CN103757014A - 富集Ac/Ds侧翼序列用特异性引物及其富集方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种富集Ac/Ds侧翼序列用特异性引物及其富集方法。该引物为：SEQIDNO：1～SEQIDNO：3所示的碱基序列。利用这些Ac特异性引物结合结合特异性引物，通过Tail-PCR结合巢式PCR，可以很好从玉米基因组中富集Ac或Ds的侧翼序列。利用这个方法，对于玉米基因组中某一Ac转座子可以富集108倍，为通过高通量测序方法进行大规模的分离Ac/Ds侧翼序列奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种富集Ac/Ds侧翼序列用特异性引物及其富集方法。特别是一种用于分离玉米Ac/Ds转座突变体中Ac/Ds转座子侧翼序列过程中从基因组中富集Ac/Ds侧翼序列用特异性引物及富集方法。
背景技术
玉米是全球第一大粮食作物，是全世界主要的粮食来源。我国玉米的总产量已超过小麦，成为仅次于水稻的第二大粮食作物。而且玉米长期以来都是一种遗传模式植物。玉米B73基因组的序列测定已经完成，这将加快玉米方面的科学研究。预计在玉米中至少存在3.2万个基因，这些基因的克隆和功能分析已成为下一个重要的挑战。转座子标签法是分析基因功能的一种十分有效的方法，它的原理是利用一些在基因组中可移动、序列已知的DNA片段，即转座子的转座，插入到一个新的位点上，通过分离、测序分析它的侧翼序列，从而克隆研究这些基因的功能。目前在玉米中最主要的用于创建插入突变体的转座子是Mutator（Mu）和Activator/Dissociator（Ac/Ds）两个系统。在分离鉴定转座系和利用转座子标签法克隆基因的过程中，分离转座子的侧翼序列是一个重要的环节。但目前用于分离Ac/Ds侧翼序列的方法还主要是利用通过Southern杂交或基于PCR技术的方法，其中基于GenomeWalking技术的PCR方法，即基于限制性内切酶酶切加接头的方法，相对于基于Southern杂交的方法具有较高的效率，但其由于受到限制性内切酶酶切位点的特异性，使得实验的通量难以进一步提高。因此需要建立一种新的、通量大的标签分离的方法，随着高通量测序方法的快速发展，目前已有将二代测序技术用于分离Mu转座子侧翼序列和克隆基因的研究，相比传统的通过Southern杂交或基于PCR技术的分离Mu转座子侧翼序列的方法大大提高了效率和通量。在Ac/Ds转座子的侧翼序列的分离方法中，一个主要的限制应用二代测序技术分离Ac/Ds侧翼序列的因素是高效的从基因组中富集出Ac/Ds的侧翼序列。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种富集Ac/Ds侧翼序列用的特异性引物。
本发明的目的之二在于提供利用这些特异性引物从基因组中富集Ac/Ds侧翼序列的方法。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种富集Ac/Ds转座子侧翼序列用特异性引物， 其特征在于该引物为SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：3所示的碱基序列。
一种富集Ac/Ds转座子侧翼序列的方法，采用上述的特异性引物，其特征在于该方法的具体步骤为：
a. 将玉米基因组DNA用超声波打断，打断的DNA片段主带在1.6kb~4.0kb之间；
b. 将步骤a所得DNA片段回收后用Taq酶进行加A，得到加A的DNA片段；
c. 将步骤b所得加A的DNA片段回收后连接接头，所述的接头由接头1和接头2退火获得；所述的接头1的序列为SEQ ID NO：7所示的碱基序列；所述的接头2的序列为SEQ ID NO：8所示的碱基序列；
d. 将步骤c所得的DNA片段回收后，用Ac末端特异性引物和接头引物AP1进行第一轮PCR扩增，得到扩增产物；所述的特异性引物为SEQ ID NO：1所示的序列；所述的接头引物AP1为SEQ ID NO：4所示的序列；
e. 将步骤d所得的PCR扩增产物回收后，进行第二轮PCR扩增，所用的特异性引物为SEQ ID NO：2所示的序列和SEQ ID NO：5所示的接头引物AP2LTm；
f. 将步骤f所得的PCR扩增产物回收后，进行第三轮PCR扩增，所用的特异性引物Ac22为SEQ ID NO：3所示的序列和SEQ ID NO：6所示的接头引物AP2；
g. 将步骤f所得的PCR扩增产物回收，即为富集了Ac/Ds侧翼序列的样品。
上述的步骤e中的 PCR扩增条件为：94°C预变性5分钟，11个循环（94°C 30秒，69°C 20秒，72°C 2.5分钟，94°C 30秒，69°C 20秒，72°C 2.5分钟，94°C 30秒，69°C 20秒，72°C 2.5分钟，94°C 30秒，55°C 20秒，72°C 2.5分钟，），过度延伸72°C 8分钟。
上述的步骤f中的PCR扩增条件为：94°C预变性5分钟，11个循环（94°C 30秒，67°C 20秒，72°C 2分钟，94°C 30秒，67°C 20秒，72°C 2分钟，94°C 30秒，67°C 20秒，72°C 2分钟，94°C 30秒，53°C 20秒，72°C 2.5分钟，），过度延伸72°C 8分钟。
上述的步骤g中的PCR扩增条件为：94°C预变性5分钟，2个循环（94°C 30秒，58°C 20秒，72°C 1分钟, 9个循环（94°C 30秒，65°C 20秒，72°C 1分钟），过度延伸72°C 8分钟。
利用这些Ac特异性引物结合结合特异性引物，通过Tail-PCR结合巢式PCR，可以很好从玉米基因组中富集Ac或Ds的侧翼序列。利用这个方法，对于玉米基因组中某一Ac转座子可以富集108倍，为通过高通量测序方法进行大规模的分离Ac/Ds侧翼序列奠定了基础。
附图说明
图1为超声波打断的基因组DNA。DNA marker为1kb DNA ladder。
图2为第一轮PCR产物。泳道分别为PCR产物，空白对照和DNA marker。DNA marker为100bp DNA ladder。
图3为第二轮PCR产物。泳道分别为PCR产物，空白对照和DNA marker。DNA marker为100bp DNA ladder。
图4为第三轮PCR产物。泳道1，2分别为两个独立的PCR反应的产物，泳道3,4分别为空白对照。
图5为在20个转座系的混合样品中Ds（bz-m2 (DI)）的富集情况的检测。泳道1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11依次为分别以10-2ng、10-3ng、10-4ng、10-5ng、10-6ng、10-7ng、10-8ng、10-9ng、10-10ng、10-11ng、10-12ng 第三轮PCR产物为模板的扩增产物，泳道12为空白对照。DNA marker为100bp DNA ladder。
图6为在20个转座系的混合样品中6个已知插入位置的Ac转座子的富集情况的检测。A、B、C、D、E、F分别对应Apt1-119，Apt1-287，Apt1-248，Apt1-265，Apt1-299，Apt1-300这6个转座系。每组中泳道1、2、3、4、5、6、7、8依次为分别以1ng、10-1ng、10-2ng、10-3ng、10-4ng、10-5ng、10-6ng、10-7ng 第三轮PCR产物为模板的扩增产物。DNA marker为100bp DNA ladder。
图7为在PCR反应检测限分析。A、B、C分别对应图6中转座系Apt1-287，Apt1-248和Apt1-300扩增产物的重组到T载体中的质粒。每组中泳道泳道1、2、3、4、5、6、7、8、9、10依次为分别以1ng、10-1ng、10-2ng、10-3ng、10-4ng、10-5ng、10-6ng、10-7ng、10-8ng、10-9ng的质粒为模板的PCR产物，泳道11为空白对照。DNA marker为100bp DNA ladder。
具体实施方式
下面结合具体实施事例，进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实例中所涉及的引物和方法适用于任何Ac和Ds侧翼序列富集。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，如分子克隆（Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd ed.）或植物分子生物学－实验手册（Plant Molecular Biology－A Laboratory Manual, Melody S. Clark编，Springer-verlag Berlin Heidelberg, 1997）中所述条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例一：Ac末端特异性引物和接头引物和接头序列的获得
本发明以根据Genebank中序列号为GU595147中的注释，截取出其中所包含的Ac转座子的序列，以60bp为单位在玉米B73基因组进行扫描，检测每段片段在玉米B73基因组中的拷贝数，即Ac转座子序列1-60,11-70，21-80……4501-4560,4511-4565。结果发现761-820 bp一段在玉米B73基因组中只有一个拷贝；291-350 bp 一段在玉米基因组中只有4个拷贝，为了提高从基因组中富集Ac/Ds序列的特异性，我们分别在这两段设计了用于第一轮和第二轮PCR 的Ac特异性的引物Ac806HTm (SEQ ID NO：1)和Ac317HTm (SEQ ID NO：2)，为了尽可能从富集的Ac/Ds序列中减少Ac/Ds末端序列的长度，我们Ac转座子5’末端设计了一条引物用于第三轮PCR Ac22 (SEQ ID NO：3)。
为了提高接头与DNA片段的连接效率，我们对Clontech公司的用于Genomewalking的平末端接头序列进行了改进，在接头1的3’端增加一个T，DNA经过3’端加A后，可以与接头进行TA连接，这样可以提高连接效率。
为了提高富集的效率，我们采用了TAIL-PCR技术进行PCR扩增，利用接头序列我们相应的设计了低退火温度的引物AP2LTm。
用于从基因组中富集Ac/Ds侧翼序列的Ac末端特异性引物，接头引物和接头序列：
| 序列名称 | 序列 |
| Ac22r | TTTTCCCATCCTACTTTCATCC |
| Ac317HTm | GAGCAGCGTTCGCTAGGTATTTCTTA |
| Ac806HTm | GCAATGGTGCTGACGTGCTGTACTG |
| AP1 | GTAATACGACTCACTATAGGGC |
| AP2LTm | ACTCACTATAGGGCACGC |
| AP2 | ACTATAGGGCACGCGTGGT |
| 接头1 | GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTCGACGGCCCGGGCTGGTT |
| 接头2 | 5’-PO4-ACCAGCCC-NH2-3’ |
其中接头2，AP1和AP2的序列引自Clontech公司的genomewalking kit的说明书。
实施例二：从转座系的基因组中富集Ac/Ds序列
我们选取了20份转座系（Apt1-119，Apt1-287，Apt1-248，Apt1-265，Apt1-299，Apt1-300，Apt1-146，Apt1-147，Apt1-148，Apt1-149，Apt1-150，Apt1-151，Apt1-154，Apt1-158，Apt1-159，Apt1-160，Apt1-161，Apt1-162，Apt1-163 和Apt1-164），其中Apt1-119，Apt1-287，Apt1-248，Apt1-265，Apt1-299，Apt1-300这6个转座系中已知Ac转座子的插入位置，其余14份转座系中没有鉴定到Ac转座子的插入位置，这些材料中均在9号染色体上的bz1基因中插入有一个已知的Ds （bz-m2 (DI)）。对于每一个转座系分别提取DNA，将DNA等量混合后，取15ug基因组DNA超声波打断（图1），打断的DNA用T4 Polymerase补平，加A，加接头后，用PCR产物清洁试剂盒回收DNA片段，取 20ng回收产物，用Ac末端特异性引物Ac806HTm和接头引物AP1进行第一轮PCR扩增，得到扩增产物（图2）；将第一轮PCR扩增产物用PCR产物清洁试剂盒回收后，取20ng PCR产物，用引物Ac末端特异性引物Ac317HTm和接头引物AP2LTm，进行第二轮扩增（图3），PCR产物清洁试剂盒回收后，取20ng PCR产物用Ac末端特异性引物Ac22和接头引物AP2，进行第三轮扩增（图4），所得产物经琼脂糖凝胶回收150bp~250bp的条带后，即为富集了Ac/Ds序列的DNA样品。
第一轮 PCR扩增条件为：94°C预变性5分钟，11个循环（94°C 30秒，69°C 20秒，72°C 2.5分钟，94°C 30秒，69°C 20秒，72°C 2.5分钟，94°C 30秒，69°C 20秒，72°C 2.5分钟，94°C 30秒，55°C 20秒，72°C 2.5分钟，），过度延伸72°C 8分钟。
第二轮PCR扩增条件为：94°C预变性5分钟，11个循环（94°C 30秒，67°C 20秒，72°C 2分钟，94°C 30秒，67°C 20秒，72°C 2分钟，94°C 30秒，67°C 20秒，72°C 2分钟，94°C 30秒，53°C 20秒，72°C 2.5分钟，），过度延伸72°C 8分钟。
第三轮 PCR扩增条件为：94°C预变性5分钟，2个循环（94°C 30秒，58°C 20秒，72°C 1分钟），9个循环（94°C 30秒，65°C 20秒，72°C 1分钟），过度延伸72°C 8分钟。
我们利用已知插入位置的Ac和Ds（bz-m2 (DI)）的侧翼序列设计了引物，与Ac末端特异性引物配合通过PCR反应检测样品中Ac/Ds序列的富集程度。我们将上述第三轮PCR产物经过PCR产物清洁试剂盒回收后并定量，电泳检测表明，第三轮的PCR产物集中在100-300bp之间（图4）。并进行从1ng/ul 开始进行10倍浓度的连续稀释，然后分别取1ul样品用作PCR的模板，查看可以扩增到产物的最低浓度。结果表明，对于Ds（bz-m2 (DI)），可以在10-7 ng/ul这个级别上扩增到目的产物（图5），而对于已知插入位置6个Ac转座子，可以在10-6ng/ul这个级别上扩增到目的产物（图6），表明在第三轮PCR产物中，Ds（bz-m2 (DI)）与每个Ac转座子的差别在10倍这个级别上，由于我们是在起始样品中混合了20份Ac转座系材料，而这20份Ac转座系材料都带有Ds（bz-m2 (DI)），所以在样品中就相当于Ds（bz-m2 (DI)）的量是每个Ac转座子的20倍，这与我们的检测的结果是一致的。
为了确定我们从基因组中将Ac/Ds转座子的侧翼序列富集了多少倍。我们将转座系Apt1-287，Apt1-248和Apt1-300的扩增片段构建到T载体中，并提取质粒，纯化后定量后，进行10倍的连续稀释，获得1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9 ng/uL稀释液，并分别取1ul作为模板，进行扩增检测（图7）。结果均在10-6ng这个级别上可以扩增到目的产物，由于这三个T载体质粒的大小约为3kb，在10-6ng这个级别上相当于3×102个拷贝，即当反应液中某一DNA片段为102个拷贝这个级别时，可以被扩增出可见的DNA条带。上述我们在第三轮PCR产物的10-6ng这个级别可以检测到目的片段，而第三轮PCR产物的大小在100-300bp之间，按平均200bp计算，则在10-6ng中约含有4×103个拷贝的DNA片段，即在20个转座系的混合样品中，通过我们可以将某一个Ac转座系的侧翼序列富集到占PCR产物的10-1这个数量级上。将上述结果按1ng这个级别计算， 200bp的DNA片段约为4×1010个拷贝，那么在20个转座系中，每个Ac转座子对应的侧翼序列的拷贝数约在109这个级别上，玉米基因组大小为2500Mb，而对于某一个Ac转座子而言，在每个基因组中只有1个拷贝，1ng的DNA片段相当含有102拷贝的基因组，所以在20个转座系的混合样品中某一个Ac转座子的拷贝数在10这个数量级上。综合上述的结果，我们这个方法可以从玉米基因组中将某一Ac转座子富集108倍。
上述用于检测Ds（bz-m2 (DI)）和6个已知插入位置的Ac转座子的引物为：
| 序列名称 | 序列 | 用途 |
| Ac22r | TTTTCCCATCCTACTTTCATCC | 检测富集情况的Ac/Ds末端特异性引物 |
| Ds2(D1)5’fds-2 | TTCCTTGTCCCTTCATTGC | 检测Ds(bz-m2 (DI))富集情况的Ds侧翼序列特异性引物 |
| Apt1-119 | CATGGCTAAGCAGTAAGCAC | 检测Apt1-119中Ac转座子富集情况的Ac侧翼序列特异性引物 |
| Apt1-287 | ACCTCAGGGGCAGCTTCTT | 检测Apt1-287中Ac转座子富集情况的Ac侧翼序列特异性引物 |
| Apt1-248 | AGACAACCAAACACACTCTACCG | 检测Apt1-248中Ac转座子富集情况的Ac侧翼序列特异性引物 |
| Apt1-265 | TCACGCCTAAAATTAGACGCT | 检测Apt1-265中Ac转座子富集情况的Ac侧翼序列特异性引物 |
| Apt1-299 | CTCTTGCCTCTATCCTCTTGTT | 检测Apt1-299中Ac转座子富集情况的Ac侧翼序列特异性引物 |
| Apt1-300 | ACTCGGTGAGGTTCTCGTAG | 检测Apt1-300中Ac转座子富集情况的Ac侧翼序列特异性引物 |
上述进行侧翼序列富集情况检测的PCR反应条件为：94°C预变性5分钟，30个循环（94°C 30秒，55°C 20秒，72°C 1分钟），过度延伸72°C 8分钟。
<110> 上海大学
<120> 富集Ac/Ds侧翼序列用特异性引物及其富集方法
<160> 15
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
GCAATGGTGCTGACGTGCTGTACTG 25
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
GAGCAGCGTTCGCTAGGTATTTCTTA 26
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
TTTTCCCATCCTACTTTCATCC 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
GTAATACGACTCACTATAGGGC 22
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ACTCACTATAGGGCACGC 18
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ACTATAGGGCACGCGTGGT 19
<210> 7
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTCGACGGCCCGGGCTGGTT 49
<210> 8
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
5’-PO4-ACCAGCCC-NH2-3’ 8
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
TTCCTTGTCCCTTCATTGC 19
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
CATGGCTAAGCAGTAAGCAC 20
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ACCTCAGGGGCAGCTTCTT 19
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
AGACAACCAAACACACTCTACCG 23
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
TCACGCCTAAAATTAGACGCT 21
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
CTCTTGCCTCTATCCTCTTGTT 22
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
ACTCGGTGAGGTTCTCGTAG 20
Claims (5)
1.一种富集Ac/Ds转座子侧翼序列用特异性引物， 其特征在于该引物为SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：3所示的碱基序列。
2.一种富集Ac/Ds转座子侧翼序列的方法，采用根据权利要求1所述的特异性引物，其特征在于该方法的具体步骤为：
a. 将玉米基因组DNA用超声波打断，打断的DNA片段主带在1.6kb~4.0kb之间；
b. 将步骤a所得DNA片段回收后用Taq酶进行加A，得到加A的DNA片段；
c. 将步骤b所得加A的DNA片段回收后连接接头，所述的接头由接头1和接头2退火获得；所述的接头1的序列为SEQ ID NO：7所示的碱基序列；所述的接头2的序列为SEQ ID NO：8所示的碱基序列；
d. 将步骤c所得的DNA片段回收后，用Ac末端特异性引物和接头引物AP1进行第一轮PCR扩增，得到扩增产物；所述的特异性引物为SEQ ID NO：1所示的序列；所述的接头引物AP1为SEQ ID NO：4所示的序列；
e. 将步骤d所得的PCR扩增产物回收后，进行第二轮PCR扩增，所用的特异性引物为SEQ ID NO：2所示的序列和SEQ ID NO：5所示的接头引物AP2LTm；
f. 将步骤f所得的PCR扩增产物回收后，进行第三轮PCR扩增，所用的特异性引物Ac22为SEQ ID NO：3所示的序列和SEQ ID NO：6所示的接头引物AP2；
g. 将步骤f所得的PCR扩增产物回收，即为富集了Ac/Ds侧翼序列的样品。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于上述的步骤e中的 PCR扩增条件为：94°C预变性5分钟，11个循环（94°C 30秒，69°C 20秒，72°C 2.5分钟，94°C 30秒，69°C 20秒，72°C 2.5分钟，94°C 30秒，69°C 20秒，72°C 2.5分钟，94°C 30秒，55°C 20秒，72°C 2.5分钟，），过度延伸72°C 8分钟。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于上述的步骤f中的PCR扩增条件为：94°C预变性5分钟，11个循环（94°C 30秒，67°C 20秒，72°C 2分钟，94°C 30秒，67°C 20秒，72°C 2分钟，94°C 30秒，67°C 20秒，72°C 2分钟，94°C 30秒，53°C 20秒，72°C 2.5分钟，），过度延伸72°C 8分钟。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于上述的步骤g中的PCR扩增条件为：94°C预变性5分钟，2个循环（94°C 30秒，58°C 20秒，72°C 1分钟, 9个循环（94°C 30秒，65°C 20秒，72°C 1分钟），过度延伸72°C 8分钟。
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