建gRNA表达载体以及gRNA体外合成
a，首先将gRNA骨架克隆到p42250载体上，取1-2μL质粒进行琼脂糖凝胶电泳检测
b，特异性gRNA体外合成
用BsaI限制性内切酶线性化此质粒。一般来说，酶切反应总体积为20μL，体系如下：
p42250载体 6μL
10× Buffer 2μL
BsaI限制性内切酶 1μL
ddH2O 11μL
总体积 20μL
混匀后于37 ℃水浴，酶切2h以上。
c，以线性化的p42250载体为模板，通过下面特异性引物进行PCR，扩增出用于特异性gRNA合成的双链DNA
正向特异性靶位点引物F1或F2：T7启动子+20pb靶序列+20bp sgRNA上游骨架；
反向引物R：20bp sgRNA下游骨架
PCR反应体系（50μL）如下：
模板（p42250载体） 0.5 μL
Primer F1（或F2，10 uM） 2 μL
Primer R（10 uM） 2 μL
2× Buffer（含20mM Mg2+） 25 μL
dNTP mix（10 mM） 1 μL
Ex-Taq DNA聚合酶 1 μL
ddH2O 18.5 μL
总体积 50 μL
震荡混匀之后，4 ℃离心，于PCR仪上进行扩增反应。反应条件为：预变性95 ℃5 min，（变性95 ℃15 s，退火56℃15 s，延伸72 ℃20 s) 30个循环，再72 ℃8 min。待反应结束后，离心PCR产物，取1 μL样品点样于1.6%琼脂糖凝胶上进行电泳，凝胶成像系统拍摄结果
d，检测确定条带正确之后，进行琼脂糖凝胶DNA回收，纯化回收PCR产物
e,测定纯化的DNA浓度（尽量达到1 μg），再以此DNA为模板，用20 μL体系进行体外转录，合成特异性gRNA。转录实验中所用Tip头，EP管均为DEPC处理过的RNase-Free产品，具体操作如下：
体外转录反应体系（20 μL）：
模板DNA 12 μL
10×Buffer 2μL
rNTP mix（10 mM） 4 μL
T7 RNA聚合酶 2 μL
Nuclease-Free Water 0 μL
总体积 20 μL
将反应物都加入0.2 mL RNase-Free 的EP管中，混匀之后，于37 ℃水浴2 .5h；
水浴结束后，向转录体系中加入1 μL DNA酶，放置于37 ℃水浴锅中反应30 min，以消化DNA模板，然后取1 μL样品，用配制好的1.6%的琼脂糖凝胶进行电泳，以检测转录结果，若转录产物大小与预期的相符，则说明转录成功；
f，特异性gRNA的纯化
用RNeasy Mini kit试剂盒纯化转录成功的gRNA，保存于-20 ℃。吸取纯化后的gRNA溶液1 μL进行琼脂糖凝胶电泳，以检验纯化产物，并测定纯化之后的gRNA浓度。
3）斑马鱼胚胎的显微注射
在受精后30 min 之内，用吸管吸取胚胎转移至用琼脂糖制作的显微注射专用培养皿中
在进行显微注射之前，将Cas9 蛋白和gRNA配成混合液，充分混匀，使Cas9 蛋白的终浓度为5μg/μL，gRNA 的终浓度为20 ng/μL。注射约3 μLCas9 蛋白和gRNA混合液于一细胞期的受精卵内。注射过的受精卵放置于E3水（5 mmol/L NaCl， 0.33mmol/L CaCl2，0.33mmol/L MgSO4，0.17 mmol/L KCl，）中，28 ℃孵化。在体式显微镜下观察胚胎表型，筛选正常发育的胚胎用于靶位点突变分析
显微注射体系如下：
Cas9 蛋白 5μg/μL
gRNA 20 ng/μL
Nuclease free H2O
Total 3μL
4）Sanger测序检测靶位点的有效性
对斑马鱼胚胎进行显微注射之后，挑选部分发育正常的早期胚胎，检测其pdlim5b基因是否存在突变，可以提前确认此次选择的靶位点是否有效果，显微注射操作是否规范。
a、提取斑马鱼基因组
斑马鱼胚胎受精48小时后（48hpf），分别收集野生型（做对照）和注射后胚胎于1.5mLEp管中（每管10颗胚胎），按照下述方法提取基因组DNA，具体步骤如下：
向装有胚胎的Ep管中加入200 μL细胞裂解液，2 μL蛋白酶K，放置于55 ℃恒温箱中裂解过夜
裂解完成后，放在振荡器上充分震荡，加入等体积（200μL）异丙醇（预先冷却）于Ep管中，充分颠倒混匀，于4 ℃条件下，12000rpm离心10 min，倒掉上清液；
加入70 %乙醇500 μL，于4 ℃条件下，12000rpm离心5 min，弃上清液，室温风干20min；
加入20 μL去离子水，充分吹打混匀，琼脂糖凝胶电泳检测提取效率
b、PCR扩增目的序列
提取基因组DNA之后，根据CRISPR靶位点上下游约150-200bp的基因组区域，利用Primer Premier 3.0软件设计引物序列以扩增出目的DNA片段
PCR反应体系（20 μL）如下：
2×Es Taq MasterMix 10 μL
Primer F (10 μM) 1 μL
Primer R (10 μM) 1 μL
模板(基因组DNA) 1μL
ddH2O 7 μL
总体积 20 μL
震荡混匀之后，4 ℃离心，于PCR仪上进行扩增反应。反应条件为：预变性95℃5 min，（变性95℃ 30 s，退火56℃ 30 s，延伸72 ℃30 s) 30个循环，再72 ℃8 min。待反应结束后，离心PCR产物，取2 μL样品点样于1.6 %琼脂糖凝胶上进行电泳，检测PCR产物大小是否正确
c、若PCR产物正确，则用1.6 %琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，送PCR产物进行Sanger测序，由测序的峰图来初步获得插入或缺失的信息
4)注射两个月之后，进行剪尾鉴定，同上鉴定步骤
5）质粒的Sanger测序
将跑胶有两条小带的PCR产物送往测序，根据测序之后给出的峰图和序列，在NCBI上与标准目的序列进行对比，；
6）获得可遗传的斑马鱼突变体的F1代
通过前面一系列筛选确定了斑马鱼突变体F0代，紧接着将F0代突变体分别与野生型斑马鱼杂交得到F1代胚胎，置于28 ℃培养，在初期观察F1代的存活率。受精两天后，每个突变体F1代分别取10个胚胎进行突变遗传性鉴定。将每管胚胎提取基因组，然后PCR扩增出497bp的靶位点附近区域，观察PCR扩增是否会出现小带，PCR会出现一条500bp左右的小带，如果此突变可以遗传到F1代，则PCR扩增会出现小于497bp的小带
如果从F1代胚胎中检测到存在突变，则将斑马鱼突变体的F1代养大至2-3个月。再分别对每条F1代斑马鱼成鱼进行剪尾，筛选F1代突变体（具体方法如前面所述）
图1为CRISPR/Cas9打靶系统的原理图；图2为ALPK2基因上打靶位点的结构图；图3为WT型和缺失型F1代成鱼PCR电泳图，将测序结果与野生型序列（497bp）进行对比，发现ALPK2的打靶位点有碱基缺失；图4为缺失型和WT型基因序列正向序列对比图；图5为靶位点附近缺失对比。由于筛选到的突变体的F1代的ALPK2基因部分碱基缺失造成整个基因的移码突变，改变了斑马鱼ALPK2基因的表达。从而影响斑马鱼的心脏的发育。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质上对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化，均落入本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 湖南师范大学
<120> 一种基因敲除选育ALPK2基因型缺失斑马鱼的方法
<141> 2018-12-21
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 斑马鱼(Danio rerio)
<400> 1
ccttggaaag aggactagtc aag 23
<210> 10
<211> 36
<212> DNA
<213> 斑马鱼(Danio rerio)
<400> 10
aggtcaagcc ttggaaagag gactagtcaa gtcaga 36
<210> 10
<211> 12
<212> DNA
<213> 斑马鱼(Danio rerio)
<400> 10
aggtcaagtc aa 12
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 斑马鱼(Danio rerio)
<400> 3
ccacaacaat ggagagccaa atg 23
<210> 10
<211> 37
<212> DNA
<213> 斑马鱼(Danio rerio)
<400> 10
aagataccac aacaatggag agccaaatga gtttgtt 37
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 斑马鱼(Danio rerio)
<400> 11
tggagagcca aatgagtttg tt 22
<210> 4
<211> 497
<212> DNA
<213> 斑马鱼(Danio rerio)
<400> 4
ctgaggactg ggagctaaca tttccacctg ttgagaggtg gtcatcctca gacagctggg 60
ctagtgcact ttcagattgg tttcaagcgg ttaacaccta tccagaagac tctttcaaga 120
gtgctagcac tggttctaag ctcggtatgg caatccagga caacattttg gagcaaagga 180
caagttccga taatgcaaac aacgatgaac agacatgcct gtccctgaac cttatgcaac 240
cagatgaacc aggtcaagcc ttggaaagag gactagtcaa gtcagataac actaatggaa 300
ctgtttttaa acaaggagat aaagagagac ttgcttcttg tttagacatg gacaaagata 360
ccacaacaat ggagagccaa atgagtttgt tggagacgtc gactcccgaa tcccataaag 420
cagataataa tgcagtgatg gaaactttta atgcatcttt gactcatgag ttcaatgcca 480
aactacacgg aagtctg 497
<210> 5
<211> 390
<212> DNA
<213> 斑马鱼(Danio rerio)
<400> 5
ctgaggactg ggagctaaca tttccacctg ttgagaggtg gtcatcctca gacagctggg 60
ctagtgcact ttcagattgg tttcaagcgg ttaacaccta tccagaagac tctttcaaga 120
gtgctagcac tggttctaag ctcggtatgg caatccagga caacattttg gagcaaagga 180
caagttccga taatgcaaac aacgatgaac agacatgcct gtccctgaac cttatgcaac 240
cagatgaacc aggtcaagtc aatggagagc caaatgagtt tgttggagac gtcgactccc 300
gaatcccata aagcagataa taatgcagtg atggaaactt ttaatgcatc tttgactcat 360
gagttcaatg ccaaactaca cggaagtctg 390
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 斑马鱼(Danio rerio)
<400> 8
ctgaggactg ggagctaaca t 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 斑马鱼(Danio rerio)
<400> 8
cagacttccg tgtagtttgg c 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 斑马鱼(Danio rerio)
<400> 8
aagcaccgac tcggtgccac t 21

Claims (6)

1.一种基因敲除选育ALPK2基因缺失型斑马鱼的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)设计CRISPR/Cas9基因敲除靶位点和检测引物
在National Center for Biotechnology Information(NCBI)上查询斑马鱼ALPK2基因的基因组DNA序列，在网站SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)上分析其功能结构域，根据CRISPR/Cas敲除原理，在网站The ZiFiT Targeter(http://zifit.partners.org/ZiFiT/)上设计ALPK2基因的靶位点
靶点的选择必须遵循此标准：5’-GG-(N)18-NGG-3’
其中5’端的GG二核苷酸是T7启动子的一部分，设计靶位点时可以不受此限制，但是必须保证靶位点的3’端是NGG
靶点的选择位置必须在基因的结构域内，以确保靶位点碱基的插入或者缺失可以影响
ALPK2基因的整个结构域，从而来改变基因的表达
两对特异性靶位点PCR引物如下：
两对特异性靶位点PCR引物如下：
F1(靶位点3正向引物)：
tgtaatacgactcactata ggtgactagtcctctttcca gttttagagctagaaatagc
R(共用的反向引物)：aagcaccgactcggtgccact
F2(靶位点4正向引物)
tgtaatacgactcactata ggtttggctctccattgttg gttttagagctagaaatagc
R(共用的反向引物)：aagcaccgactcggtgccact
PCR检测引物上下游引物分别位于2号内含子以及3号内含子上：
F(5’-gaggactgggagctaacat-3’)
R(5’-cagacttccgtgtagtttggc-3’)
2)构建gRNA表达载体以及gRNA体外合成
a，首先将gRNA骨架克隆到p42250载体上，取1-2μL质粒进行琼脂糖凝胶电泳检测
b，特异性gRNA体外合成
用BsaI限制性内切酶线性化此质粒
一般来说，酶切反应总体积为20μL，体系如下：
混匀后于37℃水浴，酶切2.5h以上
c，以线性化的p42250载体为模板，通过下面特异性引物进行PCR，扩增出用于特异性gRNA合成的双链DNA
正向特异性靶位点引物F1或F2：T7启动子+20pb靶序列+20bp sgRNA上游骨架；
反向引物R：20bp sgRNA下游骨架
PCR反应体系(50μL)如下：
震荡混匀之后，4℃离心，于PCR仪上进行扩增反应
反应条件为：预变性95℃5min，(变性95℃30s，退火56℃30s，延伸72℃30s)30个循环，再72℃8min
待反应结束后，离心PCR产物，取1μL样品点样于1.6％琼脂糖凝胶上进行电泳，凝胶成像系统拍摄结果
d，检测确定条带正确之后，进行琼脂糖凝胶DNA回收，纯化回收PCR产物
e,测定纯化的DNA浓度(尽量达到1μg)，再以此DNA为模板，用20μL体系进行体外转录，合成特异性gRNA
转录实验中所用Tip头，EP管均为DEPC处理过的RNase-Free产品，具体操作如下：
体外转录反应体系(20μL)：
将反应物都加入0.2mL RNase-Free的EP管中，混匀之后，于37℃水浴2.5h；
水浴结束后，向转录体系中加入1μL DNA酶，放置于37℃水浴锅中反应30min，以消化DNA模板，然后取1μL样品，用配制好的1.6％的琼脂糖凝胶进行电泳，以检测转录结果，若转录产物大小与预期的相符，则说明转录成功；
f，特异性gRNA的纯化
用RNeasy Mini kit试剂盒纯化转录成功的gRNA，保存于-20℃
吸取纯化后的gRNA溶液1μL进行琼脂糖凝胶电泳，以检验纯化产物，并测定纯化之后的gRNA浓度
3)斑马鱼胚胎的显微注射
在受精后30min之内，用吸管吸取胚胎转移至用琼脂糖制作的显微注射专用培养皿中
在进行显微注射之前，将Cas9蛋白和gRNA配成混合液，充分混匀，使Cas9蛋白的终浓度为5μg/μL，gRNA的终浓度为20ng/μL
注射约3μL Cas9蛋白和gRNA混合液于一细胞期的受精卵内
注射过的受精卵放置于E3水(5mmol/L NaCl，0.33mmol/L CaCl2，0.33mmol/L MgSO4，0.17mmol/L KCl，)中，28℃孵化
在体式显微镜下观察胚胎表型，筛选正常发育的胚胎用于靶位点突变分析
显微注射体系如下：
4)Sanger测序检测靶位点的有效性
对斑马鱼胚胎进行显微注射之后，挑选部分发育正常的早期胚胎，检测其ALPK2基因是否存在突变，可以提前确认此次选择的靶位点是否有效果，显微注射操作是否规范
a、提取斑马鱼基因组
斑马鱼胚胎受精48小时后(48hpf)，分别收集野生型(做对照)和注射后胚胎于1.5mLEp管中(每管10颗胚胎)，按照下述方法提取基因组DNA，具体步骤如下：
向装有胚胎的Ep管中加入200μL细胞裂解液，2μL蛋白酶K，放置于55℃恒温箱中裂解过夜
裂解完成后，放在振荡器上充分震荡，加入等体积(200μL)异丙醇(预先冷却)于Ep管中，充分颠倒混匀，于4℃条件下，12000rpm离心10min，倒掉上清液；
加入70％乙醇500μL，于4℃条件下，12000rpm离心5min，弃上清液，室温风干5-10min；
加入20μL去离子水，充分吹打混匀，琼脂糖凝胶电泳检测提取效率
b、PCR扩增目的序列
提取基因组DNA之后，根据CRISPR靶位点上下游约50-100bp的基因组区域，利用Primer3.0软件设计引物序列以扩增出目的DNA片段
[0019]PCR反应体系(20μL)如下：
震荡混匀之后，4℃离心，于PCR仪上进行扩增反应
反应条件为：预变性95℃5min，(变性95℃30s，退火56℃30s，延伸72℃30s)30个循环，再72℃8min
待反应结束后，离心PCR产物，取2μL样品点样于1.6％琼脂糖凝胶上进行电泳，检测PCR产物大小是否正确
c、若PCR产物正确，则用1.6％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，送部分PCR产物进行Sanger测序，由测序的峰图来初步获得插入或缺失的信息
4)注射两个月之后，进行剪尾鉴定，同上鉴定步骤
5)PCR产物的Sanger测序
将跑胶结果有两条带的PCR产物送往测序，将测序之后给出的峰图和序列，在NCBI上与标准目的序列进行对比；
6)获得可遗传的斑马鱼突变体的F1代
通过前面一系列筛选确定了斑马鱼突变体F0代，紧接着将F0代突变体分别与野生型斑马鱼杂交得到F1代胚胎，置于28℃培养，在初期观察F1代的存活率
受精两天后，每个突变体F1代分别取10个胚胎进行突变遗传性鉴定
将每管胚胎提取基因组，然后PCR扩增出497bp的靶位点附近区域，观察PCR扩增是否会出现小带，PCR会出现一条500bp左右的小带，如果此突变可以遗传到F1代，则PCR扩增会出现小于497bp的小带。
2.如果从F1代胚胎中检测到存在突变，则将斑马鱼突变体的F1代养大至2-3个月再分别对每条F1代斑马鱼成鱼进行剪尾，筛选F1代突变体(具体方法如前面所述)。
3.根据权利要求1所述的基因敲除选育ALPK2基因缺失型斑马鱼的方法，其特征在于，步骤1)中靶位点的选择遵循以下标准：5’-GG-(N)18-NGG-3’；其中5’端的GG二核苷酸是T7启动子的一部分，保证靶位点的3’端是NGG；靶点的选择位置在基因的结构域内。
4.根据权利要求1所述的基因敲除选育ALPK2基因缺失型斑马鱼的方法，其特征在于，步骤2)中所述的转录实验中所用Tip头，EP管均为DEPC处理过的RNase-Free产品。
5.根据权利要求1所述的基因敲除选育ALPK2基因缺失型斑马鱼的方法，其特征在于，步骤3)中所述的E3水为5mmol/L NaCl，0.33mmol/L CaCl2，0.33mmol/L MgSO4，0.17mmol/LKCl的混合物。
6.根据权利要求1所述的基因敲除选育ALPK2基因缺失型斑马鱼的方法，其特征在于，步骤4)的b步骤中所述的于PCR仪上进行扩增反应，其反应条件为：预变性95℃5min，再重复30次循环以下步骤：变性95℃30s---退火56℃30s---延伸72℃30s，再72℃8min；待反应结束后，离心PCR产物，进行电泳。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110066805A (zh) * 2019-04-26 2019-07-30 湖南师范大学 基因敲除选育adgrf3b基因缺失型斑马鱼的方法
CN110229917A (zh) * 2019-06-18 2019-09-13 广东省生态环境技术研究所 一种检测环境微生物砷氧化基因物种组成的pcr引物及方法
CN110541038A (zh) * 2019-08-23 2019-12-06 华南农业大学 一种位于猪1号染色体上与猪日增重相关的snp分子标记及应用

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